BR112019019111A2 - anticorpo de b7-h3, seu fragmento de ligação ao antígeno e seu uso médico - Google Patents
anticorpo de b7-h3, seu fragmento de ligação ao antígeno e seu uso médico Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019019111A2 BR112019019111A2 BR112019019111A BR112019019111A BR112019019111A2 BR 112019019111 A2 BR112019019111 A2 BR 112019019111A2 BR 112019019111 A BR112019019111 A BR 112019019111A BR 112019019111 A BR112019019111 A BR 112019019111A BR 112019019111 A2 BR112019019111 A2 BR 112019019111A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- binding fragment
- human
- sequences
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 121
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 138
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 133
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 39
- 102000048770 human CD276 Human genes 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 36
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 16
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100454808 Caenorhabditis elegans lgg-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000013368 capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate analysis Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 2
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100434045 Danio rerio acp7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001103581 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase RNF34 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000581125 Homo sapiens Rho-related GTP-binding protein RhoF Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000001265 Jonckheere trend test Methods 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100434047 Mus musculus Acp7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000884277 Mus musculus CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007131 hydrochloric acid regeneration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
a invenção fornece um anticorpo de b7-h3, um fragmento de ligação ao antígeno deste e seu uso médico. além disso, a presente invenção divulga uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo de b7-h3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, e a sua utilização como medicamento. em particular, a invenção divulga uma utilização de um anticorpo de b7-h3 humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença ou condição associada com a b7-h3.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO DE B7-H3, SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO E SEU USO MÉDICO.
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção refere-se ao anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, a presente invenção refere-se ainda a um anticorpo humano que compreende a região CDR do anticorpo de B7-H3, a presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, e seu uso como um reagente de diagnóstico e agente terapêutico para doenças relacionadas com B7H3.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] A resposta imune mediada por células T desempenha um papel extremamente importante no processo antitumoral do organismo, no entanto, a ativação e proliferação de células T requer não apenas o sinal de antígeno reconhecido pelo TCR, mas também o segundo sinal fornecido pelas moléculas coestimuladoras. As moléculas da família B7 pertencem à superfamília de imunoglobulina da molécula coestimuladora. Mais e mais estudos têm mostrado que as moléculas dessa família desempenham um importante papel regulador na função imune normal e no estado patológico do organismo.
[0003] B7-H3 é um membro da família B7 e pertence à proteína da transmembrana tipo I, que contém um peptídeo de sinal no terminal amino, uma região variável semelhante a imunoglobulina extracelular (IgV) e uma região constante (IgC), uma região transmembranar e uma região final citoplasmática com 45 aminoácidos (Tissue Antigens. 2007 Aug; 70(2): 96-104). Atualmente, B7-H3 envolve principalmente dois tipos de variantes de união, B7-H3a e B7-H3b. O domínio
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 20/93
2/47 extracelular de B7-H3a consiste em dois domínios de imunoglobulina de IgV-lgC (também conhecidos como 2lgB7-H3), enquanto que o domínio extracelular de B7-H3b consiste em quatro domínios de imunoglobulina de IgV-lgC-lgV-lgC (também conhecidos como 4lgB7H3).
[0004] A proteína B7-H3 não é expressa ou mal expressa em tecidos e células normais, mas altamente expressa em vários tecidos tumorais e está intimamente relacionada à progressão do tumor, sobrevida do paciente e prognóstico. Foi relatado clinicamente que a B7-H3 é superexpressa em muitos tipos de cânceres, especialmente em câncer pulmonar de não pequenas células, câncer renal, câncer epitelial do trato urinário, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário e câncer de pâncreas (Lung Cancer. 2009 Nov; 66(2): 245-249; Clin Cancer Res. 2008 Aug 15; 14(16): 5150-5157). Além disso, também foi relatado na literatura que, no câncer de próstata, o nível de expressão de B7-H3 está positivamente correlacionado com a malignidade patológica clínica (tal como volume do tumor, invasão extraprostática ou pontuação de Gleason), e também está associado com a progressão do câncer (Cancer Res. 2007 Aug 15; 67(16):7893-7900). Da mesma forma, no glioblastoma multiforme, a expressão de B7-H3 está inversamente associada à sobrevida livre de eventos e, no câncer de pâncreas, a expressão de B7-H3 está associada com a metástase linfonodal e progressão patológica. Portanto, a B7-H3 é considerada como um novo marcador tumoral e potencial alvo terapêutico.
[0005] Atualmente, existem estratégias terapêuticas específicas para o alvo B7-H3 para estudos pré-clínicos, por exemplo, anticorpos direcionados para B7-H3 de murino irão aumentar as células T positivas a CD8 infiltrativas no tumor e inibir o crescimento do tumor (Mod Pathol. 2010 Aug; 23(8): 1104-1112). Além disso, a patente WO
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 21/93
3/47
2008/066691 mostra que os anticorpos que reconhecem a variante de B7-H3 B7-H3a apresentaram um efeito antitumoral in vivo no adenocarcinoma. Em estudos clínicos, um ADC de anticorpo de B7-H3 de murino conjugado com I131 radioativo inibiu significativamente o crescimento de neuroblastoma em pacientes (J Neufooocol 97(3):40918 (2010)). No entanto, os anticorpos B7H3 atualmente em estudo são anticorpos humanizados que foram planejados através da humanização de anticorpos de murino. No entanto, os anticorpos humanizados após a imunização possuem maior imunogenicidade do que os anticorpos totalmente humanos que não contêm quaisquer componentes de anticorpo de murino. É um fator desfavorável na aplicação humana.
[0006] A tecnologia de apresentação em fagos refere-se à fusão de uma proteína ou polipeptídeo exógeno com uma proteína de revestimento de fagos, de modo a expressar uma proteína exógena na superfície do fago. A biblioteca de anticorpos bacteriófagos é uma biblioteca de anticorpos estabelecida pela combinação de tecnologia de apresentação em fagos, tecnologia de amplificação por PCR e tecnologia de expressão de proteínas.
[0007] A maior vantagem da biblioteca de anticorpos bacteriófagos é preparar o anticorpo totalmente humano através da imitação dos três processos de produção de anticorpos in vivo sem imunização in vivo. Além disso, a biblioteca de anticorpos bacteriófagos possui as seguintes vantagens: 1) A unificação do genótipo e fenótipo é alcançada; além disso, o método experimental é simples e rápido, enquanto que o método tradicional de produção de anticorpos através da tecnologia de hibridoma leva vários meses; mas, em contraste, a tecnologia de biblioteca de anticorpos leva apenas algumas semanas. 2) O produto expresso é um anticorpo totalmente humano e o seu peso molecular é pequeno, o anticorpo é principalmente expresso na
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 22/93
4/47 forma de fragmentos ativos Fab e scFv; quando comparado com o anticorpo completo, ele possui vantagens óbvias na capacidade de penetração de tecido. 3) A capacidade de triagem é grande: a tecnologia de hibridoma é utilizada para triagem entre milhares de clones, mas a tecnologia de biblioteca de anticorpos pode ser utilizada para selecionar de milhões ou mesmo centenas de milhões de moléculas; portanto, mais tipos de anticorpos serão obtidos. 4) Ampla aplicação: a utilização do sistema de expressão procariótica leva a vantagens mais óbvias na produção em grande escala (Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598-602; Immunotechnology, 2013, 48(13) 48(13):63-73).
[0008] Atualmente, patentes tais como W02008100934, WO2010096734, WO2012147713, WO2015181267, WO2016044383 etc. relataram anticorpos de B7-H3, no entanto, a maioria deles são anticorpos de murino ou anticorpos humanizados; e a maioria deles ainda está na fase clínica I e na fase de descoberta, no mercado interno ou no exterior, nenhum dos fármacos de anticorpos que direcionam a B7-H3 está disponível no mercado; portanto, é necessário desenvolver ainda mais o anticorpo de B7-H3 totalmente humano, com maior atividade, alta afinidade e alta estabilidade, para o tratamento de doenças e aplicações relacionadas.
SUMARIO DA INVENÇÃO [0009] Um objetivo da presente invenção é fornecer um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se ligue às sequências de aminoácido ou à estrutura tridimensional da região extracelular de B7-H3. Além disso, outro objetivo da presente invenção é rastrear e obter anticorpos totalmente humanos de B7-H3 antihumana altamente ativos e altamente estáveis que competem com o anticorpo monoclonal ou seus fragmentos de anticorpo.
[0010] Além disso, a presente invenção fornece um DNA que
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 23/93
5/47 codifica o anticorpo, um vetor compreendendo o DNA, um transformante obtido pela transformação do vetor, um método de produção de um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo utilizando o transformante e um reagente de diagnóstico ou agente terapêutico no qual dito anticorpo ou seu fragmento de anticorpo é útil como ingrediente ativo.
[0011] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga à B7H3 humana, em que o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é selecionado de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno dos seguintes itens de (i) a (ii):
(i) um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma ou mais sequências da região CDR selecionadas das seguintes sequências ou selecionadas das sequências de aminoácido com pelo menos 95% de identidade com o que se segue:
sequências da região variável de cadeia pesada HCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 10, 11 e 12; e sequências de aminoácido da região variável da cadeia leve LCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 13, 14 e 15;
(ii) um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma ou mais sequências da região CDR selecionadas das seguintes sequências ou selecionadas das sequências de aminoácido com pelo menos 95% de identidade com as seguintes:
sequências da região variável da cadeia pesada HCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 16, 17 e 18; e sequências da região variável da cadeia leve LCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 19, 20e21.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 24/93
6/47 [0012] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo recombinante.
[0013] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo recombinante humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
[0014] Em uma modalidade preferida, o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que as sequências estruturais (FR) de cadeia leve e as regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo recombinante humano são derivadas de uma linha germinativa humana de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente, ou sua sequência mutante.
[0015] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que o anticorpo recombinante humano compreende uma região variável da cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NQ: 6 ou 8 ou sua variante; em que a variante possui de 1 a 10 substituições de aminoácido na sequência da região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NQ: 6 ou 8.
[0016] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que o anticorpo recombinante humano compreende uma região variável da cadeia leve quanto mostrado na SEQ ID NQ: 7 ou 9 ou sua variante; em que a variante possui de 1 a 10 substituições de aminoácido na sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NQ: 7 ou 9.
[0017] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 25/93
7/47 invenção é fornecido, em que o anticorpo de B7-H3 compreende ainda uma região constante de anticorpo humano, preferivelmente o anticorpo de B7-H3 é um anticorpo de comprimento total que consiste da sequência de cadeia pesada e de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NQ: 22 e 23, respectivamente; ou um anticorpo de comprimento total que consiste da sequência de cadeia pesada e de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NQ: 22 e 26, respectivamente; ou um anticorpo de comprimento total que consiste da sequência de cadeia pesada e de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NQ: 24 e 25, respectivamente.
[0018] Em uma modalidade preferida, um anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção é fornecido, em que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada com dissulfeto (dsFv) e peptídeo contendo a CDR.
[0019] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo de B7-H3 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compete com o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito acima para a ligação à B7-H3 humana.
[0020] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, e um ou mais veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0021] A presente invenção também fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção.
[0022] A presente invenção também fornece um vetor
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 26/93
8/47 recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico como descrito acima.
[0023] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante conforme descrito acima, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em célula procariótica e célula eucariótica, preferencialmente célula eucariótica, mais preferivelmente célula de mamífero ou célula de levedura.
[0024] A presente invenção também fornece um método para produzir o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, em que o método inclui o cultivo da célula hospedeira conforme descrito acima em uma cultura para formar e acumular o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a presente invenção, e a recuperação do anticorpo acumulado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da cultura.
[0025] A presente invenção também fornece um método para imunologicamente detectar ou medir a B7-H3, em que o método compreende a utilização do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção.
[0026] A presente invenção também fornece um reagente para detecção ou medir a B7-H3 humana, em que o reagente compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno quanto descrito na presente invenção.
[0027] A presente invenção também fornece um reagente de diagnóstico para detectar doenças associadas com as células positivas para B7-H3, o reagente de diagnóstico compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção.
[0028] A presente invenção também fornece um método para o
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 27/93
9/47 diagnóstico de doenças relacionadas com as células positivas para B7-H3, o método compreende detectar ou determinar a B7-H3 ou as células positivas a B7-H3 mediante o uso do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito na presente invenção.
[0029] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece o uso do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção, para a preparação de um reagente de diagnóstico para doenças relacionadas às células positivas a B7-H3.
[0030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece ainda um agente terapêutico para o tratamento de doenças associadas às células positivas a B7-H3, o agente terapêutico compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção, ou compreende a composição farmacêutica como descrito acima, ou a molécula de ácido nucleico conforme descrito acima.
[0031] A presente invenção também fornece um método para o tratamento de doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3, o método compreende a indução da morte celular das células positivas a B7-H3 mediante o uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno conforme descrito na presente invenção, ou a composição farmacêutica como descrito acima, ou a molécula de ácido nucleico conforme descrito acima.
[0032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece ainda o uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, ou a composição farmacêutica, ou a molécula de ácido nucleico, conforme descrito na presente invenção, na preparação de agentes terapêuticos para o tratamento de doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 28/93
10/47
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0033] Figura 1: Capacidade de ligação de diferentes anticorpos ao antígeno 2lg-B7-H3 humano;
[0034] Figura 2: Capacidade de ligação de diferentes anticorpos ao antígeno 4lg-B7-H3 humano;
[0035] Figura 3: Capacidade de ligação cruzada de diferentes anticorpos ao antígeno B7-H3 de murino;
[0036] Figura 4: Capacidade de ligação de diferentes anticorpos às células U87MG;
[0037] Figura 5: Efeito endocítico de diferentes anticorpos nas células U87MG.
[0038]
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
1. TERMOS [0039] A fim de compreender mais facilmente a presente invenção, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificamente indicado em outra parte deste documento, todos os outros termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence.
[0040] Como aqui utilizado, o código de três letras e o código de uma letra para aminoácidos são como descritos em J. biol. chem, 243, p3558 (1968).
[0041] Como aqui utilizado, anticorpo refere-se à imunoglobulina, uma estrutura de cadeias de quatro peptídeos conectadas entre si por ligações de dissulfeto entre duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Diferentes regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina apresentam diferentes composições de aminoácido e ordens de ocupação, portanto, apresentam diferentes tipos de antigenicidade. Consequentemente, a imunoglobulina pode
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 29/93
11/47 ser dividida em cinco categorias, ou denominada como isótipos de imunoglobulina, isto é, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, com cadeia pesada μ, δ, γ, a e ε, respectivamente. De acordo com a sua composição de aminoácido da região de dobradiça e o número e localização das ligações de dissulfeto de cadeia pesada, o mesmo tipo de Ig pode ser dividido em diferentes subcategorias, por exemplo, IgG pode ser dividido em lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. As cadeias leves podem ser divididas em cadeias κ ou λ, devido a diferentes regiões constantes. Cada IgG entre os cinco tipos possui a cadeia κ ou λ.
[0042] Na presente invenção, a cadeia leve de anticorpo conforme aqui descrita compreende ainda uma região constante da cadeia leve, em que a região constante leve compreende uma cadeia κ, λ de ser humano ou de murino ou uma variante desta.
[0043] Na presente invenção, a cadeia pesada de anticorpo como aqui descrita compreende ainda uma região constante da cadeia pesada, em que a região constante da cadeia pesada compreende lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 de ser humano ou de murino ou uma variante desta.
[0044] A sequência de cerca de 110 aminoácidos próximos ao Nterminal das cadeias pesada e leve do anticorpo muda amplamente, conhecida como região variável (região Fv); a sequência restante de aminoácidos próximos ao C-terminal é relativamente estável, conhecida como região constante. A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões estruturais (FR) tendo sequência relativamente conservada. Três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecida como região determinante de complementaridade (CDR). Cada região variável da cadeia leve (LCVR) e cada região variável da cadeia pesada (HCVR) são compostas de três regiões CDR e quatro regiões FR, a ordem sequencial a partir do terminal de amino até o terminal de
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 30/93
12/47 carboxila é: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Três CDRs de cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três CDRs de cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a localização dos resíduos de aminoácidos da CDR nas regiões LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno nesta invenção cumprem com os critérios de numeração Kabat conhecidos (LCDR1-3, HCDR2-3) ou cumprem os critérios de numeração Kabat e Chothia (HCDR1).
[0045] Os termos anticorpo humano e anticorpo derivado de ser humano são utilizados de modo trocável e referem-se a um anticorpo que compreende uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas da sequência de imunoglobulina humana. Uma das formas preferidas é que todas as regiões variáveis e constantes sejam derivadas das sequências de imunoglobulina humana, isto é, anticorpo derivado totalmente humano ou anticorpo totalmente humano. Esses anticorpos podem ser obtidos de várias maneiras, incluindo anticorpos os obtidos utilizando a tecnologia de apresentação em fagos, incluem o isolamento de células B de PBMC humano, baço, tecido linfonodal e constroem uma biblioteca natural de anticorpos humanos bacteriófagos de fita simples única, ou através da imunização de camundongos transgênicos que expressam a cadeia leve e pesada de anticorpo humano e triagem.
[0046] O termo anticorpo de murino utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal contra a B7-H3 de ser humano preparado de acordo com o conhecimento e a habilidade na técnica. Durante a preparação, o indivíduo de teste é injetado com antígeno B7-H3 e, em seguida, os anticorpos de expressão de hibridoma tendo a sequência desejada ou as propriedades funcionais são isolados. Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo de B7-H3 de murino ou seu fragmento de ligação ao antígeno
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 31/93
13/47 compreende ainda uma região constante da cadeia leve de uma cadeia capa, lambda de murino ou uma variante desta, ou ainda compreende uma região constante da cadeia pesada de lgG1, lgG2, lgG3 de murino ou suas variantes.
[0047] O termo anticorpo quimérico é um anticorpo que é formado através da fusão da região variável de um anticorpo de murino com a região constante do anticorpo humano, de modo a aliviar a resposta imune induzida por anticorpo de murino. Para estabelecer um anticorpo quimérico, um hibridoma que secreta um anticorpo monoclonal de murino específico é estabelecido, e um gene da região variável é clonado das células de hibridoma de murino, e depois um gene da região constante desejado do anticorpo humano é clonado e conectado com os genes da região variável de murino para formar um gene quimérico que pode ser subsequentemente inserido no vetor de expressão, e finalmente a molécula de anticorpo quimérico é expressa no sistema eucariótico ou procariótico. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a cadeia leve do anticorpo quimérico de B7-H3 compreende ainda a região constante da cadeia leve derivada da cadeia capa, lambda de ser humano ou sua variante. A cadeia pesada do anticorpo quimérico de B7-H3 compreende ainda a região constante da cadeia pesada derivada de lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana ou uma variante desta, e preferivelmente compreende a região constante da cadeia pesada derivada de lgG1, lgG2 e lgG4 humana ou variante destas com mutação de aminoácido (tal como mutação YTE ou mutação reversa).
[0048] O termo anticorpo humanizado, também conhecido como anticorpo enxertado em CDR, refere-se a um anticorpo gerado através do enxerto de sequências da CDR de murino em uma estrutura de região variável de um anticorpo humano (isto é, anticorpos produzidos dentro de diferentes tipos de sequências de estrutura de anticorpo da
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 32/93
14/47 linha germinativa humana). O anticorpo humanizado supera a resposta heteróloga induzida pelo anticorpo quimérico que transporta uma grande quantidade de componentes de proteína de murino. Tais sequências estruturais podem ser obtidas de bancos de dados públicos de DNA, incluindo sequências de gene de anticorpo da linha germinativa ou referências publicadas. Por exemplo, as sequências de DNA da linha germinativa de genes da região variável de cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas em, por exemplo, banco de dados de sequência da linha germinativa humana VBase (disponível na Internet em www.mrccDe.com.ac.uk/vbase), assim como encontradas em Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition.
[0049] O enxerto de CDR pode reduzir a afinidade do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antigeno com o antigeno, devido aos resíduos estruturais que estão em contato com o antigeno. Tal interação pode ser o resultado da hipermutação em células somáticas. Portanto, ainda pode ser necessário enxertar esses aminoácidos da estrutura doadora na estrutura dos anticorpos humanizados. Os resíduos de aminoácido do anticorpo de B7-H3 não humano ou seu fragmento de ligação ao antigeno que estão envolvidos na ligação ao antigeno podem ser identificados através do exame das sequências e estruturas da região variável do anticorpo monoclonal de murino. Cada resíduo na estrutura doadora da CDR que difere da linha germinativa pode ser considerado relevante. Se a linha germinativa mais próxima não puder ser determinada, a sequência poderá ser comparada com a sequência comum de um subtipo ou a sequência do murino com alta porcentagem de similaridade. Acredita-se que os resíduos raros da estrutura são o resultado da hipermutação somática e, portanto, desempenham um papel importante na ligação.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 33/93
15/47 [0050] O termo fragmento de ligação ao antígeno ou fragmento funcional de um anticorpo refere-se a um ou mais fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, B7-H3). Foi demonstrado que os fragmentos de anticorpos de comprimento total podem ser utilizados para a função de ligação ao antígeno dos anticorpos. Exemplos dos fragmentos de ligação incluídos no termo fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo incluem: (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste do domínio VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados através de ligações de dissulfeto na região de dobradiça, (iii) fragmento Fd, que consiste do domínio VH e CH1; (iv) fragmento Fv, que consiste do domínio VH e VL de uma ramificação do anticorpo; (v) domínio único ou fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341: 544546) composto de domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) separada; ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs separadas opcionalmente ligadas por um conector sintético. Além disso, embora o domínio VL e o domínio VH do fragmento Fv sejam codificados por genes separados, eles podem ser ligados pelo conector sintético utilizando o método recombinante de tal modo que possam gerar uma única cadeia de proteína com moléculas monovalentes mediante a correlação do domínio VL e VH (chamado Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única também são destinados a serem incluídos no termo fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Tais fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas na especialidade, e a triagem funcional dos fragmentos é utilizada da mesma maneira que os anticorpos intactos. Os sítios de ligação ao antígeno podem ser produzidos por técnicas de
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 34/93
16/47
DNA recombinante ou através da interrupção enzimática ou química da imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem estar em fenótipos diferentes, por exemplo, IgG (por exemplo, subtipo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4), anticorpo lgA1, lgA2, IgD, IgE ou IgM.
[0051] Os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção incluem Fab, F(ab')2, Fab', anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada por dissulfeto (dsFv), peptídeo contendo CDR, etc.
[0052] Fab é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno, tal fragmento é obtido através do tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com protease papaína (divagem do resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H), em que cerca da metade do lado N-terminal da cadeia H e toda a cadeia L estão ligados através da ligação de dissulfeto.
[0053] O Fab da presente invenção pode ser produzido mediante o tratamento dos anticorpos monoclonais da presente invenção que reconhecem especificamente a B7-H3 humana e se ligam à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional com papaína. Além disso, o Fab pode ser produzido através da inserção de um DNA que codifica o Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariótico ou um vetor de expressão eucariótico e introdução do vetor em procariota ou eucariota para expressar o Fab.
[0054] F(ab')2 é um fragmento de anticorpo obtido pela digestão da parte inferior de duas ligações de dissulfeto na região de dobradiça de IgG com pepsina. Ele possui um peso molecular de cerca de 100.000 e atividade de ligação ao antígeno e compreende duas regiões Fab ligadas na posição de dobradiça.
[0055] O F(ab')2 da presente invenção pode ser produzido através
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 35/93
17/47 do tratamento do anticorpo monoclonal da presente invenção que especificamente reconhece a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou à sua estrutura tridimensional com pepsina. Além disso, o F(ab')2 pode ser produzido mediante a ligação do Fab' descrito abaixo com uma ligação tioéter ou uma ligação de dissulfeto.
[0056] Fab' é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno. É obtido através da divagem da ligação de dissulfeto na região de dobradiça do F(ab')2 mencionado acima. O Fab' da presente invenção pode ser produzido mediante o tratamento do F(ab')2 da presente invenção que reconhece especificamente a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácido da região extracelular ou sua estrutura tridimensional com agente redutor (tal como ditiotreitol).
[0057] Além disso, o Fab' pode ser produzido através da inserção de um DNA que codifica o fragmento Fab' do anticorpo no vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico e introdução do vetor em procariota ou eucariota para expressar o Fab'.
[0058] O termo anticorpo de cadeia única, Fv de cadeia única ou scFv refere-se a uma molécula compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (ou região; VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (ou região; VL) conectados por um conector. Tais moléculas de scFv possuem a estrutura geral: NH2VL-conector-VH-COOH ou NH2-VH-conector-VL-COOH. Os conectores adequados na técnica anterior consistem da sequência de aminoácido GGGGS repetida ou suas variantes, por exemplo, a variante tendo 1 a 4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444 -6448). Outros conectores que podem ser utilizados na presente invenção são descritos em Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 36/93
18/47 al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
[0059] O scFv da presente invenção pode ser produzido através das seguintes etapas: obtenção do cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácido da região extracelular ou sua estrutura tridimensional; construção de um DNA que codifica o scFv; inserção do DNA no vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico; e depois introdução do vetor de expressão em procariota ou eucariota para expressar dito scFv.
[0060] Um diacorpo é um fragmento de anticorpo no qual o scFv é dimerizado, e é um fragmento de anticorpo com atividade de ligação ao antígeno bivalente. Na atividade de ligação ao antígeno bivalente, os dois antígenos podem ser iguais ou diferentes.
[0061] O diacorpo da presente invenção pode ser produzido através das seguintes etapas: obtenção do cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que especificamente reconhece a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácido da região extracelular ou sua estrutura tridimensional; construção de DNA que codifica scFv de tal modo que o comprimento do peptídeo conector seja 8 ou menos resíduos de aminoácido; inserção do DNA no vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico; e depois introdução do vetor de expressão em procariota ou eucariota para expressar o diacorpo.
[0062] O dsFv é obtido através da substituição de um resíduo de aminoácido em cada um de VH e VL por um resíduo de cisteína e, depois ligação dos polipeptídeos por meio da ligação dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína. O resíduo de aminoácido a ser substituído por um resíduo de cisteína pode ser selecionado com base
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 37/93
19/47 no prognóstico da estrutura tridimensional do anticorpo de acordo com o método conhecido (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
[0063] O dsFv da presente invenção pode ser produzido através das seguintes etapas: obtenção do cDNA que codifica VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que especificamente reconhece a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácido da região extracelular ou sua estrutura tridimensional; construção do DNA de codificação de dsFv; inserção do DNA no vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico; e depois introdução do vetor de expressão em procariota ou eucariota para expressar dito dsFv.
[0064] O peptídeo contendo CDR é construído por uma ou mais regiões de CDR de VH ou VL. Os peptídeos compreendendo várias CDRs podem ser ligados diretamente ou através de um conector de peptídeo adequado.
[0065] O peptídeo contendo CDR da presente invenção pode ser produzido através das seguintes etapas: construção de DNA que codifica CDRs de VH e VL do anticorpo monoclonal da presente invenção que reconhece especificamente a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácido da região extracelular ou sua estrutura tridimensional; inserção do DNA no vetor de expressão procariótico ou vetor de expressão eucariótico; e depois introdução do vetor de expressão em procariota ou eucariota para expressar dito peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido através de métodos de síntese química tais como o método Fmoc ou o método tBoc.
[0066] O termo CDR refere-se a uma das seis regiões hipervariáveis dentro do domínio variável de um anticorpo que principalmente contribui com a ligação ao antígeno. Uma das definições mais comumente utilizadas para as seis CDRs é fornecida
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 38/93
20/47 pela Kabat E.A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. Como aqui utilizada, a definição de Kabat de CDR se aplica apenas às CDR1, CDR2 e CDR3 do domínio variável da cadeia leve (CDR L1, CDR L2, CDR L3 ou L1, L2, L3), assim como CDR2 e CDR3 do domínio variável da cadeia pesada (CDR H2, CDR H3 ou H2, H3).
[0067] O termo estrutura de anticorpo conforme aqui utilizado, refere-se a uma parte do domínio variável VL ou VH que serve como uma matriz para a alça calibrada de ligação ao antígeno (CDR) do domínio variável. Essencialmente, é um domínio variável sem CDRs.
[0068] O termo epítopo ou determinante antigênico refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente (por exemplo, um sítio específico na molécula de B7-H3). Os epítopos tipicamente incluem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos contíguos ou não contíguos em uma conformação espacial única. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
[0069] Os termos ligação específica, ligação seletiva, seletivamente se liga e especificamente se liga referem-se à ligação de um anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se a uma afinidade (KD) menor do que cerca de 10-7 M, tal como aproximadamente menor do que cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou menor.
[0070] O termo KD ou Kd refere-se à constante de equilíbrio de dissociação para a interação anticorpo-antígeno particular. Tipicamente, o anticorpo da presente invenção se liga à B7-H3 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) menor do que cerca de IO 7 M, tal como menor do que cerca de 10-8 Μ, 10-9 M ou 10-1° M ou menor, por exemplo, conforme determinado utilizando técnicas de
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 39/93
21/47 ressonância plásmon superficial (SPR) em um instrumento BIACORE.
[0071] O termo ligação competitiva refere-se em que um anticorpo reconhece e se liga ao mesmo epítopo (também conhecido como determinante antigênico) ou a uma parte deste do domínio extracelular de B7H3 humana como aquele reconhecido pelo anticorpo monoclonal da presente invenção. Um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal da presente invenção refere-se a um anticorpo que reconhece e se liga à sequência de aminoácido da B7-H3 humana reconhecida pelo anticorpo monoclonal da presente invenção.
[0072] O termo molécula de ácido nucleico conforme aqui utilizado, refere-se à molécula de DNA e à molécula de RNA. A molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou dupla, mas é preferivelmente um DNA de fita dupla. Um ácido nucleico é efetivamente ligado quando é colocado em conexão funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, se um promotor ou intensificador afeta a transcrição de uma sequência de codificação, o promotor ou intensificador é efetivamente ligado à sequência de codificação.
[0073] O termo vetor refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo que se refere a uma alça calibrada DNA circular de fita dupla na qual um segmento de DNA adicional pode ser ligado. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que o segmento de DNA adicional pode ser ligado no genoma viral. Os vetores divulgados nesta invenção são capazes de se auto-replicar na célula hospedeira na qual foram introduzidos (por exemplo, um vetor bacteriano tendo origem de replicação bacteriana e vetor mamífero epissomal) ou podem ser integrados no genoma da célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira, desse modo
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 40/93
22/47 é replicado junto com o genoma do hospedeiro (por exemplo, um vetor de mamífero não epissomal).
[0074] Os métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação a antígenos são bem conhecidos na técnica, tais como o Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Chapters 58 and 15. Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com B7-H3 humana ou um fragmento desta, e o anticorpo obtido pode ser restaurado, purificado e sequenciado através do uso do método convencional conhecido na técnica. O fragmento de ligação ao antígeno também pode ser preparado pelo método convencional. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção são geneticamente planejados para adicionar uma ou mais regiões FR humanas na região CDR não humana. As sequências da linha germinativa da FR humana podem ser obtidas pelo alinhamento do banco de dados de genes da linha germinativa do anticorpo humano e o software MOE no site da internet ImMunoGeneTics (IMGT) em http://imqt.cines.fr ou no Journal of Immunoglobulins 2001ISBN012441351.
[0075] O termo célula hospedeira refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir células bacterianas, microbianas, vegetais ou animais. As bactérias suscetíveis de serem transformadas incluem membros da família Enterobacteriaceae, tais como as cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Os microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhagens celulares hospedeiras animais adequadas incluem células de CHO (linhagem celular de ovário de hamster chinês) e NS0.
[0076] O anticorpo planejado ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser preparado e purificado por métodos
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 41/93
23/47 convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e recombinadas no vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode ser transfectado de maneira estável com células de CHO. Como uma técnica anterior mais recomendada, os sistemas de expressão de mamífero resultam na glicosilação de anticorpos, particularmente no sítio N-terminal altamente conservado na região Fe. Os clones estáveis são obtidos através da expressão de anticorpos que se ligam especificamente à B7-H3 humana. Os clones positivos são expandidos em meio livre de soro em um biorreator para produzir anticorpos. O meio de cultura contendo anticorpo secretado pode ser purificado por técnica convencional. Por exemplo, a purificação é realizada utilizando a coluna A ou G Sepharose FF que foi equilibrada com um tampão compatível. Os componentes não especificamente ligados são removidos por lavagem. O anticorpo ligado é eluído por um método de gradiente de pH e os fragmentos de anticorpo são detectados por SDS-PAGE e coletados. O anticorpo pode ser filtrado e concentrado por uma maneira convencional. O agregado solúvel e os multímeros também podem ser removidos por métodos convencionais tais como exclusão de tamanho ou troca iônica. O produto precisa ser congelado imediatamente, tal como em -70 °C, ou liofilizado.
[0077] Administração e tratamento, quando aplicados a um animal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, referem-se ao contato de um produto farmacêutico, produto terapêutico, reagente de diagnóstico ou composição exógena com o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. Administração e tratamento podem se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, pesquisas e experimentais. O tratamento de uma célula abrange o
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 42/93
24/47 contato de um reagente com a célula, assim como o contato de um reagente com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula. Administração e tratamento também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou por outra célula. Tratamento, quando aplicado a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, refere-se ao tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, aplicações de pesquisa e diagnóstico.
[0078] Tratar significa administrar um agente terapêutico, tal como uma composição compreendendo qualquer um dos compostos de ligação da presente invenção, interna ou externamente a um paciente tendo um ou mais sintomas de doença para os quais o agente possui atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas de doença no paciente ou na população tratada, de modo a induzir a regressão de tais sintomas ou impedir a progressão por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma particular da doença (também referida a quantidade terapeuticamente eficaz) pode variar de acordo com fatores como estado doentio, idade e peso do paciente e a capacidade do agente de provocar uma resposta desejada no paciente. Se um sintoma da doença foi aliviado, pode ser avaliado por qualquer medida clínica tipicamente utilizada por médicos ou outros profissionais de saúde especializados para avaliar a gravidade ou o status de progressão desse sintoma. Mesmo que uma modalidade da presente invenção (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) não seja eficaz para aliviar os sintomas da doença alvo em cada paciente, deve aliviar os sintomas da doença alvo em um número estatisticamente significativo de pacientes conforme determinado por qualquer teste estatístico
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 43/93
25/47 conhecido na técnica, tal como o teste t de Student, teste de quiquadrado, teste U de acordo com o teste de Mann and Whitney, Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.
[0079] Modificação conservadora ou substituição conservadora refere-se às substituições de aminoácidos em uma proteína por outro aminoácido tendo características semelhantes (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez da cadeia principal, etc.), de tal modo que as alterações podem ser frequentemente efetuadas sem alterar a atividade biológica da proteína. Será observado por aqueles versados na técnica que, em geral, uma única substituição de aminoácido na região não essencial do polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition)). Além disso, as substituições com aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes são improváveis de interromper a atividade biológica.
[0080] Uma quantidade eficaz inclui uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou condição de doença médica. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores tais como: a condição a ser tratada, a condição geral de saúde do paciente, a via de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou regime de dosagem que evita efeitos colaterais ou efeitos tóxicos significativos. [0081] Exógeno refere-se a uma substância que é produzida fora do organismo, célula ou ser humano, dependendo da situação. Endógeno refere-se a uma substância que é produzida em uma célula, organismo ou ser humano, dependendo da situação.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 44/93
26/47 [0082] Identidade refere-se à similaridade de sequência entre duas sequências de polinucleotídeo ou duas sequências de polipeptídeo. Quando as posições em duas sequências a serem comparadas são ocupadas pela mesma subunidade monomérica de base ou aminoácido, por exemplo, se cada posição de duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, as moléculas são consideradas homólogas nessa posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas por duas sequências divididas pelo número de posições a serem comparadas χ 100. Por exemplo, no alinhamento ideal de sequências, se houver 6 combinações ou homólogos entre 10 posições entre duas sequências, então as duas sequências são consideradas como 60% de homologia; se houver 95 correspondências ou homólogos entre 100 posições entre duas sequências, então as duas sequências serão consideradas como 95% de homologia. Em geral, uma comparação é executada quando a porcentagem máxima de identidade é obtida através do alinhamento de duas sequências.
[0083] Como aqui utilizado, as expressões célula, linhagem celular e cultura celular são utilizadas de modo trocável e todos esses termos incluem a sua progênie. Assim, as palavras transformante e célula transformada incluem células de teste primárias e culturas delas derivadas, independentemente do número de passagens. Também deve ficar entendido que toda a progênie pode não ser exatamente idêntica em termos de conteúdo de DNA devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie mutante tendo a mesma função ou atividade biológica conforme rastreada para a célula primariamente transformada é incluída. No caso de um nome diferente, fica claramente entendido a partir do contexto.
[0084] Como aqui utilizado, reação em cadeia da polimerase ou
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 45/93
27/47
PCR refere-se a um procedimento ou técnica em que pequenas quantidades da porção particular de ácido nucleico, RNA e/ou DNA são amplificadas como descrito, por exemplo, na Patente U.S. No. 4.683.195. Em geral, é necessário obter informação de sequência a partir da extremidade ou além da região alvo, assim os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados; estes iniciadores são idênticos ou semelhantes aos filamentos opostos do modelo a serem amplificados. Os nucleotídeos terminais 5' dos dois iniciadores podem ser idênticos às extremidades do material a ser amplificado. A PCR pode ser utilizada para amplificar as sequências específicas de RNA, as sequências específicas de DNA do DNA genômico total, e cDNA transcrito a partir do RNA celular total, fagos ou sequências de plasmídeo, etc. Ver de uma forma geral Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). A PCR aqui utilizada é considerada como um exemplo (mas não o único) do método de reação da polimerase de ácido nucleico para amplificação de uma amostra de teste de ácido nucleico, dito método compreende o uso de ácido nucleico conhecido como uma polimerase de iniciador e ácido nucleico para amplificar ou produzir a porção específica do ácido nucleico.
[0085] Opcional ou opcionalmente significa que o evento ou situação descrito subsequentemente pode (mas não precisa) ocorrer, isso inclui onde o evento ou a situação ocorre ou não. Por exemplo, opcionalmente compreendendo de 1 a 3 regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo significa que a região variável de cadeia pesada de anticorpo com sequência específica pode, mas não precisa, estar presente.
[0086] Composição farmacêutica significa uma mistura que compreende um ou mais compostos aqui descritos ou seu sal ou pró
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 46/93
28/47 fármaco fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, juntamente com outros componentes químicos, tais como veículo e excipiente fisiológico/farmaceuticamente aceitável. O propósito da composição farmacêutica é promover a administração ao organismo e facilitar a absorção do ingrediente ativo e assim exercer uma atividade biológica. [0087] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para imunologicamente detectar ou determinar a B7-H3, um reagente para imunologicamente detectar ou determinar a B7-H3, um método para imunologicamente detectar ou determinar as células que expressam B7-H3 e um reagente de diagnóstico para o diagnóstico da doença relacionada com as células positivas para B7-H3, compreendendo o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo da presente invenção que reconhece especificamente a B7-H3 humana e se liga à sequência de aminoácidos da região extracelular ou sua estrutura tridimensional, como um ingrediente ativo.
[0088] Na presente invenção, o método para detectar ou determinar a quantidade de B7-H3 pode ser qualquer método conhecido. Por exemplo, inclui imunodetecção ou ensaio.
[0089] A imunodetecção ou ensaio é um método para detectar ou determinar a quantidade de anticorpo ou antígeno através do uso de antígeno ou anticorpo marcado. Exemplos de imunodetecção ou ensaio incluem o método de anticorpo imunológico marcado com substância radioativa (RIA), imunoensaio enzimático (EIA ou ELISA), imunoensaio fluorescente (FIA), imunoensaio luminescente, método western blotting, métodos físico-químicos, etc.
[0090] As doenças acima mencionadas relacionadas com as células positivas para B7-H3 podem ser diagnosticadas através da detecção ou determinação de células que expressam a B7-H3 mediante o uso dos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de anticorpo da presente invenção.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 47/93
29/47 [0091] A fim de detectar células que expressam o polipeptídeo, uma imunodetecção conhecida pode ser utilizada, e preferivelmente a imunoprecipitação, coloração de células fluorescentes ou coloração imuno-histoquímica etc. pode ser utilizada. Além disso, um método de coloração de anticorpos fluorescentes, etc., utilizando o sistema FMAT8100HTS (Applied Biosystem) pode ser utilizado.
[0092] Na presente invenção, uma amostra viva para detectar ou determinar a B7-H3 não é particularmente limitada, contanto que ela tenha a possibilidade de incluir células que expressam B7-H3, tais como células de tecido, sangue, plasma, soro, líquido pancreático, urina, fezes, fluido de tecido ou fluido de cultura.
[0093] O reagente de diagnóstico contendo o anticorpo monoclonal ou o seu fragmento de anticorpo da presente invenção pode ainda conter um reagente para executar a reação antígenoanticorpo ou um reagente para detectar a reação, dependendo do método de diagnóstico desejado. O reagente para executar a reação antígeno-anticorpo inclui tampões, sais e similares. O reagente para detecção inclui reagentes comumente usados em imunodetecção ou medição, tais como anticorpos secundários marcados que reconhecem os anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos ou conjugados destes, substratos correspondentes aos marcadores, etc.
[0094] A presente invenção também se refere ao método de tratamento de doenças relacionadas às células humanas positivas a B7-H3, particularmente no tratamento de câncer e inflamação.
2· EXEMPLOS E EXEMPLOS DE [0095] A presente invenção é ainda descrita abaixo em conjunto com o exemplo, no entanto, o escopo da presente invenção não está limitado a isso. Nos exemplos da presente invenção, onde as condições específicas não são descritas, o experimental é geralmente conduzido sob condições convencionais conforme descrito em Cold
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 48/93
30/47
Spring Harbor Antibody Technology Laboratory Manual, Molecular Cloning Manual, ou sob as condições recomendadas pelo fabricante da matéria-prima ou produtos. Onde a fonte dos reagentes não é fornecida especificamente, os reagentes são reagentes convencionais comercialmente disponíveis.
Exemplo 1. Preparação do antigeno e proteína B7-H3 para detecção Projeto do antigeno B7-H3 [0096] A B7-H3 humana conforme mostrada na SEQ ID NQ: 1, foi utilizada como o modelo para B7-H3 da presente invenção, e a sequência de aminoácido do antigeno e da proteína para detecção envolvida na presente invenção foi projetada. A não ser que de outra maneira especificada, o seguinte antigeno B7-H3 é a B7-H3 humana.
[0097] Proteína humana de comprimento total B7-H3: B7-H3 (SEQ
ID NQ: 1):
A1LRW^l^llGyHYGAALG.ALAhLL.lUÀÍ..lAm.PEDf>\.yALU?IDArLC.(.SrS kí\\ttsu\h\togi rnxusu rv\uux
SFEPGFsSl χη IWQÍ WTKOLVTISrTnGRrXKtS.AYANKTALFPhl íM QRVR\ MM Í.M < I \ MRIMGRX QA \ tf’WRMH f PXkGI RPGDU I ilXM.lYRYB.WÜÍ)AHGSYUH^XMH.RtI- U Άx IV4%Cli\ d u\ [0098] Observação:
[0099] A parte com sublinhado duplo é o peptídeo sinal (Peptídeo sinal: 1-28);
[00100] A porção sublinhada é o domínio extracelular de B7-H3 (domínio extracelular: 29-466), em que 29-139 é o domínio do tipo V 1 semelhante a Ig, e 145-238 é o domínio do tipo C2 1 semelhante a Ig; 243-357 é o domínio do tipo V 2 semelhante a Ig, 363-456 é o domínio do tipo C2 2 semelhante a Ig;
[00101] A parte sinalizada por pontos é a parte do domínio da
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 49/93
31/47 transmembrana (domínio da transmembrana: 467-487);
[00102] A parte em itálico é o domínio intracelular (domínio citoplasmático: 488-534).
[00103] Sequência de aminoácido total B7-H3 de murino (SEQ ID NQ: 2)
1A C\ Rl AUA Llü Llü xpmFS.L.W.l..XUK.QI..m m\j KAüVkÀ ci ΙΛ Άλ IJ5QV πη hm! r\ \ r G VvGTYSCI. \K\T\T.QQb \HGS\ ΤΠϊ/QPlTFFPFAt \\ H úl s\í J V \ ϊ 1 V M.'VA * fAs<> / L v * 4/ / w / A>> t <\U Uí Á/’S ·> \ Á? / VX* A [00104] Observação:
[00105] A parte com sublinhado duplo é o peptideo sinal (peptideo sinal: 1-28);
[00106] A parte sublinhada é o domínio extracelular de B7-H3 (domínio extracelular: 29-248), em que 29-139 é o domínio do tipo V semelhante a Ig e 145-238 é o domínio do tipo C2 semelhante a Ig;
[00107] A parte sinalizada por pontos é a parte do domínio da transmembrana (domínio da transmembrana: 249-269);
[00108] A parte em itálico é o domínio intracelular (domínio citoplasmático: 270-316).
[00109] O antígeno B7-H3 humano (SEQ ID NQ: 3) utilizado para triagem e detecção é um produto comercial (R&D cat# 1949-B3050/CF, abreviado como 2lg-B7-H3) e a sequência é como se segue:
L) ΑΡΥΡΥΡΟΛ ALYAPYAP QA* APlMJAP* JPJRQLY MM PJJ
ADM/AVf 55MÀLLIW AQGXAYl RJJJKYBAAPIAAF HT YSLRPIGSX \ Y S
I OV \ MA SkPSM ί 1 LPNRDi RPGOI VH FÇXSY \ FApAGCX API I (.
AYJJMAAL/ALLAAOIA^ [00110] Observação: A parte sublinhada é a região extracelular de B7-H3; a parte em itálico é o marcador His-tag.
[00111] O antígeno B7-H3 humano (SEQ ID NQ: 4) utilizado para detecção é um produto comercial (SinoBiological cat # 11188-H08H,
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 50/93
32/47 abreviado como 4lg-B7-H3), e a sequência é como se segue:
I Çk \ \FX SKPW1 f FPXKÍiJ RPi d)J k í1 rCX’sYQMVH u \ í wXtPGQijVEI TG XV j [SQMAM LX1I HUHSn R\M GV^h'4'i XRNPM WDWSS\ Η ΗΌΚ ^ΗΑ\Ι\Ο\ΙΉ)Ρ\\ MUGPUIk'WH’GIM \O! MAU); imKlUH IH'RPQOS^ ANRLV j ppij WX Vrt RUMS RA KTAWILÇjS \ u ^iaa xAiri $kp>m í apxMorvD iuií <>$> ρω pl μλ wq^gq^v PE k.AA I ÍMJMXM «?U H)X ΗΧ\ I PX \ HrVM.i t¥>O \ R\p\ I ^li \Ht.UV Π IkYPMI W,v ”ZJkZ [00112] Observação: A parte sublinhada é a região extracelular de B7-H3; a parte em itálico é o marcador His-tag.
[00113] O antígeno B7-H3 de murino (SEQ ID NQ: 5) utilizado para triagem e detecção é um produto comercial (R&D cat# 1397-B3050/CF) e a sequência é como se segue:
VbA’QV^nn V \LVDJ.O\H Κ^Χί'^ΡΡΡΐϊίΑί AQ.l M lUQ! H)IKQ1 \ HXHf vxioyiiH yu $i φ U:AkMX\qin'UiMR‘\i\V\ IHÍ ’ΛχΗΑΡί: \E k ΓΑ ?1 1UX
VIWAlAXLRbí HH Hs\ ( R\ \ (ví Wv U x( l k KMM QQPMlG>\ HUUU w-www [00114] Observação: A parte sublinhada é a região extracelular de B7-H3; a parte em itálico é o marcador His-tag.
Exemplo 2. Triagem das sequências positivas para ligação específica à B7-H3 humana [00115] As células B foram isoladas a partir de tecidos humanos de PBMC, baço e linfonodo, e o RNA foi extraído para construir uma biblioteca de anticorpos bacteriófagos fago scFv passível (capacidade 3,2 x 101°). A biblioteca de anticorpos bacteriófagos scFv passível construída foi acondicionada para formar partículas de bacteriófagos, e depois submetida à extração pelo método da fase líquida. O bacteriófago foi ligado à B7-H3 biotinilada na fase líquida e depois foi separado por esferas magnéticas de estreptavidina. Para obter as sequências positivas que se ligam à B7-H3 humana (R&D cat# 1949
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 51/93
33/47
B3-050/CF), a B7-H3 humana biotinilada foi utilizada para extração e 500 colônias monoclonais foram coletadas e acondicionadas em anticorpos scFv bacteriófagos para teste ELISA de fagos. A atividade de ligação do bacteriófago monoclonal à B7-H3 humana (R&D cat# 1949-B3-050/CF) e B7-H3 de murino (R&D cat# 1397-B3-050/CF) foi testada separadamente: 1 pg/ml de B7-H3 humana ou B7-H3 de murino e BSA a 1% foi revestido na placa de ELISA, o sobrenadante de bacteriófago diluído em 1:1 com tampão de bloqueio foi adicionado e detectado com HRP anti-M13; os clones com valor de ELISA OD450 de mais do que 0,5 e com relações de valores de ELISA OD450 para ligação com B7-H3 humana ou de murino para o valor de ELISA OD450 para ligação com BSA a 1% maior que 2,0 foram selecionados, e 9 clones foram obtidos.
Exemplo 3· Construção de anticorpos monoclonais de comprimento total [00116] Os anticorpos de comprimento total foram construídos para esses 9 clones obtidos pela triagem da biblioteca de fagos, e depois dois anticorpos (h1702 e h1703, respectivamente) foram confirmados de ter forte afinidade pelo ensaio de ligação ELISA. O processo de construção de anticorpo monoclonal de comprimento total foi como se segue:
Com base nas sequências de anticorpos scFv obtidas pela triagem de fase, os iniciadores foram projetados para construir o fragmento do gene VH/VK/VL de cada sequência de anticorpos de cadeia única por PCR. As regiões variáveis de cadeia pesada e leve de h1702 e h1703 foram obtidas.
> sequência da região variável da cadeia pesada de h1702 {Η V/ VCMR v VíW <’/ W 4 1 Z '4 1 UISVpU.S
SEQ1D N0Í Á
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 52/93
34/47 > sequência da região variável da cadeia leve de h1702 jvrmvusgsvsfshypohtc>cu u> imwrtiw
SEQ II.) NOí 7 > sequência da região variável da cadeia pesada de h1703 (7 Q) \’í j<s< í V íjí <Ι<i ÀV M t 4Wt.HSW.W*’< it t .kG) / U i 4
W} 'Ί '1 nww M /7 ti} h WWWAJXIWQW'U<r
VW
SEQ ID NO,í .§:
> sequência da região variável da cadeia leve de h1703 \Λ/ ΜΛυΗ./MFn ÍM/7A <Eí HD N(b c) [00117] Observação: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3FR4, os itálicos na sequência são sequências FR e as sequências de CDR estão sublinhadas.
[00118] As sequências de CDR na cadeia leve e cadeia pesada de cada anticorpo são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Regiões CDR de cada cadeia pesada e leve
| Anticorpo | HC | LC | ||
| 1702 | HCDR1 | GFIFSSSA SEQÍDN0! 10 | LCDR1 | SGSVSTSHY SFQ II) NO; □ |
| HCDR2 | ISYDGSNK SEQ ID NO: 11 | LCDR2 | NTN SEQIDNO: 14 | |
| HCDR3 | ARSARLYASFDY SEQ ID NO: 12 | LCDR3 | AJHVDRDIWV SEQ ID NO: 15 | |
| 1703 | HCDR1 | GFTFSSYA SEQ ID NO: 16 | LCDR1 | QS.ISTY SEQ1DNO: 19; |
| HCDR2 | ISGSGGST SEQ ID NO: 17 | LCDR2 | ws SEQlDNOí 20 | |
| HCDR3 | AKGVuPVHAmy SEOiDNO.; ir | LCDR3 | QQSYSTPMWT SEQ ID NO: 21 |
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 53/93
35/47 [00119] A região variável do anticorpo foi então recombinada de forma homóloga com o fragmento do gene da região constante (CH1FC/CL) para construir o anticorpo completo VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL. [00120] As sequências de anticorpos completos construídos h1702lgG1, h1703-lgG1 são as seguintes:
h1702-lgG1:
sequência de aminoácido de cadeia pesada de h1702-lgG1: (SEQ ID NQ: 22) ih. Hi kMíi lí S\S Kl X R<í X}S 444 I \\ ixxxnsikgri nsRDxskXHM qxix-m r. \{ L»; v.\u xrsχκη \ M \ FX JKX MR XPRSkSI MRd X XUH JA kl>’> I Pl ΡΛ I X sXXXm, XI Kl 1 1 YSf.SSX vr\ pxxxs GívTVk XX XWJ «Χ’ΠΛ
OSSXS^kSI nkíHií. m Ι·Μ»Η J GUFSXH H'HUkOII XÍHfVPrX sHrnr^xxTxxvx vkatvhx xKTKrRrrox^sTXTVYsx * n híofkvi xck~ X kl ΚΧΆ'Κ XI PUÍ1 KÍXK X<í.r>PR'K\A X riPMIk I ’< i VKUX ?SOÍ Ά1 XX t xV <ψ| xxx'k ΠΧΦΧ 1 »Μ i t X MJ ] \ 1
ΜΜΕΑΙΗΜΠ FQKM Si SK..K sequência de aminoácido de cadeia leve de h1702: Lamada (SEQ ID NQ: 23)
QIX X 1QFW Π Vol M’FXf! IX
NTXTRSSGXPDKFSGSH GNK AAITITG \Q.XDDE8D¥X'C.xnr\T)RDIXX XFGGGT xl IX l GOVK WF J P^SSl HHXXKUm > IsAPíP^XXH VÀKXGGMAK ÂGVETTOSKQSNNKYÁ ASSYLSUTPEQWKSHR S¥ SCQVTOEGSTVÊrmFrE CS h1703-lgG1:
sequência de aminoácido de cadeia pesada de h1703-lgG1: (SEQ ID NQ: 24) ríFS^LGGLV^PGGSLRLSCAASGFTFSSVAMSWVTlQAPGKGLEWVS· XiXGxt »kíXIX X xnSVKGRVTiSRDNSKΝΊ 1YL.QMNSLRAFOTAVVYCXKLAW VHXI í>\XXt «MUI rV'tVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGFÀALGCLVKDYF.FEFV IVXXWSUU ΓΜΑ H iH’ W 1 M^SGI X SI .^X\ I VPSAM iCXWHKPXXf KV DkkX í ,VKSt OK I. I rCPH'PAPl 11 {1GPSX 11 ΗΨΚΡΚΠ11 MISÍG P[ \ rcx vx ΠΧ SHHIR X Kí NXX'X VfKjVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVX'SVL7Vi.,HQGV%I X GM X Kl KXSXX-M AXIMI kHSK XkGQPRi PQX ΥΠ ÍTMUM Ϊ íkXQX M IU..XK GPM’SGI \νΐ’\\ΙΡΜΚ?ΡΙ'ΧΧ\ΚΙ IPPX I l>M>GM Μ X sKI I X 1 >KMCAGQGX\K C < VMHL Alt IXH YTOK SL SLSPí
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 54/93
36/47 sequência de aminoácido de cadeia leve de h1703: Capa (SEQ ID NQ: 25)
SASXGDPA U k'R I WA OQKFGk MJH
I QSu\ PSRFSGSGSGIHFH 1 Π S LQPF DF A rVYCQOSV SI PMWIKWKVH.IK AAPSVFIFPPSDFQÍ.KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK\IDNALQSGNSQF S\ I cQDSKDSTVSl SS fl FLSK ADYEkHKVVACEVI HQGÍ.SSPVTKSFNRGFC [00121] A fim de melhorar ainda mais a estabilidade do anticorpo, os aminoácidos da sequência de cadeia leve de h1702 foram submetidos à mutação, em que a mutação específica envolve que o primeiro resíduo de aminoácido Q no N-terminal da cadeia leve tenha sido substituído por D, o primeiro resíduo de aminoácido S no Cterminal tenha sido eliminado, de modo a obter um anticorpo monoclonal mais estável e uniforme.
sequência de aminoácido de cadeia leve de h 1702-1 com modificação de mutação: (SEQ ID NQ: 26)
DI\VWS! SVSMuFVrtlCGLSSGSX SF$HY1'$W\QQHWVlLMin NÍXfRSSGVFrKÍ sdSH GXk \ HDAQ XDW'SDV'i C DRDíW \ HUd Kl ϊ \ I GQPK 11 HTnS! f 1 ç k\K Μ1 \ ί I KDÍ \ PGXX 1 \ K \s K AGVW TKPSKQSNNKYAASSYl SLTPFGVVKSHRSYSGQVTHEGSI VFK Ϊ VAPR c
Exemplo 4. Expressão e purificação de anticorpos totalmente humanos [00122] Os plasmídeos que expressam a cadeia leve e pesada do anticorpo, respectivamente, foram transfectados para dentro de células HEK293E em uma relação de 1,5:1, e o sobrenadante da cultura celular foi coletado 6 dias depois, e os resíduos celulares foram removidos por centrifugação em alta velocidade e a purificação foi executada através de uma coluna de proteína A. A coluna foi lavada com PBS até que a leitura de A280 caísse para o valor de referência. A proteína alvo foi eluída com um eluente acídico de pH 3,0 a pH 3,5 e neutralizada com Tris-HCI 1 M, pH 8,0 a 9,0. A amostra eluída foi apropriadamente concentrada e mais adiante purificada por cromatografia em gel Superdex 200 (GE) que foi equilibrada por PBS
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 55/93
37/47 para remover o agregado. O máximo de monômero foi coletado e dividido em alíquotas para uso.
O desempenho e o efeito benéfico dos anticorpos da presente invenção foram testados pelos seguintes métodos de teste:
Exemplo de teste 1. Ensaio de ligação ELISA [00123] Para testar a capacidade de ligação dos anticorpos de B7H3 submetidos a triagem em diferentes formas de B7-H3 humana in vitro, 2lg-B7-H3 humana (Cat.#1949-B3-050/CF, R&D) e 4lg-B7-H3 humana (Cat# 11188-H08H, Sino Biological) foram utilizadas para ensaios de ligação in vitro.
[00124] A proteína B7-H3 humana (2lg/4lg) foi diluída para uma concentração de 1 pg/ml com tampão de PBS, pH 7,4 (Sigma, P4417100TAB) e adicionada a uma placa Elisa de 96 reservatórios em um volume de 100 μΙ/reservatório (Corning, CLS3590-100 EA) e colocada a 4°C durante a noite, por 16 a 20 horas. Após descartar o líquido, uma solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (leite em pó desnatado GuangMing) diluída com tampão PBST (pH 7,4 PBS contendo Tween-20 0,05%) foi adicionada em 120 μΙ/reservatório, e a mistura foi incubada a 37°C durante duas horas para bloqueio. No final do bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com tampão PBST. Depois, 100 μΙ/reservatório dos anticorpos de B7-H3 correspondentes com diluição em série foram adicionados. A concentração inicial foi de 1 μΜ, depois diluída com tampão PBST para 8 gradientes e incubada a 37°C durante uma hora na incubadora. Após a incubação, a solução da reação na placa foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com PBST. Anticorpo secundário específico do fragmento Fey de IgG anti-humana marcado com HRP (Jackson Immuno Research, 109-005-008) diluído com PBST (1:4000) foi adicionado em 100 μΙ/reservatório e incubado durante uma hora a 37°C. Após lavagem da placa 4 vezes com PBST, o substrato
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 56/93
38/47 cromogênico TMB (KPL, 52-00-03) foi adicionado em 100 μΙ/reservatório, incubado durante 3 a 5 minutos na temperatura ambiente e H2SO4 1 M foi adicionado em 100 μΙ/reservatório para interromper a reação. O valor da absorbância foi lido utilizando a leitora de microplacas NOVOStar em 450 nm e 0 valor de EC50 para a ligação entre 0 anticorpo e 0 antígeno foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 2, Figura 1 e Figura 2.
Tabela 2. A capacidade de ligação de diferentes anticorpos ao antígeno humano 2lg-B7-H3 e 4lg-B7-H3
| EC50 | 2lg-B7-H3 humana (nM) | 4lg-B7-H3 humana (nM) |
| h1702 | 0,11 | 0,16 |
| h1703 | 10,28 | 2,10 |
[00125] Os resultados mostram que h1702 e h1703 possuem capacidade de ligação significativa a 2lg-B7-H3 e 4lg-B7-H3 humanas, e 0 h1702 possui capacidade de ligação mais forte.
Exemplo de teste 2. Ensaio de ligação cruzada com B7-H3 derivada de diferentes espécies [00126] Para testar a capacidade de ligação dos anticorpos de B7H3 submetidos a triagem à B7-H3 derivada de diferentes espécies in vitro, a B7-H3 de murino (Cat. #1397-B3-050/CF, R&D) foi utilizada para ensaios de ligação in vitro.
[00127] A proteína B7-H3 derivada de diferentes espécies (B7-H3 de camundongo) foi diluída para uma concentração de 1 pg/ml com tampão de PBS, pH 7,4 (Sigma, P4417-100TAB), adicionada a uma placa de microtitulação de 96 reservatórios com um volume de 100 μΙ/reservatório (Corning, CLS3590-100 EA) e colocados a 4°C durante a noite por 16 a 20 horas. Após descartar 0 líquido, uma solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (leite em pó desnatado GuangMing) diluída com tampão PBST (pH 7,4 PBS contendo Tween-20 0,05%) foi
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 57/93
39/47 adicionada em 120 μΙ/reservatório, e a mistura foi incubada a 37°C durante duas horas para bloqueio. No final do bloqueio, a solução de bloqueio foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com tampão PBST. Depois, 100 μΙ/reservatório dos anticorpos de B7-H3 correspondentes em uma concentração inicial de 1 μΜ foram adicionados, diluídos com tampão PBST em 8 gradientes e incubados a 37°C durante uma hora na incubadora. Após a incubação, a solução da reação na placa foi descartada e a placa foi lavada 4 vezes com PBST e anticorpo secundário específico do fragmento Fey de IgG antihumana de cabra marcado com HRP (Jackson Immuno Research, 109-005-008) diluído com PBST (1:4000) foi adicionado em 100 μΙ/reservatório, incubado durante uma hora a 37°C. Após a lavagem da placa 4 vezes com PBST, o substrato cromogênico TMB (KPL, 52-0003) foi adicionado a 100 μΙ/reservatório, incubado durante 3 a 5 minutos na temperatura ambiente e H2SO4 1 M foi adicionado a 100 μΙ/reservatório para interromper a reação, 0 valor da absorbância foi lido utilizando a leitora de microplacas NOVOStar em 450 nm, 0 valor de EC50 para a ligação entre 0 anticorpo e 0 antígeno foi calculado (os resultados são mostrados na Tabela 3 e na Figura 3).
Tabela 3. A capacidade de ligação de diferentes anticorpos ao antígeno B7-H3 de murino
| EC50 | B7-H3 de murino (nM) |
| h1702 | 18,12 |
| h1703 | 86,68 |
[00128] Os resultados mostraram que a capacidade de ligação de h1702 e h1703 à B7-H3 de murino foi fraca, indicando que dois anticorpos monoclonais se ligam especificamente à B7-H3 humana. Exemplo de teste 3· Teste de Biacore para afinidade de anticorpos [00129] A afinidade de reação de anticorpos anti-B7-H3 para B7-H3
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 58/93
40/47 humana e de murino foi determinada utilizando um instrumento Biacore, GE.
[00130] Um chip biossensor Protein A (Cat. # 29127556, GE) foi utilizado para capturar por afinidade uma certa quantidade de anticorpo a ser testado. Uma série diluída de antígeno 2lg-B7-H3 humano (Cat. #1949- B3-050/CF, R&D), antígeno 4lg-B7-H3 humano (Cat. #11188-H08H, Sino Biological) ou antígeno B7-H3 de murino (Cat. # 1397-B3-050/CF, R&D) foi circulada através da superfície do chip. O sinal de reação em tempo real foi detectado através do uso do instrumento Biacore (Biacore T200, GE), a fim de obter as curvas de associação e dissociação. Após a conclusão de cada ciclo de dissociação, o biochip foi lavado e regenerado com solução de regeneração de glicina-ácido clorídrico (pH 1,5) (Cat. #BR-1003-54, GE). O tampão utilizado na experiência foi solução de tampão HBS-EP (pH 7,4) (Cat. # BR-1001-88, GE).
[00131] Os dados experimentais foram ajustados com o software GE versão 4.1 de avaliação BIA em um modelo Langmuir (1:1) para obter valores de afinidade. Os resultados experimentais são mostrados nas Tabelas 4 a 6.
Tabela 4. A afinidade da reação de diferentes anticorpos ao antígeno 2lg-B7-H3 humano
| Anticorpo | Antígeno | Afinidade (M) |
| h1702 | 2lg-B7-H3 humana | 7.97E-7 |
| h1703 | 4.48E-7 |
Tabela 5. A afinidade de reação de diferentes anticorpos ao antígeno 4lg-B7-H3 humano
| Anticorpo | Antígeno | Afinidade (M) |
| h1702 | 4lg-B7-H3 humana | 8.55E-9 |
| h1703 | - |
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 59/93
41/47
Tabela 6. A afinidade da reação de diferentes anticorpos ao antígeno
B7-H3 de murino
| Anticorpo | Antígeno | Afinidade (M) |
| h1702 | B7-H3 de murino | 1.47E-6 |
| h1703 | 5.02E-7 |
[00132] Os resultados de afinidade do teste Biacore mostram que o h1702 possui forte afinidade com a 4lg-B7-H3 humana, atingindo um nível em nM, enquanto a afinidade com a 2lg-B7-H3 humana ou a B7H3 de murino é relativamente mais fraca; o h1703 possui uma afinidade mais fraca com a 4lg-B7-H3 humana, a 2lg-B7-H3 humana e a B7-H3 de murino.
Exemplo de teste 4. Ensaio de ligação celular in vitro [00133] Nesta experiência, a ligação do anticorpo foi avaliada com base na intensidade do sinal de fluorescência da ligação de anticorpo na superfície celular. Após a incubação de 10 pg de anticorpo primário com 2 x 105 células U87MG em gelo durante 30 minutos, o excesso de anticorpo foi removido por lavagem. As células foram incubadas com APC anti-human IgG Fc (Biolegend, 409306) durante 30 minutos na temperatura ambiente, e após a remoção do excesso de anticorpo, o sinal de fluorescência na superfície da célula foi lido utilizando BD Verse (os resultados foram mostrados na Figura 4). Os resultados indicam que o h1702 se liga especificamente na célula tumoral U87MG, que superexpressa a B7-H3.
Exemplo de teste 5· Teste de endocitose in vitro [00134] Nesta experiência, o efeito de endocitose do anticorpo foi avaliado com base na intensidade do sinal de fluorescência que foi determinado do anticorpo internalizado. O anticorpo de B7-H3 e o APC anti-human IgG Fc (Biolegend, 409306) foram misturados em uma relação molar de 1:2 e incubados em gelo durante 15 minutos. Após a
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 60/93
42/47 incubação da mistura de anticorpos com 2 χ 105 células U87MG em gelo durante 30 minutos, o excesso de anticorpo foi removido por lavagem, e depois as células foram transferidas para um meio préaquecido a 37°C e incubadas a 37°C durante 0, 15, 30, 60 e 120 minutos, respectivamente. As células foram centrifugadas e colocadas novamente em suspensão no tampão de eluição de anticorpo para livrar-se dos anticorpos. Após a incubação durante 7 minutos na temperatura ambiente, o tampão de eluição de anticorpo foi removido por lavagem, e o sinal de fluorescência intracelular foi lido utilizando BD Verse (resultados mostrados na Figura 5). Os resultados mostram que tanto o h1702 quanto o h1703 foram submetidos a endocitose de maneira eficiente nas células após a ligação à célula U87MG.
Exemplo de teste 6· Avaliação de T1/2 em ratos SD [00135] 4 ratos SD (adquiridos da JSJ Experimental Animal Co.,
Ltd.), 2 machos e 2 fêmeas, foram mantidos em ciclo claro/escuro ajustados em 12/12 horas, com temperatura constante de 24 ± 3°C, umidade de 50 a 60% e acesso livre a alimentos e água. No dia do experimento, os ratos SD foram injetados com o agente de teste na veia da cauda na dose de 3 mg/kg e volume de injeção de 5 ml/kg.
[00136] O momento da coleta de sangue: No primeiro dia de administração, o sangue foi coletado da veia do fundo ocular em 5 min, 8 h, 24 h, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 8 dias e 15 dias após a administração, 200 pl de cada vez (equivalente a 100 μΙ de soro); As amostras de sangue coletadas foram deixadas em temperatura ambiente durante meia hora até a coagulação e depois centrifugadas a 10.000 χ g durante 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e imediatamente armazenado a -80°C. A concentração de anticorpo de B7-H3 no soro foi medida por ELISA, e a análise de PK foi executada. Os resultados são mostrados na Tabela 7.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 61/93
43/47
Tabela 7. T1/2 do anticorpo de B7-H3 em ratos SD
| Agente testado | Via de administração | T1/2 (média± SD, h) |
| h1702 | IV (3 mg/kg ) | 185 ± 17 |
[00137] Os resultados mostram que a meia-vida do anticorpo da presente invenção em ratos foi de aproximadamente 185 h (7,7 dias). Exemplo de teste 7 Estabilidade física dos anticorpos de B7-H3 [00138] O DSC foi utilizado para detectar a estabilidade térmica de diferentes anticorpos, e a estabilidade térmica em diferentes sistemas tampão sob diferentes condições de pH foi comparada. Os sistemas tampão exemplares correspondentes aos diferentes pH foram PB 10 mM (pH 7) e acetato 10 mM (pH 5,2). A amostra foi dissolvida no tampão correspondente e a concentração da amostra foi controlada em cerca de 1 mg/ml. A detecção foi executada utilizando MicroCal* VP-Capillary DSC (Malvern). Antes da detecção, cada amostra e 0 tampão em branco foram desgasificados um desgasificador a vácuo durante 1 a 2 minutos. 400 μΙ de amostra ou tampão em branco foram adicionados a cada reservatório da placa de amostra (a carga do instrumento é de 300 μΙ). Os dois últimos pares de placas de reservatório foram adicionados respectivamente com 14% de Decon 90 e ddHbO para limpeza. Após a placa de amostra ter sido carregada, uma cobertura macia de plástico foi colocada. A temperatura de varredura começou a 25°C e terminou a 100°C. A taxa de varredura foi de 60°C/h. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Em vários sistemas de teste, tanto 0 h1702 quanto 0 h1703 apresentaram boa estabilidade térmica.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 62/93
44/47
Tabela 8. Resultados de DSC de diferentes anticorpos
| Amostra | Tampão | Tm-início (°C) | TM (°C) |
| h1702 | pH 7,0 | 65,82 | 77,51 |
| pH 5,2 | 65,59 | 78,97 | |
| h1703 | pH 7,0 | 61,33 | 73,19 |
| pH 5,2 | 60,65 | 75,71 |
[00139] A pureza da amostra foi monitorada por SEC-HPLC para investigar a estabilidade sob uma determinada condição de concentração. Como um exemplo da condição, a concentração da amostra foi controlada em cerca de 40 a 50 mg/ml. A estabilidade de diferentes anticorpos foi comparada no sistema PBS (pH 7,4) e no sistema de ácido acético/sacarose pH 5,2 a 4°C, 3°C, 40°C durante um mês de armazenamento. A pureza do anticorpo foi examinada usando a coluna de HPLC Xbridge protein BEH SEC 200A (Waters). Após um mês de investigação, tanto o h1702 quanto o h1703 apresentaram boa estabilidade. Os resultados são mostrados na Tabela 9.
Tabela 9. Resultados de estabilidade para diferentes anticorpos
| Amostra | 4°C/mês/pureza | 30°C/mês/pureza | 40°C/mês/pureza |
| h1702/ ácido acético | 99,25% | 98,68% | 97,85% |
| h1702/PBS | 99,21% | 98,07% | 96,34% |
| h1703/ ácido acético | 99,31% | 99,04% | 98,38% |
| h1703/PBS | 99,18% | 98,56% | 96,99% |
[00140] Os resultados mostram que tanto o h1702 quanto o h1703 apresentam excelente estabilidade nos tampões tanto de ácido acético quanto de PBS.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 63/93
45/47
Exemplo de teste 8· Estabilidade química dos anticorpos de B7-H3 [00141] A modificação química após a preparação do anticorpo é um dos motivos comuns que levam ao problema de estabilidade do produto, especialmente o alto grau de modificação de desaminação, oxidação ou isomerização em alguns aminoácidos na região CDR. Essas modificações devem ser evitadas ou reduzidas. 500 pg de anticorpos a serem testados foram dissolvidos em 500 pl de PBS pH 7,4 e submetidos a um banho de água a 40°C; amostras foram coletadas nos dias 0, 10 e 20, respectivamente, para experimentos de hidrólise enzimática. Amostras de 100 pg foram coletadas em diferentes momentos e dissolvidas em 100 pl de solução de His-HCI 0,2 M, Gua-HCI 8 M, pH 6,0; 3 pl de DTT 0,1 g/ml foram adicionados e submetidos a banho de água a 50°C durante uma hora; Posteriormente, as amostras foram ultrafiltradas duas vezes com solução de His-HCI 0,02 M, pH 6,0 e 3 pl de tripsina 0,25 mg/ml foram adicionados. A mistura foi hidrolisada durante a noite a 37°C em banho de água. Os sítios de modificação potenciais foram analisados por espectrometria de massa (os resultados são mostrados na Tabela 10) utilizando Agilent 6530 Q-TOF. Os resultados mostram que h1702 e h1703 descritos na presente invenção não apresentam nenhuma tendência significativamente aumentada para desamidação, oxidação ou heterogeneidade, indicando que as moléculas possuem excelente estabilidade química.
Tabela 10. Estabilidade química de diferentes anticorpos
| Amostra | LC/HC | posição/modificação | D0 | D10 | D20 |
| h1702 | LC | M48/ oxidação | 2,82% | 2,9% | 2,83% |
| HC | M34/ oxidação | 3,52% | 3,46% | 3,38% | |
| M83/ oxidação | 0,98% | 1,01% | 0,01% | ||
| h1703 | HC | M34/ oxidação | 1,93% | 2,62% | 2,16% |
| M83/ oxidação | 1,96% | 2,62% | 2,8% |
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 64/93
46/47
Exemplo de teste 9· Estabilidade do anticorpo hi702-1 [00142] O tipo lambda possui mais um aminoácido S no C-terminal do que a cadeia leve do tipo capa, e o impedimento estérico do S pode ser um fator que provoca instabilidade da ligação de dissulfeto intercadeias entre a cadeia leve e pesada. O aminoácido terminal S pode ser neutralizado através da clonagem molecular, e a estabilidade do anticorpo em condições alcalinas seria notavelmente melhorada.
[00143] Quando o primeiro aminoácido no N-terminal da cadeia leve do anticorpo exposto for Q, a ciclização parcial também ocorre no anticorpo, e que leva a um aumento na heterogeneidade de carga da amostra, o que afeta a estabilidade da formulação e produtos. O primeiro aminoácido Q no N-terminal foi submetido à mutação para D através da clonagem molecular, para eliminar a ciclização incompleta e significativamente melhorar a estabilidade do anticorpo. A modificação acima não afetou significativamente a afinidade do anticorpo planejado com seu antígeno.
[00144] A estabilidade do h1702 e do h1702-1 foi testada por SEC, método de análise CE-SDS não redutor (pH 9,0) e método de análise IEX.
[00145] Detecção SEC: Cromatógrafo Waters e2695 e coluna Xbridge BEH 200A SEC foram utilizados. 50 pg de anticorpo foram carregados e a eluição foi executada utilizando a fase móvel de PBS em gradiente constante.
Método CE-SDS NR:
[00146] As amostras foram processadas utilizando o Beckman SDS-MW Analysis Kit. Uma solução tampão foi adicionada a 100 pg de anticorpo testado e foi desnaturada por aquecimento no tampão de amostra conforme descrito no protocolo preenchido. Os dados foram coletados utilizando o mecanismo de eletroforese capilar PA800.
Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 65/93
47/47
Método ΙΕΧ:
[00147] Cromatógrafo Waters Acquity Η-Class e coluna Thermo MAbPac SCX-10 foram utilizados. 50 pg de anticorpo testado foram carregados e um gradiente linear foi aplicado utilizando o CX-1 pH Gradient Buffer Kit como a fase móvel; o sinal ultravioleta em um comprimento de onda de 280 nm foi coletado.
Tabela 11. Comparação da estabilidade de h1702 e h1702-1
| SEC | CE-SDS (pH9,0) | IEX | |
| h1702 | 100% | 71,21% | 40,5% |
| h 1702-1 | 100% | 94,67% | 86,21% |
[00148] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com as figuras e modalidades específicas com o propósito de um entendimento claro, a descrição e as modalidades não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente invenção. Todos os conteúdos públicos das literaturas e patentes citadas nesta invenção são expressamente incorporados por referência na sua totalidade.
Claims (20)
- REIVINDICAÇÕES1. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga à B7-H3 humana, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é selecionado de qualquer um dos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno das seguintes (i) a (ii):(i) um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma ou mais sequências da região CDR selecionadas das seguintes sequências ou selecionadas das sequências de aminoácido com pelo menos 95% de identidade com as seguintes sequências:sequências da região variável de cadeia pesada HCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 10, 11 e 12; e sequências de aminoácido da região variável da cadeia leve LCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 13, 14 e 15;(ii) um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma ou mais sequências da região CDR selecionadas das seguintes sequências ou selecionadas das sequências de aminoácido com pelo menos 95% de identidade com as seguintes sequências:sequências da região variável da cadeia pesada HCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 16, 17 e 18; e sequências da região variável da cadeia leve LCDR de anticorpos, conforme mostrado na SEQ ID NQ: 19, 20 e 21.
- 2. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo recombinante.
- 3. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato dePetição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 67/932/5 que o anticorpo monoclonal é um anticorpo recombinante humano ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
- 4. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as sequências estruturais (FR) das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo recombinante humano são derivadas de uma cadeia leve e uma cadeia pesada da linha germinativa humana, respectivamente, ou sua sequência mutante.
- 5. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo recombinante humano compreende uma região variável de cadeia pesada conforme mostrado na SEQ ID NQ: 6 ou 8 ou sua variante; em que a variante possui supressão, substituição ou adição de 1 a 10 aminoácidos na região variável de cadeia pesada da SEQ ID NQ: 6 ou 8.
- 6. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo recombinante humano compreende uma região variável de cadeia leve conforme mostrado na SEQ ID NQ: 7 ou 9 ou sua variante; em que a variante possui supressão, substituição ou adição de 1 a 10 aminoácidos na região variável de cadeia leve da SEQ ID NQ: 7 ou 9.
- 7. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de B7-H3 ainda compreende uma região constante de anticorpo humano, preferivelmente o anticorpo de B7-H3 é um anticorpo de comprimento total que consiste da cadeia pesada e da cadeia leve como mostrado na SEQ ID NQ: 22 e 23, respectivamente, ou um anticorpo de comprimento total que consiste da cadeia pesada e da cadeia levePetição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 68/933/5 como mostrado na SEQ ID NQ: 22 e 26, respectivamente, ou um anticorpo de comprimento total que consiste da cadeia pesada e da cadeia leve como mostrado na SEQ ID NQ: 24 e 25, respectivamente.
- 8. Anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2 e anticorpo de cadeia única (scFv), região V dimerizada (diacorpo), região V estabilizada com dissulfeto (dsFv) e peptídeo contendo CDR.
- 9. Anticorpo de B7-H3 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que compete com o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para ligação à B7-H3 humana.
- 10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
- 11. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
- 12. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 11.
- 13. Célula hospedeira transformada com o vetor recombinante como definido na reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em célula procariótica e célula eucariótica, preferivelmente célula eucariótica, mais preferivelmente célula de mamífero ou célula de levedura.Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 69/934/5
- 14. Método para a produção do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o método compreende:o cultivo da célula hospedeira como definida na reivindicação 13 em uma cultura para formar e acumular o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e a recuperação do anticorpo acumulado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da cultura.
- 15. Método para a detecção ou medição imunológica de B7-H3, caracterizado pelo fato de que o método compreende uma etapa de detecção de B7-H3 mediante o uso do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
- 16. Reagente para a detecção ou medição de B7-H3 humana, caracterizado pelo fato de que o reagente compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
- 17. Reagente de diagnóstico para a detecção de doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3 humana, caracterizado pelo fato de que o reagente de diagnóstico compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
- 18. Método para o diagnóstico de doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3 humana, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de detecção ou determinação de B7-H3 ou células positivas a B7-H3 mediante o uso do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.Petição 870190091695, de 13/09/2019, pág. 70/935/5
- 19. Agente terapêutico para o tratamento de doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3, o agente terapêutico caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 10 ou a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 11.
- 20. Método para tratar doenças relacionadas com as células positivas a B7-H3, caracterizado pelo fato de que o método compreende a indução da morte de células positivas a B7-H3 mediante o uso do anticorpo de B7-H3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 10 ou a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 11.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710206261 | 2017-03-31 | ||
| PCT/CN2018/081249 WO2018177393A1 (zh) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112019019111A2 true BR112019019111A2 (pt) | 2020-05-05 |
Family
ID=63674249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112019019111A BR112019019111A2 (pt) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | anticorpo de b7-h3, seu fragmento de ligação ao antígeno e seu uso médico |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10899837B2 (pt) |
| EP (1) | EP3604337A4 (pt) |
| JP (1) | JP7158403B2 (pt) |
| KR (2) | KR102662387B1 (pt) |
| CN (1) | CN109937212B (pt) |
| AU (1) | AU2018243123A1 (pt) |
| BR (1) | BR112019019111A2 (pt) |
| CA (1) | CA3056474A1 (pt) |
| MX (1) | MX2019011117A (pt) |
| RU (1) | RU2765306C2 (pt) |
| TW (1) | TWI796328B (pt) |
| UA (1) | UA125593C2 (pt) |
| WO (1) | WO2018177393A1 (pt) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3604337A4 (en) | 2017-03-31 | 2021-03-10 | Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. | B7-H3 ANTIBODIES, ANTIGEN BINDING FRAGMENT OF THE SAME, AND ITS MEDICAL USE |
| WO2019024911A1 (zh) * | 2017-08-04 | 2019-02-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途 |
| US11270523B2 (en) | 2017-11-29 | 2022-03-08 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| US11403813B2 (en) | 2019-11-26 | 2022-08-02 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| US10916053B1 (en) | 2019-11-26 | 2021-02-09 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images |
| WO2020018964A1 (en) | 2018-07-20 | 2020-01-23 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors |
| US20220010018A1 (en) * | 2018-11-16 | 2022-01-13 | Albert Einstein College Of Medicine | MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST IgV DOMAIN OF B7-H3 AND USES THEREOF |
| CN112969476B (zh) * | 2018-12-07 | 2024-06-14 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 多特异性蛋白分子 |
| US11030801B2 (en) | 2019-05-17 | 2021-06-08 | Standard Cyborg, Inc. | Three-dimensional modeling toolkit |
| US12056820B2 (en) | 2019-05-17 | 2024-08-06 | Sdc U.S. Smilepay Spv | Three-dimensional modeling toolkit |
| KR20210006637A (ko) * | 2019-07-09 | 2021-01-19 | 주식회사 와이바이오로직스 | B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 |
| EP4039702A1 (en) * | 2019-09-16 | 2022-08-10 | Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-b7-h3 antibody and application thereof |
| KR20230028793A (ko) * | 2020-06-26 | 2023-03-02 | 주식회사 인투셀 | 항-b7-h3 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 |
| US20240108745A1 (en) * | 2021-02-09 | 2024-04-04 | Medilink Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. | Bioactive substance conjugate, preparation method therefor and use thereof |
| US20240158505A1 (en) * | 2021-03-26 | 2024-05-16 | Theranotics Co., Ltd. | B7-h3 antibody or antigen-binding fragment thereof, and use thereof |
| CN118647408A (zh) | 2022-02-16 | 2024-09-13 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 抗体-艾日布林或其衍生物的偶联物、其中间体、制备方法、药物组合物和用途 |
| WO2023160376A1 (en) * | 2022-02-25 | 2023-08-31 | Nanjing Probio Biotech Co., Ltd. | Antibodies and variants thereof against human b7-h3 |
| TW202402808A (zh) * | 2022-05-18 | 2024-01-16 | 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 | 抗-b7h3抗體及其用途 |
| WO2023221975A1 (zh) * | 2022-05-18 | 2023-11-23 | 苏州宜联生物医药有限公司 | 包含蛋白降解剂类生物活性化合物的抗体药物偶联物及其制备方法和用途 |
| WO2024106939A1 (ko) * | 2022-11-15 | 2024-05-23 | 주식회사 셀랩메드 | B7-h3에 특이적으로 결합하는 항체 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US20050002935A1 (en) * | 2003-04-17 | 2005-01-06 | Vincent Ling | Use of B7-H3 as an immunoregulatory agent |
| CN101104639A (zh) * | 2006-07-10 | 2008-01-16 | 苏州大学 | 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用 |
| JP5601836B2 (ja) | 2006-11-08 | 2014-10-08 | マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド | Ｔｅｓ７およびｔｅｓ７に結合する抗体 |
| WO2008100934A1 (en) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | B7-h3 in cancer |
| AU2010215838A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | John Wayne Cancer Institute | B7-H3 antibody coupled bead assay for detection of circulating tumor cells |
| US8802091B2 (en) * | 2010-03-04 | 2014-08-12 | Macrogenics, Inc. | Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof |
| MX345232B (es) | 2010-03-04 | 2017-01-20 | Macrogenics Inc | Anticuerpos reactivos con b7-h3, fragmentos inmunologicamente activos de los mismos y sus usos. |
| PL2703486T3 (pl) * | 2011-04-25 | 2018-07-31 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Przeciwciało anty-b7-h3 |
| US9790282B2 (en) * | 2013-03-25 | 2017-10-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors |
| EP3149040A1 (en) * | 2014-05-29 | 2017-04-05 | Spring Bioscience Corporation | Anti-b7-h3 antibodies and diagnostic uses thereof |
| EP3186277B1 (en) | 2014-08-27 | 2020-10-07 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Antibodies, compositions, and uses |
| ES2875057T3 (es) * | 2014-09-17 | 2021-11-08 | Us Health | Anticuerpos anti-CD276 (B7H3) |
| EP3604337A4 (en) | 2017-03-31 | 2021-03-10 | Jiangsu Hengrui Medicine Co. Ltd. | B7-H3 ANTIBODIES, ANTIGEN BINDING FRAGMENT OF THE SAME, AND ITS MEDICAL USE |
-
2018
- 2018-03-30 EP EP18776535.9A patent/EP3604337A4/en active Pending
- 2018-03-30 CA CA3056474A patent/CA3056474A1/en active Pending
- 2018-03-30 UA UAA201910562A patent/UA125593C2/uk unknown
- 2018-03-30 TW TW107111275A patent/TWI796328B/zh active
- 2018-03-30 KR KR1020197027386A patent/KR102662387B1/ko active IP Right Grant
- 2018-03-30 CN CN201880004340.8A patent/CN109937212B/zh active Active
- 2018-03-30 AU AU2018243123A patent/AU2018243123A1/en active Pending
- 2018-03-30 KR KR1020247013811A patent/KR20240063177A/ko active Application Filing
- 2018-03-30 MX MX2019011117A patent/MX2019011117A/es unknown
- 2018-03-30 RU RU2019132843A patent/RU2765306C2/ru active
- 2018-03-30 WO PCT/CN2018/081249 patent/WO2018177393A1/zh active Application Filing
- 2018-03-30 US US16/497,687 patent/US10899837B2/en active Active
- 2018-03-30 BR BR112019019111A patent/BR112019019111A2/pt unknown
- 2018-03-30 JP JP2019552850A patent/JP7158403B2/ja active Active
-
2020
- 2020-12-15 US US17/121,893 patent/US11680100B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019132843A (ru) | 2021-04-30 |
| US10899837B2 (en) | 2021-01-26 |
| WO2018177393A1 (zh) | 2018-10-04 |
| AU2018243123A1 (en) | 2019-09-26 |
| US11680100B2 (en) | 2023-06-20 |
| CN109937212B (zh) | 2022-06-21 |
| US20210101984A1 (en) | 2021-04-08 |
| CA3056474A1 (en) | 2018-10-04 |
| KR20240063177A (ko) | 2024-05-09 |
| MX2019011117A (es) | 2019-11-05 |
| TW201837056A (zh) | 2018-10-16 |
| CN109937212A (zh) | 2019-06-25 |
| TWI796328B (zh) | 2023-03-21 |
| KR102662387B1 (ko) | 2024-04-29 |
| JP7158403B2 (ja) | 2022-10-21 |
| JP2020515251A (ja) | 2020-05-28 |
| RU2765306C2 (ru) | 2022-01-28 |
| US20200031934A1 (en) | 2020-01-30 |
| RU2019132843A3 (pt) | 2021-08-16 |
| UA125593C2 (uk) | 2022-04-27 |
| EP3604337A1 (en) | 2020-02-05 |
| EP3604337A4 (en) | 2021-03-10 |
| KR20190134614A (ko) | 2019-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112019019111A2 (pt) | anticorpo de b7-h3, seu fragmento de ligação ao antígeno e seu uso médico | |
| TWI803523B (zh) | Ｔｉｇｉｔ抗體、其抗原結合片段及醫藥用途 | |
| CN110914304B (zh) | Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| TWI840399B (zh) | 結合人il-4r的抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
| WO2019024911A1 (zh) | B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途 | |
| BR112020015736A2 (pt) | Anticorpo anti-b7-h4, fragmento de ligação a antígeno do mesmo e uso farmacêutico do mesmo | |
| CN116751295A (zh) | 能结合胸腺基质淋巴细胞生成素的抗体及其应用 | |
| WO2018153366A1 (zh) | Tim-3抗体、其抗原结合片段及医药用途 | |
| BR112019025048A2 (pt) | anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso médico dos mesmos | |
| BR112020013475A2 (pt) | Anticorpo de pd-l1, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico do mesmo | |
| WO2021098822A1 (zh) | 一种双特异性抗体 | |
| WO2020259550A1 (zh) | 抗cea抗体及其应用 | |
| WO2020228604A1 (zh) | 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| WO2021110095A1 (zh) | 抗gpc3抗体、其抗原结合片段及其医药用途 | |
| CN114829395B (zh) | 抗angptl3抗体及其应用 | |
| WO2021213245A1 (zh) | 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途 | |
| WO2023083327A1 (zh) | 抗cldn18.2单克隆抗体及其应用 | |
| WO2021209066A1 (zh) | 特异性抗原结合分子，其制备方法及医药用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: CHANGZHOU HANSOH PHARMACEUTICAL CO., LTD. (CN) ; HANSOH (SHANGHAI) HEALTHTECH CO., LTD. (CN) |
|
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |