CN110366560B - 抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

抗b7-h4抗体、其抗原结合片段及其医药用途 Download PDF

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Abstract

一种抗B7‑H4的抗体、其抗原结合片段及其医药用途。一种包含所述抗B7‑H4抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含抗B7‑H4抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。一种人源化的抗B7‑H4抗体，及其在制备用于治疗B7‑H4介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗B7-H4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
技术领域
本发明涉及一种对人B7-H4受体具有免疫反应性的抗B7-H4抗体，以及其抗原结合片段，包含所述抗B7-H4抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人抗B7-H4抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域长期持续的研究和开发热点，而其中T细胞肿瘤免疫治疗又处于核心位置。肿瘤逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，大部分肿瘤表达可不同程度地被宿主免疫系统识别，但在许多情况下，由于效应T细胞低效活化而引发不充分的免疫反应，因此肿瘤细胞利用其自身对免疫系统的抑制作用促进了肿瘤的生长。肿瘤免疫治疗即是充分利用并调动了肿瘤患者体内的杀伤性T细胞和/或其它免疫细胞，对肿瘤进行杀伤作用。
对CD28受体及其配体的研究己促成对称为B7超家族的相关分子的表征。B7家族成员是一类具有免疫球蛋白V样结构域(IgV)和免疫球蛋白C样结构域(IgC)的免疫球蛋白，其成员包括协同刺激因子B7.1(CD80)与B7.2(CD86)、可诱导的共剌激因子的配体(ICOS-L/B7-H2)、程序性死亡-1配体(PD-L1/B7-H1)、程序性死亡-2配体(PD-L2/B7-DC)、B7-H4和B7-H4等。
人B7-H4是由282个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，其编码基因位于1号染色体的p111区(Choi IH等，J Immunol.2003Nov 1；171(9)：4650-4)。B7-H4对T细胞免疫应答起着负性调节的作用，B7-H4在CD4+、CD8+T细胞的分化发育、细胞周期进展以及细胞因子的产生方面发挥着广泛的抑制作用(Sica GL等，Immunity.2003Jun；18(6)：849-61)。在B7-H4基因敲除的小鼠中没有发现免疫细胞紊乱和自身免疫现象(Zhu G等，Blood.2009Feb 19；113(8)：1759-67；Suh WK等，Blood.Mol Cell Biol.2006Sep；26(17)：6403-11)。目前对于B7-H4的受体及其信号转导途径尚不明确。
近来研究发现B7-H4蛋白在多种肿瘤组织中大量表达，使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击。以B7-H4分子为肿瘤治疗靶标，为肿瘤免疫治疗提供了一种新方法。
目前已知人B7-H4表达在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌和肝癌等多种癌症细胞上。在脾脏、肺、胸腺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、睾丸和卵巢中发现B7-H4mRNA的表达，蛋白质水平上，在乳房(导管和小叶)、输卵管上皮、子宫内膜腺等组织有低水平B7-H4表达。相关研究也己显示B7-H4在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中过表达(Kryczek，I.等，J.Exp.Med.2006，203(4)：871-881)，而巨噬细胞构成了肿瘤微环境的一个重要成分并且可代表多达50％的肿瘤质量。
目前有多家跨国制药公司在研发针对B7-H4的单克隆抗体和/或其与药物偶联物，提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，并达到对肿瘤细胞进行直接杀伤的目的。相关专利如WO2013025779、US20140322129等。Medimmune、FivePrime等公司的抗B7-H4单克隆抗体目前尚在临床前开发；基因泰克公司的抗B7-H4抗体-药物偶联物也已处在临床前开发阶段。
本发明提供有着高亲和力，高选择性，高生物活性的抗B7-H4抗体，用于肿瘤的单克隆抗体免疫疗法及其相关应用。用于B7-H4阳性肿瘤治疗的药物、组合物以及方法。
发明内容
本发明提供一种B7-H4抗体或其抗原结合片段，其包含：
抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：
SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；
SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16；
SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24；
SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32；
SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40；
SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48；
SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56；
SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64；
SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72；和
抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：
SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5；
SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13；
SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；
SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29；
SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37；
SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45；
SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53；
SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61；
SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69；
SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含分别如：
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含分别如：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3
或SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
特别优选的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段可选自下述任一种，其包含1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：
(1)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(2)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(3)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(4)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(5)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(6)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ IDNO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(7)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ IDNO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(8)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：59、SEQ IDNO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(9)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ IDNO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(10)、所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ IDNO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体轻链可变区选自含有如下序列的轻链可变区：SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：78，SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链可变区选自含有如下序列的重链可变区：SEQ ID NO：75，SEQ IDNO：77，SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：81。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区；更优选使用氨基酸突变后增强ADCC毒性的IgG1。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的轻链选自含有如下序列的轻链：SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQID NO：88或SEQ ID NO：90。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链选自含有如下序列的重链：SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQID NO：87或SEQ ID NO：89。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体轻链可变区选自含有如下序列的轻链可变区：SEQ ID NO：76或SEQ IDNO：80。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体重链可变区选自含有如下序列的重链可变区：SEQ ID NO：75或SEQ IDNO：79
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的轻链选自含有如下序列的轻链：SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链选自含有如下序列的重链：SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：87。
在本发明更优选的实施方案中，人源化抗体选自以下任一种：
(1)SEQ ID NO：76的轻链可变区和SEQ ID NO：75的重链可变区；
(2)SEQ ID NO：78的轻链可变区和SEQ ID NO：77的重链可变区；
(3)SEQ ID NO：80的轻链可变区和SEQ ID NO：79的重链可变区；
或(4)SEQ ID NO：82的轻链可变区和SEQ ID NO：81的重链可变区。
在本发明进一步优选的实施方案中，人源化抗体选自以下任一种：
(1)SEQ ID NO：84的轻链和SEQ ID NO：83的重链；
(2)SEQ ID NO：86的轻链和SEQ ID NO：85的重链；
(3)SEQ ID NO：88的轻链和SEQ ID NO：87的重链；
或(4)SEQ ID NO：90的轻链和SEQ ID NO：89的重链。
一种抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其具有至少一项下述特征：(1)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸41-60的表位；(2)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸53-59的表位。
一种抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其具有至少一项下述特征：(1)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸53的表位；(2)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸54的表位；(3)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸56的表位；(4)结合B7-H4中含有SEQ IDNO：92中氨基酸57的表位；(5)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸58的表位；(2)结合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中氨基酸59的表位。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
本发明进一步提供一种编码如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段的DNA序列。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA序列的表达载体。
本发明进一步提供一种导入或含有如上所述的表达载体的宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
在本发明还提供了一种生产B7-H4抗体的方法，包括：培养上述的宿主细胞，从培养物分离抗体以及对抗体进行纯化。
本发明还提供了一种多特异性抗体，含有如前所述的轻链可变区和重链可变区。
本发明还提供了一种单链抗体，含有如前所述的轻链可变区和重链可变区。
本发明还提供了一种检测试剂或诊断剂，含有如前所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种用于免疫检测或测定B7-H4的方法，所述方法包括使用本发明所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供一种用于诊断与B7-H4阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用本发明所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段检测或测定B7-H4或B7-H4阳性细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段和可药用的赋形剂、稀释或载体。
本发明进一步提供一种如上所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗B7-H4介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达B7-H4的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本发明进一步提供一种治疗和预防B7-H4介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或其所述的药物组合物，其中所述的疾病优选为癌症；更优选为表达B7-H4的癌症；所述的癌症最优选为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、胆囊癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
附图说明
图1：抗体的ELISA体外结合实验，显示7种嵌合抗体均对纯化人B7-H4抗原的结合活性，其中嵌合抗体2F7和2F8的EC50约在0.1nM。
图2：间接ELISA结合实验，显示抗B7-H4抗体hu2F7结合的抗原表位。
图3：小鼠体内药效实验，显示抗B7-H4抗体hu1C9的抗肿瘤效果。
图4：免疫功能实验，显示抗B7-H4抗体hu1C9和hu2G6的增强免疫(T细胞增殖)的效果。
具体实施方式
发明详述
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则和Kabat或AbM定义规则(http：//bioinf.org.uk/abs/)。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外用血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、B淋巴母细胞和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如作为MHC-I/MHC-II偶联物的组分。
术语“B7-H4”指人B7蛋白质家族的成员，也称为CD276，是具有四个Ig样胞外结构域的I型跨膜蛋白。B7-H4是抗原呈递细胞或癌细胞表面表达的免疫检查点蛋白之一，对T细胞的功能激活有抑制作用。术语“B7-H4”包括由细胞天然表达的B7-H4的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的B7-H4交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人B7-H4特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。B7-H4或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗B7-H4抗体靶向具有正常糖基化模式的人源B7-H4。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人B7-H4的单克隆抗体。制备时用B7-H4抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源B7-H4抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后增强ADCC(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG1。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
本发明的术语“与B7-H4结合”，指能与人B7-H4相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人B7-H4作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的B7-H4结合的能力。例如，结合人B7-H4的本发明的抗体也可以结合另一物种的B7-H4。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达B7-H4的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗B7-H4抗体接触时，与未与抗B7-H4抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，增强或降低降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人B7-H4或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由……组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：抗原准备及稳定细胞株的构建
编码带HisFlag标签的人B7-H4(huB7-H4-HF)序列、编码带huFc标签的人B7-H4(h-B7-H4-Fc)序列由CRO公司Integrated DNA Technology(IDT)合成(以上B7-H4重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到pTT5载体上(Biovector)。重组的B7-H4蛋白在293T细胞表达后，通过实施例2进行纯化。
纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。
huB7-H4-Fc序列：
huB7-H4-his序列：
huB7-H4-his纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液用离子交换(SP柱)进一步纯化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先将咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白置换到A液，并使用A液平衡SP柱，上样，B液浓度梯度0-100％，10倍柱体积洗脱，收集各洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，鉴定为正确后分装备用。得到带HisFlag标签的人B7-H4(hu-B7-H4 his)。huB7-H4-Fc纯化步骤：
将HEK293细胞表达的上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液换置换为PBS。用含有10mM磷酸缓冲液平衡Protein A亲和力柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱。用含有25倍柱体积缓冲液冲洗柱子，至A280读数降至基线。再用pH 3.5的0.8％醋酸缓冲液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰，分装后立刻加入1M Tris-Cl pH8.0缓冲液中和，然后使用Millipore’s Amico-15滤柱置换溶液为PBS。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定后分装备用。
稳定CHO-S细胞池构建：
编码人或食蟹猴B7-H4蛋白(huB7-H4或cyB7-H4)的全长序列由Integrated DNATechnology(IDT)公司合成(以上B7-H3重组蛋白均由本发明设计模版序列)，分别克隆到改造过的pcDNA3.1载体上，pcDNA3.1/puro(Invitrogen#V79020)。CHO-S(ATCC)细胞于CD-CHO培养基(Life Technologies，#10743029)内培养至0.5x106/ml。将10ug编码huB7H3或cyB7H3基因的载体与50ul LF-LTX(Life Technologies，#A12621)在1ml Opti-MEM培养基(Life Technologies，#31985088)中混合，室温孵育20分钟后，加入CHO细胞培养液中并放入二氧化碳培养箱培养。24小时后更换新培养基并加入10ug/ml嘌呤霉素。之后每2-3天更换一次新培养液，经过10-12天筛选后得到稳定CHO-S细胞池。
实施例2：鼠杂交瘤及抗体序列的获得
用人抗原huB7-H4-Fc进行动物免疫，共5只Balb/c和5只A/J小鼠，雌性，10周龄，使用Sigma完全弗氏佐剂(CFA)和Sigma不完全弗氏佐剂(IFA)，免疫原和免疫佐剂以1∶1的比例充分混合乳化，制成稳定“油包水”液体；注射剂量25μg/200μL/小鼠。
第1天 第一次免疫，完全弗氏佐剂。
第21天 第二次免疫，不完全弗氏佐剂。
第35天 第三次免疫，不完全弗氏佐剂。
第42天 采血和血清效价检测(3免血)
第49天 第四次免疫，不完全弗氏佐剂。
第56天 采血和血清效价检测(4免血)
对免疫小鼠血清使用如实施例3所述的间接ELISA、捕获ELISA法评估血清效价及结合细胞表面抗原的能力，对照效价检测情况(大于10万倍稀释度)决定启动细胞融合。选择血清效价、亲和力和FACS结合强的免疫小鼠进行一次终免疫后处死小鼠，取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后铺板获得杂交瘤，通过间接ELISA和捕获ELISA筛选到目标杂交瘤，并通过有限稀释法建株为单克隆细胞株。得到的阳性抗体株进一步使用稳转表达B7-H4的CHO-S细胞，对比空白CHO-S细胞以排除非特异性结合抗体杂交瘤株，用流式分选方法进行筛选，从而选定8株结合重组蛋白且也结合细胞表达抗原的杂交瘤。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA并反转录(PrimeScriptTM ReverseTranscriptase，Takara#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序，最终得到8株鼠源抗体的序列。
鼠单抗2F7的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSNYYMS SEQ ID NO：3
HCDR2 YVSSGGGSTYYSDSVKG SEQ ID NO：4
HCDR3 ESYSQGNYFDY SEQ ID NO：5
LCDR1 RASQSISDYLH SEQ ID NO：6
LCDR2 FASQSIS SEQ ID NO：7
LCDR3 QNGHSFSLT SEQ ID NO：8
M1的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GYPFTTYNMY SEQ ID NO：11
HCDR2 YIDPYNGGTSYNQKFKG SEQ ID NO：12
HCDR3 SGFYDGYYAWYFDV SEQ ID NO：13
LCDR1 RSSQSLVHSGGNTYLH SEQ ID NO：14
LCDR2 KVSNRFS SEQ ID NO：15
LCDR3 SQSTHVPLT SEQ ID NO：16
鼠单抗2F8的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GYTFTNSWMN SEQ ID NO：19
HCDR2 GIYPNSGNIEYNEKFKG SEQ ID NO：20
HCDR3 DSRFSY SEQ ID NO：21
LCDR1 KASQDVRTAVA SEQ ID NO：22
LCDR2 STSYRYT SEQ ID NO：23
LCDR3 QQHYSTPLT SEQ ID NO：24
鼠单抗2F4的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GLTFSRYAMS SEQ ID NO：27
HCDR2 GISSGGSYTYYSDTVKG SEQ ID NO：28
HCDR3 EYGRDY SEQ ID NO：29
LCDR1 HASQGINSNIG SEQ ID NO：30
LCDR2 HGTNLED SEQ ID NO：31
LCDR3 VQYAQFPRT SEQ ID NO：32
鼠单抗2A10的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSTFGMS SEQ ID NO：35
HCDR2 GISPGGSYTYYPDTVKG SEQ ID NO：36
HCDR3 GRSV SEQ ID NO：37
LCDR1 HASQDISSNIG SEQ ID NO：38
LCDR2 HGTTLED SEQ ID NO：39
LCDR3 VQSAQFPWT SEQ ID NO：40
鼠单抗2E4的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GYTFTSSWMN SEQ ID NO：43
HCDR2 GIYPNRGTTEYNEKFKG SEQ ID NO：44
HCDR3 DSRFAD SEQ ID NO：45
LCDR1 KASQDVSAAVA SEQ ID NO：46
LCDR2 SASYRYT SEQ ID NO：47
LCDR3 QQHYNTPLT SEQ ID NO：48
鼠单抗1E4的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSRYAMS SEQ ID NO：51
HCDR2 GISSGGSYTYYPDTLKG SEQ ID NO：52
HCDR3 QGSNHYFDY SEQ ID NO：53
LCDR1 HASQGIHNNIG SEQ ID NO：54
LCDR2 HGTNLED SEQ ID NO：55
LCDR3 VQYAQFPYT SEQ ID NO：56
鼠单抗2G6的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GFTFSRYGMS SEQ ID NO：59
HCDR2 GINGGGSYTYYLDTVKG SEQ ID NO：60
HCDR3 QGSNYYFDY SEQ ID NO：61
LCDR1 HASQGISSNIG SEQ ID NO：62
LCDR2 HGTNLED SEQ ID NO：63
LCDR3 VQYAQFPYT SEQ ID NO：64
鼠单抗1C9的重链和轻链可变区序列如下：
其含有下列CDR序列：
名称 序列 编号
HCDR1 GDTFTTY SEQ ID NO：67
HCDR2 YLNSGS SEQ ID NO：68
HCDR3 DSRFSY SEQ ID NO：69
LCDR1 KASQDVSTAVA SEQ ID NO：70
LCDR2 SASYRYT SEQ ID NO：71
LCDR3 QQHYNTPLT SEQ ID NO：72
使用每株鼠抗的重链和轻链可变区分别克隆进入含人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区，按实施例4所描述的方法纯化、鉴定，并进行相关活性检测。
实施例3：抗体的体外结合活性检测方法
(1)体外间接ELISA结合实验：
用pH7.4的PBS将huB7-H4His蛋白(Sino Biological Inc.，cat#10738-H08H)稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔高亲和力酶标板中，于4℃冰箱孵育过夜(16-20小时)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05％Tween-20)洗板4次后，加入用PBST稀释的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液150μl/孔，室温孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次。
用含3％BSA的PBST稀释待测抗体，1μM起始，10倍梯度，10个剂量，以100μl/孔加到酶标板中，放于室温孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3％BSA的PBST稀释的HRP标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室温孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，于室温避光孵育1分钟，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)终止反应，用酶标仪(BioTek，型号Synergy H1)在450nm处读取吸收值，分析数据。做浓度信号值曲线分析结果，如下表所示：
(2)竞争性ELISA实验：
用pH7.4的PBS将huB7-H4His蛋白(Sino Biological Inc.，cat#10738-H08H)稀释至1μg/ml浓度，以100μl/孔的体积加入96孔高亲和力酶标板中，于4℃冰箱孵育过夜(16-20小时)，用PBST(pH7.4 PBS含0.05％Tween-20)洗板4次后，加入用PBST稀释的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液150μl/孔，室温孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板4次。
用含3％BSA的PBST配制0.1nM的参照嵌合抗体，用该抗体作为稀释液将待测鼠源抗体稀释为100nM起始，10倍梯度，10个剂量，将稀释好的抗体以100μl/孔加到酶标板中，放于室温孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3％BSA的PBST稀释的HRP标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室温孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，于室温避光孵育1分钟，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)终止反应，用酶标仪(BioTek，型号Synergy H1)在450nm处读取吸收值，分析数据。竞争性抑制率＝((参照抗体吸光值-竞争抗体吸光值)/Abv抗体吸光值)*100。
(3)体外捕获ELISA结合实验：
用pH7.4的PBS缓冲液将山羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immuno Research，cat#115-006-071)稀释至2ug/ml浓度，以100ul/孔的体积加入96孔酶标板中，于37℃孵育箱中放置2小时。用PBST洗板一次后，加入用PBST稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200ul/孔，37℃孵育箱孵育2小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST洗板4次。
用含5％NHS的样品稀释液(2.5％脱脂牛奶的PBST)稀释待测小鼠血清或纯化重组抗体成不同浓度，室温孵育40分钟后，100ul/孔加到酶标板中，放于37℃孵育箱孵育40分钟。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100ul/孔用样品稀释液稀释的生物素化huB7-H4-his(义翘神州#10738-H08H)蛋白溶液，37℃孵育40分钟。孵育结束后用PBST洗板4次，加入100ul/孔用PBST稀释的HRP标记链霉亲和素(Jackson Immuno Research，cat#016-030-084)，37℃孵育40分钟。用PBST洗板4次后，加入100μl/孔TMB显色底物(湖州英创生物科技公司)，于室温避光孵育10-15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(北京普朗新技术有限公司，型号DNM-9602)在450nm处读取吸收值，分析数据。
(4)体外细胞结合实验：
收集培养好的CHO-huB7-H4稳定转染细胞或SK-BR3细胞，调节细胞密度后分铺于96孔U底板，每孔1～2x105个细胞。1200g，5min离心，去上清，添加100ul已梯度稀释的抗体溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；1200g，5min离心，去上清，PBS洗细胞2次后，添加荧光标记二抗(PE-GAM或PE-GAH)100ul每孔，4℃度孵育60min。1200g，5min离心去上清。PBS洗细胞2次后，再重悬于PBS，使用流式细胞计数仪检测信号，并作浓度曲线分析结果。
实施例4：抗B7-H4重组嵌合抗体构建表达
将本发明中的各鼠源抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别做FR(framework region)区域的定点氨基酸突变，根据不同的氨基酸突变组合，设计不同的人源化抗体重链和轻链，将不同的轻重链组合质粒转染细胞可以生产出人源化抗体。
重链载体设计如下：信号肽+突变的重链可变区序列+人的IgG1恒定区序列。
轻链载体设计如下：信号肽+突变的轻链可变区序列+人的Kappa恒定区序列。
分别将上述序列插入pCEP4载体。按照上述设计合成表达载体，得到载体质粒后，大抽质粒，将质粒送测序验证。将验证合格的质粒用PEI转染至人293F细胞中，连续培养，将293F细胞用无血清培养液(上海奥浦迈生物，OPM-293CD03)培养至对数生长期用于细胞转染。将21.4μg人源化抗体轻链质粒和23.6μg人源化抗体重链质粒溶解在10mlIReduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混匀，然后加入200ug PEI，混匀，RT孵育15min，加入50mL细胞中。细胞培养条件：5％CO2，37℃，125rpm/min。培养期间，第1天和第3天加补料，直到细胞活率低于70％，收取细胞上清，离心过滤。将离心过滤后的细胞培养液上样到抗体纯化亲和柱，经磷酸缓冲液洗柱、甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.70.1M Gly-HCl)洗脱、1M Tris盐酸pH 9.0中和、以及磷酸缓冲液透析，最终获得纯化的各嵌合抗体。
实施例5：体外结合亲和力和动力学实验：
Biacore方法是公认的客观检测蛋白相互间亲和力和动力学的检测方法。通过Biacore T200(GE)分析本发明待测B7-H4抗体表征亲和力及结合动力学。
利用由Biacore提供的试剂盒，采用NHS标准氨基偶联法将本发明待测抗B7-H4抗体共价连接至CM5(GE)芯片上。然后：
a).将稀释于同样缓冲液中的50nM人huB7-H4-his蛋白(义翘神州#10738-H08H)进样，流速10uL/min，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用GE的BIAevaluation软件以1∶1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法估测的各鼠源抗体单点kd(koff)数据如下表所示。
b).稀释于同样缓冲液中的一系列浓度梯度的人huB7-H4-his蛋白于前后各个循环进样，流速10uL/min，进样后均以试剂盒内配再生试剂再生。追踪抗原-抗体结合动力学3分钟并追踪解离动力学10分钟。使用GE的BIAevaluation软件以1∶1(Langmuir)结合模型分析所得数据，以此法测定的嵌合抗体ka(kon)、kd(koff)和KD值显示于下表所示。
实施例6：小鼠抗体人源化实验
鼠源抗人B7-H4单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列，本发明将鼠源候选分子2F7、2F8、2G6和1C9进行人源化。
在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与人源抗体种系数据库比较，获得同源性高的人种系模板。
将鼠源抗体2F7、2F8、2G6和1C9的CDR区移植到选择好的相应人源化模板上。其中，2F8的HCDR1区(GYTFTNSWMN，SEQ ID NO：19)和HCDR2区(GIYPNSGNIEYNEKFKG，SEQ ID NO：20)分别突变为GYTFTSSWMN(SEQ ID NO：73)和GIYPNRGNIEYNEKFKG(SEQ ID NO：74)以去除潜在的脱酰胺不稳定位点。替换人源化可变区，再与IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，设计并检测人源化轻重链可变区序列组合而成的抗体。
经表达测试和回复突变数量对比，选择出最终的人源化hu2F7、hu2F8、hu2G6和hu1C9抗体分子，其各自重链和轻链可变区序列如SEQ ID NO：75-82所示，其各自重链和轻链序列如SEQ ID NO：83-90所示。
/>
/>
/>
根据以上各人源化抗体轻链和重链的氨基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表达载体(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。将表达载体和转染试剂PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1∶2的比例转染HEK293细胞(Life TechnologiesCat.No.11625019)，并置于CO2孵育箱中孵育4-5天。表达的抗体通过离心回收后，按实施例4方法进行抗体纯化，得到本发明的人源化抗体蛋白hu2F7和hu2F8。
实施例7：人源化抗体活性测定
对hu2F7和hu2F8人源化抗体在体外进行了以下实验测定：
1.体外细胞结合实验：
收集培养好的MX-1细胞，用pH为7.4的PBS调节细胞密度后分铺于96孔V型底板，每孔1x105个细胞。2000rpm离心5分钟，去上清，每孔加入100μl已梯度稀释的嵌合抗体溶液(用含0.5％BSA的PBS稀释，1μM起始，3倍梯度，10个剂量)，混匀，4℃摇床孵育1个小时；2000rpm离心5分钟，去上清，PBS洗细胞2次后，每孔加入100μl用0.5％BSA的PBS稀释的FITC标记羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97224)，混匀，4℃摇床孵育30分钟。2000rpm离心5分钟，去上清。PBS洗细胞2次后，再重悬于PBS，使用流式细胞计数仪(BECKMAN COULTER，型号DxFLEX)检测信号，并作浓度曲线分析结果。结果如图表所示，人源化抗体2F7、2F8、2G6和1C9均与高表达B7-H4的MX-1细胞阳性结合。
抗体名称 与MX-1细胞的FACS Binding EC50(nM)
hu2F7 7.32
抗体名称 与MX-1细胞的FACS Binding EC50(nM)
hu2F8 7.26
抗体名称 与MX-1细胞的FACS Binding EC50(nM)
hu2G6 14.3
抗体名称 与MX-1细胞的FACS Binding EC50(nM)
hu1C9 7.25
2.亲和力动力学实验(方法步骤同实施例5)，结果如下表所示，人源化抗体hu2F7、hu2F8、hu2G6和hu1C9均对人B7-H4抗原蛋白显出很强的亲和力。
实施例8：人源化抗体结合表位测定
方法步骤同实施3(1)体外间接ELISA结合实验。将SEQ ID NO：92的B7-H4分解为长度为20个氨基酸的抗原片段，通过体外间接ELISA结合实验发现抗原片段P12(氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)与人源化抗B7-H4抗体hu2F7有特异性结合，结果如图2所示。为进一步确证抗体结合表位，在抗原片段P12中做丙氨酸扫描，即将P12中的单个氨基酸分别突变为丙氨酸。通过体外间接ELISA结合实验发现氨基酸序列：ILSCTFE部分的突变显著减弱了抗体与抗原片段的结合，显示抗体结合表位位于氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的氨基酸序列：ILSCTFE(SEQ ID NO：109)部分。结果如下表所示：
通过体外间接ELISA结合实验发现抗原片段P12(氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)与人源化抗B7-H4抗体hu1C9有特异性结合，结果如下表所示。为进一步确证抗体结合表位，在抗原片段P12中做丙氨酸扫描，即将P12中的单个氨基酸分别突变为丙氨酸。通过体外间接ELISA结合实验发现氨基酸序列：LSCTF部分的突变显著减弱了抗体与抗原片段的结合，显示抗体结合表位位于氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的氨基酸序列：LSCTF(SEQ ID NO：110)部分。结果如下表所示：
抗原片段序列 SEQ ID NO： 亲和力EC50(nM)
TVASAGNIGEDGILSCTFEP 101 271.7
TVASAGNIGEDGIASCTFEP 103 466.9
TVASAGNIGEDGILSATFEP 104 292.3
TVASAGNIGEDGILSCTAEP 106 487.9
通过体外间接ELISA结合实验发现抗原片段P12(氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)与人源化抗B7-H4抗体hu2G6有特异性结合，结果如下表所示。为进一步确证抗体结合表位，在抗原片段P12中做丙氨酸扫描，即将P12中的单个氨基酸分别突变为丙氨酸。通过体外间接ELISA结合实验发现氨基酸序列：ILSCTFEP部分的突变显著减弱了抗体与抗原片段的结合，显示抗体结合表位位于氨基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的氨基酸序列：ILSCTFEP(SEQ ID NO：111)部分。结果如下表所示：
抗原片段序列 SEQ ID NO： 亲和力EC50(nM)
TVASAGNIGEDGILSCTFEP 101 792.6
TVASAGNIGEDGALSCTFEP 102 2626
TVASAGNIGEDGIASCTFEP 103 3158
TVASAGNIGEDGILSATFEP 104 3480
TVASAGNIGEDGILSCAFEP 105 2289
TVASAGNIGEDGILSCTAEP 106 2600
TVASAGNIGEDGILSCTFEA 108 2372
实施例9：人源化抗体抗肿瘤效果
在通过基因编辑技术导入人B7-H4基因的小鼠中植入MC38肿瘤细胞，待肿瘤生长到平均100mm3后，开始给小鼠每3天注射一次对照或人源化B7-H4抗体hu1C9(10mg/kg或30mg/kg)。通过对肿瘤大小的观察发现，hu1C9具有显著的抑制肿瘤生长的功能，具有抗肿瘤效果。具体结果如图3及下表所示：
实施例10：人源化抗体增强免疫的效果
抗B7-H4的抗肿瘤效果可能是通过增强肿瘤免疫效果所介导的。为验证该机理，从人外周血中提取CD4阳性的T细胞后，在培养的T细胞中加入不同浓度的抗B7-H4抗体，包括人源化抗体hu2G6和人源化抗体hu1C9。具体结果如图4及下表所示，人源化抗体hu2G6和人源化抗体hu1C9具有提高T细胞增殖的作用，可通过增强肿瘤免疫达到抗肿瘤的效果。
/>
序列表
<110> 江苏豪森药业集团有限公司
上海翰森生物医药科技有限公司
常州恒邦药业有限公司
<120> 抗B7-H4抗体、其抗原结合片段及其医药用途
<130> 719011CPCT
<160> 111
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 123
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Gly Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
Gly Tyr Pro Phe Thr Thr Tyr Asn Met Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
Ser Gly Phe Tyr Asp Gly Tyr Tyr Ala Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 16
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Ala Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 19
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 20
Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 21
Asp Ser Arg Phe Ser Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 22
Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 23
Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 24
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 26
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 27
Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 28
Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 29
Glu Tyr Gly Arg Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 30
His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 31
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 32
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Arg Ser Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 34
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Thr Leu Glu Asp Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Ser Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 35
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 36
Gly Ile Ser Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 37
Gly Arg Ser Val
1
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 38
His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 39
His Gly Thr Thr Leu Glu Asp
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 40
Val Gln Ser Ala Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 41
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Thr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Asp Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 42
Asp Ile Met Leu Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 43
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 44
Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Thr Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 45
Asp Ser Arg Phe Ala Asp
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 46
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ala Ala Val Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 47
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(10)
<223> 突变的2F8的HCDR1区
<400> 48
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Gln Gly Ser Asn His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 50
Asp Thr Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile His Asn Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 51
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 52
Gly Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 53
Gln Gly Ser Asn His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 54
His Ala Ser Gln Gly Ile His Asn Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 55
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 56
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 58
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 59
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 60
Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 61
Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 62
His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 63
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 64
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 65
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 67
Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 68
Tyr Leu Asn Ser Gly Ser
1 5
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 69
Asp Ser Arg Phe Ser Tyr
1 5
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 70
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 71
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 72
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(10)
<223> 人源化2F8的HCDR1
<400> 73
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met Asn
1 5 10
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(17)
<223> 人源化2F8的HCDR2
<400> 74
Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(120)
<223> hu2F7 HCVR
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F7 LCVR
<400> 76
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(115)
<223> hu2F8 HCVR
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F8 LCVR
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(118)
<223> hu2G6 HCVR
<400> 79
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<221> 结构域
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Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(115)
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<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<221> 结构域
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 214
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
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Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<220>
<221> 结构域
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 结构域
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(214)
<223> hu2G6 LC
<400> 88
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(445)
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
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Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<222> (1)..(214)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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<220>
<221> 结构域
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<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F7 LCVR
<400> 93
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F7 LCVR
<400> 94
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(115)
<223> hu2F8 HCVR
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(115)
<223> hu2F8 HCVR
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F8 LCVR
<400> 97
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 结构域
<222> (1)..(107)
<223> hu2F8 LCVR
<400> 98
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
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<223> huB7-H4-Fc
<400> 99
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 100
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(276)
<223> huB7-H4-his
<400> 100
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser His His His His
260 265 270
His His His His
275
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 101
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
1 5 10 15
Thr Phe Glu Pro
20
<210> 102
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 102
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ala Leu Ser Cys
1 5 10 15
Thr Phe Glu Pro
20
<210> 103
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 103
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Ala Ser Cys
1 5 10 15
Thr Phe Glu Pro
20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 104
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Thr Phe Glu Pro
20
<210> 105
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 105
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
1 5 10 15
Ala Phe Glu Pro
20
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 106
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
1 5 10 15
Thr Ala Glu Pro
20
<210> 107
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 107
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
1 5 10 15
Thr Phe Ala Pro
20
<210> 108
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(20)
<223> 抗原片段P12的变体
<400> 108
Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys
1 5 10 15
Thr Phe Glu Ala
20
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 109
Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu
1 5
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 110
Leu Ser Cys Thr Phe
1 5
<210> 111
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 111
Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
1 5

Claims (16)

1.一种抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其包含：
抗体轻链可变区和抗体重链可变区，其中所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
2.如权利要求1所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其片段，嵌合抗体或其片段，人抗体或其片段以及人源化抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链可变区进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链FR区。
4.如权利要求3所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区。
5.如权利要求4所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的重链可变区进一步包含使用氨基酸突变后增强ADCC毒性的IgG1。
6.如权利要求2所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：SEQID NO:76的轻链可变区和SEQ ID NO:75的重链可变区。
7.如权利要求2所述的B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：SEQID NO:84的轻链和SEQ ID NO:83的重链。
8.一种DNA序列，其编码如权利要求1-7任一项所述的抗体或抗原结合片段。
9.一种表达载体，含有如权利要求8所述的DNA序列。
10.一种宿主细胞，导入或含有如权利要求9所述的表达载体。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，
所述的宿主细胞为细菌，酵母菌或哺乳动物细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，
所述的宿主细胞为大肠杆菌，毕赤酵母，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
13.生产抗体的方法，包括：
培养权利要求10-12所述的宿主细胞，从培养物分离抗体以及对抗体进行纯化。
14.一种药物组合物，其含有如权利要求1-7任一项所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
15.一种检测试剂，其包含权利要求1-7任一项所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段。
16.一种诊断剂，其包含权利要求1-7任一项的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段。
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