TW201831512A

TW201831512A - Ｔｉｍ－３抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

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Publication number: TW201831512A
Application number: TW107106582A
Authority: TW
Inventors: 曹卓曉; 付雅媛; 張婷; 陶維康
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2018-02-27
Publication date: 2018-09-01
Also published as: EP3587452A1; CN109983032A; US20190375839A1; EP3587452A4; WO2018153366A1; CN109983032B; JP2020508658A; US11345753B2

Abstract

本發明涉及TIM-3抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含所述TIM-3抗體CDR區的鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，以及包含TIM-3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。特別地，本發明涉及一種人源化的TIM-3抗體在製備用於治療TIM-3相關的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

TIM-3抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

本發明涉及TIM-3抗體以及其抗原結合片段，進一步地，本發明還涉及包含所述TIM-3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，本發明還涉及包含所述TIM-3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為TIM-3相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulinand mucin-domain-containing molecule 3，TIM-3)，又稱甲型肝炎病毒細胞受體2(hepatitis A virus cellular receptor 2，HAVCR-2)，是一種I型膜表面蛋白分子，屬TIM家族成員。人類TIM-3分子由301個胺基酸組成，包含信號肽、Ig可變區(IgV區)、富含絲胺酸/蘇氨酸的黏蛋白區、跨膜區和胞質區，人鼠之間的同源性63%。

TIM-3選擇性地表達在分泌IFN-γ的T輔助細胞(Th1和Th17)、T調控細胞(Treg)、樹突狀細胞(DC)、單核細胞、肥大細胞、NK細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL) 上(see,e.g.,Clayton et al.,J.Immunol.,192(2)：782-791(2014)；Jones et al.,J.Exp.Med.,205：2763-2779(2008))。目前已知的TIM-3的受體包括磷脂醯絲胺酸半乳糖凝集素9(Galectin-9，Gal-9)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)和癌胚抗原細胞黏附分子1(CEACAM1)。

TIM-3可從多方面調節免疫系統的功能，在Th1細胞表面與配體Gal-9結合可下調Th1細胞應答，並能誘導Th1細胞凋亡，在自身和異體免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡、哮喘)以及免疫耐受中起著重要作用。在單核-巨噬細胞表達的TIM-3與磷脂醯絲胺酸相互作用，促進凋亡細胞的吞噬；在腫瘤浸潤DC中，TIM-3則與HMGB1配體結合，抑制核酸正確轉運，從而抑制核酸免疫反應，參與免疫逃逸。TIM-3不僅表達於免疫細胞，在卵巢癌、腦膜瘤、黑色素瘤等腫瘤細胞中也有過表達，並直接促進腫瘤的增長。下調TIM-3的表達可以明顯抑制Hela細胞的侵襲和轉移。TIM-3的過表達均與肺癌、胃癌、前列腺癌和宮頸癌的不良預後密切相關。在血液系統腫瘤中，TIM-3過表達於急性骨髓性白血病的白血病幹細胞、MDS患者的造血幹細胞上，且TIM-3⁺造血幹細胞具有低分化、低凋亡及高增殖的惡性生物學特徵。因此，藉由抑制TIM-3的活性(如TIM-3抗體)以提高固有免疫系統的功能，有望成為治療腫瘤的新方法(see,e.g.,Ngiow et al.,Cancer Res.,71(21)：1-5(2011)；Guo et al.,Journαl of Translationαl Medicine,11：215(2013)；and Ngiow et al.,Cancer Res., 71(21)：6567-6571(2011))。

抗體藥物的穩定性是影響抗體成藥性的關鍵因素之一，其中天冬醯胺(Asn)和麩胺醯胺(Gln)的非酶促脫醯胺作用，能夠引起抗體的不穩定和異質性，是抗體分子常見化學降解途徑之一。已有文獻報導，多個IgG1亞型抗體因為其CDR區胺基酸的脫醯胺和異構化作用，而失去了其生物學活性。Huang等人發現，位於IgG1單株抗體重鏈可變區2(CDR2)的Asn55的脫醯胺作用，明顯降低了其結合活性。因此，在抗體的研發過程中應儘量避免或者突變相應胺基酸以降低抗體脫醯胺情況的發生，以增加抗體的穩定性和生物利用率。

儘管目前已有專利報導了有關TIM-3的抗體，如WO2011159877、WO2013006490、WO2015117002、WO2016144803、WO2016161270、US20150218274，但就國內外而言，僅有兩個TIM-3抗體處於臨床研究階段，其他抗體藥物仍處於發現和研究階段，尚沒有TIM-3抗體進入臨床應用。因此，有必要進一步開發具有更高活性、高親和力和高穩定性的TIM-3的抗體，以進行TIM-3相關疾病的治療研究和應用。

本發明提供與TIM-3的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或抗原結合片段。此外，本發明藉由篩選，獲得與所述單株抗體或其抗體片段競爭的高活性和高穩定性的抗人TIM-3抗體。

此外，本發明將提供生產根據本發明的抗體的融合瘤、編碼該抗體的DNA、包含該DNA的載體、藉由轉化所述載體而獲得的轉化體、使用該融合瘤或轉化體生產抗體或其抗體片段的方法、以及使用根據本發明的抗體或其抗體片段作為活性成分的診斷劑或治療劑。

一方面，本發明提供一種TIM-3抗體或抗原結合片段，其與人TIM-3的胞外區結合，同時與選自下面(i)至(iv)中的一種單株抗體或抗原結合片段競爭，或是選自下面(i)至(iv)中的一種單株抗體或其抗原結合片段：(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：8、43和10胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：11、12和13胺基酸序列所示；(ii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：14、15和16胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：17、18和19胺基酸序列所示；(iii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、43和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(iv)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列。

一方面，本發明提供一種TIM-3抗體或抗原結合片段，其與人TIM-3的胞外區結合，同時與選自下面(a)至(m)中的一種單株抗體或抗原結合片段競爭，或是選自下面(a)至(m)中的一種單株抗體或其抗原結合片段：(a)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、9和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(b)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、62和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(c)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、63和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(d)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、64和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(e)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、65和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(f)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、66和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(g)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、67和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(h)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、68和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、69和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(j)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、70和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(k)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、71和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(1)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、72和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(m)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該TIM-3抗體或其抗原結合片段與選自上面(i)至(iv)中的一種單株抗體結合相同的表位。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體是重組抗體。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體的重組抗體或其抗原結合片段。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人种系輕鏈和重鏈或其突變序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體含有SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區上具有1至10個胺基酸變化的序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該變體是在SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變；較佳的，該回復突變選自在SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區上進行D89E,R98T,G49A,M48I,M70L,R38K和V68A的胺基酸回復突變或在SEQ ID NO：31所示的重鏈可變區上進行Q3K和R87K的胺基酸回復突變。

在一種較佳的實施方式中，為消除抗體CDR區的乙醯化、脫醯胺化等化學修飾，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該CDR區的易發生化學修飾的位點可以進行胺基酸的置換，較佳CDR2中的NNG被置換；較佳地，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：45-50中任一個所示的重鏈可變區或包含選自SEQ ID NO：34-35中任一個所示的重鏈可變區。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體含有SEQ ID NO：21或32所示的輕鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO： 21或32所示的輕鏈可變區上具有1-10個胺基酸變化的序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該變體是在SEQ ID NO：21或32所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變；較佳的，該回復突變選自在SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區上進行A43S的胺基酸回復突變或在SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區上進行Q3K和I48V、K45Q、A43S、T85S的胺基酸回復突變。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變區或包含選自SEQ ID NO：37-40中任一個所示的輕鏈可變區。

在一种較佳的實施方案中，為消除抗體CDR區的乙醯化、脫醯胺化等化學修飾，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中所述CDR區易發生化學修飾的位點可以進行胺基酸的置換，較佳CDR2中的NNG被置換，形成如SEQ ID NO：43所示的CDR2序列；較佳地本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體包含：選自SEQ ID NO：44-50所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29-30中任一個所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：22-28中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29-30中任一個所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：33-35中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：36-40中任一個所示的輕鏈可變區序列；較佳選自SEQ ID：24所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：33所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區序列。

在一種較佳的實施方案中，為消除抗體CDR區胺基酸位點的脫醯胺，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該CDR區的易脫醯胺化的位點可以進行胺基酸的置換，較佳CDR2中的NNG被置換；一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含；選自SEQ ID NO：51-61中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29-30所示的輕鏈可變區序列，較佳選自SEQ ID NO：51所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列；或選自SEQ ID NO：52所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為全長抗體，進一步包括人抗體恒定區，較佳SEQ ID NO：41所示的人重鏈恒定區序列和較佳SEQ ID NO：42所示的人輕鏈恒定區序列。

在一種較佳的實施方式中，本發明所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR區的肽的抗原結合片段。

本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如上所述TIM-3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發明進一步提供一種核酸分子，其編碼如上所述抗體或其抗原結合片段。

本發明進一步提供一種重組載體，其包含如上述項所述核酸分子。

本發明進一步提供一種用如上述項所述重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更較佳哺乳動物細胞。

本發明進一步提供一種用於生產如上的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括將如前述項所述宿主細胞在培養物中進行培養以形成並積累如上所述抗體或其抗原結合片段，以及從培養物回收抗體或其抗原結合片段。

本發明進一步提供一種用於免疫檢測或測定人TIM-3的方法，該方法包括使用如上所述抗體或其抗原結合片段。

本發明進一步提供一種用於檢測或測定人TIM-3的試劑，該試劑包含如上所述抗體或其抗原結合片段。

本發明進一步提供一種與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，該診斷劑包含如上所述抗體或其抗原結合片段。

本發明進一步提供一種用於診斷與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的方法，該方法包括使用如上所述任一項的抗體或其抗原結合片段檢測或測定人TIM-3或TIM-3陽性細胞。

本發明進一步提供一種如上所述抗體或其抗原結合片段在製備與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的診斷劑中的應用。

本發明進一步提供一種與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療劑，該治療劑包含如上所述抗體或其抗原結合片段，或包含上述的醫藥組成物，或包含上述述的核酸分子。

本發明進一步提供一種與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療方法，該方法包括使用如上所述抗體或其抗原結合片段，或包含上述的醫藥組成物，或上述的核酸分子誘導人TIM-3陽性細胞的細胞死亡。

本發明進一步提供如上所述抗體或其抗原結合片段，或包含上述的醫藥組成物，或上述的核酸分子在製備與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療劑中的應用。

第1圖：候選TIM-3抗體的細胞結合實驗曲線，資料顯示候選抗體mAb-1701和mAb-1799對表達抗原的細胞均具有很強的結合活性；第2A至2C圖：在混合淋巴細胞反應實驗中本發明的候選抗體和其抗原結合片段對IFNγ分泌的影響；第2A圖，h1701-009及其抗原結合片段對IFNγ分泌的影響；第2B圖，h1701-005及其抗原結合片段對IFNγ分泌的影響；第2C圖，h1701-009,h1799-005對IFNγ分泌的影響。結果顯示h1701-009、h1799-005均能夠有效刺激IFNγ的分泌；第3A至3D圖：PBMC被CD3/CD28抗體啟動。h1701-009,h1799-005，AbTIM-3對活化後PBMC細胞內IFNγ表達的影響，均不同程度提高了細胞內IFNγ陽性細胞的百分比以及IFNγ的表達；第4A至4B圖：SEB刺激PBMC5天後，h1701-009,h1799-005以及AbTIM-3均有效升高了SEB誘導的IL12和IFNγ的分泌。

一. 術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε 鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明所述抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述抗體重鏈可進一步包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從氨基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人TIM-3的單株抗體。製備時用TIM-3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，所述鼠源TIM-3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單株的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恒定區基因，將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系统或原核系统中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該TIM-3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。該TIM-3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人類抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜带大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類架構序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人類序列數據庫(在互聯網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中，該TIM-3人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：8-13或14-19；人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人類重鏈IGHV1-18*01和hjh4.1的組合序列或IGHV3-7*01和hjh4.1的組合序列；其中該抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人類輕鏈IGKV1-33*01和hjk4.1的組合序列或IGKV1-39*01和hjk2.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

CDR的移植可由於與抗原接觸的架構殘基而導致產生的TIM-3抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體架構胺基酸移植至人源化抗體的架構。來自非人TIM-3抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑑定。CDR供體架構中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的种系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分率的鼠序列的共有序列相比较。稀有架構殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。

術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，TIM-3)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由絞鏈區上的二硫橋連接的两個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

本發明的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

本發明的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼所述抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產所述Fab。

F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

本發明的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產所述F(ab')2。

Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本發明的特異性識別TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產所述Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構區域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構區域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers 等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本發明的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。

雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

本發明的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。

dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱氨酸殘基取代的多肽經由半胱氨酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱氨酸殘基取代的胺基酸殘基。

本發明的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得獲得本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。

包含CDR的肽是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。

本發明的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達所述肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。

術語“CDR”是指抗體的可可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。

本文中使用的術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作该可變結構域的抗原結合環(CDR) 的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，TIM-3分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合TIM-3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。

術語“競爭結合”是指與本發明的單株抗體識別人TIM-3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與該抗原結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的單株抗體所識別的人TIM-3的胺基酸序列的抗體。

本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起載體(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人TIM-3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞株包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞株)和NS0細胞。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人TIM-3特異性結合的抗體得到穩定的殖株。陽性的殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞株”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程式或技術。一般來說，需要獲得來自目的地區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增範本的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

此外，本發明包括用於治療與TIM-3陽性細胞相關的疾病的藥劑，該藥劑包含本發明的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。

對與TIM-3陽性細胞相關的疾病沒有限制，只要它是與表達TIM-3的細胞相關的疾病即可，例如癌症、自體免疫性疾病和過敏性疾病。

癌症包括血液癌、乳腺癌、子宮癌、結直腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、宮頸癌、小腸癌、前列腺癌和胰腺癌。癌症的較佳實例包括血液癌、食道癌、胃癌、結直腸癌、肝癌和前列腺癌。

血液癌的實例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、外周T細胞淋巴瘤(PTCL)、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、其他淋巴性白血病、NK細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤例如Burkitt淋巴瘤等等。

自體免疫性疾病的具體實例包括類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊柱炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren綜合症、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血等。

過敏性疾病的實例包括急性或慢性反應性氣道疾病、支氣管哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎、蕁麻疹、PIE綜合症、食物過敏、花粉熱、過敏性鼻、支氣管哮喘、特應性皮炎、過敏性休克等。

此外，本發明涉及用於免疫檢測或測定TIM-3的方法、用於免疫檢測或測定TIM-3的試劑、用於免疫檢測或測定表達TIM-3的細胞的方法和用於診斷與TIM-3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本發明的特異性識別人TIM-3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。

在本發明中，用於檢測或測定TIM-3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。

免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。

上述與TIM-3陽性細胞相關的疾病可以藉由用本發明的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達TIM-3的細胞來診斷。

為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。

在本發明中，對用於檢測或測定TIM-3的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達TIM-3的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。

根據所需的診斷方法，含有本發明的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別所述單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與所述標記對應的受質等。

二. 實施例與測試例

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1、TIM-3抗原及檢測用蛋白的製備

1．TIM-3抗原設計及表達

以UniProt Hepatitis A virus cellular receptor 2(人HAVCR2，人TIM-3，Uniprot號：Q8TDQ0)作為本發明TIM-3的範本，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在TIM-3蛋白基礎上融合不同的標籤，分別選殖到pHr載體上(自產)或pTargeT載體上(promega，A1410)，在293細胞瞬轉表達或CHO-S穩定表達純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。以下TIM-3抗原未特殊說明的均指人TIM-3。

TIM-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白：TIM-3-Fc(SEQ ID NO：1)，用於小鼠免疫注釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為Fc。

帶Flag標籤和His標籤的TIM-3胞外區：TIM-3-Flag-His(SEQ ID NO：2)，用於檢測TIM-3-flag-His 注釋：劃橫線部分為信號肽，斜體部分為Flag-His標籤。

全長TIM-3：用於構建TIM-3過表達細胞株TIM-3-full length(SEQ ID NO：3) 注釋：信號肽+胞外區+跨膜區+胞內區

2．TIM-3相關重組蛋白的純化，以及融合瘤抗體、重組抗體的純化

2.1 TIM-3-Flag-His重組蛋白的純化步驟：

將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用PBS平衡NI-NTA親和柱(QIAGEN，Cat No.30721)，沖洗2-5倍管柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用PBS沖洗管柱，沖洗雜蛋白，並收集。依次用洗滌緩衝液(咪唑20mM)和洗脫緩衝液(咪唑300mM)洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。

收集的洗脫液用離子交換(Hiload 16/600 superdex 200柱)進一步純化。用PBS平衡2個管柱體積左右，保證pH7.4。將鑒定含目的蛋白的elution buffer濃縮後上樣，收集樣品，SDS-PAGE和LC-MS鑒定為正確後分裝備用。

2.2 融合瘤，重組抗體，Fc融合蛋白的純化

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，融合瘤表達上清用Protein G管柱，重組抗體、Fc融合蛋白表達上清用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0洗脫目的蛋白，用 1M Tris-HCl,pH8.0中和。洗脫樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。

實施例2、抗人TIM-3單株抗體的製備

1．動物免疫

抗人TIM-3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6-8週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為帶Fc標籤的人TIM-3胞外區(SEQ ID NO：1)。

免疫方案：用QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)對小鼠進行免疫。抗原與佐劑比例為1：1，10μg/隻/次(首免/加強免疫)。抗原與佐劑迅速充分混勻後接種，接種時間為第1和第2次免疫間隔21天，之後每次免疫間隔14天。於每次免疫後7天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體效價。選擇血清中抗體效價高並且效價趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射20μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。

2．脾細胞融合

採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以4-5E5/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培養基)重懸，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5% CO₂培養3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成針尖般直。去除上清，加入200μl/well的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，37℃，5% CO₂培養3天後進行ELISA檢測。

3．融合瘤細胞篩選

根據融合瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測(見實施例4測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行TIM-3過表達細胞結合實驗(見實施例4測試例2)。蛋白結合和細胞結合均為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種和二到三次次選殖直至獲得單細胞殖株。

每次次選殖細胞均需進行TIM-3結合ELISA、細胞結合實驗檢測。藉由以上實驗篩選得到融合瘤殖株，並獲得其分泌的抗體mAb-1701和mAb-1799，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

4．融合瘤陽性殖株序列測定

從陽性融合瘤中殖株序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set (Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到mAb-1701和mAb-1799的重鏈和輕鏈可變區DNA序列對應的胺基酸序列：

mAb-1701重鏈可變區(SEQ ID NO：4)

mAb-1701輕鏈可變區(SEQ ID NO：5)

mAb-1799重鏈可變區(SEQ ID NO：6)

mAb-1799輕鏈可變區(SEQ ID NO：7)

其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表1所示。

實施例3、抗人TIM-3鼠融合瘤單株抗體的人源化

1．抗TIM-3抗體mAb-1701號的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與mAb-1701抗體同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為範本，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。

1.1 融合瘤殖株mAb-1701號人源化架構選擇

鼠源抗體mAb-1701號的人源化輕鏈範本為IGKV1-33*01和hjk4.1，人源化重鏈範本為IGHV1-18*01 和hjh4.1，人源化可變區序列如下：

h1701VH-CDR接枝物(SEQ ID NO：20)

h1701VL-CDR接枝物(SEQ ID NO：21)

注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。

1.2 h1701號的範本選擇和回復突變設計

具體突變設計見下表2：

注：如A43S表示依照Kabat編號系統，將43位點的A突變回S。已接枝代表鼠抗體CDR植入人類FR區序列。

注：該表表示各種突變組合所得的序列。如h1701-007表示，在人源化的鼠抗體h1701-007上的有輕鏈h1701_VL.1A、重鏈h1701_VH.1A兩種突變。其它類推。

1701號人源化具體序列如下：

>h1701_VH.1(同h1701VH-CDR接枝物，SEQ ID NO：22)

>h1701h1701_VH.1A(SEQ ID NO：23)

>h1701_VH.1B(SEQ ID NO：24)

>h1701_VH.1C(SEQ ID NO：25)

>h1701_VH.1D(SEQ ID NO：26)

>h1701_VH.1E(SEQ ID NO：27)

>h1701_VH.1F(SEQ ID NO：28)

>h1701_VL.1(同h1701VL-CDR接枝物，SEQ ID NO：29)

>h1701_VL.1A(SEQ ID NO：30)

2．抗TIM-3抗體mAb-1799號的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與mAb-1799號抗體同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為範本，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。

2.1 融合瘤殖株1799號人源化架構選擇

鼠源抗體1799號的人源化輕鏈範本為IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重鏈範本為IGHV3-7*01和hjh4.1，人源化可變區序列如下：

h1799VH-CDR接枝物(SEQ ID NO：31)

h1799VL-CDR接枝物(SEQ ID NO：32)

2.2 融合瘤殖株1799號的範本選擇和回復突變設計，見下表4：注：如I48V表示依照Kabat編號系統，將48位點I突變回V。已接枝代表鼠抗體CDR植入人類FR區序列。

注：該表表示各種突變組合所得的序列。如h1799-005表示，在人源化的鼠抗體h1799-005上的有輕鏈h1799_VL.1A、重鏈h1799_VH.1兩種突變。其它類推。

1799號人源化具體序列如下：

>h1799_VH.1(同h1799VH-CDR接枝物，SEQ ID NO：33)

>h1799_VH.1A(SEQ ID NO：34)

>h1799_VH.1B(SEQ ID NO：35)

>h1799_VL.1(同h1799VL-CDR接枝物，SEQ ID NO：36)

>h1799_VL.1A(SEQ ID NO：37)

>h1799_VL.1B(SEQ ID NO：38)

>h1799_VL.1C(SEQ ID NO：39)

>h1799_VL.1D(SEQ ID NO：40)

實施例4. 重組嵌合抗體以及人源化抗體的製備及效果測試

抗體選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恒定區與各可變區組合，在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其它已知的突變來增加其性能。

重鏈恒定區序列如SEQ ID NO：41所示：

輕鏈恒定區序列如SEQ ID NO：42所示：

1. 重組嵌合抗體的分子殖株

融合瘤篩選所獲得的陽性抗體分子經過測序後，得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計首尾引子，以測序基因為範本，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建重組嵌合抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr，形成Ch1701和Ch1799兩個嵌合抗體。

2. 人源化抗體的分子殖株

人源設計之後的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建人源化抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

3. 重組嵌合抗體以及人源化抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質粒以1：1.2的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

實施例5、h1701抗體的點突變

脫醯胺修飾是抗體中可能影響後期穩定性的一種常見的化學修飾，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺、氧化或者異構化修飾一般選擇儘量避免或者突變降低。根據加速穩定性實驗和電腦類比抗體結構和熱點預測，h1701抗體重鏈CDR2中的NNG是易於發生脫醯胺化的位點，上述NNG分別位於h1701抗體重鏈可變區的第54-56位點，根據胺基酸性質和電腦抗體結構類比技術，上述位點的胺基酸可以進行任意的胺基酸取代，較佳地， h1701的CDR2突變體為：DIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKD(SEQ ID NO：43)，其中X₁X₂X₃分別為h1701抗體重鏈可變區第54-56位胺基酸殘基，X₁可選自Asn、Leu、Val、Met或Glu，X₂可選自Asn、Glu、Met、His、Lys、Leu、Ala或Val，X₃可選自Gly或Ala。

進一步地，含上述第54-56位突變的CDR2與含不同回復突變的FR區可形成如下的重鏈可變區：

>h1701_VH.1-CDR2突變體(SEQ ID NO：44)

>h1701_VH.1A-CDR2突變體(SEQ ID NO：45)

>h1701_VH.1B-CDR2突變體(SEQ ID NO：46)

>h1701_VH.1C-CDR2突變體(SEQ ID NO：47)

>h1701_VH.1D-CDR2突變體(SEQ ID NO：48)

>h1701_VH.1E-CDR2突變體(SEQ ID NO：49)

>h1701_VH.1F-CDR2突變體(SEQ ID NO：50)

h1701的HCDR2突變體相關的示例性序列，及包含相應CDR2突變體的人源化序列h1701_VH.1B-CDR2突變體(SEQ ID NO：46)見以下突變體及表6。

示例性地，把h1701-009的HCDR2中的NNG設計突變為NLG、NVG、NNA、NMA、NEA、NHA、NMG、NEG、NKG、NAG、NHG(上述重鏈可變區的CDR2胺基酸突變體的序列分別如SEQ ID NO：51-61所示)，藉由分子選殖選殖的方法進行表達質粒構建和293E表達，純化後進一步檢測突變體抗體的親和力和穩定性。

其中示例性變體的親和力檢測結果分別見測試例1、3。

對h1701-009進行系列胺基酸突變具體相關序列包括，但不限於，表6所述，具體化學穩定性檢測結果見測試例9：

以下用測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。

測試例1：抗TIM-3抗體與人TIM-3過表達CHO-s細胞的結合實驗

抗TIM-3抗體的結合力藉由抗體與過表達TIM-3蛋白的CHO-S細胞的結合實驗來檢測。藉由電轉染的方法將TIM-3全長質粒(內部生產，SEQ ID NO：3)轉染進CHO-S細胞中後加壓篩選兩週後，檢測TIM-3的表達量。將過表達細胞固定於96孔板底後，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和Tim-3過表達CHO-S細胞的結合活性，具體實驗方法如下。所使用的陽性對照抗體為AbTim-3，序列來源自US20150218274A1表2，為我公司自行製備。

將細胞以4E5/ml密度，100μl/孔接種於96孔板中過夜培養。棄上清，用PBS洗三遍後，加入100μl/孔4% PFA室溫固定半小時，PBS洗三遍。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃培養箱培養2.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃培養箱培養1小時。培養結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃培養1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫培養5-15分鐘，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算TIM-3抗體對Tim-3過表達CHO-S細胞的結合EC50值。

結果表明，TIM-3抗體1701號和1799號及其人源化抗體與過表達人TIM-3全長蛋白的CHO-s細胞均有很好的結合活性。

對h1701-009抗體的HCDR2點突變抗體進行的人TIM-3過表達細胞結合活性檢測，結果見表8。

結果顯示，h1701-009抗體的HCDR2點突變抗體對過表達人TIM-3的CHO-s細胞仍顯示出很強的結合活性。

測試例2：抗TIM-3抗體分組競爭實驗

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將抗體A稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，於37℃培養箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃培養箱培養2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至20μg/ml和4μg/ml的抗體B及終濃度為0.4μg/ml的生物素標記的TIM-3-Fc蛋白(內部生產，SEQ ID NO：1)的預混液，置37℃培養箱培養1小時。培養結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板5次後，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的streptavidin(Sigma，Cat No.S2438)，37℃培養1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫培養5-10分鐘，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算不同抗體對Tim-3結合的競爭作用。

結果表明，在結合TIM-3時，mAb-1701與mAb-1799兩者之間沒有競爭關係。

測試例3：BIAcore檢測抗TIM-3抗體親和力實驗

1、鼠源抗體BIAcore親和力檢測

按照鼠抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-38，GE)說明書中所述方法將鼠抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於晶片表面流經TIM-3-His(Sino.Biol，Cat.10390-H03H)抗原，利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值。在實驗中每個循環解離完成後，用鼠抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生，結果如表10所示。

結果表明，TIM-3抗體mAb-1701號和mAb-1799號對人TIM-3蛋白有較強的結合活性和親和力。

2、嵌合抗體和人源化抗體BIAcore親和力檢測

按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中所述方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於晶片表面流經TIM-3-Flag-His(內部生產，SEQ ID NO：2)抗原，利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見下表11。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。

結果表明，本發明篩選得到的人源化抗體對人TIM-3蛋白有較強的結合活性和親和力(結果未全部示出)。

對h1701-009抗體的HCDR2點突變抗體進行的BIAcore親和力檢測，結果見表12。

結果顯示，上述h1701-009突變體仍具有很強的TIM-3親和力。在NNG位點的突變並不影響抗體與抗原的親和力。

測試例4：體外免疫細胞功能實驗

為研究抗TIM-3抗體對T淋巴細胞啟動效果，我們建立了3個體外功能實驗：混合淋巴細胞反應實驗(MLR assay)，PBMC活化實驗以及超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)刺激實驗。

1. 混合淋巴細胞反應實驗

實驗過程簡單描述如下：1)收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)；2)將PBMC以2E6 cell/ml密度種於6孔NUNC板中培養2小時；3)去除非貼壁細胞，使用GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(100ng/ml)刺激貼壁細胞5天，然後再和TNFα(100ng/ml)培養2天誘導DC細胞成熟；4)將成熟的DC細胞和不同捐獻血者的PBMC以1：5的比例混合培養在預先包被10ng/ml CD3抗體的96孔板中，同時加入不同濃度的h1701-009，h1799-005，AbTIM-3以及陰性對照Fc-IgG；5)5天後使用ELISA的方法檢測上清中的IFNγ濃度(結果如第2A圖至第2C圖所示)。

結果顯示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3均有效刺激了IFNγ的分泌，h1701-009，h1799-005則顯示出更強的刺激作用。

2. PBMC活化實驗

實驗過程簡單描述如下：1)收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)，並用CD3和CD28抗體包被96孔板，濃度均為10ng/ml；2)將PBMC以1E5 cell/孔的密度種於包被好的96孔板中。同時加入不同濃度的TIM-3抗體以及陰性對照Fc-IgG；3)6天後收集細胞進行細胞內IFNγ和TIM-3染色，利用FACS分析IFNγ陽性細胞比例(IFNγ+%)，在所有細胞上IFNγ Geo mean值，IFNγ和TIM-3雙陽性細胞比例(TIM-3+IFNγ+%)，在TIM-3+細胞上IFNγ Geo mean值(第3A圖至第3D圖)。

結果顯示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3不同程度提高了細胞內IFNγ陽性細胞的百分比以及IFNγ的表達，h1701-009，h1799-005的作用更強。

3. SEB刺激實驗

實驗過程簡單描述如下：1)收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)；2)將PBMC以1E5 cell/孔的密度種於96孔板中。同時加入1ng/ml SEB和不同濃度的TIM-3抗體以及陰性對照Fc-IgG；3)5天後收集上清用ELISA檢測IL12和IFNγ(分別見第4A圖和第4B圖)；結果顯示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3均有效升高了SEB誘導的IL12和IFNγ的分泌，h1701-009，h1799-005在低劑量時顯示出更高的優勢。

測試例5：抗TIM-3人源化抗體，h1701-009,h1799-005的大鼠PK測定

SD大鼠12隻，體重180-240g，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養期間自由攝取飼料和水，實驗室環境適應性飼養不小於3天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%。實驗開始前一天，對SD大鼠進行編號，隨機分組，每組3隻(2雄1雌)。實驗當天，兩組大鼠分別靜脈注射受試藥物h1701-009，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg；兩組大鼠分別靜脈注射受試藥物h1799-005，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg。靜脈注射體積為5ml/kg。

於給藥前及給藥後5分鐘，8h,1d,2d,4d,7d,10d,14d,21d,28d各時間點採血。每隻動物取全血0.2ml，不加抗凝劑，取血後在4℃放置30分鐘，1000g離心15分鐘，取上清置於EP管中，80℃保存。

採用ELISA方法檢測血清中的抗體濃度，採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥物動力學參數。所得主要藥物動力學參數見表13。

SD大鼠靜脈注射給予10mg/kg抗TIM-3抗體h1701-009、h1799-005後，在大鼠體內的暴露量相近；抗體h1799-005在3、10mg/kg劑量下的暴露量增長與劑量增長基本呈線性關係，抗體h1701-009在3、10mg/kg劑量下的暴露量增長略高於劑量增長倍數；抗體h1701-009，h1799-005的消除半衰期相近。

測試例6：利用DSC檢測h1701-009、h1799-005抗體的熱穩定性

比較了不同的緩衝體系不同pH條件下的熱穩定性情況，不同pH對應的示例性緩衝體系如10mM PB(pH7)，15mM His(pH6.0)，10mM Acetate(pH5.2)。將樣品置換到對應緩衝液中，控制樣品濃度在1mg/ml左右，利用MicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。檢測前，將各個樣品及空白buffer用真空脫氣器脫氣1~2分鐘。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白buffer(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH2O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑膠軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如表14所示，在幾個測試體系中h1701-009、h1799-005均表現了較好的熱穩定性。

測試例7：藉由SEC-HPLC監測樣品純度考察一定濃度條件下週期性穩定性

示例性的條件比如將樣品濃度控制在約50mg/ml，在PBS(pH7.4)體系中比較不同抗體在比如-80℃重複凍融5 次及4℃和40℃保存一個月的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC管柱檢測抗體純度，藉由一個月的考察，h1701-009、h1799-005均表現了良好的穩定性，一個月40℃加速SEC純度無明顯變化。

測試例8：抗體的化學穩定性

對h1701-009、h1799-005以及SEQ ID NO：51-55所示的h1701-009突變體進行化學穩定性檢測。

取500μg待測抗體溶於500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分別於0、14、28天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl，8M Gua-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小時，後用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的trypsin，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測分析，結果顯示h1799-005在40度條件加速一個月均未發現明顯的異構化、氧化及脫醯胺修飾，提示分子良好的化學穩定性。h1701-009檢測中發現無明顯的氧化及異構化修飾，但存在N54N55G56位點的強脫醯胺修飾，嘗試對其進行系列胺基酸突變。其中示例性突變如NLG、NVG、NMA、NEA、NNA等，體外活性驗證這些突變均不影響其生物活性，加速實驗後進行LC-MS分析顯示這些突變體均能夠有效降低脫醯胺修飾，表中所示為加速後不同突變體脫醯胺修飾比例。

雖然為了清楚的理解，已經借助於附圖和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本發明的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。

<110> 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、大陸商上海恆瑞醫藥股份有限公司

<120> TIM-3抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

<130> 780010CPCT

<160> 72

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TIM-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白

<400> 1

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶Flag標籤和His標籤的TIM-3胞外區

<400> 2

<210> 3

<211> 301

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 全長TIM-3

<400> 3

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 9

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 16

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 17

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 18

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701重鏈可變區

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701輕鏈可變區

<400> 21

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-005/h1701-006

<400> 22

<210> 23

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-007/h1701-008

<400> 23

<210> 24

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-009/h1701-010

<400> 24

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-011/h1701-012

<400> 25

<210> 26

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-013/h1701-014

<400> 26

<210> 27

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-015/h1701-016

<400> 27

<210> 28

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1701-017/h1701-018

<400> 28

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1701-005/h1701-007/h1701-009/h1701-011/h1701-013/h1701-015/h1701-017

<400> 29

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1701-006/h1701-008/h1701-010/h1701-012/h1701-014/h1701-016/h1701-018

<400> 30

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1799重鏈可變區

<400> 31

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1799輕鏈可變區

<400> 32

<210> 33

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1799-005/h1799-006/h1799-007/h1799-008/h1799-009

<400> 33

<210> 34

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1799-010/h1799-011/h1799-012/h1799-013/h1799-014

<400> 34

<210> 35

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1799-015/h1799-016/h1799-017/h1799-018/h1799-019

<400> 35

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人據化輕鏈可變區，h1799-005/h1799-010/h1799-015

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1799-006/h1799-011/h1799-016

<400> 37

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1799-007/h1799-012/h1799-017

<400> 38

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的輕鏈可變區，h1799-008/h1799-013/h1799-018

<400> 39

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1799-009/h1799-014/h1799-019

<400> 40

<210> 41

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 含Fc突變的人IgG4重鏈恆定區

<400> 41

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人kappa輕鏈恆定區

<400> 42

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701 HCDR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 43

<210> 44

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-005/h1701-006重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 44

<210> 45

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-007/h1701-008重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 45

<210> 46

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009/h1701-010重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 46

<210> 47

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-011/h1701-012重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 47

<210> 48

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-013/h1701-014重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 48

<210> 49

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-015/h1701-016重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 49

<210> 50

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-017/h1701-018重鏈可變區的CDR2突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(54)

<223> Xaa可以是Asn,Leu,Val,Met或Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> Xaa可以是Asn,Glu,Met,His,Lys,Leu,Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (56)..(56)

<223> Xaa可以是Gly或Ala

<400> 50

<210> 51

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NLG重鏈可變區

<400> 51

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NVG重鏈可變區

<400> 52

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NNA重鏈可變區

<400> 53

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NMA重鏈可變區

<400> 54

<210> 55

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NEA重鏈可變區

<400> 55

<210> 56

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NHA重鏈可變區

<400> 56

<210> 57

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NMG重鏈可變區

<400> 57

<210> 58

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NEG重鏈可變區

<400> 58

<210> 59

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NKG重鏈可變區

<400> 59

<210> 60

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NAG重鏈可變區

<400> 60

<210> 61

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NHG重鏈可變區

<400> 61

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NLG的HCDR2

<400> 62

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NVG的HCDR2

<400> 63

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NNA的HCDR2

<400> 64

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NMA的HCDR2

<400> 65

<210> 66

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009 NEA的HCDR2

<400> 66

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NHA的HCDR2

<400> 67

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NMG的HCDR2

<400> 68

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NEG的HCDR2

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NKG的HCDR2

<400> 70

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NAG的HCDR2

<400> 71

<210> 72

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1701-009NHG的HCDR2

<400> 72

Claims

一種TIM-3抗體或其抗原結合片段，其與人TIM-3的胞外區結合，選自下面(i)至(ii)中的任一種單株抗體或其抗原結合片段：(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：8、43和10胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：11、12和13胺基酸序列所示，其中該SEQ ID NO：43為DIIPX ₁X ₂X ₃GSKYNQKFKD序列，其中：其中，X ₁可選自N、L、V、M或E，X ₂可選自N、E、M、H、K、L、A或V，X ₃可選自G或A；(ii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：14、15和16胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：17、18和19胺基酸序列所示。
如申請專利範圍第1項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，選自下面(i)至(ii)中的任一種單株抗體或其抗原結合片段：(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、43和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(ii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列。
如申請專利範圍第1或2項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，選自下面(a)至(m)中的任一種單株抗體或其抗原結合片段：(a)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、9和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(b)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、62和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(c)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、63和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列； (d)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、64和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(e)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、65和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(f)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、66和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(g)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、67和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(h)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、68和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、69和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列； (j)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、70和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(k)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、71和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(l)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：8、72和10所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列；(m)單株抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗體重鏈可變區HCDR1-3區序列，和分別如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗體輕鏈可變區LCDR1-3區序列。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中所述單株抗體是重組抗體。
如申請專利範圍第4項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體的重組抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第5項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人類輕鏈和重鏈或其突變序列。
如申請專利範圍第6項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體含有SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區或其變體；所述變體是在SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸變化。
如申請專利範圍第7項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該變體是在SEQ ID NO：44或31所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1至10個胺基酸的回復突變。
如申請專利範圍第8項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該回復突變選自在SEQ ID NO：44所示的重鏈可變區上的D89E、R98T、G49A、M48I、M70L、R38K和V68A的胺基酸回復突變或在SEQ ID NO：31所示的重鏈可變區上的Q3K和R87K的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第8或9項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體包含選自SEQ ID NO：45至50中任一個所示的重鏈可變區或包含選自SEQ ID NO：34至35中任一個所示的重鏈可變區。
如申請專利範圍第6項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體含有SEQ ID NO：21或32所示的輕鏈可變區或其變體；所述變體是在SEQ ID NO：21或32所示的輕鏈可變區上具有1至10個胺基酸變化的序列。
如申請專利範圍第11項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該變體是在SEQ ID NO：21或32所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1至10個胺基酸的回復突變。
如申請專利範圍第12所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中，該回復突變選自在SEQ ID NO：21所示的輕鏈可變區上的A43S的胺基酸回復突變或在SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區上的Q3K和I48V、K45Q、A43S、T85S的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第12項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：30所示的輕鏈可變區或包含選自SEQ ID NO：37至40中任一個所示的輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至14項中任一項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含：選自SEQ ID NO：44至50中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29至30中任一個所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：22至28中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29至30中任一個所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：33至35中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：36至40中任一個所示的輕鏈可變區序列；優選選自SEQ ID：24所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列，或選自SEQ ID NO：33所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第15項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含：選自SEQ ID NO：51至61中任一個所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29至30中任一個所示的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第16項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含：選自SEQ ID NO：51所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列；或選自SEQ ID NO：52所示的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：29所示的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為全長抗體，進一步包括人抗體恒定區。
如申請專利範圍第18項中任一項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該人抗體恒定區包含SEQ ID NO：41所示的人重鏈恒定區序列和SEQ ID NO：42所示的人輕鏈恒定區序列。
申請專利範圍第1至17項中任一項所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與申請專利範圍第1至20項中任一項所述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合Tim3。
一種醫藥組成物，其含有治療有效量的根據申請專利範圍第1至21任一項所述所述的TIM-3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種重組載體，其包含根據申請專利範圍第23項所述的核酸分子。
一種用根據申請專利範圍第24項所述的重組載體轉化的宿主細胞，其係選自原核細胞和真核細胞。
如申請專利範圍第25項所述的宿主細胞，其係真核細胞。
如申請專利範圍第26項所述的宿主細胞，其係哺乳動物細胞。
一種用於生產申請專利範圍第1至21項中任一項所述之抗體或其抗原結合片段的方法，包括：將申請專利範圍第25至27項中任一項所述的宿主細胞在培養物中進行培養以形成並積累申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，以及從培養物回收所述抗體或其抗原結合片段。
一種用於免疫檢測或測定人TIM-3的方法，包括：使用申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種用於檢測或測定人TIM-3的試劑，包含：申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種用於與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，包含：根據申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
用於診斷與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的方法，包括：使用申請專利範圍第1至21中任一項所述的抗體或其抗原結合片段檢測或測定人TIM-3或TIM-3陽性細胞。
申請專利範圍第1至21項任一項所述的抗體或其抗原結合片段在製備與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的診斷劑中的應用。
一種用於與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療劑，包含：申請專利範圍第1至21項任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或包含申請專利範圍第22所述的醫藥組成物，或包含申請專利範圍第23項所述的核酸分子。
一種與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療方法，包括：使用申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，或包含申請專利範圍第22項所述的醫藥組成物，或申請專利範圍第23項所述的核酸分子誘導人TIM-3陽性細胞的細胞死亡。
一種申請專利範圍第1至21項任一項的抗體或其抗原結合片段，或包含申請專利範圍第22項所述的醫藥組成物，或申請專利範圍第23項所述的核酸分子的用途，其用在製備與人TIM-3陽性細胞相關的疾病的治療劑。