JP7158403B2 - B7-h3抗体、その抗原結合フラグメント、及びそれらの医学的使用 - Google Patents
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Description
(i)以下の配列から選択されるか、又は以下と少なくとも 95 %の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント:
配列番号:10、11 及び 12 に示される抗体重鎖可変領域 HCDR 配列;並びに
配列番号:13、14 及び 15 に示される抗体軽鎖可変領域 LCDR アミノ酸配列;
(ii)以下の配列から選択されるか、又は以下と少なくとも 95 %の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント:
配列番号:16、17 及び 18 に示される抗体重鎖可変領域 HCDR 配列;並びに
配列番号:19、20 及び 21 に示される抗体軽鎖可変領域 LCDR 配列、
を提供する。
本発明をより容易に理解するために、ある特定の技術用語及び科学用語を以下で具体的に定義する。本文書の他の箇所で特に示されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解される意味を有する。
B7-H3 抗原の設計
配列番号:1 に示すヒトB7-H3 を本発明の B7-H3 のテンプレートとして使用し、本発明に関与する検出用の抗原及びタンパク質のアミノ酸配列を設計した。特に明記しない限り、以下の B7-H3 抗原はヒト B7-H3 である。
二重下線部分はシグナル・ペプチド(シグナル・ペプチド:1-28)である;
下線部分はB7-H3 細胞外ドメイン(細胞外ドメイン:29-466)であり、29-139 は Ig 様 V 型 1 ドメインであり、145-238 は Ig様 C2 型1ドメインである;243-357 は Ig 様 V 型 2 ドメイン、363-456 は Ig 様 C2 型 2 ドメインである;
点線部分は膜貫通ドメイン部分である(膜貫通ドメイン:467-487);
斜体部分は細胞内ドメインである(細胞質ドメイン:488-534)。
二重下線部分はシグナル・ペプチド(シグナル・ペプチド:1-28)である;
下線部分はB7-H3細胞外ドメイン(細胞外ドメイン:29-248)であり、ここで、29-139 は Ig 様 V 型ドメインであり、145-238 は Ig 様 C2 型ドメインである;
点線部分は膜貫通ドメイン部分である(膜貫通ドメイン:249-269);
斜体部分は細胞内ドメインである(細胞質ドメイン:270-316)。
B 細胞をヒト PBMC、脾臓、及びリンパ節組織から単離し、RNA を抽出してナイーブ scFv ファージ抗体ライブラリ(容量 3.2×1010)を構築した。構築したナイーブ scFv ファージ抗体ライブラリをパッケージングしてファージ粒子を形成し、液相法によるパニングに供した。ファージは、液相でビオチン化した B7-H3 に結合し、それから、ストレプトアビジン磁気ビーズによって分離した。ヒトB7-H3(R&D カタログ番号 1949-B3-050/CF)に結合する陽性配列を得るために、ビオチン化ヒトB7-H3 をパニングに使用し、500 個のモノクローナル・コロニーを拾い、ファージ ELISA 試験用のファージ scFv 抗体にパッケージした。ヒト B7-H3(R&D cat#1949-B3-050 /CF)及びマウス B7-H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)へのモノクローナル・ファージの結合活性を個別に試験した:1 μg/ml ヒト B7-H3 又はマウス B7-H3 及び 1% BSA を ELISA プレートにコーティングし、ブロッキング・バッファーで 1:1 に希釈したファージ上清を添加し、抗‐M13 HRP で検出した;ELISA OD450 値が 0.5 を超える、及びヒト又はマウスB7-H3 との結合に関する ELISA OD450 値と 1% BSA との結合に関する ELISA OD450 値との比が 2.0 を超える、クローンを選択したところ、9 つのクローンを得た。
ファージ・ライブラリ・スクリーニングによって得られたこれらの 9 クローンに対して、完全長抗体を構築した。そして、ELISA 結合アッセイによって、2 つの抗体(それぞれ、h1702 及び h1703)で、強い親和性を有することが、確認された。完全長モノクローナル抗体を構築するプロセスは次の通りであった:
相スクリーニング(phase screening)により得られた scFv 抗体の配列に基づいて、プライマーを設計し、PCR により各単鎖抗体配列の VH/VK/VL 遺伝子フラグメントを構築した。h1702 及び h1703 の重鎖及び軽鎖可変領域を得た。
h1702-IgG1:
抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれ発現するプラスミドを 1.5:1 の比率で HEK293E 細胞にトランスフェクトし、細胞培養上清を 6 日後に回収し、細胞の残骸を高速遠心分離により除去し、プロテイン A カラムによって精製を行った。A280 の測定値がベースラインに下がるまで、カラムを PBS で洗浄した。標的タンパク質は、pH 3.0 - pH 3.5 の酸性溶離液で溶出し、1 M Tris-HCl、pH 8.0-9.0で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBS で平衡化したゲル・クロマトグラフィー Superdex 200(GE)で更に精製し、凝集体を除去した。モノマーのピークを回収し、分注して使用した。
ヒト B7-H3 の様々な形態への、スクリーニングした B7-H3 抗体の、in vitro での結合能を試験するために、ヒト 2Ig-B7-H3(Cat.#1949-B3-050/CF、R&D)及びヒト 4Ig-B7-H3(Cat# 11188-H08H, Sino Biological)を、in vitro の結合アッセイに使用した。
スクリーニングした B7-H3 抗体の、異なる種に由来する B7-H3 への結合能を in vitro で試験するために、マウス B7-H3(Cat. #1397-B3-050/CF, R&D)を in vitro での結合アッセイに使用した。
ヒト及びマウスのB7-H3 に対する抗‐B7-H3 抗体の反応親和性を、Biacore, GE instrument を使用して測定した。
この実験では、細胞表面への抗体結合の蛍光シグナルの強度に基づいて、抗体の結合を評価した。10 μgの一次抗体を、氷上で、2×105 個のU87MG 細胞とともに 30 分間インキュベートした後、過剰な抗体を洗浄により除去した。前記細胞を APC 抗‐ヒト IgG Fc(Biolegend, 409306)と室温で 30 分間インキュベートし、過剰な抗体を除去した後、細胞表面の蛍光シグナルを BD Verse を使用して読み取った(結果を図4に示した)。本結果は、h1702 が、B7-H3 を過剰発現する腫瘍細胞 U87MG に特異的に結合することを示す。
この実験では、内在化された抗体について測定された蛍光シグナルの強度に基づいて、抗体のエンドサイトーシス効果を評価した。B7-H3 抗体と APC 抗‐ヒト IgG Fc(Biolegend, 409306)を 1:2 のモル比で混合し、氷上で 15 分間インキュベートした。その抗体混合物を、氷上で、2×105個の U87MG 細胞とともに 30 分間インキュベートした後、過剰な抗体を洗浄により除去した。それから、前記細胞を 37°C に予め温めておいた培地に移し、37°Cで0、15、30 、60 及び 120 分間、それぞれインキュベートした。前記細胞を遠心分離し、抗体溶出バッファーに再懸濁して、抗体を除去した。室温で 7 分間インキュベートした後、前記抗体溶出バッファーを洗浄により除去し、BD Verse を使用して細胞内蛍光シグナルを読み取った(結果を図5に示す)。本結果は、h1702 及び h1703 の両方が U87MG 細胞に結合した後、細胞内に効率的にエンドサイトーシスされたことを示す。
4 匹の SD ラット(JSJ 実験動物株式会社から購入)(2 匹のオスと 2 匹のメス)は、12/12 時間に調整した明暗サイクル、24±3°Cの一定温度、湿度50- 60%、及び餌と水へ自由にアクセス、で飼育した。本実験の当日に、SD ラットに、3 mg/kg の用量及び 5 ml/kg の注入量で、試験薬剤を尾静脈に注射した。
DSC を使用して、異なる抗体の熱安定性を検出し、様々な pH 条件下の様々なバッファー・システムでの熱安定性を比較した。様々な pH に対応する例示的なバッファー系は、10 mM PB(pH 7)及び 10 mM 酢酸(pH 5.2)であった。サンプルを対応するバッファーに溶解し、サンプル濃度を約 1 mg/ml にコントロールした。MicroCal * VP-Capillary DSC(Malvern)を使用して、検出を行った。検出前に、各サンプルとブランク・バッファーを真空脱気装置で 1 から 2 分間脱気した。400 μl のサンプル又はブランク・バッファーをサンプル・プレートの各ウェルに添加した(機器にロードするのは 300 μl である)。ウェル・プレートの最後の2 組には、クリーニング用にそれぞれ 14% の Decon 90 と ddH2O を添加した。前記サンプル・プレートをロードした後、プラスチック製のソフト・カバーをかけた。スキャン温度は 25°Cから始まり、100°Cで終了した。スキャン速度は 60°C/h とした。本結果を表8に示す。いくつかの試験系では、h1702 と h1703 の両方が良好な熱安定性を示した。
抗体調製後の化学的修飾(特に、CDR 領域のいくつかのアミノ酸での高度な脱アミノ化、酸化、異性化の修飾)は、製品の安定性の問題につながる一般的な理由のうちの 1 つである。これらの修飾は、避けるか、減らすべきである。試験する 500 μg の抗体を 500 μl の PBS pH 7.4 に溶解し、40°C の水浴に供した;酵素加水分解実験のために、サンプルをそれぞれ0、10、20 日目に採取した。100 μg のサンプルを様々な時点で採取し、0.2 M His-HCl、8 M Gua-HCl、pH 6.0 の 100 μl 溶液に溶解した;3 μl の 0.1 g/mL DTT を加え、50°Cの水浴に 1 時間、供した;その後、前記サンプルを 0.02 M His-HCl、pH 6.0 の溶液で 2 回限外ろ過し、3 μL の0.25 mg/mL トリプシンを加えた。その混合物を水浴中で 37℃で一晩加水分解した。修飾される可能性がある部位を、Agilent 6530 Q-TOF を使用して、質量分析法で分析した(結果を表10に示す)。本結果は、本発明に記載の h1702 及び h1703 は、脱アミド化、酸化又は不均一性の傾向が有意には増加していないことを示しており、前記分子が優れた化学的安定性を有することを示している。
ラムダ型は、カッパ型軽鎖よりも C 末端に 1 つ多くのアミノ酸 S を持ち、S による立体障害が、軽鎖と重鎖の間の鎖間ジスルフィド結合の不安定性を引き起こす要因になることがある。モレキュラー・クローニング(molecular cloning)により末端のアミノ酸 S をノックアウトすることができ、アルカリ条件下での抗体の安定性が著しく改善される。
サンプルを、Beckman SDS-MW Analysis Kit を使用して処理した。バッファー液を 100 μg の試験抗体に加え、製造者プロトコル(manned protocol)に記載されているようにサンプル・バッファー中で加熱することにより変性させた。PA800 キャピラリー電気泳動装置を使用してデータを収集した。
Waters Acquity H-Class クロマトグラフと Thermo MAbPac SCX-10 カラムを使用した。試験をする抗体 50 μg をロードし、CX-1 pH Gradient Buffer Kit を移動相として使用して、線形勾配を適用した;280 nm の波長の紫外線シグナルを収集した。
Claims (21)
- ヒト B7-H3 に結合する、B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント、ここで、前記B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ここで:
前記重鎖可変領域は、配列番号:10、11 及び 12 のアミノ酸配列をそれぞれ有する、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む;並びに
前記軽鎖可変領域は、配列番号:13、14 及び 15 のアミノ酸配列をそれぞれ有する、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む。 - 前記抗体が組換え抗体である、請求項1に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体がヒト組換え抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項2に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト組換え抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のフレームワーク(FR)配列が、それぞれヒト生殖細胞系列型軽鎖及び重鎖、又はそれらの変異配列に由来する、請求項3に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト組換え抗体が、配列番号:6 に示される重鎖可変領域又はそれらのバリアントを含み、前記バリアントは、配列番号:6 の重鎖可変領域中に 1-10 個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する、請求項4に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト組換え抗体が、配列番号:7 に示される軽鎖可変領域又はそれらのバリアントを含み、前記バリアントは、配列番号:7 の軽鎖可変領域中に 1-10 個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する、請求項4に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記 B7-H3 抗体がヒト抗体定常領域を更に含む、請求項1から6の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記 B7-H3 抗体が、それぞれ配列番号:22 及び 23 に示される重鎖及び軽鎖からなる完全長抗体、又はそれぞれ配列番号:22 及び 26 に示される重鎖及び軽鎖からなる完全長抗体、である、請求項7に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗原結合フラグメントが、Fab、Fab'、F(ab')2 及び単鎖抗体(scFv)、二量体化 V 領域(ダイアボディ)、ジスルフィド安定化 V 領域(dsFv)及び CDR-含有ペプチドからなる群から選択される、請求項1から7の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 治療有効量の請求項1から9の何れか1項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメント、及び 1 種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、核酸分子。
- 請求項11に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞、ここで、前記宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞、からなる群から選択される。
- 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞又は酵母細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントを形成及び蓄積するために請求項13又は14に記載の宿主細胞を培養物中で培養すること、及び
蓄積した抗体又はその抗原結合フラグメントを前記培養物から回収すること、
を含む、請求項1から9の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するための方法。 - 請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して B7-H3 を検出するステップを含む、B7-H3 を免疫学的に検出する又は測定するための方法。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ヒト B7-H3 を検出する又は測定するための試薬。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ヒト B7-H3 陽性細胞に関連する疾患を検出するための診断薬。
- ヒト B7-H3 陽性細胞に関連する疾患を診断するための医薬品を調製する際における、請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
- 請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは請求項10に記載の医薬組成物、又は請求項11の核酸分子を含む、B7-H3 陽性細胞に関連する疾患を治療するための治療薬。
- B7-H3 陽性細胞に関連する疾患を治療するための医薬品を調製する際における、請求項1から9の何れか一項に記載の B7-H3 抗体若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは請求項10の医薬組成物、又は請求項11の核酸分子、の使用。
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