JP2021500856A - Il−6r抗体およびその抗原結合フラグメントならびに医薬としての使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、IL−6R抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明のIL−6R抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体である。本発明は、IL−6関連疾患処置用医薬の製造における本発明の抗体の使用をも提供する。
Description
本開示は、IL−6R抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。本開示は、該IL−6R抗体のCDR領域を含むキメラ抗体およびヒト化抗体にも関する。本開示はさらに、該IL−6R抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにIL−6RまたはIL−6が関与する疾患の診断および処置剤としてのその使用に関する。
インターロイキン6(IL−6)は、細胞の増殖および分化を調節する多面的な炎症性サイトカインで、炎症反応および免疫反応の仲介において重要な役割を担う。インターロイキン−6およびその受容体(IL−6R)の産生は、多発性骨髄腫、自己免疫疾患および前立腺癌といったさまざまな疾患の原因に関連する。
IL−6Rは、IL−6RαおよびIL−6Rβを含む、CD126としても知られる、造血サイトカイン受容体スーパーファミリーの最初に発見されたメンバーで、シグナル伝達タンパク質gp130はIL−6ファミリーメンバーに共通する。IL−6はIL−6Rαに結合してIL−6/IL−6Rα複合体を形成し、これがgp130に結合して高親和性複合体を形成する(Journal of Immunology, 2006, 25(5): 475-479)。
IL−6Rαは主に、肝細胞、好中球、マクロファージおよびいくつかのリンパ球の表面で発現され、gp130はすべての細胞の表面で発現される(Rheumatology (Oxford, England), 2010, 49(1): 15-24)。さらに、可溶性形態のIL−6R(すなわち、sIL−6R)が存在する。sIL−6Rは、体液中を輸送され、したがって、IL−6と反応する細胞種を増加させる。例えば、内皮細胞および滑膜細胞はgp130を発現するが、IL−6Rを発現しない。これらの細胞は、sIL−6R存在下においてのみ、IL−6と反応することができる(Rheumatology (Oxford, England), 2010, 49(1): 15-24)。さらに、gp130の細胞外ドメインからなる可溶性フラグメント(sgp130)が存在し、これはIL−6およびsIL−6Rの複合体と結合することができ、IL−6の生物学的活性に対しアンタゴニスト作用を示す。
さまざまな疾患、例えば多発性骨髄腫、肝臓癌およびほぼすべてのタイプの骨髄性白血病において、IL−6Rが高度に発現されることが、研究により示されている(Journal of Experimental Hematology 2001: 9 (2) 184-187)。免疫療法の標的として、2009年に世界初のIL−6Rモノクローナル抗体トシリズマブの上市が承認された。また、2番目のIL−6Rモノクローナル抗体サリルマブの上市が、2017年1月にカナダで初めて承認された。IL−6R抗原は、古くから開示されている。現在、例えばWO1996011020A1、WO2009052454、WO2016089886、WO2005061000、US8753634、US20100215664、US7582298、US5795965、US8034344、WO2016062766およびCN101454345Bにおいて、患者におけるIL−6Rに対する抗体が報告されている。肝臓癌、中枢神経系(CNS)の炎症、慢性関節リウマチおよび血管炎のような患者の多くがIL−6R抗体の適用に関連付けられる。
しかしながら、IL−6仲介疾患等の処置における上記薬物の改良が依然必要とされている。したがって、選択性が高く、効果が高く、副作用の少ない抗体を開発し、IL−6Rが関与する疾患の処置のための抗IL−6Rを用いるより良い処置法を提供することが依然必要である。
本開示は、IL−6R細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。さらに、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗体フラグメントと競合する、高活性および高安定性の抗ヒトIL−6R抗体を提供する。
本開示はさらに、本開示の抗体のクローン、該抗体をコードするDNA、該DNAを含むベクター、および該ベクターの導入により得られる形質転換体を作製する方法を提供する。本開示はまた、該クローンまたは該形質転換体を用いて、抗体またはその抗体フラグメントを生産する方法を提供する。本開示はまた、本開示の抗体またはその抗体フラグメントを活性成分として含む診断または処置剤を提供する。
一側面において、本開示はモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、CDR1、CDR2およびCDR3を含み、ここで、CDR1の配列は、配列番号15および配列番号15のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号15のバリアント配列は、配列番号15の配列と1、2または3アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号15のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。CDR2の配列は、配列番号16および配列番号16のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号16のバリアント配列は、配列番号16の配列と1、2または3アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号16のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。CDR3の配列は、配列番号17および配列番号17のバリアント配列からなる群から選択される。特定の一態様において、配列番号17のバリアント配列は、配列番号17の配列と1、2または3アミノ酸が相異する。特定の一態様において、配列番号17のバリアント配列は、抗体親和性成熟試験によって得られる。該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトIL−6Rを認識し、それに結合する。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントにおいて、CDR1配列は配列番号15のものであり、CDR2配列は配列番号16のものであり、CDR3配列は配列番号17のものである。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、組換え抗体である。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。
いくつかの態様において、ヒト化抗体の可変領域のFR領域の配列は、ヒト生殖細胞系列の重鎖またはその変異配列に由来する。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、配列番号14のVHHまたはそのバリアントを含み、該バリアントは、配列番号14のVHH配列において1〜15のアミノ酸の変異を有する。より具体的には、VHHのバリアントは、配列番号14のVHH配列のFR領域において1〜15のアミノ酸の変異を有する。より具体的には、VHHのバリアントは、配列番号14のVHH配列において、A14P、E23A、Q44G、V78L、K86R、N96A、A97F、Q116Lおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される変異を有する。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体Fc領域をさらに含み、好ましくは配列番号19のヒト抗体Fc領域を含む。
いくつかの態様において、抗原結合フラグメントは、シングルドメイン抗体およびCDR1〜CDR3を含むペプチドからなる群から選択される。
いくつかの態様において、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記に限定したモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、IL−6Rへの結合を競合し、IL−6RへのIL−6の結合を阻害する。
他の一側面において、本開示は、処置有効量の前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および1つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。
いくつかの態様において、該核酸分子は、前記CDR領域をコードする。いくつかの態様において、該核酸分子は、配列番号13との相同性が少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%であるポリヌクレオチドを含む。
他の一側面において、本開示は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
他の一側面において、本開示は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞または酵母細胞からなる群から選択される。哺乳動物細胞は、好ましくはHEK293E細胞、CHO細胞またはNS0細胞である。哺乳動物細胞は個体へと成長しない。
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法を提供する。該方法は、
前記宿主細胞を培養するステップ;
該培養において前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積するステップ;および
該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ
を含む。
前記宿主細胞を培養するステップ;
該培養において前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積するステップ;および
該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ
を含む。
他の一側面において、本開示は、ヒトIL−6Rを検出または測定する方法を提供する。該方法は、サンプル中のIL−6Rを、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントによって検出するステップを含む。
他の一側面において、本開示は、ヒトIL−6Rを検出または測定するための試薬を提供する。該試薬は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
他の一側面において、本開示は、ヒトIL−6Rが関与する疾患を処置する方法を提供する。該方法は、ヒトIL−6が関与する疾患を処置するために、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与すること、または前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与すること、または前記核酸分子を対象に投与することを含む。
他の一側面において、本開示は、IL−6が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。本開示はまた、IL−6が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記医薬組成物の使用を提供する。本開示はまた、IL−6が関与する疾患の処置用の処置剤を製造するための、前記核酸分子の使用を提供する。
本開示はさらに、IL−6R陽性細胞に関連付けられる疾患を処置するための薬剤を包含する。該薬剤は、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを活性成分として含む。
本開示の抗体、抗原結合フラグメントおよび組成物は、IL−6R、IL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体(場合により、gp130がさらに結合した複合体)に関連付けられる、および/またはIL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体(場合により、gp130がさらに結合した複合体)が関与するシグナル伝達経路および/または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態を予防および治療するために使用することができる。特に、本開示の抗体、抗原結合フラグメントおよび組成物は、IL−6R、IL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体(場合により、gp130がさらに結合した複合体)に関連付けられ、および/またはIL−6R、IL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体(場合により、gp130がさらに結合した複合体)が関与するシグナル伝達経路および/または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態を予防および治療するために使用することができ、ここで、該疾患および状態は、IL−6RによるかまたはIL−6Rが関与する経路によって仲介される過剰なおよび/または望ましくないシグナル伝達によって特徴付けられる。本開示にしたがって、当業者は、IL−6R、IL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体に関連付けられ、および/またはIL−6および/またはIL−6/IL−6R複合体が関与するシグナル伝達経路および/または生物学的機能および反応に関連付けられる疾患および状態の例を明確に理解しうる。該疾患および該状態は本書において、「IL−6に関連付けられる状態」または「IL−6Rに関連付けられる疾患」ともいう。
他の一側面において、本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、前記医薬組成物、前記核酸分子、またはそれらの組み合わせの、下記のものからなる群から選択される疾患または状態の予防または処置用医薬を製造するための使用を提供する:敗血症(Starnes et al, 1999)およびさまざまな癌、例えば多発性骨髄腫(MM)、腎細胞癌(RCC)、形質細胞白血病(Klein et al, 1991)、リンパ腫、Bリンパ組織過形成疾患(BLPD)および前立腺癌。過剰なIL−6産生またはシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の例は、骨吸収(骨粗鬆症)(Roodman et al, 1992; Jilka et al, 1992)、悪液質(Strassman et al, 1992)、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫(Emilie et al, 1994);炎症性疾患および状態、例えば関節リウマチ、全身的に発症する若年性特発性関節炎、高γグロブリン血症(Grau et al., 1990);限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、キャッスルマン病、IgMγグロブリン疾患、心臓粘液腫、喘息(特にアレルギー性喘息)、炎症性貧血、および自己免疫性インスリン依存性糖尿病(Campbell et al, 1991)を包含するが、それに限定されない。
さらに、本開示は、IL−6Rの免疫検出または免疫アッセイ法;IL−6Rの免疫検出または免疫アッセイ用の試薬;IL−6R発現細胞の免疫検出または免疫アッセイ;およびヒトIL−6Rを特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを活性成分として含む、IL−6に関連付けられる疾患の診断用の診断剤に関する。
本開示において、IL−6Rの量を検出または測定する方法は、当分野で知られる任意の方法でありうる。例えば、それには免疫検出または免疫アッセイが包含される。
免疫検出または免疫アッセイは、抗体または抗原の量を、標識した抗原または抗体を用いて検出または測定する方法である。免疫検出または免疫アッセイの例は、放射性物質標識免疫学的抗体法(RIA)、酵素免疫アッセイ(EIAまたはELISA)、蛍光免疫アッセイ(FIA)、発光免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング、物理化学的アッセイ等を包含する。
前記IL−6関連疾患は、発現されたIL−6を本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントで検出または測定することによって診断することができる。
該ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、既知の免疫アッセイ、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織化学染色等を使用することができる。FMAT8100HTSシステム(Applied Biosystem)による蛍光抗体染色法等を用いることもできる。
本開示において、IL−6Rdを検出または測定する生体サンプルには、それがIL−6R発現細胞、例えば組織細胞を含む可能性がある限り、特に制限はなく、血液(全血、血漿または血清)、膵液、尿、便、組織液または培養培地を用いることができる。
本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断剤は、所望の診断方法に応じて、抗原−抗体反応を実施するための試薬、または該反応を検出するための試薬をさらに含みうる。抗原−抗体反応を実施するための試薬は、例えば緩衝剤および塩を包含する。該反応を検出するための試薬は、免疫検出または免疫アッセイにおいて通常用いられる試薬、例えば、該モノクローナル抗体、その抗体フラグメントまたはそのコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、および該標識に対応する基質を包含する。
発明の詳細な説明
1.用語
本開示をより容易に理解するために、いくつかの技術用語および科学用語を定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書において異なる定義が明らかになされない限り、本開示が属する技術分野における通常の技術を有する者に通常理解される意味を有する。
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本開示をより容易に理解するために、いくつかの技術用語および科学用語を定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書において異なる定義が明らかになされない限り、本開示が属する技術分野における通常の技術を有する者に通常理解される意味を有する。
本開示において用いられるアミノ酸の3文字コードおよび1文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558 (1968)に記載されるとおりである。
通常の免疫グロブリンは、2つの重鎖および2つの軽鎖からなる四量体であり、全体の分子量は約150kDaである。ラクダ科のメンバーの血清抗体の多くは、分子量約80kDaのホモ二量体IgGである(Hamers-Casterman et al. 1993 Nature, 363, 446-448)。そのような重鎖免疫グロブリン(Ig)は、3つのドメインを有し、その可変領域はVHH(重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン)と称される。組換えVHH(約12〜14kDa)は、抗原結合ドメイン全体を構成し、広範な抗原結合プロファイルを示す。その超可変領域の拡大によりユニークな性質が示され、例えば、3〜4個の疎水性フレームワーク残基(通常の抗体VLと相互作用する)が、より親水性のアミノ酸に置換される。拡大されたCDRを安定化するために、通常のジスルフィド結合に加えて、VHHは、ヒトコブラクダの場合はCDR1とCDR3の間に、ラマの場合はCDR2とCDR3の間に、さらなるジスルフィド結合を有しうる(Harmsen and De Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol., 77, 13-22; Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302)。拡大されたCDR3のループは凸型のコンフォメーションをとり、通常のパラトープは凹型または平面状の構造に限られる(Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302)。これらの特徴によってVHHは、通常の抗体と比較した場合、免疫原性がより低いユニークなエピトープを認識する(Lafaye et al. 2009 Mol Immuno., 46, 695-704; Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health., 48, 561-568)。VHHは1価抗体として定義されるが、親和性効果はデフォルトで除外され、生物学的活性はインビトロIC50として測定され、これは通常の2価抗体分子のものと同等である(Thys et al. 2010 Antiviral Res., 87: 257-264)。
用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同である抗体の集団から得られる抗体をさし、すなわち、該集団に含まれる各抗体は、(わずかな量で存在する可能性のある天然の変異を除き)同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して高度に特異的である。さらに、抗原上の異なる抗原決定基(エピトープ)を標的とする異なる抗体を通常含む通常のポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の抗原決定基またはエピトープのみを標的とする。
いくつかの態様において、本開示は、キメラ ラクダ科/ヒト抗体、特に、VHおよび/またはVLドメインの全体がラクダ科配列(例えばラマまたはアルパカ)であり、残部が完全にヒト配列からなるキメラ抗体に関する。さらに、いくつかの好ましい態様において、本開示は、VHおよび/またはVLドメインが、能動免疫により得られるラクダ科VHおよび/またはVLドメインと比較して、フレームワーク領域における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、「ヒト化」または「生殖細胞系列化」ラクダ科抗体およびキメラ ラクダ科/ヒト抗体に関する。ヒト生殖細胞系列VHまたはVLドメインに対する配列同一性パーセントは、そのような「ヒト化」プロセス、すなわち、元のラクダ科VHまたはVLドメイン中に存在するミスマッチアミノ酸残基の、ヒト生殖細胞系列VHまたはVLドメイン中の対応する残基による置換、によって高められる。
本開示は、天然、組換えVHHまたはVHを包含する。
「組換え」は、遺伝子工学的方法(クローン化、増幅)によるVHHまたはVHの生産を伴う。
本開示によるVHHは、単量体またはホモ重合体、例えばホモ二量体もしくはホモ三量体の形態でありうる。
抗体重鎖および軽鎖のN末端に隣接する約110アミノ酸の配列は、高度に可変であり、可変領域(Fv領域)と呼ばれる。残部のC末端に近いアミノ酸配列は、比較的保存的であり、定常領域と呼ばれる。可変領域は3つの超可変領域(HVR)および4つの比較的保存されたフレームワーク領域(FR)を含む。抗体の特異性を決定する該3つの超可変領域は、相補性決定領域(CDR)とも称される。各軽鎖可変領域(LCVR)および各重鎖可変領域(HCVR)は、3つのCDR領域および4つのFR領域からなり、その並びは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、次のとおりである:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4。軽鎖の3つのCDR領域はLCDR1、LCDR2およびLCDR3と称され、重鎖の3つのCDR領域はHCDR1、HCDR2およびHCDR3と称される。本開示において抗体または抗原結合フラグメントのLCVRおよびHCVR領域中のCDRアミノ酸残基の数および位置は、知られているKabatナンバリング基準にしたがう(LCVR1〜3、HCDR1〜3)。
本開示の抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくはヒト化抗体を包含する。
用語「アルパカ由来抗体」とは、ヒトIL−6Rに対するアルパカ由来モノクローナル抗体のことで、当分野の知識および技術にしたがって調製しうる。そのような抗体の調製のために、IL−6R抗原を対象に注射し、その後、所望の配列または機能性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離するか、またはファージディスプレイ技術によって、免疫学的ライブラリーを樹立して所望の機能を有する抗体を単離する。本開示の特定の一態様において、アルパカ由来IL−6R抗体またはその抗原結合フラグメントは、アルパカ重鎖Fc領域をさらに含みうる。
用語「キメラ抗体」とは、アルパカ由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域(またはFc領域)との融合によって形成される抗体のことであり、キメラ抗体では、アルパカ由来抗体によって誘導される免疫反応が減弱される。キメラ抗体を作製するために、まず、特定のアルパカ由来モノクローナル抗体をつくるハイブリドーマまたは抗体ライブラリーを構築し、次いで、アルパカ由来可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子(またはFc領域)と連結してキメラ遺伝子を作製し、これを発現ベクターに挿入し、最後に原核生物または真核生物系においてキメラ抗体分子を発現させる。本開示の好ましい一態様において、IL−6Rキメラ抗体の重鎖は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4の重鎖定常領域(またはFc領域)またはそのバリアント、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2もしくはIgG4の重鎖定常領域(またはFc領域)またはIgG1、IgG2もしくはIgG4の重鎖定常領域(またはFc領域)のアミノ酸変異(例えばYTE変異または復帰変異)を含むバリアントをさらに含む。
用語「ヒト化抗体」とは、アルパカCDR配列をヒト抗体可変領域フレームワークの中に挿入することによって作製される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワークから作製される抗体をさす。ヒト化抗体は、多量のアルパカタンパク質成分を含むキメラ抗体によって誘発される異種反応の欠点を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公のDNAデータベース、または刊行物から得ることができる。例えば、生殖細胞系列のヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のDNA配列は、“VBase”ヒト生殖細胞系列配列データベース(ウェブでwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseにて利用可能)に含まれ、また、Kabat, E A, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.に記載されている。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列は、活性維持のために、最小限の復帰変異に付される。本開示のヒト化抗体は、CDR親和性成熟がファージディスプレイによって行われたヒト化抗体をも包含する。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、1764の配列に基づいて、ヒト配列への段階的な変異が行われ、すなわち、活性維持のために、1764のFR領域に存在するアルパカ由来残基がヒト由来残基で段階的に置換される。
用語「VHH」とは、ラクダ科(ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ等)の重鎖抗体に由来する可変抗原結合ドメインに関する(Nguyen et al. 2000 EMBO J., 19, 921-930; Muyldermans 2001 J Biotechnol., 74, 277-302、およびVanlandschoot et al. 2011 Antiviral Res. 92, 389-407参照)。
一般に、ナノボディとは、下記(一般)構造:
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を有するアミノ酸配列として定義され得、ここで、FR1〜FR4はそれぞれ、フレームワーク領域1〜4をさし、CDR1〜CDR3はそれぞれ、相補性決定領域1〜3をさすす。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を有するアミノ酸配列として定義され得、ここで、FR1〜FR4はそれぞれ、フレームワーク領域1〜4をさし、CDR1〜CDR3はそれぞれ、相補性決定領域1〜3をさすす。
本書において用いられる用語「抗体フレーム領域」または「抗体フレームワーク領域」とは、可変ドメインの抗原結合ループ(CDR)の足場の役割を有する可変ドメイン(VH)部分をさす。これは本質的に、CDR以外の可変ドメインをさす。
抗体の「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」なる用語は、抗原(例えばIL−6R)への特異的結合能力を維持する1つまたはそれ以上の抗体フラグメントをさす。抗体の抗原結合機能は、完全抗体のフラグメントによって達成されうることが示されている。抗体の「抗原結合フラグメント」なる用語に含まれる結合性フラグメントの例には、以下のものが含まれる:
(i) Fabフラグメント、すなわち、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる1価フラグメント;
(ii) F(ab’)2フラグメント、すなわち、ヒンジ領域に存在するジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメント;
(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;
(iv) 抗体の1つのアームのVHおよびVLドメインからなるFvフラグメント;
(v) VHHドメインからなる、シングルドメインまたはdAbフラグメント(Ward et al, (1989) Nature 341:544-546);
(vi) 単離された相補性決定領域(CDR);または
(vii)場合により合成リンカーで連結された、2つまたはそれ以上の別個のCDRの組み合わせ;
(viii)VHHおよびFcによって形成された融合タンパク質;
(ix) VHHおよび抗体重鎖定常領域によって形成された融合タンパク質。
(i) Fabフラグメント、すなわち、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる1価フラグメント;
(ii) F(ab’)2フラグメント、すなわち、ヒンジ領域に存在するジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む2価フラグメント;
(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;
(iv) 抗体の1つのアームのVHおよびVLドメインからなるFvフラグメント;
(v) VHHドメインからなる、シングルドメインまたはdAbフラグメント(Ward et al, (1989) Nature 341:544-546);
(vi) 単離された相補性決定領域(CDR);または
(vii)場合により合成リンカーで連結された、2つまたはそれ以上の別個のCDRの組み合わせ;
(viii)VHHおよびFcによって形成された融合タンパク質;
(ix) VHHおよび抗体重鎖定常領域によって形成された融合タンパク質。
さらに、「抗原結合フラグメント」は、IL−6Rに結合することができるVHHドメインの3つのCDRを含む他の抗原結合形態をも包含する。
本開示はさらに、VHHドメインの超可変ループまたはCDRがラクダ科に由来するが、ラクダ科に由来する超可変ループまたはCDRの少なくとも1つが、ラクダ科由来コーディング配列と比較して1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含むように組換えられている、抗原結合ポリペプチドを包含する。そのような変更は、超可変ループ/CDRの「ヒト化」を包含する。そのように組換えられたラクダ科由来HV/CDRは、ラクダ科によってコードされるHV/CDRのものと「実質的に同一」のアミノ酸配列を依然示すことができる。ここで、「実質的に同一」とは、ラクダ科によりコードされるHV/CDRと比較したときの1つ以下、または2つ以下、または3つ以下のアミノ酸配列ミスマッチを許容しうる。
本開示の抗体は、任意のアイソタイプのものでありうる。ヒト処置用の抗体のタイプは、典型的には、IgA、IgD、IgE、IgG、IgMである。通常、抗体はIgG型抗体であり、その場合、それは4つのサブタイプ、すなわちIgG1、IgG2aおよびIgG2b、IgG3、またはIgG4のいずれのものであってもよい。これらサブタイプにおいて、Fc部分における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失が許容されるか、または他の構造改変、例えばFc依存性機能の向上もしくは低下のための構造改変が許容される。
本開示のディアボディは、下記ステップで生産することができる:ヒトIL−6Rを特異的に認識し細胞外領域(アミノ酸配列またはその立体構造)に結合する本開示のモノクローナル抗体のVHHをコードするcDNAを得るステップ;ペプチドリンカーが8個またはそれ以下のアミノ酸残基の長さとなるように該VHHをコードするDNAを構築するステップ;該DNAを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ;そしてその後、ディアボディを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。
VHHを構成する1つまたはそれ以上のCDR領域によって、CDR含有ペプチドを構築する。複数のCDRを含むペプチドは、直接に、または適当なペプチドリンカーを介して、連結されうる。
本開示のCDR含有ペプチドは、以下のステップによって生産することができる:ヒトIL−6Rを特異的に認識し細胞外領域(アミノ酸配列またはその立体構造)に結合する本開示のモノクローナル抗体のVHHのCDRをコードするDNAを構築するステップ;該DNAを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ;そしてその後、該ペプチドを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。CDR含有ペプチドは、化学合成方法、例えばFmoc法またはtBoc法によって生産することもできる。
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位(例えばIL−6R分子上の特定の部位)をさす。エピトープは典型的には、特定の三次構造をとる少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の連続するかまたは連続しないアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris ed. (1996)を参照されたい。
「特異的な結合」、「選択的な結合」、「…に選択的に結合する」および「…に特異的に結合する」なる表現は、抗体が、抗原上の予め決定されたエピトープに結合することをいう。典型的には、抗体は、約10−7M未満、例えば約10−8M、10−9Mもしくは10−10M未満の、またはより小さい親和性(KD)で結合する。
記号「KD」または「Kd」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。典型的には、本開示の抗体はIL−6Rに、例えばBIACORE装置を用いる表面プラズモン共鳴(SPR)法による測定で、約10−7M未満、例えば約10−8M、10−9Mもしくは10−10M未満の、またはより小さい平衡解離定数(KD)で結合する。
用語「競合」とは、同じエピトープを競合する複数の抗原結合タンパク質(例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体)に関して用いられるとき、抗原結合タンパク質間で競合が起こることを意味し、これは下記アッセイによって決定される:試験する抗原結合タンパク質(例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント)は、参照抗原結合タンパク質(例えば、リガンドまたは参照抗体)と共通の抗原(例えば、IL−6R抗原またはそのフラグメント)との間の特異的結合を、抑制または阻害(例えば低減)する。抗原結合タンパク質どうしが競合するかを決定するために、多くの種類の競合結合アッセイが利用可能である。そのようなアッセイは、例えば、直接的または間接的な固相放射免疫アッセイ(RIA);直接的または間接的な固相酵素免疫アッセイ(EIA);サンドイッチ競合アッセイ(例えばStahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253参照);直接的な固相標識アッセイ;直接的な固相標識サンドイッチアッセイ(例えばHarlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照);I−125標識を用いる直接的な固相標識RIA(例えばMorel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15参照);直接的な固相ビオチン−アビジンEIA(例えばCheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552参照);および直接的な標識RIA(Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82)である。アッセイは典型的には、試験される標識されていない抗原結合タンパク質と、標識された参照抗原結合タンパク質との両方に結合可能な、(固体表面上または細胞表面上の)精製された抗原の使用を伴う。試験する抗原結合タンパク質の存在下に固体表面または細胞に結合された標識の量を測定することによって、競合阻害が調べられる。試験する抗原結合タンパク質は通常、過剰に存在する。(抗原結合タンパク質と競合する)競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質;および参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープの十分近くのエピトープ(ここで、該2つのエピトープは、結合を妨害するよう、立体障害し合う)に結合する抗原結合タンパク質を包含する。競合的結合を調べる方法についてのさらなる詳細は、本書の実施例に記載される。典型的には、競合する抗原結合タンパク質は、それが過剰に存在する場合、参照抗原結合タンパク質と共通の抗原との間の特異的結合を少なくとも40〜45%、45〜50%、50〜55%、55〜60%、60〜65%、65〜70%、70〜75%または75%もしくはそれ以上阻害しうる。いくつかの態様において、結合は少なくとも80〜85%、85〜90%、90〜95%、95〜97%または97%もしくはそれ以上阻害される。
本書において、用語「核酸分子」とは、DNA分子およびRNA分子をさす。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖のDNAである。核酸は、別の核酸配列との機能的関連性をもって配置されるとき、「作動可能に連結」されているものと考える。例えば、プロモーターまたはエンハンサーはコーディング配列に、該配列の転写に影響を及ぼす場合、作動可能に連結される。
用語「ベクター」とは、それが連結する別の核酸を輸送することのできる核酸分子をさす。一態様において、ベクターは「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるDNAセグメントがライゲートされていてもよい、環状二本鎖DNAループをさす。他の一態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるDNAセグメントが該ウイルスゲノムにライゲートされていてもよい。本開示のベクターは、それが導入された宿主細胞内で自己複製可能であるか(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター)、または宿主細胞への導入後に宿主細胞ゲノムと一体化され得、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される(例えば、エピソーマルでない哺乳動物ベクター)。
抗体および抗原結合フラグメントを生産および精製する方法は当分野において知られており、例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 5-8 and 15を参照することができる。当分野で知られる方法によって、例えば、マウスをヒトIL−6Rまたはそのフラグメントで免疫し、その後、生じた抗体を変性、精製およびアミノ酸配列決定することができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来CDRの中に1つまたはそれ以上のヒトフレームワーク領域を導入するように組換えられる。ヒトFR生殖細胞系列配列は、ヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースとMOEソフトウェアとを利用して得ることができ、ImMunoGeneTics (IMGT) ウェブサイトhttp://imgt.cines.fr、またはThe Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351から利用可能である。
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入されている細胞をさす。宿主細胞は、微生物(例えば細菌)、植物または動物の細胞を包含しうる。形質転換を受けることのできる細菌は、下記のものを包含する:腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌またはサルモネラ属の株;バシラス科のメンバー、例えば枯草菌;肺炎球菌;レンサ球菌およびインフルエンザ菌。適当な微生物は、出芽酵母およびピキア酵母を包含する。適当な動物宿主細胞株は、CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞株)、HEK細胞(例としてHEK293E細胞が挙げられるが、それに限定されない)、およびNS0細胞等を包含するが、それに限定されない。
本開示の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、既知の方法を用いて調製および精製しうる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするcDNA配列を、GS発現ベクター中にクローン化および組換えしうる。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターを、CHO細胞に安定にトランスフェクトしうる。当分野で知られるより推奨される方法として、哺乳動物発現系によって、グリコシル化、典型的には、Fc領域の高度に保存されたN末端部位におけるグリコシル化をもたらしうる。適当なクローンは、ヒトIL−6Rに特異的に結合する抗体の発現について確認されうる。抗体生産のために、陽性クローンを、バイオリアクター内で血清不含有培養培地中で増殖させうる。抗体が分泌された培養培地を、従来の方法で精製しうる。精製のために、例えば、調整緩衝液で平衡化したプロテインAまたはGのSepharose FFカラムを使用しうる。カラムを洗って非特異的結合成分を除去し、次いで、結合した抗体をpH勾配によって溶出し、抗体画分をSDS−PAGEによって検出し、収集する。抗体を、一般的な方法で濾過および濃縮しうる。可溶性の凝集物および重合体を、一般的な方法、例えばサイズ排除またはイオン交換によって、効果的に除去しうる。その後、得られた産物を直ちに冷凍、例えば−70℃で冷凍するか、または凍結乾燥しうる。
動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に対しての、「投与」、「投与する」または「処置(処理)」とは、外来の薬剤、処置剤、診断剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体と接触させることをさす。「投与」、「投与する」または「処置(処理)」とは、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験の方法をさすことができる。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させること、および試薬を、細胞と接触した状態にある流体と接触させることを包含する。「投与」、「投与する」または「処置(処理)」とは、インビトロおよびエクスビボの処置(処理)、例えば、細胞の、試薬、診断剤、結合組成物または他の細胞による処理をも意味する。ヒト、動物または研究対象に対する「処置(処理)」とは、治療的処置、予防または防止の手段、研究および診断のための適用をさす。
「処置(処理)」とは、処置剤、例えば本開示の任意の抗体またはそのフラグメントを含む組成物を、それが処置活性を示すことがわかっている1つまたはそれ以上の疾患症状を有する患者に、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、該剤は、処置される患者または集団の1つまたはそれ以上の疾患症状を、臨床的に測定可能な程度の該症状の改善の誘導または該症状の進行の防止によって、軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状の軽減に有効な処置剤の量(「処置有効量」ともいう)は、患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘導する薬物の能力といった因子によって異なりうる。疾患状態が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状況を評価するために医師または他のヘルスケア提供の専門家により通常用いられる任意の臨床的測定方法によって評価することができる。本開示のある一つの態様(例えば処置方法または製造物品)は、すべての患者における標的疾患症状軽減に有効でないことがあるが、スチューデントのt検定、カイ二乗検定、マン-ホイットニーのU検定、クラスカル-ウォリス検定(H−検定)、ヨンクヒール-タプストラ検定、およびウィルコクソン検定といった当分野で知られる任意の統計学的検定法によって決定される統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を軽減しうる。
「保存的改変」または「保存的置換」とは、変化をしばしば、タンパク質の生物学的活性を変えることなくもたらすことができるように、タンパク質中のアミノ酸を、同様の性質(例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性/親水性、バックボーンのコンフォメーション、および硬さ等)を有する他のアミノ酸に置き換えることをさす。当業者は、ポリペプチドの本質的でない領域における単一のアミノ酸置換は一般的に、実質的に生物学的活性を変化しないことを認識する(Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照)。さらに、構造的または機能的に類似するアミノ酸による置換は、生物学的活性を変化させる可能性が低い。
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または防止するのに十分な量を包含する。有効量とは、診断を可能にするかまたは促進するのに十分な量をも意味する。特定の患者または動物対象に対する有効量は、処置する状態、患者の全身的健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の重篤度といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与プロトコルでありうる。
「外因(外来)」とは、文脈により生物、細胞または人体の外部で生産される物質のことをさす。「内因(内生)」とは、文脈により生物、細胞または人体の内部で生産される物質のことをさす。
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチド配列間、または2つのポリペプチド配列間の配列類似性をさす。比較される2つの配列の両方において、ある位置を同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットが占める場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占める場合、それら分子は該位置において相同である。2つの配列間の相同性パーセントは、2つの配列の間でマッチするかまたは相同である位置の数を、比較される位置の数で除し、100を掛けた関数である。例えば、配列が最適にアラインされたとき、2つの配列間で10個の位置のうちの6個がマッチするかまたは相同である場合、2つの配列の相同性は60%であり、2つの配列間で100個の位置のうちの95個がマッチするかまたは相同である場合、2つの配列の相同性は95%である。一般に、比較は、2つの配列が相同性パーセントが最大となるようにアラインされたときに行われる。
本書において「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」なる表現は、互換的に用いられ、いずれもその子孫を包含する。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代の対象細胞、および継代数に関わらず、それから誘導された培養物を包含する。意図されるかまたなされない変異のために、子孫はDNAの中身において完全に同一ではない可能性があることも理解すべきである。元の形質転換細胞と同じ機能または生物学的活性を有するスクリーニングされた変異子孫が包含される。異なる意味が意図される場合、それは、その文脈から明らかに理解されうる。
本書において「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、微量の核酸、RNAおよび/またはDNAの特定の部分を増幅する手順または技術をさし、例えば米国特許第4683195号に記載されている。通常、関心の領域または関心の領域を越える領域の各末端の配列情報が、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能とするために必要である。そのようなプライマーは、その配列が、増幅するテンプレートの相対する鎖と同一または同様でありうる。2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅対象の末端に対応する。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNA配列、および全細胞RNAから転写されたcDNA、バクテリオファージまたはプラスミドの配列を増幅するために使用することができる。Mlis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照されたい。本開示において用いられるPCR試験は、核酸試験サンプルをポリメラーゼ反応により増幅する方法の1例であって、それが唯一の方法ではないと解釈される。該方法は、特定の核酸部分を増幅または生産するための、プライマーとしての既知の核酸、および核酸ポリメラーゼの使用を含む。
「任意の」または「任意に(場合により)」とは、そのように記載される事象または状況が必ずしも起こらないことを意味し、記載は、事象または状況が起こるかまたは起こらない例を含む。例えば、「場合により1〜3個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在することができるが、その存在は必須ではないことを意味する。
「医薬組成物」とは、本開示の1つまたはそれ以上の化合物、またはその生理学的/薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および他の化学的成分、例えば生理学的/薬学的に許容される担体および賦形剤を含む混合物をさす。医薬組成物は、生体への投与の促進、活性成分の吸収の促進、およびそれによる生物学的効果の発揮を目的とするものである。
2.実施例および試験例
下記実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
下記実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
本開示の実施例または試験例において特定の条件を示していない実験方法は全般に、従来の条件にしたがって、または製造者の推奨する条件にしたがって行われる。Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Contemporary Molecular Biology Methods, Ausubel et al., Greene Publishing Association, Wiley Interscience, NYを参照されたい。入手元を特定していない試薬は、市販される試薬である。
実施例
実施例1:抗原、関連のタンパク質および抗体といった試薬の調製
Fc、HisおよびBP15タグ(細胞内部位指向ビオチン化のために用いられる)を有するヒトインターロイキン6受容体(それぞれ、hIL−6R.Fc、hIL−6R.His、hIL−6R.BP15)をコードする配列、Flag.Hisタグを有するカニクイザルIL−6R(cIL−6R.FH)をコードする配列、FcまたはHisタグを有するヒトIL−6(IL−6.Fc、IL−6.his)をコードする配列、ならびにFcタグを有するgp130をコードする配列を、哺乳動物細胞における一過性発現のために、分子クローニング法によって発現ベクター中に構築した。
実施例1:抗原、関連のタンパク質および抗体といった試薬の調製
Fc、HisおよびBP15タグ(細胞内部位指向ビオチン化のために用いられる)を有するヒトインターロイキン6受容体(それぞれ、hIL−6R.Fc、hIL−6R.His、hIL−6R.BP15)をコードする配列、Flag.Hisタグを有するカニクイザルIL−6R(cIL−6R.FH)をコードする配列、FcまたはHisタグを有するヒトIL−6(IL−6.Fc、IL−6.his)をコードする配列、ならびにFcタグを有するgp130をコードする配列を、哺乳動物細胞における一過性発現のために、分子クローニング法によって発現ベクター中に構築した。
陽性抗体は次のものである:Roche/Chugaiから入手可能な抗IL−6Rヒト化mAbトシリズマブ(その配列はWO1996011020A1に記載されている);抗IL−6Rシングルドメイン抗体20A11およびFcにより形成される融合タンパク質(Ablynx);Regeneronから入手可能なサリルマブ(その配列はCN101454345Bに記載されている)。それらのアミノ酸配列は次のとおりである:
タンパク質の発現のために、HEK293E細胞(すなわち293E細胞)をPEIを用いて一過性にトランスフェクトした。その後、タグまたは融合タンパク質に応じて、次のように精製法を選択した:
1.ニッケルカラム精製(Hisタグ付きタンパク質の単離):発現産物を含む上清を高速遠心分離して、不純物を除去した。ニッケルカラムをPBS緩衝液で平衡化し、2〜5カラム体積で洗った。上清サンプルをNi Sepharose Excel Column(GE Healthcare, Cat #17-3712-01)に、ある流速で適用した。カラムをPBS緩衝液で、A280の測定値がベースラインに低下するまで洗い、次いで、PBS+10mMイミダゾールで洗って、望ましくない非特異的結合タンパク質を除去し、流出液を収集した。最後に、標的タンパク質を、300mMイミダゾールを含むPBS溶液で溶出し、溶出ピークを収集した。
2.排除クロマトグラフィー精製:SECカラム(superdex75)をPBSで予め平衡化した。サンプルを適用し(適用体積はカラム体積の3%以下とすべきである)、次いでPBSを移動相として溶出した。各溶出ピークを収集し、標的タンパク質含有画分をSDS−PAGEにより同定した。
3.Flagアフィニティークロマトグラフィー(Flag含有タンパク質の単離):Flag親和性の充填材を0.5×PBSで平衡化し、2〜5カラム体積で洗った。精製するサンプルを充填材と共に、室温で2時間インキュベートした。充填材を5カラム体積の0.5×PBSで洗い、標的タンパク質を、100μg/mlの3×Flagポリペプチドを含むTBS緩衝液で溶出し、収集し、SDS−PAGEにより同定した。
4.キメラ抗体のアフィニティークロマトグラフィー(Fc含有タンパク質の単離):発現産物を含む上清を高速遠心分離して不純物を除去し、発現組換え抗体を含む上清をプロテインAカラムを用いて精製した。カラムをPBSで、A280測定値がベースラインまで低下するまで洗った。標的タンパク質を、100mM酢酸(pH3.0)で溶出し、1M Tris−HCl(pH8.0)で中和した。溶出サンプルを適当に濃縮し、PBSで予め平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex 200(GE)によってさらに精製した。解重合産物のピークを収集し、使用のためにアリコートに分けた。
実施例2:ラマの免疫、ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
免疫原として用いたIL−6R.FcまたはIL−6R.Hisを、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバントまたはPBSと混合し、アルパカに6回注射した。4回目、5回目および6回目の免疫の前と後に、力価測定のために末梢血サンプルを採った。最後の回の免疫の後、脾臓細胞を抽出した。
免疫原として用いたIL−6R.FcまたはIL−6R.Hisを、完全フロイントアジュバントもしくは不完全フロイントアジュバントまたはPBSと混合し、アルパカに6回注射した。4回目、5回目および6回目の免疫の前と後に、力価測定のために末梢血サンプルを採った。最後の回の免疫の後、脾臓細胞を抽出した。
単離したリンパ球を、RNA抽出、その後のcDNAへの逆転写に付した。ライブラリーの構築のために2ステップPCRを用いた:第1のステップにおいて、PCR反応のために、FR1領域に対して設計された3つのフォワードプライマー、およびCH2領域に対して設計された3つのリバースプライマーを等しい比で混合した。小フラグメントをアガロースゲルから回収した。第2のステップでは、フォワードおよびリバースプライマーの両方にsfiI制限酵素部位および保護塩基を組み込んだ。sfiI制限酵素部位および保護塩基以外のフォワードプライマー配列は、1回目のPCRに用いたフォワードプライマーと同一であった。リバースプライマーはFR4領域に対して設計された。第2ステップのPCR産物を回収し、ファージミドベクター中にクローン化し、SS320コンピテント細胞に電気的導入した。最終的に、キャパシティー1.74E9のファージディスプレイライブラリーを得た。
構築したライブラリーにヘルパーファージをパッケージして、ファージを形成した。ファージディスプレイライブラリーを、IL−6R結合についてパニングおよびスクリーニングした。所望のクローンをELISAによって同定した。パニングは、液相および固相法の両方で行った:液相法においては、ビオチン化IL−6R.BP15抗原を液相中でファージ粒子に結合させ、次いでストレプトアビジン磁気ビーズで捕捉した;固相法においては、ELISAプレートをIL−6R.Fcでコートし、ファージ粒子を結合させた。パニングを2回行った後、モノクローナルパックされたファージを収集した。結合活性ならびにIL−6およびgp130ブロック活性をELISAによって調べた。ELISAの方法は次のとおりである:
IL−6R結合ELISA:プレートを、100μl/ウェルのストレプトアビジン2ng/μlで、4℃で一晩コートし、2%MPBSCaMgで、37℃で1時間ブロックした。その後、プレートを洗い、IL−6R.BP15 1ng/μlと共に37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、50μl/ウェルの2%MPBSCaMgおよび50μl/ウェルのファージ上清を加えた。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗い、次いで、1:5000希釈で100μlの抗M13 HRPを加えた。37℃で1時間インキュベートし、洗った後、プレートの発色のために100μl/ウェルのTMBを加えた。100μlの1M H2SO4の添加により反応を停止した。OD450によってシグナルを測定した。
IL−6ブロックELISA:プレートを、100μl/ウェルのIL−6.Fc 2ng/μlでコートした。4℃で一晩インキュベートした後、プレートを2%MPBSCaMg(2%ミルク、0.90mM CaCl2、0.49mM MgCl2、1×PBS)で、37℃で1時間ブロックした。プレートを洗った後、100μlのIL−6R.his(1ng/μl)と共に37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、100μlIL−6R.hisと共に、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗い、50μl/ウェルのファージ上清+50μl/ウェルの2%MPBSCaMgブロッキング液共に、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗った後、1:5000希釈で100μlの抗M13 HRP(GE healthcare, Cat# 27-9421-01)と共に、37℃で1時間インキュベートした。洗浄およびTMBインキュベーションの後、100μlの1M H2SO4の添加により反応を停止した。OD450のシグナルを測定した。
gp130ブロックELISA:プレートを、100μl/ウェルのgp130 2ng/μlで4℃で一晩コートし、2%MPBSCaMgで、37℃で1時間ブロックした。次いで、プレートを洗い、100μlのIL−6R.his 1ng/μl+IL−6R.his 1ng/μlと共に37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、50μl/ウェルのファージ上清+50μl/ウェルの2%MPBSCaMgブロッキング液を加え、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートを洗い、1:5000希釈で100μlの抗M13 HRPを各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、100μl/ウェルのTMBでプレートを発色させた。100μlの1M H2SO4の添加により反応を停止した。OD450のシグナルを測定した。
例えば次のような予め選択された基準に合うクローンを、シーケンシングのために選択した:陽性のIL−6R結合結果、OD450(IL−6R結合ELISA)/OD450(IL−6ブロックELISA)(IL−6R/IL−6)の値が4またはそれ以上;およびOD450(IL−6ブロックELISA)/OD450(IL−6ブロックELISA)(IL−6/gp130)の値が3またはそれ以上。
配列を解析し、独特の配列を有するクローンのパネルを同定した。
実施例3:Fc融合タンパク質の構築および特徴付け
選択されたクローンを分子および細胞レベルでさらに特徴付けるために、同定されたVHHをFcのN末端に融合し、哺乳動物発現ベクター中にクローン化し、293E細胞中で一過性に発現させた。タンパク質A精製後、VHH−hFc融合タンパク質を下記試験に付した。
選択されたクローンを分子および細胞レベルでさらに特徴付けるために、同定されたVHHをFcのN末端に融合し、哺乳動物発現ベクター中にクローン化し、293E細胞中で一過性に発現させた。タンパク質A精製後、VHH−hFc融合タンパク質を下記試験に付した。
IL−6Rブロックアッセイ(試験例1)、gp130結合阻害アッセイ(試験例2)、U266B1細胞結合活性(試験例3)、およびIL−6刺激TF−1増殖抑制アッセイ(試験例4)。あらゆる面で最も良好な性質を有するIL−6Rシングルドメイン抗体1764を選択した。そのヌクレオチド配列は次のとおりである:
上記シングルドメイン抗体VHHを、融合タンパク質形成のために下記のFcフラグメントと融合させた。
実施例4:1764のヒト化
処置用抗体の抗薬剤反応を回避するために、本開示においてラマ由来分子1764を、その免疫原性を低下するようヒト化した。ヒト化は、1764の配列に基づき、ヒト配列への段階的変異の様式で行い、1764のFR領域におけるラマ由来アミノ酸残基を、ヒト由来残基で段階的に置換した。設計された配列は次のとおりである:
注釈:例えば、A14Pは、1764の位置14におけるアミノ酸残基AがPで置換されたことを示す。本表におけるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号14に示される天然の位置番号にしたがう。
処置用抗体の抗薬剤反応を回避するために、本開示においてラマ由来分子1764を、その免疫原性を低下するようヒト化した。ヒト化は、1764の配列に基づき、ヒト配列への段階的変異の様式で行い、1764のFR領域におけるラマ由来アミノ酸残基を、ヒト由来残基で段階的に置換した。設計された配列は次のとおりである:
注釈:例えば、A14Pは、1764の位置14におけるアミノ酸残基AがPで置換されたことを示す。本表におけるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号14に示される天然の位置番号にしたがう。
設計された9つのクローンをFc(アミノ酸配列を配列番号19に示した)に融合させ、哺乳動物一過性発現ベクター中に構築し、293E細胞において一過性に発現させた。アフィニティー精製によって、VHH−hFc融合タンパク質を得た。
精製したIL−6R抗体融合タンパク質(Fcフラグメントを含み、以下、IL−6R抗体とも称する)を、下記試験に付した。
試験例1:IL−6R抗体によるIL−6Rブロックアッセイ
IL−6R/IL−6複合体の形成は、IL−6RへのIL−6R抗体の結合によって阻害され得、したがって、細胞膜上におけるIL−6/IL−6R複合体形成阻害によって、下流細胞シグナル伝達が遮断されうる。発現され精製されたすべての抗体を、IL−6とIL−6Rの間の結合を阻害するその能力について、ELISAによって試験した。手順は次のとおりであった:
IL−6R/IL−6複合体の形成は、IL−6RへのIL−6R抗体の結合によって阻害され得、したがって、細胞膜上におけるIL−6/IL−6R複合体形成阻害によって、下流細胞シグナル伝達が遮断されうる。発現され精製されたすべての抗体を、IL−6とIL−6Rの間の結合を阻害するその能力について、ELISAによって試験した。手順は次のとおりであった:
プレートを100μlのIL−6.Fc 2ng/μlで、4℃で一晩コートし、2%スキムミルクで37℃で1時間ブロックした。次いで、プレートを洗い、100μlの試験サンプル段階希釈物、およびIL−6R.BP15 1ng/μlと共にインキュベートした。37℃で1時間のインキュベーション後、プレートを洗い、HRP−ストレプトアビジン(Jackson, 016-030-084)を1:4000希釈でプレートに加えてインキュベートした。洗浄し、100μlのTMBで室温で5分間発色させた後、100μlの1M H2SO4を加えて反応を停止した。OD450値を測定した。結果を図1A〜1Cに示す。
試験例2:IL−6R抗体によるgp130結合阻害アッセイ
IL−6とIL−6Rの複合体はgp130に結合することができる。本アッセイは、選択された抗体がIL−6Rへの結合によってIL−6/IL−6R/gp130複合体の形成を阻害することができるかを評価しうる。
IL−6とIL−6Rの複合体はgp130に結合することができる。本アッセイは、選択された抗体がIL−6Rへの結合によってIL−6/IL−6R/gp130複合体の形成を阻害することができるかを評価しうる。
プレートを、1μg/mlのgp130(PBSで希釈)で、4℃で一晩コートした。コーティング液を廃棄し、プレートをPBS中の5%スキムミルクで37℃で2〜3時間ブロックした。ブロッキング後、プレートを洗浄用緩衝液PBST(PBS中の0.1%Tween−20)で3回洗った。
IL−6.hisおよびIL−6R.BP15を、PBS中の1%BSAで希釈して0.06μg/mlの濃度とした。IL−6R抗体を、50μg/mlから始めて希釈緩衝液で連続1:3希釈し、試験抗体サンプルおよびIL−6/IL−6R複合体の両方をプレートに入れ、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレートを、洗浄用緩衝液PBST(PBS中の0.1%Tween−20)で3回洗った。
1:2000希釈した二次抗体HRPストレプトアビジン(Jackson, 016-030-084)をプレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄の後、TMBを用いて発色させた。OD450値を測定した。結果を図2Aおよび2Bに示す。
試験例3:IL−6R抗体のU266B1細胞結合活性
細胞表面IL−6RへのIL−6R抗体の結合能力を試験するために、IL−6R発現U266B1細胞においてIL−6R抗体の結合アッセイを行った。U266B1細胞(ATCC(登録商標)TIB-196(商標))を収集し、4℃で5分間、400gで遠心分離した。終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁した後、4℃で5分間、400gで遠心分離した。2回洗浄後、細胞を10E5/ウェルで96ウェルプレートに播種した。各ウェルに50μlのサンプルを加え、4℃で45〜60分間インキュベートし、次いで終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBS 250μlを加えた。2回洗浄後、50μlの二次抗体Alexa Fluor@488ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Lifetechologies, A11013)(1:200希釈)を加え、暗所にて4℃で45分間インキュベートした。その後、プレートを、終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBS 250μl/ウェルで2回洗った。細胞の再懸濁のために、各ウェルに、100μl/ウェルの予め冷却したDPBSを加えた。機器(BD, FACSverse)上で検出を行った。結果をflowjoで解析し、図3に示した。
細胞表面IL−6RへのIL−6R抗体の結合能力を試験するために、IL−6R発現U266B1細胞においてIL−6R抗体の結合アッセイを行った。U266B1細胞(ATCC(登録商標)TIB-196(商標))を収集し、4℃で5分間、400gで遠心分離した。終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBSを用いて細胞ペレットを再懸濁した後、4℃で5分間、400gで遠心分離した。2回洗浄後、細胞を10E5/ウェルで96ウェルプレートに播種した。各ウェルに50μlのサンプルを加え、4℃で45〜60分間インキュベートし、次いで終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBS 250μlを加えた。2回洗浄後、50μlの二次抗体Alexa Fluor@488ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Lifetechologies, A11013)(1:200希釈)を加え、暗所にて4℃で45分間インキュベートした。その後、プレートを、終濃度10%のFBSを含む予め冷却したDPBS 250μl/ウェルで2回洗った。細胞の再懸濁のために、各ウェルに、100μl/ウェルの予め冷却したDPBSを加えた。機器(BD, FACSverse)上で検出を行った。結果をflowjoで解析し、図3に示した。
試験例4:IL−6R抗体によるIL−6刺激TF−1増殖抑制
IL−6は、膜型IL−6Rに結合することによって、下流シグナル伝達を開始し、TF−1細胞の増殖を誘導することができる。IL−6R抗体は、IL−6RへのIL−6の結合を阻害することができ、それによってTF−1細胞の増殖を抑制することができる。
IL−6は、膜型IL−6Rに結合することによって、下流シグナル伝達を開始し、TF−1細胞の増殖を誘導することができる。IL−6R抗体は、IL−6RへのIL−6の結合を阻害することができ、それによってTF−1細胞の増殖を抑制することができる。
TF−1細胞培養:TF−1白血病細胞(ATCC, CRL-2003)を、10%FBSを含むRPMI1640(2ng/mL rhGM−CSF)(GE, Catalog No. SH30809.01)中で培養し、1E6細胞/ml以下の細胞密度で、37℃、5%CO2のインキュベーター内に置いた。
IL−6刺激TF−1増殖阻害アッセイの手順:対数増殖期の細胞をPBSで3回洗い、800rpmで3分間遠心分離し、細胞密度をRPMI1640(FBS2%、組換えヒトIL−6 5ng/ml)で20000細胞/ウェル/180μlに調節した。20μlの試験抗体連続希釈物を96ウェルプレートに加え、3日間インキュベートした(連続希釈物の抗体濃度490nMで開始し、4.9×10−7nMまで10倍連続希釈)。検出のために、100μlの細胞懸濁液を100μlのCell Titer(Promega, Catalog No. G7573)と混合した。結合を表2に示す。
試験例5:IL−6R抗体はIL−6誘導ヘプシジン発現を抑制する
ヘプシジンの高発現は、炎症性貧血の主な原因である。IL−6は、下流シグナル伝達経路を活性化するIL−6Rとの結合によって、ヘプシジン発現をアップレギュレートしうる。したがって、IL−6R抗体は、IL−6とIL−6Rの間の結合を阻害することにより、IL−6誘導ヘプシジン発現を抑制しうる。実験デザインは次のとおりである:
群1:ブランク対照;
群2:IL−6のみで処理する陽性対照;
群3:1764−mu3およびIL−6で処理;
群4:トシリズマブおよびIL−6で処理。
ヘプシジンの高発現は、炎症性貧血の主な原因である。IL−6は、下流シグナル伝達経路を活性化するIL−6Rとの結合によって、ヘプシジン発現をアップレギュレートしうる。したがって、IL−6R抗体は、IL−6とIL−6Rの間の結合を阻害することにより、IL−6誘導ヘプシジン発現を抑制しうる。実験デザインは次のとおりである:
群1:ブランク対照;
群2:IL−6のみで処理する陽性対照;
群3:1764−mu3およびIL−6で処理;
群4:トシリズマブおよびIL−6で処理。
Hep3B細胞(Chinese Academy of Sciences, TCHu106)を、10%FBSを含むEME培地(Gibco, 11095098)中で培養し、37℃、5%CO2のインキュベーター内でインキュベートした。2〜3日毎に細胞を継代した。対数増殖期のHep3B細胞を、200000細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2のインキュベーター内で培養した。翌日、細胞が80%〜90%のコンフルエンシーに達したら、IL−6R抗体1764−mu3およびトシリズマブをそれぞれ群3および群4の各ウェルに終濃度5nMで加えた。37℃、5%CO2のインキュベーター内で30分間インキュベートした後、ブランク対照を除く各ウェルにIL−6タンパク質を終濃度10ng/mlで加えた。細胞をさらに24時間培養し、次いで細胞を収集し、全RNAを抽出し、cDNAに逆転写した。ヘプシジンのmRNAレベルを検出するために、cDNAを鋳型として用いて蛍光定量PCRを行った。ミクログロブリンmRNAの発現レベルを内部標準とした。結果を表3および図4に示す。
試験例6:抗体のBIAcoreアフィニティー(KD)アッセイ
Human Anti-Capture Kit(Cat. #BR-1008-39, GE)を用いてBiacore装置(Biacore T200, GE)においてバイオセンサーチップCM5(Cat.# BR-1000-12, GE)にヒト抗体キャプチャー抗体を製造者のプロトコルにしたがって共有結合カップリングさせ、それによって、ある量の試験する抗体を捕捉した。次いで、抗原(hIL−6R.hisおよびcIL−6R.FH)を一連の濃度勾配でチップ表面に流した。Biacore装置(Biacore T200, GE)を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出して結合および解離曲線を得た。
Human Anti-Capture Kit(Cat. #BR-1008-39, GE)を用いてBiacore装置(Biacore T200, GE)においてバイオセンサーチップCM5(Cat.# BR-1000-12, GE)にヒト抗体キャプチャー抗体を製造者のプロトコルにしたがって共有結合カップリングさせ、それによって、ある量の試験する抗体を捕捉した。次いで、抗原(hIL−6R.hisおよびcIL−6R.FH)を一連の濃度勾配でチップ表面に流した。Biacore装置(Biacore T200, GE)を用いて反応シグナルをリアルタイムで検出して結合および解離曲線を得た。
各解離サイクルの後に、バイオチップを洗い、Human Anti-Capture Kitに提供される再生液で再生した。本試験において使用したアミノカップリングキットは、GEから購入し(Cat. #BR-1000-50, GE)、緩衝液はHBS−EP+10×緩衝液(Cat.#BR-1006-69, GE)を脱イオン水で1×希釈したものであった(pH7.4)。
12匹のSDラット(Sipper-Beikai Experimental Animal Co., Ltd.)(雌雄同数)を6匹ずつの2群に分けた。薬物を静脈内注射した。処置群において、投与前と、投与の15分後、8時間後、1日後、2日後、4日後、7日後、10日後、14日後、21日後、および28日後に、全血サンプル0.2mlを抗凝固剤の添加なしに採った。血液サンプルを4℃で30分間置き、1000gで15分間遠心分離し、上清(血清)をEP管に入れ、−80℃で保存した。標的の濃度をELISAによって決定し、試験薬物の薬物動態パラメーターをWinnolinソフトウェアで計算した。試験結果を表6に示す。
1764−mu3および1764−mu4は、それぞれ半減期が7.7日および6.2日の一本鎖抗体である。
試験例8:加速安定性試験
いくつかの抗体について、抗体の安定性を観察するために加速試験を行った。1mg/mlの抗体融合タンパク質を40℃に3日間置いた後、沈殿物の存否を観察し、SEC検出に付した。試験結果を表7に示す。
いくつかの抗体について、抗体の安定性を観察するために加速試験を行った。1mg/mlの抗体融合タンパク質を40℃に3日間置いた後、沈殿物の存否を観察し、SEC検出に付した。試験結果を表7に示す。
上記本発明を、明確な理解のために、添付の図面および実施例を参照して詳細に説明した。しかしながら、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。すべての図面の数値の単位は、横座標に示す単位と同じである。本書において引用される特許および科学文献はいずれも、引用によってその全体を本書の一部とする。
Claims (18)
- CDR1、CDR2およびCDR3を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントにおいて、
CDR1の配列は、配列番号15の配列、および配列番号15の配列と3、2または1個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され;
CDR2の配列は、配列番号16の配列、および配列番号16の配列と3、2または1個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され;
CDR3の配列は、配列番号17の配列、および配列番号17の配列と3、2または1個のアミノ酸が異なるバリアント配列からなる群から選択され;
該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトIL−6Rに結合する、
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - CDR1配列が配列番号15の配列であり;
CDR2配列が配列番号16の配列であり;
CDR3配列が配列番号17の配列である、
請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 該モノクローナル抗体が、組換え抗体、好ましくはアルパカ由来抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される組換え抗体であり;
好ましくは、該モノクローナル抗体は配列番号14のVHHを含む、
請求項1または2に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 該ヒト化抗体が、配列番号14のVHHのバリアントを含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該VHHのバリアントが、配列番号14のVHHのFR領域において1〜15個のアミノ酸のヒト化変異を有し;好ましくは該アミノ酸変異は、配列番号14のVHHにおけるA14P、E23A、Q44G、V78L、K86R、N96A、A97F、Q116Lまたはそれらの組み合わせからなる群から選択され;最も好ましくは該バリアントのアミノ酸配列は配列番号20〜28からなる群から選択される、請求項4に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該抗体がヒト抗体Fc領域をさらに含み、好ましくは配列番号19のヒト抗体Fc領域を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 該抗原結合フラグメントが、シングルドメイン抗体、または3つのCDRを含むペプチドである、請求項1〜6のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、IL−6Rへの結合を競合し、IL−6RへのIL−6の結合を阻害する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 処置有効量の、請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および
1つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤
を含む医薬組成物。 - 請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
- 配列番号13の核酸分子との相同性が少なくとも80%であるポリヌクレオチドを含む、請求項10に記載の核酸分子。
- 請求項10または11に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞において、該宿主細胞は原核生物細胞および真核生物細胞であり、好ましくは該宿主細胞は真核生物細胞であり、より好ましくは該宿主細胞は哺乳動物細胞または酵母細胞である、宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法において、該方法は、
請求項13に記載の宿主細胞を培養するステップ;
該培養において請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積するステップ;および
該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するステップ
を含む、方法。 - ヒトIL−6Rを検出または測定する方法において、該方法は、請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをサンプルと接触させるステップを含む、方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ヒトIL−6Rを検出または測定するための試薬。
- ヒトIL−6Rが関与する疾患の治療または予防用医薬の製造における、請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項9に記載の医薬組成物、または請求項10もしくは11に記載の核酸分子の使用。
- 敗血症、多発性骨髄腫、腎細胞癌、形質細胞白血病、リンパ腫、Bリンパ組織過形成、前立腺癌、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、関節リウマチ、全身的に発症する若年性特発性関節炎、高γグロブリン血症、限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、キャッスルマン病、IgMγグロブリン疾患、心臓粘液腫、喘息、自己免疫性インスリン依存性糖尿病および炎症性貧血からなる群から選択される1つまたはそれ以上の疾患の治療または予防用医薬の製造における、請求項1〜8のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項9に記載の医薬組成物、または請求項10もしくは11に記載の核酸分子、またはそれらの組み合わせの使用。
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