BR112017003582B1 - Agente de anticorpo, uso do mesmo, composição farmacêutica e receptor de antígeno quimérico - Google Patents

Agente de anticorpo, uso do mesmo, composição farmacêutica e receptor de antígeno quimérico Download PDF

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Abstract

anticorpos, composições e usos. a presente divulgação descreve agentes de anticorpo anti-b7h3 e os usos relacionados aos mesmos. dentre outras coisas, a presente divulgação demonstra eficácia imunomoduladora particular de certos tais anticorpos. a presente divulgação descreve ainda, particularmente, anticorpos de alta afinidade ou de outro modo úteis, e agentes de anticorpo baseados nos mesmos, incluindo particularmente certas versões humanizadas e/ou de afinidade maturada de um anticorpo 8h9. em algumas modalidades, são fornecidos agentes de anticorpo que são úteis, por exemplo, no tratamento do câncer. em algumas modalidades, são fornecidos agentes de anticorpo que são úteis para aliviar a imunossupressão, por exemplo, mediada por células positivas para b7h3.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] O presente relatório descritivo faz referência a uma listagem de sequências (enviada eletronicamente como um arquivo .txt nomeado "2003080-0937_SL.txt" em 26 de agosto de 2015). O arquivo .txt foi criado em 31 de julho de 2015 e possui tamanho de 129.896 bytes. Todo o conteúdo da listagem de sequências é incorporado nesse documento por referência. A Descrição abaixo das Sequências lista a identidade das sequências na Listagem de Sequências.
ANTECEDENTES
[0002] Os tumores muitas vezes criam um microambiente que suprime o sistema imunológico. A remoção deste bloco imunológico tem sido um foco de muitos esforços para desenvolver terapias eficazes.
SUMÁRIO
[0003] A presente invenção fornece novos anticorpos que se ligam ao B7H3. Em algumas modalidades, tais anticorpos compartilham identidade de sequência significativa com o 8H9. Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos representam variantes humanizadas de afinidade maturada de 8H9.
[0004] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos se ligam a um epítopo no B7H3 que é reconhecido pelo 8H9. Dentre outras coisas, a presente invenção fornece a visão surpreendente que o m8H9, e variantes humanizadas dos mesmos, se ligam a um epítopo distinto no B7H3 que não é reconhecido por certos outros anticorpos para o B7H3. A presente invenção, portanto, define um conjunto útil de novos anticorpos - aqueles que não são m8H9, mas se ligam ao mesmo epítopo.
[0005] A presente invenção fornece um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3, e inclui uma cadeia leve de imunoglobulina, conforme é definido em uma SEQ ID No: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, e inclui uma cadeia pesada da imunoglobulina, como é definido na SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16.
[0006] Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 1 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves de imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 1 e cadeias pesadas de imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 2 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 2 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 3 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 3 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 4 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 4 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 2 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 2 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 3 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 3 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 5 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo com cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 5 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 6 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 6 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 7 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 7 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 8 e a cadeia pesada da imunoglobulina é definida na SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo que tem cadeias leves da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 8 e cadeias pesadas da imunoglobulina definidas na SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a cadeia leve da imunoglobulina compreende um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34, e em que a cadeia pesada da imunoglobulina compreende um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102.
[0007] A presente invenção fornece o anticorpo 8H9 de murino, em que as cadeias leves de imunoglobulina incluem um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34, e em que as cadeias pesadas da imunoglobulina incluem um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102.
[0008] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos divulgados nesse documento inclui um ou mais de um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34 da cadeia leve da imunoglobulina, e um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102 da cadeia pesada da imunoglobulina, ou inclui uma substituição de aminoácido homóloga do mesmo em qualquer uma dessas posições.
[0009] Em algumas modalidades, uma cadeia leve da imunoglobulina é fundida a um polipeptídeo definido na SEQ ID NO: 30 ou na SEQ ID NO.: 31.
[00010] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo aqui divulgados é conjugado com um agente terapêutico ou agente de detecção.
[00011] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo divulgados nesse documento, incluindo os anticorpos, é conjugado a um radioisótopo, um conjugado de fármaco, uma nanopartícula, uma imunotoxina ou qualquer outra carga.
[00012] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo divulgados nesse documento, incluindo os anticorpos, é conjugado com um agente de diagnóstico ou de imagem, ou ambos.
[00013] Em algumas modalidades, um agente de anticorpo é um anticorpo biespecífico.
[00014] Em algumas modalidades, um agente de anticorpo tem uma primeira e uma segunda especificidade, e a primeira especificidade se liga à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3, e a segunda especificidade se liga ao CD3 nas células T ou DOTA.
[00015] A presente invenção fornece um scFv que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3, e inclui o polipeptídeo definido em uma SEQ ID NO: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27.
[00016] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de um scFv inclui uma treonina na posição 24, uma glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56, um resíduo de glicina na posição 102, um resíduo de treonina na posição 153 e um resíduo de tirosina na posição 167.
[00017] Em algumas modalidades, um scFv inclui um ou mais de uma treonina na posição 24, uma glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56, um resíduo de glicina na posição 102, um resíduo de treonina na posição 153 e um resíduo de tirosina na posição 167, ou inclui uma substituição de aminoácido homóloga a sua qualquer uma destas posições.
[00018] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de um scFv é fundido a um segundo polipeptídeo definido na SEQ ID NO: 28 ou na SEQ ID NO: 29.
[00019] Em algumas modalidades, o scFv é conjugado com um agente terapêutico ou agente de detecção.
[00020] Em algumas modalidades, qualquer um do scFvs divulgados nesse documento é parte de um receptor de antígeno quimérico.
[00021] A presente invenção fornece um agente de anticorpo que se liga especificamente ao epítopo definido na SEQ ID NO: 32 localizado no loop FG no domínio V da proteína 2Ig-B7H3 e nos domínios V1 e V2 da proteína 4Ig-B7H3, cujo agente de anticorpo não é m8H9.
[00022] A presente invenção fornece um agente de anticorpo que se liga especificamente ao loop FG no domínio V da proteína 2Ig-B7H3 e nos domínios V1 e V2 da proteína 4Ig-B7H3, com um KD menor que 2 nM, cujo agente de anticorpo não é m8H9.
[00023] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo aqui divulgados suprime um efeito inibidor do B7H3 na proliferação e função das células T.
[00024] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo aqui divulgados suprime um efeito inibidor do B7H3 na atividade e na função das células NK.
[00025] A presente invenção fornece uma composição farmacêutica, incluindo quaisquer agentes de anticorpo, scFvs ou anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui divulgados, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00026] A presente invenção fornece um método de tratamento de câncer, incluindo administrar a um paciente que necessita disso uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos agentes de anticorpo, scFvs, anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos divulgados nesse documento.
[00027] A presente invenção fornece um método de modulação do sistema imunológico, incluindo administrar a um paciente que necessita disso uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos agentes de anticorpo, scFvs, anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos divulgados nesse documento.
[00028] A presente invenção fornece um método de tratamento de câncer, o método incluindo as etapas de administrar a um indivíduo uma composição, incluindo um agente de anticorpo anti-B7H3 que se liga ao loop FG do B7H3.
[00029] Em algumas modalidades, o câncer é ou inclui um neuroblastoma. Em algumas modalidades, o câncer é ou inclui um câncer de colo uterino. Em algumas modalidades, o câncer inclui células tumorais positivas para o B7H3.
[00030] A presente invenção fornece um método de aumentar a citotoxicidade mediada pelas células T em um indivíduo, o método incluindo as etapas de administrar a um indivíduo uma composição, incluindo um agente de anticorpo anti-B7H3 que se liga ao loop FG do B7H3.
[00031] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é ou inclui um agente de anticorpo 8H9.
[00032] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 e 52.
[00033] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 e 54.
[00034] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 e 56.
[00035] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 e 76.
[00036] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 e 78.
[00037] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 e 80.
[00038] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 e 52; uma sequência CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 e 54; e uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 e 56.
[00039] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 e 76; uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 e 78; e uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 e 80.
[00040] Em algumas modalidades, o agente de anticorpo 8H9 inclui um polipeptídeo que inclui uma sequência CDR1 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 e 52; uma sequência CDR2 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 e 54; e uma sequência CDR3 de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 e 56; e uma sequência CDR1 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 e 76; uma sequência CDR2 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 e 78; e uma sequência CDR3 de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 e 80.
[00041] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo divulgados nesse documento inclui ou consiste em um anticorpo 8H9 ou em um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00042] Em algumas modalidades, o anticorpo 8H9 é ou compreende m8H9, h8H9 ou ham8H9.
[00043] Em algumas modalidades, o anticorpo 8H9 compreende uma cadeia pesada, conforme é definido em uma das SEQ ID NOs: 9 a 16, e uma cadeia leve, conforme é definido em uma das SEQ ID NOs: 1 a 8.
[00044] Em algumas modalidades, qualquer um dos agentes de anticorpo divulgados nesse documento compete com o anticorpo 8H9 pela ligação ao B7H3.
[00045] A presente invenção fornece um DNA ou RNA que codifica qualquer um dos agentes de anticorpo ou seus fragmentos divulgados nesse documento.
[00046] A presente invenção fornece uma célula que expressa qualquer um dos agentes de anticorpo ou seus fragmentos divulgados nesse documento.
[00047] A presente invenção fornece um método de preparação de uma célula que expressa um agente de anticorpo ou um fragmento do mesmo, incluindo transfectar ou transduzir, viralmente, a célula com um DNA ou RNA que codifica qualquer um dos agentes de anticorpo divulgados nesse documento.
[00048] Em algumas modalidades, a célula é viralmente transduzida dentro de um paciente.
[00049] Em algumas modalidades, a célula é uma célula do sistema imunológico.
[00050] Em algumas modalidades, a célula é uma célula apresentadora de antígeno.
[00051] Em algumas modalidades, a célula é uma célula T. Em algumas modalidades, a célula é uma célula NK.
[00052] A presente invenção fornece uma vacina incluindo qualquer um dos DNAs ou RNAs divulgados nesse documento.
[00053] A presente invenção fornece um método de vacinação de um paciente, incluindo a administração de qualquer uma das vacinas divulgadas nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00054] Em algumas modalidades, o paciente é canino ou felino.
[00055] A presente invenção fornece um receptor de antígeno quimérico incluindo qualquer um dos agentes de anticorpo, ou fragmentos dos mesmos, divulgados nesse documento.
[00056] Em algumas modalidades, um DNA ou RNA codifica um receptor de antígeno quimérico.
[00057] A presente invenção fornece uma célula que expressa qualquer um dos receptores de antígeno quimérico divulgados nesse documento (por exemplo, uma célula T ou uma célula NK).
[00058] A presente invenção fornece um método de preparação de uma célula, incluindo transfectar ou transduzir viralmente uma célula com qualquer um dos DNAs ou RNAs divulgados nesse documento.
[00059] A presente invenção fornece um método de terapia celular adotiva, incluindo uma etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das células divulgadas nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00060] A presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente pelo alvejamento de um epítopo peptídico definido na SEQ ID NO: 32, incluindo administrar qualquer um dos agentes de anticorpo ou fragmentos dos mesmos divulgados nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00061] Em algumas modalidades, o paciente é selecionado do grupo de um ser humano, um cão, um gato, um chimpanzé, um orangotango, um gibão, um macaco, um sagui, um porco, um cavalo, um panda e um elefante.
[00062] A presente invenção fornece um método de tratar um paciente, incluindo administrar qualquer uma das células divulgadas nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00063] A presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente, incluindo administrar um vírus incluindo um DNA ou RNA que codifica qualquer um dos agentes do anticorpo ou fragmentos dos mesmos divulgados nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00064] A presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente por radioimunoterapia compartimental (cRIT), incluindo administrar qualquer um dos agentes do anticorpo ou fragmentos dos mesmos divulgados nesse documento a um paciente que necessita disso.
[00065] Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado intratecalmente, intraperitonealmente ou por administração aumentada por convecção.
BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO
[00066] O desenho incluído nesse documento, que é composto pelas seguintes figuras, é para fins ilustrativos, e não de limitação.
[00067] A figura 1 mostra um diagrama de fita da estrutura cristalina do Fab ch8H9. A: Vista lateral do Fab mostrando domínios Ig individuais e a região determinante de complementaridade (CDR). B: Vista de cima para baixo do sítio de ligação ao antígeno, mostrando a orientação dos 6 loops da CDR. C: Potencial de superfície eletrostático do sítio de ligação ao antígeno tornado de negativamente carregado (vermelho) para positivamente carregado (azul) na faixa de -1 a +1 kT/e.
[00068] A figura 2 ilustra uma estratégia fornecida para o desenvolvimento de anticorpos 8H9 humanizados e de afinidade maturada, ou aos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00069] A figura 3 mostra a cinética da ligação dos anticorpos IgG 8GH9 de murino (m8H9) e 8H9 quiméricos de camundongo/ser humano (ch8H9) ao 2Ig-B7H3-Fc, conforme determinado pela ressonância de plasmônio de superfície.
[00070] A figura 4 mostra os resultados de um ELISA no qual uma variedade de concentrações de ch8H9 e das variantes da IgG 8H9 humanizadas H1L1, H1L2, H2L1 e H2L2 se ligaram ao 4Ig-B7H3.
[00071] A figura 5 mostra a detecção por ELISA do antígeno B7H3- mFc biotinilado por HRP-estreptavidina diluído em série (A) ou IgG ch8H9 (B).
[00072] A figura 6 mostra dados de citometria de fluxo associados com a maturação de afinidade do scFv 8H9 H3L3 humanizado (hu).
[00073] A figura 7 mostra uma comparação das células de levedura exibindo scFv hu8H9 H3L3 (esquerda) e células de levedura derivadas do último/sétimo ciclo de classificação de células (direita). As células de levedura foram marcadas com 0,1 ou 1 μg/mL de B7H3-mFc e foram, em seguida, detectadas por um anticorpo APC-cabra anticamundongo.
[00074] A figura 8 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos para as variantes Fv de cadeia simples hu8H9 (scFvs) derivadas do sétimo ciclo de classificação de células, conforme descrito. Os dados de sequência dos ligantes fortes foram agrupados por análise de cluster. As seguintes cinco variantes scFv foram selecionadas repetidamente: S7.2, S7.17, S7.22, S7.28 e S7.29. S3.3 é a scFv derivada do terceiro ciclo de classificação de células. 8H9 H3L3 (SEQ ID NO.:87); 8H9S3.3 (SEQ ID NO.:88); 8H9S7.2 (SEQ ID NO.:89); 8H9S7.3 (SEQ ID NO.:90); 8H9S7.4 (SEQ ID NO.:91); 8H9S7.5 (SEQ ID NO.:92); 8H9S7.6 (SEQ ID NO.:93); 8H9S7.7 (SEQ ID NO.:94); 8H9S7.8 (SEQ ID NO.:95); 8H9S7.9 (SEQ ID NO.:96); 8H9S7.17 (SEQ ID NO.:97); 8H9S7.18 (SEQ ID NO.:98); 8H9S7.19 (SEQ ID NO.:99); 8H9S7.20 (SEQ ID NO.:100); 8H9S7.21 (SEQ ID NO.:101); 8H9S7.22 (SEQ ID NO.:102); 8H9S7.27 (SEQ ID NO.:103); 8H9S7.28 (SEQ ID NO.:104); 8H9S7.29 (SEQ ID NO.:105).
[00075] A figura 9 mostra os resultados dos experimentos de ELISA em que variantes scFv hu8H9 se ligaram ao 4Ig-B7H3 (esquerda) e ao 2Ig-B7H3 (direita).
[00076] A figura 10 mostra os resultados dos experimentos em que as variantes scFv hu8H9 se ligaram às células de neuroblastoma M14. As células tumorais foram marcadas com 1 μg/mL de scFv hu8H9 H3L3 (azul), S3.3 (laranja), S7.22 (verde) ou isotipo controle (vermelho) e um anticorpo anti-his. A ligação foi quantificada por citometria de fluxo.
[00077] A figura 11 mostra a cinética da ligação pelos anticorpos IgG ch8H9 e hu8H9 H1L2, H3L3, 3.1 e 5.1 ao 4Ig-B7H3-Fc, conforme determinado pela ressonância de plasmônio de superfície.
[00078] A figura 12 mostra a cinética da ligação pelos anticorpos IgG ch8H9 e hu8H9 H1L2, H3L3, 3.1 e 5.1 ao 2Ig-B7H3-Fc, conforme determinado pela ressonância de plasmônio de superfície.
[00079] A figura 13 mostra os resultados dos experimentos em que as variantes de IgG ch8H9 e hu8H9 se ligaram às células de neuroblastoma M14. A ligação foi quantificada por citometria de fluxo.
[00080] A figura 14 mostra a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo in vitro (ADCC) dos constructos de anticorpo 8H9 contra as células LAN-1 de neuroblastoma B7-H3(+) usando o PBMC humano como células efetoras. A citotoxicidade foi medida pela liberação de cromo 51.
[00081] A figura 15 mostra a biodistribuição dos agentes de anticorpo 8H9 marcada com 131I injetados em camundongos sem pelo atímicos xenoenxertados com os tumores LAN-1 de neuroblastoma subcutâneo.
[00082] A figura 16 mostra uma exibição gráfica da ligação simulada entre o ch8H9 e o huB7H3. A IRDF (SEQ ID NO.:32) é indicada com uma seta.
[00083] A figura 17 mostra a cinética de ligação pelos anticorpos IgG anti-B7H3 ch8H9, MIH42, 6A1 e o clone 185504 ao 2Ig-B7H3-mFc tipo selvagem e aos mutantes 2Ig-B7H3-mFc R127A e D128A, conforme determinado por ressonância de plasmônio de superfície.
[00084] A figura 18 mostra a cinética de ligação pelos anticorpos IgG anti-B7H3 hu8H9 3.1 e 5.1 ao 2Ig-B7H3-mFc tipo selvagem e aos mutantes 2Ig-B7H3-mFc R127A e D128A, conforme determinado por ressonância de plasmônio de superfície.
[00085] A figura 19 mostra os resultados dos experimentos nos quais a proliferação de células T foi medida na presença de esferas de ativação de CD3/CD8 e na presença ou ausência de células IMR-32 de neuroblastoma positivas para B7H3.
[00086] A figura 20 mostra os resultados dos experimentos nos quais a proliferação de células T foi medida na presença de esferas de ativação de CD3/CD8 e células IMR-32 de neuroblastoma positivas para B7H3, e com concentrações crescentes de ch8H9.
[00087] A figura 21 mostra os resultados dos experimentos em que a citotoxicidade mediada por células T em relação às células de carcinoma cervical humano (HeLa) foi medida. As células de carcinoma foram pré-tratadas apenas com um anticorpo biespecífico Her2xCD3 ou com este anticorpo e, adicionalmente, IgG m8H9.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[00088] A SEQ ID NO.: 1 (cadeia leve de ch8H9) é DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00089] A SEQ ID NO.: 2 (cadeia leve L1 de hu8H9) é EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLL IKYASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00090] A SEQ ID NO.: 3 (cadeia leve L2 de hu8H9) é EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00091] A SEQ ID NO.: 4 (cadeia leve L3 de hu8H9) é EIVMTQSPATLSVSPGERVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00092] A SEQ ID NO.: 5 (cadeia leve de hu8H9 3.1) é EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00093] A SEQ ID NO.: 6 (cadeia leve 4.1 de hu8H9) é EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHQAPRLL IKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFP LTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00094] A SEQ ID NO.: 7 (cadeia leve 5.1 de hu8H9) é EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHQAPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00095] A SEQ ID NO.: 8 (cadeia leve 6.1 de ch8H9; ch8H9 + 6 mutações de maturação de afinidade) é DIVMTQSPATLSVTPGDRVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00096] A SEQ ID NO.: 9 (cadeia pesada de ch8H9) é QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00097] A SEQ ID NO.: 10 (cadeia pesada H1 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00098] A SEQ ID NO.: 11 (cadeia pesada H2 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSRLTSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00099] A SEQ ID NO.: 12 (cadeia pesada H3 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000100] A SEQ ID NO.: 13 (cadeia pesada 3.1 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000101] A SEQ ID NO.: 14 (cadeia pesada 4.1 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000102] A SEQ ID NO.: 15 (cadeia pesada 5.1 de hu8H9) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000103] A SEQ ID NO.: 16 (cadeia pesada 6.1 de ch8H9; ch8H9 + 6 mutações de maturação de afinidade) é QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000104] A SEQ ID NO.: 17 (scFv hu8H9 H3L3) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000105] A SEQ ID NO.: 18 (scFv do clone hu8H9 S3.3) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000106] A SEQ ID NO.: 19 (scFv do clone hu8H9 S7.2) é QVQLVQSGAEVVKPGASCKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGVGSEIVMT QSPATLSVSPGERVTLSCRASQSIGDYLYWYQQKSHESPRLLIKYAS QSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000107] A SEQ ID NO.: 20 (scFv do clone hu8H9 S7.17) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WVGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTSTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQPISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGYSFPLTFG QGTKLELKR
[000108] A SEQ ID NO.: 21 (scFv do clone hu8H9 S7.22) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRPEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSIPGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000109] A SEQ ID NO.: 22 (scFv do clone hu8H9 S7.28) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLGSEDTAV YFCTRQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSEIVMT QSPATLSVSPGERVTLSCRASQSIGDYLYWYQQKSHESPRLLIKYAS QSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000110] A SEQ ID NO.: 23 (scFv do clone hu8H9 S7.29) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYLELSSLGSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000111] A SEQ ID NO.: 24 (scFv do hu8H9 3.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000112] A SEQ ID NO.: 25 (scFv do hu8H9 4.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHQAPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000113] A SEQ ID NO.: 26 (scFv do hu8H9 5.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHQAPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000114] A SEQ ID NO.: 27 (scFv do ch8H9 6.1) é QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVM TQSPATLSVTPGDRVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTF GAGTKLELKR
[000115] A SEQ ID NO.: 28 (scFv do ligante huOKT3 (anti-CD3)) é GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTF TRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNS KNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSY MNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSL QPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
[000116] A SEQ ID NO.: 29 (scFv do ligante C825 (anti-DOTA)) é GGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLT DYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKN QVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASN YANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGT QTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG
[000117] A SEQ ID NO.:30 (scFv do ligante huOKT3 (anti-CD3)) é GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTF TRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNS KNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSY MNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSL QPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
[000118] A SEQ ID NO.: 31 (scFv do ligante C825 (anti-DOTA)) é GGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLT DYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKN QVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASN YANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGT QTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG
[000119] A SEQ ID NO.: 32 é IRDF
[000120] A SEQ ID NO.: 81 é TCAGTTTTGGCCCAGGCGGCC
[000121] A SEQ ID NO.: 82 é ACCACTAGTTGGGCCGGCCTG
[000122] A SEQ ID NO.: 83 é a) CTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTC AGTTTTGGCCCAGGCGGCC
[000123] A SEQ ID NO.: 84 é b) GAGCCGCCACCCTCAGAACCGCCACCCTCAGA GCCACCACTAGTTGGGCCGGCCTG
[000124] A SEQ ID NO.: 85 é FVSIRDFG
[000125] A SEQ ID NO.: 86 é IQDF
DEFINIÇÕES
[000126] Neste pedido, a menos que seja claro de outra forma, (i) o termo "um" pode ser compreendido como significando "pelo menos um"; (ii) o termo "ou" pode ser compreendido como significando "e/ou"; (iii) os termos "compreendendo" e "incluindo" podem ser compreendidos como englobando componentes ou etapas discriminadas, presentes por si só ou juntas com um ou mais componentes ou etapas adicionais; e (iv) os termos "cerca de" e "aproximadamente" podem ser compreendidos para permitir a variação padrão, tal como seria compreendido pelas pessoas normalmente versadas na técnica; e (v) onde as faixas são fornecidas, os parâmetros extremos são incluídos.
[000127] Administração: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "administração" refere-se à administração de uma composição a um indivíduo ou sistema. A administração a um indivíduo animal (por exemplo, a um ser humano) pode ser por qualquer via adequada. Por exemplo, em algumas modalidades, a administração pode ser brônquica (incluindo por instilação brônquica), bucal, enteral, intradérmica, intra-arterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, pela mucosa, nasal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (incluindo por instilação intratraqueal), transdérmica, vaginal e vítrea. Em algumas modalidades, a administração pode envolver a dosagem intermitente. Em algumas modalidades, a administração pode envolver a dosagem contínua (por exemplo, perfusão) durante pelo menos um determinado período de tempo.
[000128] Afinidade: Tal como é conhecido na técnica, "afinidade" é uma medida da firmeza com a qual um ligante específico se liga ao seu parceiro. As afinidades podem ser medidas de formas diferentes. Em algumas modalidades, a afinidade é medida por um ensaio quantitativo. Em algumas dessas modalidades, a concentração de parceiro de ligação pode ser fixada para ser em excesso de concentração de ligante, de modo a simular as condições fisiológicas. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, a concentração de parceiro de ligação e/ou a concentração de ligante pode variar. Em algumas dessas modalidades, a afinidade pode ser comparada a uma referência em condições comparáveis (por exemplo, concentrações).
[000129] Agente: O termo "agente", conforme utilizado na presente invenção, pode referir-se a um composto ou entidade de qualquer classe química, incluindo, por exemplo, os polipeptídeos, ácidos nucleicos, sacarídeos, lipídios, moléculas pequenas, metais ou combinações dos mesmos. Como será evidente a partir do contexto, em algumas modalidades, um agente pode ser ou compreender uma célula ou organismo, ou uma fração, extrato ou componentes dos mesmos. Em algumas modalidades, um agente é ou compreende um produto natural, tal como ele é encontrado e/ou é obtido da natureza. Em algumas modalidades, um agente é ou compreende uma ou mais entidades que são sintéticas pelo fato de serem projetadas, manipuladas e/ou produzidas pela ação da mão do homem e/ou não são encontradas na natureza. Em algumas modalidades, um agente pode ser utilizado de forma isolada ou pura; em algumas modalidades, um agente pode ser utilizado na forma bruta. Em algumas modalidades, agentes potenciais são fornecidos como coleções ou bibliotecas, por exemplo, que podem ser testados para identificar ou caracterizar agentes ativos dentre eles. Algumas modalidades particulares dos agentes que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem pequenas moléculas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, aptâmeros, ácidos nucleicos (por exemplo, siRNAs shRNAs, híbridos de DNA/RNA, oligonucleotídeos antissentido, ribozimas), peptídeos, peptídeo miméticos, etc. Em algumas modalidades, um agente é ou compreende um polímero. Em algumas modalidades, um agente não é um polímero e/ou é substancialmente isento de qualquer polímero. Em algumas modalidades, um agente contém pelo menos uma porção polimérica. Em algumas modalidades, um agente não possui ou é substancialmente isento de qualquer porção polimérica.
[000130] Aminoácido: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "aminoácido", em seu sentido mais amplo, se refere a qualquer composto e/ou substância que pode ser incorporado em uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, um aminoácido tem a estrutura geral H2N-C(H)(R)-COOH. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido sintético; em algumas modalidades, um aminoácido é um d-aminoácido; em algumas modalidades, um aminoácido é um l-aminoácido. "Aminoácido padrão" refere-se a qualquer um dos vinte l-aminoácidos padrão comumente encontrados nos peptídeos naturais. "Aminoácidos não padrão" refere- se a qualquer aminoácido, que não seja os aminoácidos padrão, independentemente de ser preparado sinteticamente ou obtido de uma fonte natural. Conforme utilizado na presente invenção, "aminoácido sintético" engloba aminoácidos quimicamente modificados, incluindo, mas sem se limitar, aos sais, derivados de aminoácidos (tais como amidas) e/ou substituições. Aminoácidos, incluindo aminoácidos amino ou carbóxi terminais nos peptídeos, podem ser modificados por metilação, amidação, acetilação, grupos protetores e/ou substituição com outros grupos químicos que podem mudar a meia-vida circulante do peptídeo sem afetar adversamente a sua atividade. Os aminoácidos podem participar em uma ligação dissulfeto. Os aminoácidos podem compreender uma ou mais modificações pós-tradução, como a associação com uma ou mais entidades químicas (por exemplo, grupos metila, grupos acetato, grupos acetila, grupos fosfato, grupos formila, grupos isoprenoide, grupos sulfato, porções de polietilenoglicol, porções de lipídios, porções de carboidratos, porções de biotina, etc.). O termo "aminoácido" é usado de modo intercambiável com "resíduo de aminoácido" e pode referir-se a um aminoácido livre e/ou a um resíduo de aminoácido de um peptídeo. Será evidente a partir do contexto no qual o termo é usado se ele refere-se a um aminoácido livre ou a um resíduo de um peptídeo.
[000131] Análogo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "análogo" refere-se a uma substância que compartilha uma ou mais características, elementos, componentes ou porções estruturais com uma substância de referência. Tipicamente, um "análogo" mostra significativa semelhança estrutural com a substância de referência, por exemplo, partilhando uma estrutura de núcleo ou consenso, mas também difere em certos aspectos discretos. Em algumas modalidades, um analógico é uma substância que pode ser gerada a partir da substância de referência por manipulação química da substância de referência. Em algumas modalidades, um análogo é uma substância que pode ser gerada através do desempenho de um processo sintético substancialmente semelhante (por exemplo, compartilhando uma pluralidade de etapas) com um que gera a substância de referência. Em algumas modalidades, um análogo é ou pode ser gerado através do desempenho de um processo sintético diferente daquele usado para gerar a substância de referência.
[000132] Animal: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "animal" se refere a qualquer membro do reino animal. Em algumas modalidades, "animal" refere-se aos seres humanos, em qualquer fase de desenvolvimento. Em algumas modalidades, "animal" refere-se a animais não humanos, em qualquer fase de desenvolvimento. Em algumas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, um roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cachorro, um gato, uma ovelha, gado, um primata e/ou um porco). Em algumas modalidades, os animais incluem, mas não se limitam, aos mamíferos, aves, répteis, anfíbios, peixes e/ou vermes. Em algumas modalidades, um animal pode ser um animal transgênico, um animal geneticamente modificado e/ou um clone.
[000133] Antagonista: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "antagonista" refere-se a um agente que i) inibe, diminui ou reduz os efeitos de outro agente; e/ou ii) inibe, diminui, reduz ou retarda um ou mais eventos biológicos. Os antagonistas podem ser ou incluem agentes de qualquer classe química, incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, polipeptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, metais e/ou qualquer outra entidade que mostre atividade inibitória relevante. Um antagonista pode ser direto (em cujo caso, ele exerce a sua influência diretamente sobre o seu alvo) ou indireto (em cujo caso ele exerce a sua influência por outra forma que não seja a ligação com o seu alvo; por exemplo, interagindo com um regulador do alvo, por exemplo, de modo que o nível ou a atividade do alvo seja alterado).
[000134] Anticorpo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "anticorpo" refere-se a um polipeptídeo que inclui elementos de sequência de imunoglobulina canônica suficientes para conferir ligação específica a um antígeno alvo particular. Tal como é conhecido na técnica, os anticorpos intactos produzidos na natureza são agentes tetraméricos de aproximadamente 150 KD, compreendidos por dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos (cada um com cerca de 50 KD) e dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos (cada um com cerca de 25 KD) que se associam entre si no que é comumente referido como uma estrutura "em forma de Y". Cada cadeia pesada é composta de pelo menos quatro domínios (cada um com 110 aminoácidos de comprimento) - um domínio aminoterminal variável (VH) (localizado nas pontas da estrutura Y), seguido por três domínios constantes: CH1, CH2 e o carboxiterminal CH3 (localizado na base da haste de Y). Uma região curta, conhecida como "switch", conecta as regiões variável e constante da cadeia pesada. A "dobradiça" liga os domínios CH2 e CH3 ao restante do anticorpo. Duas ligações dissulfeto nesta região da dobradiça conectam os dois polipeptídeos de cadeia pesada entre si em um anticorpo intacto. Cada cadeia leve é composta de dois domínios - um domínio aminoterminal variável (VL), seguido por um domínio carboxiterminal constante (CL), separados um do outro por outro "switch". Os tetrâmeros de anticorpo intactos são compreendidos por dois dímeros de cadeia pesada-cadeia leve em que as cadeias pesada e leve são ligados entre si por uma ligação dissulfeto simples; duas outras ligações dissulfeto ligam as regiões de dobradiça da cadeia pesada entre si, de modo que os dímeros estão conectados entre si, e o tetrâmero é formado. Os anticorpos produzidos naturalmente também são glicosilados, normalmente no domínio CH2. Cada domínio em um anticorpo natural possui uma estrutura caracterizada por uma "dobra de imunoglobulina", formada por duas folhas beta (por exemplo, folhas de 3, 4 ou 5 fitas) empacotadas umas contra as outras em um barril beta antiparalelo compactado. Cada domínio variável contém três alças hipervariáveis, conhecidas como "regiões determinantes do complemento" (CDR1, CDR2 e CDR3) e quatro regiões de "estrutura" de certa forma invariáveis (FR1, FR2, FR3 e FR4). Quando os anticorpos naturais se dobram, as regiões FR formam as folhas beta que fornecem a estrutura estrutural para os domínios, e as regiões de alça da CDR de ambas as cadeias pesada e leve são unidas no espaço tridimensional, de modo que elas criem um sítio de ligação ao antígeno hipervariável único localizado na ponta da estrutura Y. Comparações de sequências de aminoácidos entre as cadeias polipeptídicas do anticorpo têm duas classes de cadeia leve definidas (K e À), várias classes de cadeia pesada (por exemplo, μ, Y, α, ε, δ) e certas subclasses de cadeia pesada (α1, α2, y1, y2, Y3 e y4)- As classes de anticorpos (incluindo IgA1, IgA2], IgD, IgE, IgG [incluindo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4], IgM) são definidas com base na classe das sequências de cadeia pesada utilizadas. A região Fc dos anticorpos que ocorrem na natureza se liga aos elementos do sistema complemento, e também aos receptores nas células efetoras, incluindo, por exemplo, as células efetoras que medeiam a citotoxicidade. Tal como é conhecido na técnica, afinidade e/ou outros atributos de ligação das regiões Fc para os receptores da Fc podem ser modulados através da glicosilação ou de outras modificações. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos e/ou utilizados de acordo com a presente invenção incluem os domínios Fc glicosilados, incluindo os domínios Fc com tal glicosilação modificada ou manipulada. Para fins da presente invenção, em certas modalidades, qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que inclui sequências de domínio de imunoglobulina suficientes, como encontrado nos anticorpos naturais, pode ser referido e/ou usado como um "anticorpo", seja tal polipeptídeo produzido naturalmente (por exemplo, gerado por um organismo que reage com um antígeno) ou produzido por engenharia recombinante, síntese química ou outro sistema ou metodologia artificial. Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal; em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo tem sequências de região constante que são características de anticorpos de camundongos, coelhos, primatas ou seres humanos. Em algumas modalidades, os elementos da sequência de anticorpo são humanizados, primatizados, quiméricos, etc., tal como é conhecido na técnica. Além disso, o termo "anticorpo", conforme utilizado na presente invenção, será compreendido para se referir às modalidades apropriadas (a menos que seja indicado de outra forma ou esteja claro a partir do contexto) para quaisquer constructos ou formatos conhecidos na técnica ou desenvolvidos para capturar as características estruturais e funcionais do anticorpo em uma apresentação alternativa. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo pode referir-se aos anticorpos bi ou multiespecíficos (por exemplo, zicorpos, etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos ("SMIPsTM"), anticorpos de cadeia simples (scAbs), anticorpos cameloides e/ou fragmentos de anticorpos. Em algumas modalidades, um anticorpo pode não ter uma modificação covalente (por exemplo, a ligação de um glicano) que ele teria, se fosse produzido naturalmente. Em algumas modalidades, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (por exemplo, a ligação de um glicano, uma carga [por exemplo, uma porção detectável, uma porção terapêutica, uma porção catalítica, etc.]), ou outro grupo pendente (por exemplo, polietilenoglicol, etc.).
[000135] Agente de anticorpo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "agente de anticorpo" refere-se a um agente que se liga especificamente a um antígeno particular. Em algumas modalidades, o termo abrange qualquer polipeptídeo com elementos estruturais de imunoglobulina suficientes para conferir a ligação específica. Agentes de anticorpo adequados incluem, mas não se limitam, aos anticorpos humanos, anticorpos primatizados, anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos conjugados (ou seja, os anticorpos conjugados ou fundidos a outras proteínas, radiomarcadores, citotoxinas), imunofarmacêuticos modulares pequenos ("SMIPsTM"), anticorpos de cadeia simples, anticorpos cameloides e fragmentos de anticorpo. Conforme utilizado na presente invenção, o termo "agente de anticorpo" também inclui anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos de domínio simples (por exemplo, anticorpos de domínio simples de tubarão (por exemplo, IgNAR ou os fragmentos dos mesmos)), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo, contanto que eles apresentem a atividade biológica desejada. Em algumas modalidades, o termo engloba os peptídeos grampeados. Em algumas modalidades, o termo engloba um ou mais peptidomiméticos de ligação tipo anticorpo. Em algumas modalidades, o termo engloba uma ou mais proteínas estruturais de ligação tipo anticorpo. Em algumas modalidades, o termo engloba monocorpos ou adnectinas. Em muitas modalidades, um agente de anticorpo é ou compreende um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos inclui um ou mais elementos estruturais reconhecidos pelas pessoas versadas na técnica como uma região determinante de complementaridade (CDR); em algumas modalidades, um agente de anticorpo é ou compreende um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos inclui pelo menos uma CDR (por exemplo, pelo menos uma CDR de cadeia pesada e/ou pelo menos uma CDR de cadeia leve) que é substancialmente idêntico à encontrada em um anticorpo de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência pelo fato de ser idêntica em sequência ou conter entre 1 a 5 substituições de aminoácidos em comparação com a CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência pelo fato de apresentar pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência pelo fato de demonstrar pelo menos 96%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência, pelo fato de pelo menos um aminoácido na CDR incluída ser deletado, adicionado ou substituído em comparação com a CDR de referência, mas a CDR incluída tem uma sequência de aminoácidos que, de outro modo, é idêntica à CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência, pelo fato de que de 1 a 5 aminoácidos na CDR incluída ser(em) deletado(s), adicionado(s) ou substituído(s) em comparação com a CDR de referência, mas a CDR incluída tem uma sequência de aminoácidos que, de outro modo, é idêntica à CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência, pelo fato de pelo menos um aminoácido na CDR incluída ser deletado, adicionado ou substituído em comparação com a CDR de referência, mas a CDR incluída tem uma sequência de aminoácidos que, de outro modo, é idêntica à CDR de referência. Em algumas modalidades, uma CDR incluída é substancialmente idêntica a uma CDR de referência, pelo fato de 1 a 5 aminoácidos na CDR incluída ser(em) deletado(s), adicionado(s) ou substituído(s) em comparação com a CDR de referência, mas a CDR incluída tem uma sequência de aminoácidos que, de outro modo, é idêntica à CDR de referência. Em algumas modalidades, um agente de anticorpo é ou compreende um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos inclui elementos estruturais reconhecidos pelas pessoas versadas na técnica como um domínio de imunoglobulina variável. Em algumas modalidades, um agente de anticorpo é uma proteína de polipeptídeo que tem um domínio de ligação que é homólogo ou em grande parte homólogo a um domínio de ligação de imunoglobulina. O termo agente de anticorpo inclui os receptores de antígeno quiméricos.
[000136] Fragmento de anticorpo: Conforme utilizado na presente invenção, um "fragmento de anticorpo" inclui uma porção de um anticorpo intacto, como, por exemplo, a região de ligação ao antígeno ou variável de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; triacorpos; moléculas lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos incluem fragmentos isolados, fragmentos "Fv", consistindo nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve, moléculas de polipeptídeo de cadeia simples recombinante, em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada estão conectadas por um ligante peptídico ("proteínas ScFv") e unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácidos que mimetizam a região hipervariável. Em muitas modalidades, um fragmento de anticorpo contém sequência suficiente do anticorpo original, do qual ele é um fragmento que se liga ao mesmo antígeno, como faz o anticorpo original; em algumas modalidades, um fragmento se liga ao antígeno com uma afinidade comparável ao do anticorpo original e/ou compete com o anticorpo original pela ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo incluem, mas não se limitam, ao fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento Fv, diacorpo dsFv, fragmento dAb, fragmento Fd', fragmento Fd e uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser enzimaticamente ou quimicamente produzido pela fragmentação de um anticorpo intacto e/ou pode ser recombinantemente produzido a partir de um gene que codifica a sequência parcial do anticorpo. Alternativamente ou além disso, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser totalmente ou parcialmente produzido de forma sintética. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode opcionalmente compreender um fragmento de anticorpo de cadeia simples. Alternativamente ou além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode compreender múltiplas cadeias que são ligadas entre si, por exemplo, por ligações dissulfeto. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode opcionalmente compreender um complexo multimolecular. Um fragmento de anticorpo funcional tipicamente compreende pelo menos cerca de 50 aminoácidos e, mais tipicamente, compreende pelo menos cerca de 200 aminoácidos.
[000137] polipeptídeo de anticorpo: Conforme utilizado na presente invenção, os termos "polipeptídeo de anticorpo" ou "anticorpo", ou "fragmento de ligação ao antígeno do mesmo", que podem ser usados de modo intercambiável, referem-se ao(s) polipeptídeo(s) capaz(es) de se ligar(em) a um epítopo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de anticorpo é um anticorpo completo e, em algumas modalidades, ele é menor que o comprimento total, mas inclui pelo menos um sítio de ligação (que compreende pelo menos um e, preferencialmente, pelo menos duas sequências com estrutura de "regiões variáveis" do anticorpo). Em algumas modalidades, o termo "polipeptídeo de anticorpo" engloba qualquer proteína que tem um domínio de ligação, que é homólogo ou em grande parte homólogo a um domínio de ligação de imunoglobulina. Em modalidades particulares, "polipeptídeos de anticorpo" engloba polipeptídeos que têm um domínio de ligação que mostra pelo menos 99% de identidade com um domínio de ligação de imunoglobulina. Em algumas modalidades, "polipeptídeo de anticorpo" é qualquer proteína que tem um domínio de ligação que mostra pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade com um domínio de ligação de imunoglobulina, por exemplo, um domínio de ligação de imunoglobulina de referência. Um "polipeptídeo de anticorpo" incluído pode ter uma sequência de aminoácidos idêntica a de um anticorpo que é encontrado em uma fonte natural. Polipeptídeos de anticorpo, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados por quaisquer meios disponíveis, incluindo, por exemplo, o isolamento de uma fonte natural ou biblioteca de anticorpos, produção recombinante dentro ou com um sistema hospedeiro, síntese química, etc., ou combinações dos mesmos. Um polipeptídeo de anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. Um polipeptídeo de anticorpo pode ser um membro de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo qualquer uma das classes humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser um membro da classe de imunoglobulina IgG. Conforme utilizado na presente invenção, os termos "polipeptídeo de anticorpo" ou "porção característica de um anticorpo" são usados de modo intercambiável e referem-se a qualquer derivado de um anticorpo que possui a capacidade de ligar a um epítopo de interesse. Em certas modalidades, o "polipeptídeo de anticorpo" é um fragmento de anticorpo que retém pelo menos uma parcela significativa da capacidade de ligação específica do anticorpo completo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam, a Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacorpo dsFv e fragmentos Fd. Alternativamente ou além disso, um fragmento de anticorpo pode compreender múltiplas cadeias que unidas, por exemplo, por ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de anticorpo pode ser um anticorpo humano. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de anticorpo podem ser humanizados. Os polipeptídeos de anticorpo humanizados incluem pode ser imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou polipeptídeos de anticorpo (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antígeno) que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, os anticorpos humanizados são as imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas.
[000138] Antígeno: Um "antígeno" é uma molécula ou entidade que i) provoca uma resposta imunológica; e/ou (ii) é especificamente ligado por um receptor de célula T (por exemplo, quando apresentado por uma molécula do MHC) ou um anticorpo (por exemplo, produzido por uma célula B), por exemplo, quando exposto ou administrado a um organismo. Em algumas modalidades, um antígeno provoca uma resposta humoral (por exemplo, incluindo a produção de anticorpos antígeno-específicos) em um organismo; alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, um antígeno provoca uma resposta celular (por exemplo, envolvendo as células T cujos receptores interagem especificamente com o antígeno) em um organismo. Será notado pelas pessoas versadas na técnica que um antígeno particular pode eliciar uma resposta imunológica em um ou vários membros de um organismo alvo (por exemplo, camundongos, coelhos, primatas e seres humanos), mas não em todos os membros das espécies de organismo alvo. Em algumas modalidades, um antígeno provoca uma resposta imunológica em pelo menos cerca de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% dos membros de uma espécie de organismo alvo. Em algumas modalidades, um antígeno se liga a um anticorpo e/ou a um receptor de célula T, e pode ou não induzir uma resposta fisiológica específica em um organismo. Em algumas modalidades, por exemplo, um antígeno pode se ligar a um anticorpo e/ou a um receptor de célula T in vitro, quer tal interação ocorra ou não in vivo. Em geral, um antígeno pode ser ou incluir qualquer entidade química como, por exemplo, uma molécula pequena, um ácido nucleico, um polipeptídeo, um carboidrato, um lipídio, um polímero [em algumas modalidades, diferente de um polímero biológico (por exemplo, diferente de um polímero de aminoácido ou ácido nucleico)], etc. Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um glicano. As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que, em geral, um antígeno pode ser fornecido ou utilizado de forma isolada ou pura, ou alternativamente, ele pode ser fornecido na forma bruta (por exemplo, juntamente com outros materiais, por exemplo, em um extrato como em um extrato celular ou outra preparação relativamente bruta de uma fonte contendo antígeno). Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um antígeno recombinante. Em algumas modalidades, um antígeno é ou compreende um polipeptídeo ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, um antígeno é associado com (por exemplo, expresso por) um agente infeccioso. Em algumas modalidades, um antígeno está associado com o câncer (por exemplo, com células tumorais e/ou metástases).
[000139] Fragmento de ligação ao antígeno: O termo "fragmento de ligação ao antígeno", conforme utilizado na presente invenção, refere- se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), por exemplo, CDR3 VH compreendendo ou não uma sequência adicional (ligante, região/regiões de estrutura, etc.) e (vii) uma combinação de dois a seis CDRs isoladas que abrange ou não uma sequência adicional (ligante, região/regiões de estrutura, etc.). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, são codificados por genes separados, eles podem ser unidos usando métodos de recombinação, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia polipeptídica simples em que as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423426 e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também são destinados a ser englobados no termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno incluem proteínas de fusão da imunoglobulina do domínio de ligação que compreendem (i) um polipeptídeo do domínio de ligação (como uma região variável da cadeia pesada, uma região variável da cadeia leve ou uma região variável da cadeia pesada fundida a uma região variável da cadeia leve por meio de um peptídeo ligante) que é fundido a um polipeptídeo da região da dobradiça da imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 da cadeia pesada de imunoglobulina fundida com a região da dobradiça e (iii) uma região constante CH3 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região constante CH2. A região da dobradiça pode ser modificada através da substituição de um ou mais resíduos de cisteína com resíduos de serina, a fim de evitar a dimerização. Tais proteínas de fusão da imunoglobulina do domínio de ligação são adicionalmente divulgadas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e os fragmentos são testados quanto à utilidade da mesma maneira como os anticorpos intactos. Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno incluem fragmentos variáveis de cadeia simples divalentes (di- scFvs, bi-scFvs) ou, alternativamente, os denominados diacorpos, que podem ser manipulados por meios de biologia molecular padrão.
[000140] Célula apresentadora de antígeno: A frase "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" conforme utilizada na presente invenção, tem o seu significado compreendido da técnica se referindo Às células que processam e apresentam antígenos às células T. As células de antígeno exemplares incluem células dendríticas, macrófagos e certas células epiteliais ativadas.
[000141] Identidade antigênica: conforme utilizado na presente invenção, o termo "identidade antigênica" (AI) refere-se à fração porcentual de aminoácidos em um polipeptídeo de interesse, ou porção do mesmo [por exemplo, em um polipeptídeo HA, ou em um epítopo (por exemplo, em um epítopo imunodominante) do mesmo], que são compartilhadas com um polipeptídeo de referência relevante (por exemplo, um polipeptídeo HA original que pode, por exemplo, ser um HA pandêmico) ou porção do mesmo. O valor de AI resultante da comparação de quaisquer dois polipeptídeos ou sequências pode ser um número entre 0 e 100, com um valor de 100 indicando que os dois polipeptídeos, ou partes deles, possuem sequências idênticas.
[000142] Aproximadamente: Conforme utilizado na presente invenção, os termos "aproximadamente" e "cerca de" são, cada um, destinados a englobar a variação estatística normal, que seria compreendida pelas pessoas normalmente versadas na técnica como sendo apropriadas para ao contexto relevante. Em certas modalidades, cada um dos termos "aproximadamente" ou "cerca de" se refere a uma faixa de valores que estão dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos em qualquer direção (maior ou menor do que) de um valor declarado, a menos que seja indicado de outra forma ou, de outro modo, esteja evidente do contexto (por exemplo, onde tal número excederia 100% de um valor possível).
[000143] Associado com: Dois eventos ou entidades estão "associados" um com outro, como o termo é usado nesse documento, se a presença, nível e/ou a forma de um estiver correlacionado com o do outro. Por exemplo, uma entidade particular (por exemplo, polipeptídeo) é considerada associada com uma doença, distúrbio ou condição particular se a sua presença, nível e/ou forma se correlaciona com a incidência e/ou a susceptibilidade da doença, distúrbio ou condição (por exemplo, em uma população relevante). Em algumas modalidades, duas ou mais entidades estão fisicamente "associadas" entre si se elas interagem, diretamente ou indiretamente, de modo que elas estejam e permaneçam em proximidade física uma com a outra. Em algumas modalidades, duas ou mais entidades que estão fisicamente associadas entre si estão covalentemente ligadas entre si; em algumas modalidades, duas ou mais entidades que estão fisicamente associadas entre si não estão covalentemente ligadas entre si, mas estão não covalentemente associadas, por exemplo, por meio de ligações de hidrogênio, interações de van der Waals, interações hidrofóbicas, magnetismo e combinações dos mesmos.
[000144] Biologicamente ativo: conforme utilizado na presente invenção, a frase "biologicamente ativo" se refere a uma substância que possui atividade em um sistema biológico (por exemplo, em uma célula (por exemplo, isolada, na cultura, em um tecido, em um organismo), em uma cultura de células, em um tecido, em um organismo, etc.). Por exemplo, uma substância que, quando é administrada a um organismo, tem um efeito biológico naquele organismo, é considerada biologicamente ativa. Será notado pelas pessoas versadas na técnica que, geralmente, apenas uma porção ou fragmento de uma substância biologicamente ativa é necessário (por exemplo, é necessário e suficiente) para que a atividade esteja presente; em tais circunstâncias, aquela porção ou fragmento é considerado como sendo uma porção ou fragmento "biologicamente ativo".
[000145] Ligação: Será compreendido que o termo "ligação", conforme utilizado na presente invenção, se refere tipicamente a uma associação não covalente entre duas ou mais entidades. A ligação "direta" envolve contato físico entre as entidades ou porções; a ligação indireta envolve a interação física, por meio de contato físico, com uma ou mais entidades intermediárias. A ligação entre duas ou mais entidades pode ser tipicamente avaliada em qualquer um de uma variedade de contextos - incluindo onde as entidades ou porções interagindo são estudadas de forma isolada ou no contexto de sistemas mais complexos (por exemplo, enquanto são covalentemente, ou de outra forma, associadas com uma entidade transportadora e/ou em um sistema biológico ou célula).
[000146] Agente ligante: Em geral, o termo "agente ligante" é usado nesse documento para se referir a qualquer entidade que se liga a um alvo de interesse, conforme descrito na presente invenção. Em muitas modalidades, um agente de ligação de interesse é aquele que se liga especificamente com o seu alvo, em que ele discrimina a sua forma alvo de outros potenciais parceiros de ligação em um contexto de interação específico. Em geral, um agente de ligação pode ser ou compreender uma entidade de qualquer classe química (por exemplo, polímero, não polímero, molécula pequena, polipeptídeo, carboidrato, lipídio, ácido nucleico, etc.). Em algumas modalidades, um agente ligante é uma entidade química única. Em algumas modalidades, um agente de ligação é um complexo de duas ou mais entidades químicas distintas associadas entre si sob condições pertinentes por interações não covalentes. Por exemplo, as pessoas versadas na técnica compreenderão que, em algumas modalidades, um agente de ligação pode compreender uma "porção de ligação" genérica (por exemplo, uma de biotina/avidina/estreptavidina e/ou de um anticorpo de classe específico) e uma porção de ligação "específica" (por exemplo, um anticorpo ou aptâmeros com um determinado alvo molecular) que esteja ligado ao parceiro da porção de ligação genérica. Em algumas modalidades, tal abordagem pode permitir a montagem modular de vários agentes de ligação através da ligação de diferentes porções de ligação específica com o mesmo parceiro de porção de ligação genérica. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem os polipeptídeos (incluindo, por exemplo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos). Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem moléculas pequenas. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são aptâmeros. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são polímeros; em algumas modalidades, os agentes ligantes não são polímeros. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são não poliméricos, pelo fato de não possuírem porções poliméricas. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem carobidratos. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem lectinas. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem peptidomiméticos. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem proteínas estruturais. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem mimótopos. Em algumas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem peptídeos grampeados. Em certas modalidades, os agentes ligantes são ou compreendem ácidos nucleicos, como o DNA ou RNA.
[000147] Porção característica: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "porção característica" é usado, no sentido mais amplo, para se referir a uma porção de uma substância cuja presença (ou ausência) se correlaciona com a presença (ou ausência) de uma característica, atributo ou atividade particular da substância. Em algumas modalidades, uma porção característica de uma substância é uma porção que é encontrada na substância e em substâncias relacionadas que compartilham a característica, atributo ou atividade particular, mas não naquelas que não compartilham a característica, atributo ou atividade particular. Em certas modalidades, uma porção característica compartilha pelo menos uma característica funcional com a substância intacta. Por exemplo, em algumas modalidades, uma "porção característica" de uma proteína ou polipeptídeo é aquela que contém um trecho contínuo de aminoácidos, ou uma coleção de trechos contínuos de aminoácidos, que juntos, são característicos de uma proteína ou de um polipeptídeo. Em algumas, modalidades, cada tal trecho contínuo geralmente contém pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 ou mais aminoácidos. Em geral, uma porção característica de uma substância (por exemplo, de uma proteína, anticorpo, etc.) é aquele que, além da sequência e/ou da identidade estrutural especificada acima, compartilha pelo menos uma característica funcional com a substância intacta. Em algumas modalidades, uma porção característica pode ser biologicamente ativa.
[000148] Sequência característica: Uma "sequência característica" é uma sequência que é encontrada em todos os membros de uma família de polipeptídeos ou ácidos nucleicos e, portanto, pode ser usada pelas pessoas normalmente versadas na técnica para definir os membros da família.
[000149] Elemento de sequência característico: Conforme utilizado na presente invenção, a frase "elemento de sequência característico" refere-se a um elemento de sequência encontrado em um polímero (por exemplo, em um polipeptídeo ou ácido nucleico) que representa uma porção característica daquele polímero. Em algumas modalidades, a presença de um elemento de sequência característico correlaciona-se com a presença ou o nível de uma atividade ou propriedade particular do polímero. Em algumas modalidades, a presença (ou ausência) de um elemento de sequência característico define um polímero particular como um membro (ou não membro) de uma determinada família ou grupo de tais polímeros. Um elemento de sequência característico compreende tipicamente pelo menos dois monômeros (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos). Em algumas modalidades, um elemento de sequência característico inclui pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais monômeros (por exemplo, monômeros contiguamente ligados). Em algumas modalidades, um elemento de sequência característico inclui pelo menos o primeiro e o segundo trechos de monômeros contíguos espaçados por uma ou mais regiões espaçadoras cujo comprimento pode ou não variar pelos polímeros que compartilham o elemento da sequência.
[000150] Receptores de antígeno quiméricos/terapia celular adotiva: Os agentes de anticorpo da presente invenção, incluindo os fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv), podem ser utilizados para a preparação dos receptores de antígeno quiméricos, sendo a preparação e o uso dos mesmos geralmente conhecidos na técnica. Normalmente, um receptor de antígeno quimérico (CAR) é uma proteína ou polipeptídeo híbrido construído artificialmente contendo um domínio de ligação ao antígeno de um scFv, ou outro agente de anticorpo, ligado aos domínios de sinalização das células T. As características dos CARs incluem a sua habilidade de redirecionar a especificidade das células T e a reatividade para um alvo selecionado de uma maneira não restrita por MHC, explorando as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos monoclonais. O reconhecimento do antígeno não restrito por MHC confere às células T a expressão de CARs com a capacidade de reconhecer o antígeno independente do processamento do antígeno, ignorando assim um mecanismo importante de escape tumoral. Os receptores de antígeno quiméricos podem ser utilizados para o tratamento terapêutico, incluindo, por exemplo, para a terapia celular adotiva. A terapia celular adotiva é uma abordagem terapêutica que normalmente inclui o isolamento e a expansão e/ou manipulação ex vivo das células do sistema imunológico, muitas vezes as células T, e a subsequente administração dessas células a pacientes, por exemplo, para o tratamento de câncer. As células administradas podem ser autólogas ou alogênicas. As células podem ser manipuladas para expressar os receptores de antígeno quiméricos de qualquer uma das formas conhecidas, incluindo, por exemplo, por meio de transfecção de RNA e DNA, sendo ambas as tecnologias conhecidas na técnica.
[000151] Terapia de combinação: O termo "terapia de combinação", para uso na presente invenção, refere-se às situações em que dois ou mais diferentes agentes farmacêuticos ou terapêuticos diferentes são administrados em regimes de sobreposição ou sequencial, de modo que o indivíduo é exposto simultaneamente ou sequencialmente a ambos os agentes. Por "em combinação com," não se pretende insinuar que os agentes devem ser administrados ao mesmo tempo e/ou formulados para administração em conjunto, embora estes métodos de administração estejam dentro do escopo da invenção. As composições da invenção podem ser administradas ao mesmo empo, antes de ou após um ou mais outros procedimentos terapêuticos ou clínicos desejados. Será estimado que os agentes terapeuticamente ativos utilizados em conjunto podem ser administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em diferentes composições. Em geral, cada agente será administrado na dose e/ou em um horário determinado para aquele agente.
[000152] Comparável: O termo "comparável", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a dois ou mais agentes, entidades, situações, conjuntos de condições, etc. que podem não ser idêntico entre si, mas que são suficientemente semelhantes para permitir a comparação entre eles, de modo que conclusões podem ser razoavelmente obtidas com base nas diferenças ou semelhanças observadas. Em algumas modalidades, os conjuntos comparáveis de condições, circunstâncias, indivíduos ou populações são caracterizados por uma pluralidade de características substancialmente idênticas e um ou um pequeno número de características variadas. As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão, no contexto, qual grau de identidade é necessário em qualquer dada circunstância, para dois ou mais desses agentes, entidades, situações, conjuntos de condições, etc. para serem considerados comparáveis. Por exemplo, as pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que os conjuntos de circunstâncias, indivíduos ou populações são comparáveis entre si quando são caracterizados por um número suficiente e tipo de características substancialmente idênticas para justificar uma conclusão razoável que as diferenças nos resultados obtidos ou nos fenômenos observados sob ou com diferentes conjuntos de circunstâncias, indivíduos, ou populações são causados por ou indicativos da variação naquelas características que são variadas.
[000153] Correspondendo a: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "correspondendo a" é comumente usado para designar um elemento ou porção estrutural em um agente do interesse que compartilha uma posição (por exemplo, no espaço tridimensional ou em relação a outro elemento ou porção) com aquele presente em um agente de referência adequado. Por exemplo, em algumas modalidades, o termo é usado para se referir à posição/identidade de um resíduo em um polímero, como em um resíduo de aminoácido em um polipeptídeo ou um resíduo de nucleotídeo em um ácido nucleico. As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que, para fins de simplicidade, os resíduos em tal polímero são muitas vezes designados usando um sistema de numeração canônico, com base em um polímero de referência relacionado, de modo que um resíduo em um primeiro polímero "corresponde a" um resíduo na posição 190 no polímero de referência, por exemplo, na verdade não precisa ser o 190° resíduo no primeiro polímero, mas sim corresponder ao resíduo encontrado na 190a posição no polímero de referência; as pessoas normalmente versadas na técnica prontamente saberão como identificar aminoácidos "correspondentes", incluindo através do uso de um ou mais algoritmos comercialmente disponíveis, projetados especificamente para fins de comparações de sequência de polímeros.
[000154] Derivado: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "derivado" refere-se a um análogo estrutural de uma substância de referência. Ou seja, um "derivado" é uma substância que mostra significativa semelhança estrutural com a substância de referência, por exemplo, partilhando uma estrutura de núcleo ou consenso, mas também difere em certos aspectos discretos. Em algumas modalidades, um derivado é uma substância que pode ser gerada a partir da substância de referência por manipulação química. Em algumas modalidades, um derivado é uma substância que pode ser gerada através do desempenho de um processo sintético substancialmente semelhante (por exemplo, compartilhando uma pluralidade de etapas) com um que gera a substância de referência.
[000155] Entidade/agente de detecção: O termo "entidade de detecção" ou "agente de detecção", conforme utilizado na presente invenção, se refere a qualquer elemento, molécula, grupo funcional, composto, fragmento ou porção que é detectável. Em algumas modalidades, uma entidade de detecção é fornecida ou utilizada sozinha. Em algumas modalidades, uma entidade de detecção é fornecida e/ou utilizada associada com (por exemplo, unida com) outro agente. Exemplos de entidades de detecção incluem, mas não se limitam, a: vários ligantes, radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr etc.),corantes fluorescentes (para corantes fluorescentes exemplares específicos, consulte abaixo), agentes quimiluminescentes (como, por exemplo, ésteres de acridínio, dioxetanos estabilizados e similares), agentes bioluminescentes, nanocristais semicondutores fluorescentes inorgânicos espectralmente resolvíveis (ou seja, pontos quânticos), nanopartículas metálicas (por exemplo, ouro, prata, cobre, platina, etc.) nanoclusters, íons metálicos paramagnéticos, enzimas (para exemplos específicos de enzimas, consulte abaixo), marcadores colorimétricos (como, por exemplo, corantes, ouro coloidal e similares), biotina, dioxigenina, haptenos e proteínas para as quais antissoro ou anticorpos monoclonais estão disponíveis.
[000156] Determinar: Muitas metodologias descritas neste documento incluem uma etapa de "determinação". As pessoas normalmente versadas na técnica, lendo o presente relatório descritivo, perceberão que tal "determinação", pode utilizar ou ser realizada através do uso de qualquer uma dentre diversas técnicas disponíveis para as pessoas versadas na técnica, incluindo, por exemplo, técnicas específicas explicitamente referidas nesse documento. Em algumas modalidades, a determinação envolve a manipulação de uma amostra física. Em algumas modalidades, uma determinação envolve a consideração e/ou manipulação de dados ou informações, por exemplo, utilizando um computador ou outra unidade de processamento adaptada para executar uma análise relevante. Em algumas modalidades, uma determinação envolve receber informações relevantes e/ou materiais de uma fonte. Em algumas modalidades, a determinação envolve comparar uma ou mais características de uma amostra ou uma entidade com uma referência comparável.
[000157] Forma de dosagem: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "forma de dosagem" refere-se a uma unidade fisicamente discreta do agente ativo (por exemplo, um agente terapêutico ou de diagnóstico) para a administração a um indivíduo. Cada unidade contém uma quantidade predeterminada de agente ativo. Em algumas modalidades, tal quantidade é uma quantidade de dosagem unitária (ou uma fração da mesma) apropriada para a administração de acordo com um regime de dosagem que foi determinado para se correlacionar com um resultado desejado ou benéfico quando administrado a uma população relevante (isto é, com um regime de dosagem terapêutica). As pessoas normalmente versadas na técnica notam que a quantidade total de uma composição terapêutica ou agente administrado a um determinado indivíduo é determinada por um ou mais médicos responsáveis e pode envolver a administração de múltiplas formas de dosagem.
[000158] Regime de dosagem: Conforme utilizado na presente invenção, um "regime de dosagem" ou "regime terapêutico", se refere a um conjunto de doses unitárias (geralmente mais de uma) que são administradas individualmente a um indivíduo, tipicamente separado por períodos de tempo. Em algumas modalidades, um determinado agente terapêutico tem um regime de dosagem recomendado, que pode envolver uma ou mais doses. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma pluralidade de doses, cada uma das quais sendo separadas umas das outras por um período de tempo da mesma duração; em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma pluralidade de doses e pelo menos dois diferentes períodos de tempo separando doses individuais. Em algumas modalidades, todas as doses dentro de um regime de dosagem são a mesma quantidade de dose unitária. Em algumas modalidades, doses diferentes dentro de um regime de dosagem são de diferentes quantidades. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma primeira dose em uma primeira quantidade de dose, seguido por uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade de dose diferente da primeira quantidade de dose. Em algumas modalidades, um regime de dosagem compreende uma primeira dosagem em uma primeira quantidade de dosagem, seguido por uma ou mais doses adicionais em uma segunda quantidade de dosagem igual à primeira quantidade de dosagem. Em algumas modalidades, um regime de dosagem está correlacionado com um resultado desejado ou benéfico quando administrado através de uma população relevante (ou seja, é um regime de dosagem terapêutica).
[000159] Manipulado: Em geral, o termo "manipulado" refere-se ao aspecto de ter sido manipulado pelo homem. Por exemplo, um polinucleotídeo é considerado "manipulado" quando duas ou mais sequências, que não estão ligadas nessa ordem na natureza, são manipuladas pelo homem para serem diretamente ligadas uma a outra no polinucleotídeo manipulado. Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção, um polinucleotídeo manipulado compreende uma sequência reguladora que é encontrada na natureza em associação operativa com a primeira sequência codificante, mas não em associação operativa com uma segunda sequência codificante, sendo ligada pelo homem de modo a estar operativamente associada com a segunda sequência codificante. Comparativamente, uma célula ou um organismo é considerado sendo "manipulado" se ele foi manipulado para que a sua informação genética seja alterada (por exemplo, novo material genético não anteriormente presente foi introduzido, por exemplo, pela transformação, pareamento, hibridação somática, transfecção, transdução ou outro mecanismo, ou o material genético anteriormente presente é alterado ou removido, por exemplo, por mutação por substituição ou deleção, ou por protocolos de pareamento). Como é prática comum e é compreendido pelas pessoas versadas na técnica, a progenia de um polinucleotídeo ou célula manipulada ainda são tipicamente referidos como "manipulado", mesmo que a real manipulação tenha sido realizada em uma entidade anterior.
[000160] Epítopo: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "epítopo" tem o seu significado tal como é compreendido na técnica. Será notado pelas pessoas normalmente versadas na técnica que um epítopo, também conhecido como um determinante antigênico, é uma região molecular de um antígeno que é reconhecida pelo sistema imunológico, especificamente pelos anticorpos, células B ou células T. Será adicionalmente notado que os epítopos podem ser compostos de açúcares, lipídios ou aminoácidos. Os epítopos dos antígenos de proteína são divididos em duas categorias, epítopos conformacionais e epítopos lineares, com base na sua estrutura e interação com o parátopo (parte de um anticorpo que reconhece o epítopo). Um epítopo conformacional compreende seções descontínuas da sequência de aminoácidos do antígeno e esses resumos interagem com o parátopo com base nas características da superfície 3-D e na forma ou estrutura terciária do antígeno. Epítopos lineares interagirem com o parátopo com base em suas estruturas primárias, e um epítopo linear é formado por uma sequência contínua de aminoácidos a partir do antígeno.
[000161] Expressão: Conforme utilizado na presente invenção, "expressão" de uma sequência de ácidos nucleicos refere-se a um ou mais dos seguintes eventos: (1) produção de um molde de RNA a partir de uma sequência de DNA (por exemplo, por transcrição); (2) processamento de um transcrito de RNA (por exemplo, por união, edição, formação de cap 5’ e/ou formação de extremidade 3'); (3) tradução de um RNA em um polipeptídeo ou proteína; e/ou (4) modificação pós-tradução de um polipeptídeo ou proteína.
[000162] Funcional: Conforme utilizado na presente invenção, uma molécula biológica "funcional" é uma molécula biológica em uma forma na qual ela exibe uma propriedade e/ou atividade pela qual ela é caracterizada. Uma molécula biológica pode ter duas funções (ou seja, ser bifuncional) ou muitas funções (ou seja, ser multifuncional).
[000163] Fragmento: Um "fragmento" de um material ou entidade, conforme descrito na presente invenção, tem uma estrutura que inclui uma porção discreta do todo, mas carece de uma ou mais porções encontradas no todo. Em algumas modalidades, um fragmento consiste em uma tal porção discreta. Em algumas modalidades, um fragmento consiste em ou compreende um elemento estrutural característico ou porção encontrada no todo. Em algumas modalidades, um fragmento de polímero compreende ou consiste em pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 , 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais unidades monoméricas (por exemplo, resíduos), tal como são encontrados no polímero inteiro. Em algumas modalidades, um fragmento de polímero compreende ou consiste em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais das unidades monoméricas (por exemplo, resíduos) encontrados no polímero inteiro. O material ou entidade inteira pode, em algumas modalidades, ser referido como a "origem" do todo.
[000164] Gene: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "gene" tem o seu significado tal como é compreendido na técnica. Será estimado pelas pessoas normalmente versadas na técnica que o termo "gene" pode incluir sequências reguladoras do gene (por exemplo, promotores, intensificadores, etc.) e/ou sequências de íntron. Será adicionalmente estimado que as definições de gene incluem referências aos ácidos nucleicos que não codificam proteínas, mas antes, codificam moléculas de RNA funcionais, como tRNAs, agentes de indução de RNAi, etc. Para efeitos de clareza, podemos notar que, tal como é usado no presente pedido, o termo "gene" geralmente se refere a uma porção de um ácido nucleico que codifica uma proteína; o termo pode opcionalmente englobar sequências reguladoras, tal como será claro a partir do contexto para as pessoas normalmente versadas na técnica. Esta definição não se destina a excluir a aplicação do termo "gene" para unidades de expressão de codificação não proteicas, mas é particularmente para esclarecer que, na maioria dos casos, o termo como usado neste documento refere-se a um ácido nucleico codificante de proteína.
[000165] Produto de gene ou produto de expressão: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "produto de gene" ou "produto de expressão" geralmente se refere a um RNA transcrito do gene (antes e/ou após o processamento) ou um polipeptídeo (antes e/ou após a modificação) codificado por um RNA transcrito do gene.
[000166] Ligação de alta afinidade: O termo "ligação de alta afinidade", conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um elevado grau de firmeza com a qual um determinado ligante se liga ao seu parceiro. As afinidades podem ser medidas por qualquer método disponível, incluindo aqueles conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a ligação é considerada de alta afinidade se a Kd for igual a cerca de 500 pM ou menos (por exemplo, abaixo de cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 20 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, cerca de 4 pM, cerca de 3 pM, cerca de 2 pM, etc.) nos ensaios de ligação. Em algumas modalidades, a ligação é considerada como sendo de alta afinidade se a afinidade for mais forte (por exemplo, a Kd for mais baixa) para um polipeptídeo de interesse do que para um polipeptídeo de referência selecionado. Em algumas modalidades, a ligação é considerada como sendo de alta afinidade se a razão entre a Kd para um polipeptídeo de interesse para a Kd para um polipeptídeo de referência selecionado for igual a 1:1 ou menor (por exemplo, 0,9:1, 0,8:1, 0,7:1, 0,6:1, 0,5:1, 0,4:1, 0,3:1, 0,2:1, 0,1:1, 0,05:1, 0,01:1 ou menos). Em algumas modalidades, a ligação é considerada como sendo de alta afinidade se a Kd para um polipeptídeo de interesse é igual a cerca de 100% ou menos (por exemplo, cerca de 99%, cerca de 98%, cerca de 97%, cerca de 96%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25% cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de 1% ou menos) da Kd para um polipeptídeo de referência selecionado.
[000167] Homologia: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "homologia" refere-se à relação global entre as moléculas poliméricas, por exemplo, entre as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre as moléculas de polipeptídeo. Em algumas modalidades, as moléculas poliméricas são consideradas "homólogas" entre si se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas. Em algumas encarnações, as moléculas poliméricas são consideradas "homólogas" entre si se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% semelhantes (por exemplo, contendo resíduos com propriedades químicas relacionadas às posições correspondentes). Por exemplo, tal como é conhecido pelas pessoas normalmente versadas na técnica, certos aminoácidos são normalmente classificados como semelhantes entre si como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofílicos", e/ou como tendo cadeias laterais "polares" ou "não polares". A substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo pode, muitas vezes, ser considerada uma substituição "homóloga". As classificações de aminoácidos típicas estão resumidas a seguir:
[000168] Como será compreendido pelas pessoas versadas na técnica, uma variedade de algoritmos estão disponíveis que permitem a comparação de sequências para determinar o seu grau de homologia, inclusive permitindo lacunas de comprimentos designados em uma sequência em relação à outra, ao considerar quais resíduos "correspondem" um ao outro em sequências diferentes. O cálculo da homologia porcentual entre duas sequências de ácido nucleico, por exemplo, pode ser realizado pelo alinhamento das duas sequências para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequências de ácidos nucleicos para o alinhamento ideal e sequências não correspondentes podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência alinhada para fins de comparação é igual a pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou substancialmente 100% do comprimento da sequência de referência. Os nucleotídeos nas posições de nucleotídeos correspondentes são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo nucleotídeo mesmo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição; quando uma posição na primeira sequência é ocupada por um nucleotídeo semelhante que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são semelhantes naquela posição. A homologia porcentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas e semelhantes compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna que precisa ser introduzida para o alinhamento ideal das duas sequências. Algoritmos representativos e programas de computador úteis para determinar a homologia porcentual entre duas sequências nucleotídicas incluem, por exemplo, o algoritmo de Meyers e Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) usando uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de lacuna de extensão igual a 12 e uma penalidade de lacuna igual a 4. A homologia porcentual entre duas sequências nucleotídicas pode, alternativamente, ser determinada, por exemplo, usando o programa GAP no pacote de software GCG, usando uma matriz NWSgapdna.CMP.
[000169] Ser humano: Em algumas modalidades, um ser humano é um embrião, um feto, um bebê, uma criança, um adolescente, um adulto ou um idoso.
[000170] Hidrofílico: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "hidrofílico" e/ou "polar" refere-se a uma tendência de misturar-se com, ou dissolver-se facilmente, em água.
[000171] Hidrofóbico: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "hidrofóbico" e/ou "não polar" refere-se a uma tendência de repelir, não combinam com, ou a uma incapacidade para se dissolver facilmente em água.
[000172] Identidade: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "identidade" refere-se à relação global entre as moléculas poliméricas, por exemplo, entre as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA e/ou moléculas de RNA) e/ou entre as moléculas de polipeptídeo. Em algumas modalidades, as moléculas poliméricas são consideradas sendo "substancialmente idênticas" entre si se as suas sequências forem pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas. O cálculo da identidade porcentual das duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, por exemplo, pode ser realizado pelo alinhamento das duas sequências para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequências para o alinhamento ideal, e sequências não correspondentes podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em certas modalidades, o comprimento de uma sequência alinhada para fins de comparação é igual a pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou substancialmente 100% do comprimento da sequência de referência. Os nucleotídeos nas posições correspondentes são, então, comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo (por exemplo, nucleotídeo ou aminoácido) que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade porcentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna que precisa ser introduzida para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da identidade porcentual entre as duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático. Por exemplo, a identidade porcentual entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo de Meyers e Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que foi incorporada ao programa ALIGN (versão 2.0). Em algumas modalidades exemplares, comparações de sequência de ácido nucleico feitas com o programa ALIGN usam uma tabela de peso de resíduos PAM120, uma penalidade de lacuna de extensão de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. A identidade porcentual entre as duas sequências nucleotídicas pode, alternativamente, ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG, usando uma matriz NWSgapdna.CMP.
[000173] Isolado: O termo "isolado" refere-se a uma substância e/ou a uma entidade que foi (i) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela estava associada quando foi inicialmente produzida (seja na natureza ou em um cenário experimental); e/ou (ii) projetada, produzida, preparada e/ou fabricada artificialmente. As substâncias e/ou entidades Isoladas podem ser separadas de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais de cerca de 99% dos outros componentes com os quais elas estavam inicialmente associadas. Em algumas modalidades, os agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cera de 99% ou mais do que cerca de 99% puros. Conforme utilizado na presente invenção, uma substância é "pura" se ela for substancialmente isenta de outros componentes. Em algumas modalidades, como será compreendido pelas pessoas versadas na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "isolada" ou mesmo "pura", após ter sido combinado com certos outros componentes tais como, por exemplo, um ou mais veículos ou excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.);em tais modalidades, o isolamento ou a pureza porcentual da substância é calculado sem incluir tais veículos ou excipientes. Em algumas modalidades, o isolamento envolve ou requer o rompimento de ligações covalentes (por exemplo, para isolar um domínio de polipeptídeo de um polipeptídeo mais longo e/ou para isolar um elemento de sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo ou ácido nucleico mais longo).
[000174] Marcador: Um marcador, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma entidade ou porção cuja presença ou nível é uma característica de um determinado estado ou evento. Em algumas modalidades, a presença ou o nível de um marcador específico pode ser característico da presença ou do estágio de uma doença, distúrbio ou condição. Para dar apenas um exemplo, em algumas modalidades, o termo se refere a um produto de expressão gênica que é característico de um determinado tumor, subclasse de tumor, estágio do tumor, etc. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, uma presença ou nível de um marcador particular correlaciona-se com a atividade (ou o nível de atividade) de uma via de sinalização particular, por exemplo, que pode ser característica de uma determinada classe de tumores. A significância estatística da presença ou da ausência de um marcador pode variar dependendo do marcador particular. Em algumas modalidades, a detecção de um marcador é altamente específica, pelo fato de refletir uma alta probabilidade de que o tumor seja de uma subclasse específica. Essa especificidade pode vir à custa de sensibilidade (ou seja, um resultado negativo pode ocorrer mesmo se o tumor for um tumor que se esperaria para expressar o marcador). Por outro lado, marcadores com um alto grau de sensibilidade podem ser menos específicos do que aqueles com sensibilidade mais baixa. De acordo com a presente invenção, um marcador útil não precisa distinguir tumores de uma subclasse específica com 100% de precisão.
[000175] Mutante: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "mutante" refere-se a uma entidade que mostra significativa identidade estrutural com uma entidade de referência, mas que difere estruturalmente da entidade de referência na presença ou no nível de uma ou mais porções químicas em comparação com a entidade de referência. Em muitas modalidades, um mutante também difere funcionalmente de sua entidade de referência. Em geral, se uma entidade particular é corretamente considerada como sendo um "mutante" de uma entidade de referência baseia-se no seu grau de identidade estrutural com a entidade de referência. Como será notado pelas pessoas versadas na técnica, qualquer entidade de referência biológica ou química tem certos elementos estruturais característicos. Um mutante, por definição, é uma entidade química distinta que compartilha um ou mais desses elementos estruturais característicos. Para dar apenas alguns exemplos, uma pequena molécula pode ter um elemento estrutural do núcleo característico (por exemplo, um núcleo macrocíclico) e/ou uma ou mais porções pendentes características, de modo que um mutante da molécula pequena seja aquele que compartilha o elemento estrutural do núcleo e as porções pendentes características, mas que difere de outras porções pendentes e/ou nos tipos de ligações presentes (simples vs. dupla, E vs. Z, etc.) no núcleo, um polipeptídeo pode ter um elemento de sequência característico compreendido por uma pluralidade de aminoácidos com posições designadas um em relação ao outro no espaço linear ou tridimensional e/ou contribuindo para uma determinada função biológica, um ácido nucleico pode ter um elemento de sequência característico composto de uma pluralidade de resíduos de nucleotídeos com posições designadas um em relação ao outro no espaço linear ou tridimensional. Por exemplo, um polipeptídeo mutante pode diferir de um polipeptídeo de referência como resultado de uma ou mais diferenças na sequência de aminoácidos e/ou um ou mais diferenças nas porções químicas (por exemplo, carboidratos, lipídios, etc.) covalentemente ligadas à estrutura polipeptídica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante mostra uma identidade de sequência total com um polipeptídeo de referência que é igual a pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99%. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante não compartilha pelo menos um elemento de sequência característico com um polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência tem uma ou mais atividades biológicas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante não tem uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante mostra um nível reduzido de uma ou mais atividades biológicas em comparação com o polipeptídeo de referência.
[000176] Ácido nucleico: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "ácido nucleico", em seu sentido mais amplo, refere-se a qualquer composto e/ou substância que é ou pode ser incorporado em uma cadeia oligonucleotídica. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é um composto ou substância que é ou pode ser incorporado em uma cadeia oligonucleotídica por meio e uma ligação fosfodiéster. Como ficará claro a partir do contexto, em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se aos resíduos de ácido nucleico individuais (por exemplo, nucleotídeos e/ou nucleosídeos); em algumas modalidades, "ácidos nucleicos" refere-se a uma cadeia oligonucleotídica compreendendo resíduos de ácidos nucleicos individuais. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende RNA; em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende DNA. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais resíduos de ácido nucleico naturais. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais análogos de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um análogo de ácido nucleico difere de um ácido nucleico que ele não utiliza uma estrutura fosfodiéster. Por exemplo, em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais "ácidos nucleicos de peptídeo", que são conhecidos na técnica e têm ligações peptídicas ao invés de ligações fosfodiéster na estrutura, e que são considerados dentro do escopo da presente invenção. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, um ácido nucleico tem uma ou mais ligações fosforotioato e/ou 5’-N-fosforoamidita ao invés de ligações fosfodiéster. Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina). Em algumas modalidades, um ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2- aminoadenosina, 2-thiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3- metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propiniluridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluoruridina, C5-iodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 2- aminoadenosina, 7-deaza-adenosina, 7-deazaguanosina, 8- oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas e combinações dos mesmos). Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende um ou mais açúcares modificados (por exemplo, 2'-flúor-ribose, ribose, 2'- desoxirribose, arabinose e hexose) em comparação com aqueles em ácidos nucleicos naturais. Em algumas modalidades, um ácido nucleico tem uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto de gene funcional, como um RNA ou proteína. Em algumas modalidades, um ácido nucleico inclui um ou mais íntrons. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são preparados por uma ou mais dentre isolamento de uma fonte natural, síntese enzimática pela polimerização com base em um molde complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula ou sistema recombinante e síntese química. Em algumas modalidades, um ácido nucleico tem pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais resíduos de comprimento.
[000177] Paciente: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "paciente" ou "indivíduo" refere-se a qualquer organismo para o qual uma composição fornecida é ou pode ser administrada, por exemplo, para fins experimentais, de diagnóstico, profiláticos, cosméticos e/ou terapêuticos. Pacientes típicos incluem animais (por exemplo, mamíferos como camundongos, ratos, coelhos, primatas não humanos e/ou seres humanos). Como as pessoas versadas na técnica notarão, em algumas modalidades, um animal pode ser um animal doméstico (por exemplo, um animal de fazenda, um animal de companhia, etc.). Em algumas modalidades, um paciente é um ser humano. Em algumas modalidades, um paciente está sofrendo de ou é suscetível a um ou mais distúrbios ou condições. Em algumas modalidades, um paciente exibe um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um paciente foi diagnosticado com um ou mais distúrbios ou condições. Em algumas modalidades, o distúrbio ou condição é ou inclui câncer, ou a presença de um ou mais tumores. Em algumas modalidades, tal câncer ou tumor é ou compreende um câncer de próstata, ou tumor na próstata. Em algumas modalidades, o distúrbio ou condição é o câncer metastático.
[000178] Peptídeo: O termo "peptídeo" refere-se a dois ou mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas. Em modalidades particulares, "peptídeo" refere-se a um polipeptídeo com um comprimento de menos que cerca de 100 aminoácidos, menos do que cerca de 50 aminoácidos, menos do que 20 aminoácidos ou menos de 10 aminoácidos.
[000179] Composição farmacêutica: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "composição farmacêutica" refere-se a um agente ativo, formulado juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em uma quantidade de dose unitária apropriada para a administração em um regime terapêutico que mostra uma probabilidade significativa de alcançar um efeito terapêutico predeterminado, quando é administrado a uma população relevante. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser especialmente formuladas para a administração na forma sólida ou líquida, incluindo aquelas adaptadas para os seguintes casos: administração oral, por exemplo, líquidos (drenches - soluções ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, por exemplo, aqueles destinados à absorção sistêmica, sublingual e bucal, bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na língua; administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solução ou suspensão estéril ou formulação de liberação sustentada; aplicação tópica, por exemplo, como um creme, unguento ou um emplastro de liberação controlada ou spray aplicado à pele, pulmões ou cavidade oral; intravaginalmente ou intrarretalmente, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; sublingualmente; ocularmente; tansdermicamente ou por via nasal, pulmonar e por outras vias das superfícies mucosas.
[000180] Farmaceuticamente aceitável: O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado na presente invenção, refere-se aos agentes que, no âmbito do bom julgamento médico, são adequados para uso em contato com os tecidos dos seres humanos e/ou animais sem toxicidade, irritação ou resposta alérgica excessiva, ou outro problema ou complicação, proporcionado com uma relação risco/benefício aceitável.
[000181] Veículo farmaceuticamente aceitável: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um material de enchimento sólido ou líquido, diluente, excipiente ou material de encapsulamento, envolvido em carregar ou transportar o composto em questão de um órgão, ou parte do corpo, para outro órgão ou parte do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável", no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição, e não prejudicial ao paciente. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, como lactose, glicose e sacarose; amidos, como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes, como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, como propilenoglicol; polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, como o oleato de etila e o laurato de etila; agar-agar; agentes tamponantes, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; e outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas nas formulações farmacêuticas.
[000182] Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo", conforme utilizado na presente invenção, tem geralmente o seu significado reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos, ligados entre si por ligações peptídicas. Em algumas modalidades, o termo é usado para se referir a classes funcionais específicas de polipeptídeos. Para cada uma dessas classes, o presente relatório descritivo fornece vários exemplos de sequências de aminoácidos de polipeptídeos exemplares conhecidos dentro da classe; em algumas modalidades, tais polipeptídeos conhecidos são polipeptídeos para a classe. Em tais modalidades, o termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer membro da classe que mostra homologia de sequência ou identidade significativa com um polipeptídeo de referência relevante. Em muitas modalidades, tal membro também compartilha uma atividade significativa com o polipeptídeo de referência. Alternativamente ou além disso, em muitas modalidades, tal membro também compartilha um elemento de sequência característico particular com o polipeptídeo de referência (e/ou com outros polipeptídeos dentro da classe; em algumas modalidades, com todos os polipeptídeos dentro da classe). Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo membro mostra um grau total de homologia de sequência ou identidade com um polipeptídeo de referência que é pelo menos cerca de 30 a 40%, e é comumente maior do que cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, e/ou inclui pelo menos uma região (ou seja, uma região conservada que pode, em algumas modalidades, ser ou compreender um elemento de sequência característico) que mostra identidade de sequência muito alta, muitas vezes maior do que 90% ou até 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Tal região conservada geralmente engloba pelo menos 3 ou 4 e, muitas vezes, até 20 ou mais aminoácidos; em algumas modalidades, uma região conservada engloba pelo menos um trecho de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo útil pode compreender ou consistir em um fragmento de um polipeptídeo original. Em algumas modalidades, um polipeptídeo útil pode compreender ou consistir em uma pluralidade de fragmentos, cada um dos quais sendo encontrado no mesmo polipeptídeo original em uma disposição espacial diferente em relação à que é encontrada no polipeptídeo de interesse (por exemplo, fragmentos que estão ligados diretamente no original podem ser espacialmente separados no polipeptídeo de interesse ou vice- versa, e/ou fragmentos podem estar presentes em uma ordem diferente no polipeptídeo de interesse do que no original), de modo que o polipeptídeo de interesse é um derivado do seu polipeptídeo original. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais ou ambos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender apenas os ácidos aminados naturais ou somente os aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender D- aminoácidos, L-aminoácidos ou ambos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender apenas D-aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode compreender apenas L- aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir um ou mais grupos pendentes, por exemplo, modificando ou ligando a uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos, e/ou no N-terminal do polipeptídeo, no C-terminal do polipeptídeo, ou em ambos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode ser cíclico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo não é cíclico. Em algumas modalidades, um polipeptídeo é linear.
[000183] Proteína: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "proteína" refere-se a um polipeptídeo (ou seja, uma sequência de pelo menos dois aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas). As proteínas podem incluir porções diferentes de aminoácidos (por exemplo, elas podem ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) e/ou podem ser, de outra forma, processadas ou modificadas. As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que uma "proteína" pode ser uma cadeia polipeptídica completa, tal como é produzida por uma célula (com ou sem uma sequência sinal), ou pode ser uma porção característica da mesma. As pessoas normalmente versadas compreenderão que uma proteína pode, às vezes, incluir mais de uma cadeia polipeptídica, por exemplo, ligada por uma ou mais ligações dissulfeto ou associada por outros meios. Os polipeptídeos podem conter L-aminoácidos, D-aminoácidos ou ambos, e podem conter qualquer um de uma variedade de modificações de aminoácidos ou dos análogos conhecidos na técnica. Modificações úteis incluem, por exemplo, acetilação, metilação, amidação terminal, etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem compreender aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sintéticos e combinações dos mesmos. O termo "peptídeo" é geralmente usado para se referir a um polipeptídeo com um comprimento de menos que cerca de 100 aminoácidos, menos do que cerca de 50 aminoácidos, menos do que 20 aminoácidos ou menos de 10 aminoácidos. Em algumas modalidades, as proteínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologicamente ativas dos mesmos e/ou suas porções características.
[000184] Puro: Conforme utilizado na presente invenção, um agente ou entidade é "puro" se for substancialmente isento de outros componentes. Por exemplo, uma preparação que contém mais de cerca de 90% de um determinado agente ou entidade é geralmente considerada uma preparação pura. Em algumas modalidades, um agente ou entidade é pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, no mínimo, 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% puro.
[000185] Referência: O termo "referência" é usado frequentemente neste documento para descrever um agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor padrão ou de controle contra o qual um agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse é comparado. Em algumas modalidades, um agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é testado e/ou determinado substancialmente ao mesmo tempo com o teste ou a determinação do agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse. Em algumas modalidades, um agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é uma referência histórica, opcionalmente incorporada em um meio tangível. Normalmente, como seria entendida pelas pessoas versadas na técnica, um agente de referência, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor é determinado ou caracterizado sob condições comparáveis às utilizadas para determinar ou caracterizar o agente, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse.
[000186] Resposta: Conforme utilizado na presente invenção, uma resposta ao tratamento pode referir-se a qualquer alteração benéfica na condição do indivíduo que ocorre como resultado de ou correlaciona-se com o tratamento. Tal alteração pode incluir a estabilização da condição (por exemplo, prevenção de deterioração que teria ocorrido na ausência do tratamento), melhoria dos sintomas da condição e/ou melhoria nas perspectivas para a cura de uma condição, etc. Ela pode referir-se à resposta de um indivíduo ou à resposta do tumor. A resposta do tumor ou do indivíduo pode ser medida de acordo com uma grande variedade de critérios, incluindo critérios clínicos e critérios objetivos. Técnicas para avaliar a resposta incluem, mas não e limitam, ao exame clínico, tomografia por emissão de pósitrons, radiografia de tórax, tomografia computadorizada, ressonância magnética, ultrassom, endoscopia, laparoscopia, presença ou nível de marcadores tumorais em uma amostra obtida de um indivíduo, citologia e/ou histologia. Muitas dessas técnicas tentam determinar o tamanho de um tumor ou, de outra forma, determinar a carga tumoral total. Métodos e diretrizes para avaliar a resposta ao tratamento são discutidos em Therasse et. al., "New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors", Organização Europeia para a Investigação e o Tratamento do Câncer, Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos, Instituto Nacional do Câncer do Canadá, J. Natl. Cancer Inst., 2000, 92(3): 205-216. Os critérios de resposta exatos podem ser selecionados de qualquer forma adequada, desde que ao comparar grupos de tumores e/ou pacientes, os grupos a serem comparados sejam avaliados com base em critérios iguais ou comparáveis para determinar a taxa de resposta. Uma pessoa normalmente versada na técnica será capaz de selecionar critérios adequados.
[000187] Ligação específica: Conforme utilizado na presente invenção, os termos "ligação específica" ou "específico para" ou "específico a" se referem a uma interação (tipicamente não covalente)( entre uma entidade alvo (por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo alvo) e um agente de ligação (por exemplo, um anticorpo, como um anticorpo fornecido). Como será compreendido pela pessoas normalmente versadas na técnica, uma interação é considerada "específica", se ela for favorecida na presença de interações alternativas. Em muitas modalidades, uma interação é tipicamente dependente da presença de uma característica estrutural particular da molécula alvo, como um determinante antigênico ou epítopo reconhecido pela molécula de ligação. Por exemplo, se um anticorpo é específico para o epítopo A, a presença de um polipeptídeo contendo o epítopo A ou a presença de A não marcado livre em uma reação contendo tanto o A marcado livre como o anticorpo para o mesmo, irá reduzir a quantidade de A marcado que se liga ao anticorpo. Deve ser compreendido que a especificidade não precisa ser absoluta. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que vários anticorpos reagem de forma cruzada com outros epítopos, além daqueles presentes na molécula alvo. Tal reatividade cruzada pode ser aceitável, dependendo da aplicação para a qual o anticorpo é para ser usado. Em modalidades particulares, um anticorpo específico para o receptor das tirosina quinases possui menos de 10% de reatividade cruzada com o receptor da tirosina quinase ligado aos inibidores de protease (por exemplo, ACT). Uma pessoa normalmente versada na técnica será capaz de selecionar os anticorpos com um grau suficiente de especificidade para executar adequadamente em uma determinada aplicação (por exemplo, para a detecção de uma molécula alvo, para fins terapêuticos, etc.). A especificidade pode ser avaliada no contexto de fatores adicionais, tais como a afinidade da molécula de ligação para a molécula alvo versus a afinidade da molécula de ligação por outros alvos (por exemplo, competidores). Se uma molécula de ligação apresenta uma elevada afinidade para uma molécula alvo que se deseja detectar e uma baixa afinidade por moléculas não alvo, o anticorpo provavelmente será um reagente aceitável para fins de imunodiagnóstico. Uma vez que a especificidade de uma molécula de ligação é definida em um ou mais contextos, ela pode ser empregada em outros contextos preferencialmente semelhantes, sem necessariamente reavaliar a sua especificidade.
[000188] Especificidade: Tal como é conhecido na técnica, a "especificidade" é uma medida da habilidade de um ligante específico para distinguir o seu parceiro de ligação de outros parceiros de ligação em potencial.
[000189] Indivíduo: Por "indivíduo" se entende um mamífero (por exemplo, um ser humano, em algumas modalidades, incluindo formas humanas pré-natal). Em algumas modalidades, um indivíduo está sofrendo de uma doença, distúrbio ou condição relevante. Em algumas modalidades, um indivíduo é suscetível a uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um assunto exibe um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo não exibe qualquer sintoma ou característica de uma doença, distúrbio ou condição. Em algumas modalidades, um indivíduo é alguém com uma ou mais características de susceptibilidade para ou risco de uma doença, distúrbio ou condição. Um indivíduo pode ser um paciente, que se refere a um ser humano apresentando a um médico para diagnóstico ou tratamento de uma doença. Em algumas modalidades, um indivíduo é uma pessoa a quem a terapia é administrada.
[000190] Substancialmente: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "substancialmente" refere-se à condição qualitativa de expor total ou quase total extensão ou grau de uma característica ou propriedade de interesse. Uma pessoa normalmente versada nas técnicas biológicas vai entender que fenômenos biológicos e químicos raramente, se alguma vez, são concluídos e/ou prosseguem até a totalidade, ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto, usado nesse documento para capturar a potencial falta de completude inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos.
[000191] Homologia de sequência substancial: A frase "homologia substancial" é usada neste documento para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Como será evidente pelas pessoas normalmente versadas na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente homólogas" se elas contiverem resíduos homólogos nas posições correspondentes. Resíduos homólogos podem ser resíduos idênticos. Alternativamente, resíduos homólogos podem ser resíduos não idênticos com características estruturais e/ou funcionais apropriadamente semelhantes. Por exemplo, tal como é bem conhecido pelas pessoas normalmente versadas na técnica, certos aminoácidos são normalmente classificados como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofílicos", e/ou como tendo cadeias laterais "polares" ou "não polares". A substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo pode, muitas vezes, ser considerada uma substituição "homóloga". As classificações de aminoácidos típicas estão resumidas a seguir:
[000192] Tal como é bem conhecido nesta técnica, sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais como BLASTN, para sequências de nucleotídeo, e BLASTP, BLAST intervalado e PSI- BLAST para sequências de aminoácidos. Exemplares de tais programas são descritos em Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; e em Misener, et al., (eds.),Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol., Humana Press, 1999). Além de identificar sequências homólogas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de homologia. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente homólogas se pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98 %, pelo menos 99% ou mais dos seus resíduos correspondentes são homólogos em relação a um trecho relevante de resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante é de pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos, 55, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70, pelo menos 75, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300, pelo menos 325, pelo menos 350, pelo menos 375, pelo menos 400, pelo menos 425, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500 ou mais resíduos.
[000193] Identidade substancial: A frase "identidade substancial" é usada neste documento para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Como será percebido pelas pessoas normalmente versadas na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente idênticas" se elas contiverem resíduos idênticos nas posições correspondentes. Tal como é bem conhecido nesta técnica, sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais como BLASTN, para sequências de nucleotídeo, e BLASTP, BLAST intervalado e PSI-BLAST para sequências de aminoácidos. Exemplares de tais programas são descritos em Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.)Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol., Humana Press, 1999). Além de identificar sequências idênticas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de identidade. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente idênticas se pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais dos seus resíduos correspondentes são idênticos ao longo de um trecho relevante de resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante possui pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais resíduos.
[000194] Semelhança estrutural substancial: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "semelhança estrutural substancial" refere- se à presença de características estruturais comuns, tais como a presença e/ou a identidade de aminoácidos particulares em posições específicas (consulte as definições de "homologia de sequência compartilhada" e "identidade de sequência compartilhada"). Em algumas modalidades, o termo "semelhança estrutural substancial" refere-se à presença e/ou à identidade de elementos estruturais (por exemplo: alças, folhas, hélices, doadores de ligação de H, aceitadores de ligação de H, padrões de glicosilação, pontes salinas e ligações dissulfeto). Em algumas outras modalidades, o termo "semelhança estrutural substancial" refere-se à disposição e/ou orientação tridimensional de átomos ou porções em relação um ao outro (por exemplo: distância e/ou ângulos entre um agente de interesse e um agente de referência).
[000195] Agente terapêutico: Conforme utilizado na presente invenção, a frase "agente terapêutico" refere-se, em geral, a qualquer agente que provoca um efeito farmacológico quando é administrado a um organismo. Em algumas modalidades, um agente é considerado um agente terapêutico se ele demonstra um efeito estatisticamente significativo em toda uma população apropriada. Em algumas modalidades, a população adequada pode ser uma população de organismos modelos. Em algumas modalidades, uma população adequada pode ser definida por diversos critérios, tais como uma determinada faixa etária, sexo, antecedentes genéticos, condições clínicas pré-existentes, etc. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é uma substância que pode ser usada para aliviar, amenizar, mitigar, inibir, prevenir, retardar o aparecimento de, reduzir a gravidade de e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente que foi ou que precisa ser aprovado por uma agência governamental antes que possa ser comercializado para administração aos seres humanos. Em algumas modalidades, um "agente terapêutico" é um agente para o qual uma prescrição médica é necessária para a administração aos seres humanos.
[000196] Regime terapêutico: Um "regime terapêutico", como o termo é usado nesse documento, refere-se a um regime de dosagem cuja administração em uma população relevante está correlacionada com um resultado terapêutico desejado ou benéfico.
[000197] Quantidade terapeuticamente eficaz: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade que é suficiente, quando administrada a um indivíduo que sofre de ou é suscetível À doença, distúrbio e/ou condição, de acordo com um regime de dosagem terapêutica, para tratar a doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que reduz a incidência e/ou a gravidade de, e/ou retarda o aparecimento de um ou mais sintomas da doença, distúrbio e/ou condição. As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" não requer, de fato, que o tratamento bem sucedido seja alcançado em um determinado indivíduo. Em vez disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser aquela quantidade que fornece uma resposta farmacológica desejada particular em um número significativo de indivíduos, quando é administrada a pacientes que necessitam de tal tratamento. É especificamente compreendido que indivíduos particulares podem, de fato, ser "refratários" a uma "quantidade terapeuticamente eficaz." Para dar apenas um exemplo, um indivíduo refratário pode ter uma biodisponibilidade baixa, de modo que a eficácia clínica não possa ser obtida. Em algumas modalidades, referência a uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma referência a uma quantidade tal como é medida em um ou mais tecidos específicos (por exemplo, um tecido afetado pela doença, distúrbio ou condição) ou fluidos (por exemplo, sangue, saliva, soro, suor, lágrimas, urina, etc.). As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que, em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser formulada e/ou administrada em dose única. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser formulada e/ou administrada em uma pluralidade de doses, por exemplo, como parte de um regime de dosagem.
[000198] Tratamento: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "tratamento" (também "tratar" ou "tratando"), em seu sentido mais amplo, se refere a qualquer administração de uma substância (por exemplo, composições fornecidas) que alivia, melhora, revive, inibe, atrasa o início, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência, parcialmente ou completamente, de um ou mais sintomas, características e/ou causas de uma determinada doença, distúrbio e/ou condição. Em algumas modalidades, tal tratamento pode ser administrado a um indivíduo que não apresenta sinais da doença, distúrbio e/ou condição em questão e/ou de um indivíduo que apresenta apenas sinais precoces da doença, distúrbio e/ou condição. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado para um indivíduo que apresenta um ou mais sinais estabelecidos da doença, distúrbio e/ou condição relevante. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo que foi diagnosticado como sofrendo da doença, distúrbio e/ou condição em questão. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo conhecido por ter um ou mais fatores de susceptibilidade que são estatisticamente correlacionados com o aumento do risco de desenvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição em questão.
[000199] Tratamento pela expressão in vivo de anticorpos: As células linfoides e não linfoides (por exemplo, mioblastos, células tronco mesenquimais) podem ser geneticamente modificadas ex vivo ou in vivo para secretar IgG completa (Compte et al., 2013 Biomatter 3; Noel et al., 1997 Hum Gene Ther 8: 1219-1229. A terapia genética com IgG usando adenovírus recombinantes carregando as sequências de DNA poderia alcançar altos níveis de IgG no soro, mas a durabilidade foi limitada pela imunogenicidade do vírus (Noel et al., 2002 Hum Gene Ther 13:1483-1493; Jooss & Chirmule, 2004 Gene Ther 10:955-963). Os vírus adenoassociados (rAAV) e, especialmente, os sorotipos seletivos, são menos imunogênicos (Xiao et al., 2012 Therapeutic Delivery 3:835-856) e são comprovadamente vetores duráveis da terapia genética humana (Nathwani et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365:2357-2365; Patel et al., 2014 International Journal of Hematology 99:372-376). Provas pré- clínicas do conceito foram relatadas para anticorpos de IgG completos específicos para o VEGFR-2 (DC101) (Fang et al, 2005 Nat. Biotechnol. 23:584-590), VEGF (Watanabe et al., 2009 Hum. Gene Ther. 20:598610), HER-2 (Ho et al., 2009 Cancer Gene Ther. 16:184-194; Wang et al., 2010 Cancer Gene Ther. 17, 559-570), Met (Vigna et al., 2008 Cancer Res. 68:9176-9183), e HIV (Balazs et al., 2012 Nature 481:8184). Sucessos semelhantes foram descritos para o fragmento Fv de cadeia simples (scFv) contra a laminina associada à angiogênese (Arafat et al., 2002 Gene Ther 9:256-262; Sanz et al., 2001 Cancer Immunol. Immunother. 50:557-565; Sanz et al., 2003 EMBO J. 22:15081517; Sanz et al., 2002 Gene Ther. 9:1049-1053) e suas formas trivalentes e hexavalentes (Sanchez-Arevalo et al, 2006 Int. J. Cancer 119:455-462), ou o scFv contra VEGF (Afanasieva et al., 2003 Gene Ther. 10:1850-1859) e seus derivados bivalentes (minicorpo e scFv-Fc), ou a imunotoxina anti-HER2 scFv (Liu et al., 2009 Cancer Gene Ther. 16:861-872), ou diacorpos biespecíficos CEA x CD3 (Blanco et al, 2007 J. Immunol. 171:1070-1077; Compte et al., 2007 Cancer Gene Ther. 14:380-388).
[000200] Variante: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "variante" refere-se a uma entidade que mostra significativa identidade estrutural com uma entidade de referência, mas que difere estruturalmente da entidade de referência na presença ou no nível de uma ou mais porções químicas em comparação com a entidade de referência. Em muitas modalidades, uma variante também difere funcionalmente de sua entidade de referência. Em geral, se uma entidade particular é corretamente considerada como sendo uma "variante" de uma entidade de referência baseia-se no seu grau de identidade estrutural com a entidade de referência. Como será notado pelas pessoas versadas na técnica, qualquer entidade de referência biológica ou química tem certos elementos estruturais característicos. Uma variante, por definição, é uma entidade química distinta que compartilha um ou mais desses elementos estruturais característicos. Para dar apenas alguns exemplos, uma pequena molécula pode ter um elemento estrutural do núcleo característico (por exemplo, um núcleo macrocíclico) e/ou uma ou mais porções pendentes características, de modo que uma variante da molécula pequena seja aquele que compartilha o elemento estrutural do núcleo e as porções pendentes características, mas que difere de outras porções pendentes e/ou nos tipos de ligações presentes (simples vs. dupla, E vs. Z, etc.) no núcleo, um polipeptídeo pode ter um elemento de sequência característico compreendido por uma pluralidade de aminoácidos com posições designadas um em relação ao outro no espaço linear ou tridimensional e/ou contribuindo para uma determinada função biológica, um ácido nucleico pode ter um elemento de sequência característico composto de uma pluralidade de resíduos de nucleotídeos com posições designadas um em relação ao outro no espaço linear ou tridimensional. Por exemplo, um polipeptídeo variante pode diferir de um polipeptídeo de referência, como resultado de uma ou mais diferenças na sequência de aminoácidos e/ou uma ou mais diferenças nas porções químicas (por exemplo, carboidratos, lipídios, etc.) covalentemente ligadas à estrutura polipeptídica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante mostra uma identidade de sequência total com um polipeptídeo de referência que é igual a pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99%. Alternativamente ou além disso, em algumas modalidades, um polipeptídeo variante não compartilha pelo menos um elemento de sequência característico com um polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de referência tem uma ou mais atividades biológicas. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante não tem uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo mutante mostra um nível reduzido de uma ou mais atividades biológicas em comparação com o polipeptídeo de referência. Em muitas modalidades, um polipeptídeo de interesse é considerado como sendo uma "variante" de um polipeptídeo original ou de referência se o polipeptídeo de interesse tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica à original, mas para um pequeno número de alterações de sequência em posições particulares. Normalmente, menos de 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% ou 2% dos resíduos na variante são substituídos em comparação com o original. Em algumas modalidades, uma variante tem 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo substituído em comparação com o original. Muitas vezes, uma variante tem um número muito pequeno (por exemplo, menos de 5, 4, 3, 2 ou 1) de resíduos funcionais substituídos (ou seja, resíduos que participam de uma determinada atividade biológica). Além disso, uma variante tipicamente não tem mais de 5, 4, 3, 2, ou 1 adições ou deleções e, muitas vezes, ela não tem adições ou deleções, em comparação com o original. Além disso, quaisquer adições ou deleções são tipicamente menos de cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6 e, comumente, elas são menos de cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 resíduos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo original ou de referência é um encontrado na natureza. Como será compreendido pelas pessoas normalmente versadas na técnica, uma pluralidade de variantes de um polipeptídeo particular de interesse podem ser comumente encontradas na natureza, particularmente quando o polipeptídeo de interesse é um polipeptídeo de agente infeccioso.
[000201] Vetor: Conforme utilizado na presente invenção, "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele está associado. Em alguma modalidade, os vetores são capazes de se replicar e/ou expressar extracromossomicamente os ácidos nucleicos aos quais eles estão ligados em uma célula hospedeira, como uma célula eucariótica ou procariótica. Vetores capazes de direcionar a expressão dos genes operativamente ligados são referidos como "vetores de expressão".
[000202] Tipo selvagem: Conforme utilizado na presente invenção, o termo "tipo selvagem" tem o seu significado compreendido na técnica, que se refere a uma entidade com uma estrutura e/ou atividade como encontrada na natureza em um estado ou contexto "normal" (ao contrário de um mutante, doente, alterado, etc.). As pessoas normalmente versadas na técnica compreenderão que os genes e os polipeptídeos tipo selvagem comumente existem em várias formas diferentes (por exemplo, alelos).
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES Alívio da imunossupressão
[000203] A remoção das vias reguladoras negativas que inibem as células do sistema imunológico está rapidamente ganhando importância no tratamento do câncer. Um dos primeiros exemplos bem sucedidos de tal abordagem terapêutica foi incorporado na aprovação do ipilimumab para o tratamento do melanoma em março de 2001 pelo Food and Drug Administration (FDA). O ipilimumab é um anticorpo monoclonal (MAb) que tem como alvo o CTLA-4, um regulador negativo chave encontrado nas células T ativadas. O CTLA-4 se liga aos membros da família B7 de moléculas acessórias que são expressas pelas células dendríticas (DCs) e outras células apresentadoras de antígeno (APCs). A ligação do CTLA-4 a essas moléculas acessórias efetivamente inibe ainda mais a ativação e a expansão da célula T, bloqueando assim o progresso de uma resposta imunológica envolvendo tais células (Mellman et al, 2011 Nature 480: 480-489). Ao alvejar o CTLA-4, o ipilimumab libera essa inibição, permitindo a ativação e a expansão das células T, incluindo especificamente aquelas que destroem as células cancerosas.
[000204] Outras abordagens que foram buscadas para tratar o câncer removendo a inibição imunológica incluem o alvejamento do correceptor de célula T de morte programada 1 (PD-1) e os seus ligantes B7-H1/PD- L1 e B7-DC/PD-L2, que fazem parte de uma via que mantém um microambiente do tumor imunossupressor (Topalian et al, 2012 Curr. Opin. Immunol. 24:207-212). Em particular, esses ensaios clínicos de fase I/II, usando os anticorpos anti-PD-1 (Topalian et al., 2012 N. Engl. J. Med. 366:2443-2454) ou anti-PD-L1 (Brahmer et al., 2012 N. Engl. J. Med. 366:2455-2465) demonstraram regressão ou estabilização do tumor no melanoma, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de célula renal e câncer de ovário.
[000205] Além disso, outras abordagens foram projetadas para remover a inibição imunológica direcionada pelas células natural killer (NK). Por exemplo, os receptores tipo Ig de células killer humanas (KIRs) são glicoproteínas que são expressas nas superfícies das células NK e se ligam ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC)/subtipos de classe I do antígeno leucocitário humano (HLA) nas células-alvo potenciais. Essa interação de ligação inibe a citotoxicidade das células NK. Os anticorpos monoclonais que alvejam as KIR demonstraram, em ensaios clínicos, bloquear tal inibição, aliviando a supressão da atividade NK. (Romagne et al, 2009, Blood 114:26672677).
[000206] Da mesma forma, os receptores tipo Ig de leucócitos (LIRs, também conhecidos como transcritos tipo Ig, ILTs), também são expressos nas superfícies das células NK (assim como alguns linfócitos T e B e certos macrófagos, mastócitos e células dendríticas) e também se ligam ao MHC/subtipos de HLA classe I, resultando na inibição da atividade das células efetoras que expressam LIR. Alguns estudos relataram sucesso na estimulação da citotoxicidade de células efetoras por meio do bloqueio das interações entre LIRs e MHC/moléculas GLA classe I (Godal et al., 2010, Biol. Blood Marrow Transplant 16:612-621).
[000207] Além disso, várias abordagens foram buscadas que procuram desfazer a imunossupressão associada ao tumor pelo alvejamento dos antígenos associados ao tumor. Por exemplo, o bloqueio de MAbs (por exemplo, anti-CD47) foi estudado e verificou-se ser eficaz em estimular os macrófagos a fagocitar as células tumorais na leucemia/linfoma e em modelos tumorais sólidos, tanto in vitro como in vivo (Zhao et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:1834218247; Majeti et al., 2009, Cell 138:286-299; Chao et al., 2011, Cancer Res. 71:1374-1384; Chao et al., 2010, Sci. Transl. Med. 2:63ra94; Chao et al., 2010, Cell 142:699-713; Willingham et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:6662-6667).
[000208] Outros alvos de antígeno tumoral de particular interesse incluem o gangliosídeo GD2, que é altamente expresso em sarcomas e tumores derivados de neuoroectoderma, mas tem expressão restrita nas células normais. Foi demonstrado que o alvejamento de GD2 promove a ativação de células NK através da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Tarek et al., 2012, J. Clin. Invest. 122:3260-3270).
[000209] O B7H3 humano (também conhecido como CD276) é um membro da superfamília das imunoglobulinas B7/CD28, que fornece sinais de coestimulação cruciais que regulam a função das células T no contexto da sobrevivência tumoral, bem como das doenças infecciosas e autoimunes (Wilcox et al., 2012, Eur. J. Haematol. 88:465-475).
[000210] O B7H3 é amplamente expresso em muitos tipos de tumores sólidos, incluindo no câncer de próstata (Roth et al., 2007, Cancer Res. 67:7893-900; Zang et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:19458-19463) carcinoma de célula renal, carcinoma de célula urotelial (Crispen et al. 2008, Clin. Cancer Res. 14:5150-157; Boorjian et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:4800-4808), câncer de ovário (Zang et al., 2010, Mod. Pathol. 23: 1104-1112), glioblastoma (Lemke et al., 2012, Clin. Cancer Res. 18:105-117), osteossarcoma (Wang et al., 2013, PLoS One 8:e70689), neuroblastoma (Gregorio et al., 2008, Histopathology 53:73-80), glioma pontino intrínseco difuso (DIPG) (Zhou et al., 2013, J. Neurooncol. 111:257-264), mesotelioma (Calabro et al., 2011, J. Cell Physiol. 226:2595-600) e câncer de pâncreas (Yamato et al., 2009, Br. J. Cancer 101:1709-1716).
[000211] O B7H3 foi inicialmente identificado como uma proteína transmembranar tipo I que, semelhante a todos os outros membros da família B7, tem uma região extracelular contendo apenas um domínio Ig tipo V e um do tipo C (esta forma de B7H3 foi denominada 2Ig-B7H3) (Chapoval et al., 2001, Nat. Immunol. 2:269-274). Posteriormente, uma segunda forma de B7H3 humano (huB7H3) foi identificada (denominada 4Ig-B7H3) que contém uma duplicação do domínio Ig tipo V e tipo C em tandem (Steinberger et al., 2004, J. Immunol. 172:2352-2359; Sun et al., 2002, J. Immunol. 168:6294-6297).
[000212] O B7H3 é considerado inibidor para as células NK e células T. A ideia de uma função inibidora do B7H3 é suportada pelo relatórios indicando que tanto as formas 2Ig como 4Ig do B7H3 humano podem inibir a proliferação de células T e a produção de citocinas (Steinberger et al., 2004, J. Immunol. 172:2352-2359; Sun et al. (2002) J. Immunol. 168:6294-6297). Estudos em camundongos deficientes de B7H3 sugeriram que o B7H3 preferencialmente infrarregula as respostas imunológicas mediadas por TH1 (ao contrário do TH2) (Suh et al., 2003, Nat. Immunol. 4:899-906). E outras investigações mostraram que a forma 4Ig-B7H3 pode inibir a lise mediada por NK de células de neuroblastoma interagindo com um receptor inibidor putativo na superfície das células NK (Castriconi et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12640-12645). Em estudos mais recentes envolvendo pacientes com câncer de próstata, o nível de expressão B7H3 no tecido tumoral, no momento da cirurgia, foi fortemente correlacionado com a extensão na qual o tumor foi metastatizado, com um risco aumentado de recorrência clínica de câncer e com a morte específica do câncer (Roth et al. 2007, Cancer Res. 67:7893-7900; Zang et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:19458-19463). Da mesma forma, um elevado nível de expressão de B7H3 no tecido tumoral correlacionado com a sobrevivência ruim do paciente no carcinoma de célula renal de células claras, carcinoma de células uroteliais (Crispen et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:5150-5157; Boorjian et al., 2008, Clin. Cancer Res. 14:4800-4808), câncer de ovário (Zang et al., 2010, Mod. Pathol. 23: 1104-1112), glioblastoma (Lemke et al., 2012, Clin. Cancer Res. 18:105117) osteossarcoma (Wang et al., 2013, PLoS One 8:e70689), câncer pancreático (Yamato et al., 2009, Br. J. Cancer 101:1709-1716) e neuroblastoma (Gregorio et al., 2008, Histopathology 53:73-80).
[000213] Com base em dados de estrutura cristalina para o B7H3 de murino (muB7H3), foi proposto que o B7H3 inibe a proliferação de células T, pelo menos em parte, através da alça FG de seu domínio IgV (Vigdorovich et al, 2013, Structure 21: 707-717).
[000214] Por outro lado, o B7H3 também pode ter propriedades estimulatórias de células T, dependendo os receptores com os quais ele interage (Hofmeyer et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10277-10278). Por exemplo, alguns relatórios anteriores indicaram que o 2Ig- B7H3 humano promove a ativação de células T e a produção de IFN-Y por ligação a um receptor putativo nas células T ativadas (Chapoval et al., 2001, Nat. Immunol. 2:269-274). Além disso, estudos utilizando alguns modelos tumorais de murino forneceram dados que sugerem que a resposta antitumoral do sistema imunológico é aumentada pela expressão do B7H3 (Sun et al., 2003, Gene Ther. 10:1728-1734). E estudos em seres humanos sugeriram que a presença do B7H3 se correlaciona com a maior sobrevivência no câncer gástrico (Wu et al, 2006, World J. Gastroenterol. 12: 457-459) e de pâncreas (Loos et al, 2009, BMC Cancer 9: 463).
[000215] Um anticorpo murino, conhecido como m8H9, que se liga ao B7H3, demonstrou alvejar tumores cerebrais, sarcomas de infância e neuroblastomas e, em menor extensão, adenocarcinomas (Modak et al, 2001, Cancer Res. 61:4048-4054; Xu et al., 2009, Cancer Res. 69:6275-6281). Dentre os tumores cerebrais primários, 15 dos 17 glioblastomas testados, 3 dos 4 gliomas misturados testados, 4 dos 11 oligodendrogliomas testados, 6 dos 8 astrocitomas testados, 2 dos 2 meningiomas testados, 3 das 3 schwannomas testadas, 2 dos 2 meduloblastomas testados, 1 de 1 neurofibroma testado, 1 dos 2 tumores neuronogliais testados, 2 dos 3 ependimomas testados e 1 de 1 pineoblastoma testado mostraram ligação pelo 8H9. Dentre os sarcomas, 21 dos 21 tumores neuroectodérmicos primitivos/de Ewing testados, 28 dos 29 rabdomiossarcomas testados, 35 dos 37 tumores desmoplásicos de pequenas células redondas testados, 2 dos 3 sarcomas sinoviais testados, 4 dos 4 leiomiossarcomas testados, 1 de 1 histiocitoma fibroso maligno e 2 de 2 testado sarcomas indiferenciados testados foram positivos para a ligação 8H9. Oitenta e sete dos 90 neuroblastomas testados, 12 dos 16 melanomas testados, 3 dos 4 hepatoblastomas testados, 7 dos 8 tumores de Wilms testados, 3 dos 3 tumores rabdoides testados e 12 dos 27 adenocarcinomas testados também foram positivos. Ao contrário, o m8H9 não se ligou aos tecidos humanos normais, incluindo a medula óssea, cólon, estômago, coração, pulmão, músculo, tireoide, testículos, pâncreas e cérebro humano (lobo frontal, cerebelo, ponte e medula espinhal) (Modak et al, 2001 Cancer Res 61: 4048-4054).
Agentes de anticorpo 8H9
[000216] Conforme observado acima, os anticorpos 8H9 e ligam especificamente ao B7H3. Ao contrário de outros anticorpos anti-B7H3 testados, apenas o 8H9 pode ser usado para ligar a alça FG do B7H3 e para bloquear a função imunoinibidora do B7H3.
[000217] Os estudos imuno-histoquímicos demonstraram que o m8H9 é amplamente reativo com tumores sólidos humanos, incluindo tumores embrionários e carcinomas (Modak et al., 2001, Cancer Res. 61:4048-4054). O m8H9 demonstrou a absorção favorável do tumor para tumores de sarcoma e cérebro em modelos de xenoenxerto (Modak et al., 2005, Cancer Biother. Radiopharm. 20: 534-546; Luther et al, 2008, 63: 1166-1174; discussion 1174), e quando o anticorpo é conjugado com o fator de veneno de cobra, ele induz a lise tumoral mediada pelo complemento eficiente (Juhl et al., 1997, Immunobiology 197: 444-459). Além disso, a forma Fv de cadeia simples (scFv) do m8H9 demonstrou ser capaz de alvejar uma potente imunotoxina aos sarcomas e gliomas em um sistema de modelo pré-clínico (Onda et al., 2004, Cancer Res. 64:1419-1424; Luther et al., 2010, Mol. Cancer Ther. 9:1039-1046).
[000218] Como parte de um receptor de antígeno quimérico (CAR), a forma scFv de m8H9 é capaz de direcionar as células NK para matar as células tumorais positivas para B7H3(+) (Cheung et al, 2003, Hybrid Hybridomics 22:209-218). Além disso, certos ensaios clínicos humanos de fase inicial demonstraram que a radioimunoterapia com 8H9 marcado com 131I prolonga a sobrevida de pacientes de alto risco com câncer metastático no sistema nervoso central (SNC) (Kramer et al., 2007, American Association for Cancer Research LB-4 (Apresentação); Kramer et al., 2008, Apresentação no ISPNO 2008).
[000219] Vários ensaios clínicos de fase 1 estão actualmente em curso para a radioimunoterapia à base de m8H9 das metástases leptomeníngeas (NCT00089245) (Kramer et al, 2010 J Neurooncol 97: 409-418) e glioma pontino intrínseco difuso (DIPG) (NCT01502917) (Zhou et al, 2013, J. Neurooncol. 111:257-264). De acordo com o conhecimento dos inventores, apenas outro anticorpo anti-B7H3 sujeito a um ensaio clínico é o MGA271, um MAb de IgG1 humanizado (NCT01391143) (Loo et al., 2012, Clin. Cancer. Res. 18:3834-3845, 2012).
[000220] Um anticorpo m8H9 radiomarcado está atualmente nos ensaios clínicos para o tratamento de tumores desmoplásicos de pequenas células redondas e outros tumores sólidos envolvendo o peritônio (protocolo NCI ID 09-090 NCT01099644).
Camundongo
[000221] O 8H9 de murino (m8H9) é um anticorpo monoclonal IgG1 (MAb) que tem como alvo o B7H3.
Humanizado e Afinidade Maturada
[000222] Embora o m8H9 seja promissor como um agente terapêutico para o tratamento do câncer em seres humanos, ele é de origem murina. O uso de anticorpos humanos é preferido neste contexto, entre outras coisas, porque ele reduz a probabilidade de reações imunológicas contra o anticorpo administrado.
[000223] A invenção fornece certas sequências de anticorpo humanizado, e também certas sequências de anticorpos de afinidade maturada, encontradas em anticorpos que se ligam ao B7H3 e, particularmente, à sua alça FG. Por exemplo, é particularmente aqui exemplificado os agentes de anticorpo (por exemplo, anticorpos completos, seus fragmentos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos ou outras formas de agente anticorpo, conforme descrito na presente invenção ou de outro modo conhecido na técnica) que contêm elementos de sequência, conforme descrito na presente invenção.
[000224] Em particular, a presente invenção fornece um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 e inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido em uma SEQ ID NO: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 (definido abaixo), ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo, e/ou incluindo uma cadeia pesada da imunoglobulina, como definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000225] SEQ ID NO.: 1 (cadeia leve de ch8H9) DIVMTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000226] SEQ ID NO.: 2 (cadeia leve L1 de hu8H9) EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQAPRLL IKYASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSVQPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000227] SEQ ID NO.: 3 (cadeia leve L2 de hu8H9) EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000228] SEQ ID NO.: 4 (cadeia leve L3 de) EIVMTQSPATLSVSPGERVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000229] SEQ ID NO.: 5 (cadeia leve de hu8H9 3.1) EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000230] SEQ ID NO.: 6 (cadeia leve de hu8H9 4.1) EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHQAPRLL IKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFP LTFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000231] SEQ ID NO.: 7 (cadeia leve de hu8H9 5.1) EIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHQAPRLLI KYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPL TFGQGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000232] SEQ ID NO.: 8 (cadeia leve 6.1 de ch8H9; ch8H9 + 6 mutações de maturação de afinidade) DIVMTQSPATLSVTPGDRVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLI KYASQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[000233] SEQ ID NO.: 9 (cadeia pesada de ch8H9) QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000234] SEQ ID NO.: 10 (cadeia pesada H1 de hu8H9) QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000235] SEQ ID NO.: 11 (cadeia pesada H2 de hu8H9) QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQAPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSRLTSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000236] SEQ ID NO.: 12 (cadeia pesada H3 de hu8H9) QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000237] SEQ ID NO.: 13 (cadeia pesada 3.1 de hu8H9) QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000238] SEQ ID NO.: 14 (cadeia pesada 4.1 de hu8H9) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000239] SEQ ID NO.: 15 (cadeia pesada 5.1 de hu8H9) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000240] SEQ ID NO.: 16 (cadeia pesada 6.1 de ch8H9; ch8H9 + 6 mutações de maturação de afinidade) QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[000241] Em algumas modalidades, um agente de anticorpo fornecido é ou compreende um anticorpo que é um membro de uma classe de anticorpo selecionado do grupo consistindo em IgG, IgM, IgA, IgD, IgE ou um fragmento do mesmo.
[000242] Os agentes de anticorpo fornecidos, incluindo anticorpos e/ou porções característicos dos mesmos, ou ácidos nucleicos que os codificam podem ser produzidas por qualquer meio disponível. As tecnologias para a geração de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais) são bem conhecidas na técnica. Será notado que uma grande variedade de espécies animais pode ser usada para a produção de antissoros, incluindo coelho, camundongo, rato, hamster, porquinho-da-índia ou cabra. A escolha do animal pode ser decidida com base na facilidade de manipulação, nos custos ou na quantidade desejada de soro, tal como seria conhecido por uma pessoa versada na técnica. Será notado que os agentes de anticorpo também podem ser produzidos transgenicamente, através da geração de um mamífero ou planta que é transgênico para as sequências de cadeia pesada e leve d imunoglobulina de interesse. Juntamente com a produção transgênica em mamíferos, os anticorpos podem ser produzidos em, e recuperados do leite de cabra, vaca ou outros mamíferos. Consulte, por exemplo, as Patentes Norte- Americanas Nos. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172 e 5.741.957 (incorporadas nesse documento por referência em suas totalidades).
[000243] Os agentes de anticorpo fornecidos (incluindo anticorpos e/ou porções características) podem ser produzidos, por exemplo, utilizando um sistema de célula hospedeira manipulado para expressar um ácido nucleico que codifica um anticorpo da invenção. Alternativamente ou além disso, os agentes de anticorpo fornecidos podem ser parcialmente ou totalmente preparados por síntese química (por exemplo, usando um sintetizador de peptídeo automatizado).
[000244] Tecnologias de fazer e utilizar anticorpos policlonais e monoclonais são descritas, por exemplo, em Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (1° de dezembro de 1998). As tecnologias para fazer agentes de anticorpo modificados, como anticorpos e fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos quiméricos, anticorpos reformulados, anticorpos humanizados ou fragmentos dos mesmos, por exemplo, os fragmentos Fab', Fab, F(ab')2); ou anticorpos biossintéticos (por exemplo, os anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples (DABs), Fv, Fv de cadeia simples (scFv) e similares), são conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de dezembro de 2000; 1a edição).
[000245] Fontes exemplares para as preparações de agente de anticorpo adequadas para a invenção incluem, mas não se limitam, ao meio de cultura condicionado derivado do cultivo de uma linhagem celular recombinante que expressa uma proteína de interesse, ou de um extrato celular de, por exemplo, células produtoras de anticorpo, bactérias, células fúngicas, células de insetos, plantas transgênicas ou células vegetais, animais transgênicos ou células animais ou soro de animais, fluido de ascite, hibridoma ou sobrenadantes de mieloma. As células bacterianas adequadas incluem, mas não se limitam, às células de Escherichia coli. Exemplos de cepas de E. coli adequadas incluem: HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, e qualquer cepa de E. coli que falhe em clivar DNA estrangeiro. As células hospedeiras fúngicas adequadas que podem ser usadas incluem, mas não se limitam, às células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Aspergillus. Células de inseto adequadas incluem, mas não se limitam, às células Schneider S2, células D. Mel-2, SF9, SF21, Mimic™- SF9, MG1 e KC1. Linhagens celulares recombinantes exemplares adequadas incluem, mas não se limitam, à linhagem de mieloma de camundongo BALB/c, retinoblastos humanos (PER.C6), células de rim de macaco, linhagem de rim embrionário humano (293), células de rim de hâmster bebê (BHK), células de ovário de hamster chinês (CHO), células de sertoli de camundongo, células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HeLa), células de rim canino, células de fígado de rato norvégico, células de pulmão humano, células de fígado humano, células tumorais mamárias de rato, células TRI, células MRC 5, células FS4 e a linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[000246] Os agentes de anticorpo de interesse podem ser expressos usando qualquer vetor apropriado. Uma variedade de vetores (ou a progenia de tais células) pode ser cultivada tal como são conhecidos na técnica; as células em que tais vetores foram introduzidas (ou a progenia de tais células) podem ser cultivadas tal como é conhecido na técnica (por exemplo, usando sistemas de cultura em batelada alimentada ou contínua). Em algumas modalidades, as células podem ser geneticamente modificadas; as tecnologias para que as células geneticamente manipuladas expressem os polipeptídeos manipulados (por exemplo, polipeptídeos de agente de anticorpo, conforme descrito nesse documento) são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, Nova Iorque).
[000247] Em algumas modalidades, os agentes de anticorpo fornecidos podem ser purificados, se desejado, usando a filtração, centrifugação e/ou uma variedade de tecnologias cromatográficas, como HPLC ou cromatografia de afinidade. Em algumas modalidades, os fragmentos de agentes de anticorpo fornecidos são obtidos por métodos que incluem a digestão com enzimas, como a pepsina ou papaína, e/ou por clivagem de ligações dissulfeto por redução química.
[000248] Em geral, conforme descrito na presente invenção, os agentes de anticorpo fornecidos podem ser ou incluir, por exemplo, um anticorpo policlonal; um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; um anticorpo modificado, como um anticorpo quimérico, anticorpo reformulado, anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo (por exemplo, Fab', Fab, F(ab')2); ou um anticorpo biossintético, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples, anticorpo de domínio único (DAB), Fv, Fv de cadeia simples (scFv) ou similar.
[000249] Será notado que os agentes de anticorpo fornecidos podem ser manipulados, produzidos e/ou purificados de modo a melhorar as características e/ou a atividade dos agentes de anticorpo. Por exemplo, características melhoradas dos agentes de anticorpo fornecidos incluem, mas não se limitam, à maior estabilidade, afinidade de ligação e/ou avidez aprimorada, especificidade de ligação aprimorada, produção aumentada, agregação diminuída e ligação não específica diminuída, entre outros.
Modalidades exemplares específicas - combinações de cadeias leves epesadas
[000250] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO.: 1 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo que inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO.: 1 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 9.
[000251] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 2 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 2 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 10.
[000252] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 3 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo que inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 3 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 11.
[000253] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, como definido na SEQ ID NO: 4 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 4 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 12.
[000254] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 2 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 2 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 11.
[000255] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 3 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo que inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 3 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 10.
[000256] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 5 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 5 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 13.
[000257] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 6 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 6 e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 14.
[000258] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 7, e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 7, e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 15.
[000259] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 8, e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo é um anticorpo incluindo uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 8, e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, conforme é definido na SEQ ID NO: 16.
[000260] A presente invenção contempla, dentre outras coisas, os anticorpos abaixo listados, incluindo as cadeias leves da imunoglobulina, conforme é definido nas SEQ ID NOs: indicadas, ou porções de ligação ao epítopo das mesmas, e cadeias pesadas de imunoglobulina,conforme é definido nas SEQ ID NOs: indicadas, ou porções de ligação ao epítopo das mesmas. TABELA 1
Modalidades exemplares específicas - resíduos de aminoácidos específicos
[000261] Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, incluindo um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34, e/ou uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102.
[000262] Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo carrega uma substituição de aminoácido homóloga em relação à treonina na posição da cadeia leve 20, a tirosina na posição da cadeia leve 34, a treonina na posição da cadeia pesada 24, a glicina na posição da cadeia pesada 42, o ácido aspártico na posição da cadeia pesada 56 e a glicina na posição da cadeia pesada 102.
[000263] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, conforme é definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, incluindo um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34, e/ou inclui uma cadeia pesada de imunoglobulina, conforme é definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16, incluindo um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102.
[000264] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de anticorpo é o anticorpo 8H9 de murino, em que uma cadeia leve da imunoglobulina inclui um resíduo de treonina na posição 20 e um resíduo de tirosina na posição 34, e em que as cadeias pesadas da imunoglobulina incluem um resíduo de treonina na posição 24, um resíduo de glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56 e um resíduo de glicina na posição 102.
[000265] Dentre outras coisas, a presente divulgação demonstra que a presença desses resíduos de aminoácidos em um agente de anticorpo 8H9 aumenta a afinidade de ligação do agente de anticorpo ao B7H3 em relação à observada com m8H9. Ou seja, a introdução desses resíduos no m8H9 melhora a sua afinidade de ligação para o B7H3 e, particularmente, à alça FG do seu domínio V.
[000266] As pessoas versadas na técnica estão cientes de uma variedade de tecnologias, bem estabelecidas na técnica, para realizar tal introdução, ou para, de outra forma, preparar, fornecer ou produzir polipeptídeos contendo tais sequências. Tecnologias exemplares úteis sob este aspecto são fornecidas, por exemplo, em Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012.
Modalidades exemplares específicas - Afinidades Específicas
[000267] A presente divulgação fornece a primeira demonstração de que agentes de anticorpo, incluindo agentes de anticorpo 8H9, que alvejam a alça FG de B7H3, podem ser usados para bloquear a função imunoinibidora do B7H3.
[000268] A presente invenção fornece agentes de anticorpo que se ligam especificamente ao epítopo definido na SEQ ID NO: 32 (definido abaixo) localizado na alça FG no domínio V da proteína 2Ig-B7H3 e nos domínios V1 e V2 da proteína 4Ig-B7H3, e agentes de anticorpo que se ligam especificamente ao mesmo epítopo com uma constante de dissociação (KD) menor do que 2 nM. Conforme divulgado nos exemplos nesse documento, o anticorpo 8H9 de afinidade maturada e humanizado descrito e os fragmentos de ligação dos mesmos, têm essas características. Em algumas modalidades, esses agentes de anticorpo não são m8H9.
[000269] O epítopo IRDF é conservado entre as espécies e é encontrado, por exemplo, em seres humanos, cachorros, chimpanzés, orangotangos, gibões, macacos, saguis, porcos, cavalos, pandas e elefantes. A presente invenção fornece agentes de anticorpo que se ligam especificamente ao epítopo definido na SEQ ID NO: 32 que está presente em animais humanos e não humanos, incluindo cães, chimpanzés, orangotangos, gibões, macacos, saguis, porcos, cavalos, pandas e elefantes.
[000270] A SEQ ID NO.: 32 é IRDF
[000271] Em certas modalidades da presente invenção, os agentes de anticorpo se ligam à alça FG no domínio V da proteína 2Ig-B7H3 e nos domínios V1 e V2 da proteína 4Ig-B7H3 com uma KD (nM) de menos de 100 nM, menos de 80 nM, menos de 50 nM, menos de 30 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM e menos de 2 nM.
[000272] Em algumas modalidades da presente invenção, os agentes de anticorpo suprimem o efeito inibidor do B7H3 na proliferação e função das células T.
[000273] Em algumas modalidades da presente invenção, os agentes de anticorpo suprimem o efeito inibidor do B7H3 na proliferação e função das células T, e/ou aumentam a citotoxicidade mediada pelas células T.
[000274] Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo, conforme descrito na presente invenção, suprime um efeito inibidor do B7H3 na atividade e; ou na função das células NK.
[000275] Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo, conforme descrito na presente invenção, suprime um efeito inibidor do B7H3 na atividade e/ou na função das células NK, e/ou aumenta a atividade e/ou a função das células NK.
[000276] Ensaios para determinar tais efeitos são amplamente conhecidos na técnica. Alguns ensaios exemplares, mas não limitantes, são fornecidos nos exemplos nesse documento.
[000277] Em algumas modalidades, os agentes de anticorpo compreendem e/ou são anticorpos, fragmentos de anticorpo e/ou scFvs.
Modalidades exemplares específicas - CDRs específicos
[000278] Tal como é geralmente conhecido na técnica, os anticorpos humanos e de murino são geralmente feitos de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, cada uma compreendendo regiões variáveis e regiões constantes. A região variável da cadeia leve geralmente compreende 3 CDRs (regiões determinantes da complementaridade), identificadas nesse documento como CDRL1, CDRL2 e CDRL3, flanqueadas por regiões de estrutura. A região variável da cadeia pesada geralmente compreende 3 CDRs, identificados nesse documento como CDRH1, CDRH2 e CDRH3, flanqueados pelas regiões de estrutura (consulte, por exemplo, William E. Paul, Fundamental Immunology (7a ed.)Lippincott Williams & Wilkins 2013).
[000279] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, incluindo um CDRL1 definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 33, 34, 39, 40, 45, 46, 51 e 52 (definido abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000280] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, incluindo um CDRL2 definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 35, 36, 41, 42, 47, 48, 53 e 54 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante da mesma. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000281] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia leve da imunoglobulina, incluindo um CDRL3 definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 37, 38, 43, 44, 49, 50, 55 e 56 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante das mesmas. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000282] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo uma CDRH1 definida na SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75 e 76 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante das mesmas. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000283] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo uma CDRH2 definida na SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 59, 60, 65, 66, 71, 72, 77 e 78 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante das mesmas. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000284] Em algumas modalidades da invenção, um agente de anticorpo que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3 inclui uma cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo uma CDRH3 definida na SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 61, 62, 67, 68, 73, 74, 79 e 80 (definidas abaixo) ou uma porção de ligação ao epítopo relevante das mesmas. Em algumas modalidades, o agente de anticorpo é um anticorpo, scFv e/ou uma porção de ligação ao epítopo relevante do mesmo.
[000285] A presente invenção contempla agentes de anticorpo, incluindo as CDRs descritas abaixo em qualquer combinação possível. Por exemplo, que não se destina a ser um fator limitante, a invenção inclui agentes de anticorpo, incluindo um CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 que são SEQ ID NO.: 34, SEQ ID NO.: 36, SEQ ID NO.: 38, SEQ ID NO.: 58, SEQ ID NO.: 60 e SEQ ID NO.: 62, respectivamente.
[000286] A produção de anticorpos, tendo as CDRs e/ou regiões de estrutura desejadas é geralmente conhecida na técnica e descrita, por exemplo, em Strohl & Strohl, Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing Limited 2012.
Formatos de agente do anticorpo
[000287] As pessoas versadas na técnica, lendo a presente divulgação, compreenderão que as sequências de anticorpo fornecidas, ou as porções de ligação ao epítopo das mesmas, podem ser utilmente incorporadas em qualquer um de uma variedade de formatos de polipeptídeos e polipeptídeos, incluindo elementos de sequência, ou porções de ligação ao epítopo dos mesmos, conforme descrito na presente invenção. São incluídos em tais polipeptídeos e formatos de polipeptídeo fornecidos aqueles que se ligam especificamente ao B7H3 e, particularmente, à sua alça FG. Em algumas modalidades particulares, os polipeptídeos e/ou formatos de polipeptídeo fornecidos competem com o m8H9 pela ligação ao B7H3, por exemplo, à sua alça FG.
Fv de cadeia simples (scFv)
[000288] Os Fvs de cadeia simples (scFvs) são amplamente conhecidos e utilizados na técnica. Um Fv de cadeia simples é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) das imunoglobulinas, muitas vezes conectadas por um peptídeo ligante curto (consulte, por exemplo, Benny K. C. Lo (ed.)Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004, e as referências citadas no mesmo).
[000289] A presente invenção também proporciona a ligação dos Fvs de cadeia simples (scFvs) especificamente à proteína B7H3 e incluindo um polipeptídeo, conforme é definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 (definidas abaixo). Os polipeptídeos são definidos nas SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27, sendo adicionalmente descritos nos exemplos nesse documento.
[000290] Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo scFv é conjugado a agente terapêutico ou agente de detecção, ou compreende uma treonina na posição 24, uma glicina na posição 42, um resíduo de ácido aspártico na posição 56, um resíduo de glicina na posição 102, um resíduo de treonina na posição 153 e um resíduo de tirosina na posição 167. Os 6 resíduos de aminoácidos específicos nestas 6 posições específicas são adicionalmente descritos nos exemplos.
[000291] Em algumas modalidades da presente invenção, estes resíduos de aminoácidos são substituídos com um aminoácido homólogo (isto é, aqueles com características semelhantes).
[000292] Tal como é conhecido pelo profissional versado, a geração de scFvs e a modificação dos mesmos de acordo com a presente invenção é rotineira na técnica (consulte, por exemplo, Benny K. C. Lo (ed.)Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004, e as referências citadas no mesmo).
[000293] Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo scFv é fundido a um segundo polipeptídeo.
[000294] Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídeo scFv, conforme é definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27, é fundido a um segundo polipeptídeo, conforme é definido nas SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 (descritas abaixo) para criar um scFv biespecífico em tandem. A SEQ ID NO: 28 inclui uma sequência do ligante peptídico e uma sequência peptídica de um huOkt3 de ligação ao scFv (anti-CD3), que faz parte do complexo receptor de célula T. Da mesma forma, a SEQ ID NO.: 29 inclui uma sequência do ligante peptídico e uma sequência peptídica de um fragmento de anticorpo scFv C825 anti-DOTA.
[000295] A utilidade dos scFvs em tandem biespecíficos é amplamente conhecida e aceita na técnica, e semelhante à utilidade dos anticorpos biespecífico, que é descrita em outras partes nesse documento. Tal como é conhecido pelo profissional versado, a geração de scFvs e a modificação dos mesmos, incluindo, mas sem se limitar, à fabricação de scFvs em tandem biespecíficos, de acordo com a presente invenção, é rotineira na técnica (consulte, por exemplo, Benny K. C. Lo (ed.)Antibody Engineering - Methods and Protocols, Humana Press 2004, e as referências citadas no mesmo).
[000296] Em algumas modalidades, um scFv, incluindo o polipeptídeo conforme definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27, é fundido com o seu C-terminal ao N-terminal de um polipeptídeo, conforme é definido na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, um scFv, incluindo o polipeptídeo, conforme definido em uma SEQ ID NO.: selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27, é fundido com o seu N-terminal ao C-terminal de um polipeptídeo, conforme é definido na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.
[000297] A SEQ ID NO.: 17 (scFv hu8H9 H3L3) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVSLSCRASQSISDYLHWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000298] A SEQ ID NO.: 18 (scFv do clone hu8H9 S3.3) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000299] A SEQ ID NO.: 19 (scFv do clone hu8H9 S7.2) é QVQLVQSGAEVVKPGASCKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGVGSEIVMT QSPATLSVSPGERVTLSCRASQSIGDYLYWYQQKSHESPRLLIKYAS QSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000300] A SEQ ID NO.: 20 (scFv do clone hu8H9 S7.17) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WVGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTSTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQPISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGYSFPLTFG QGTKLELKR
[000301] A SEQ ID NO.: 21 (scFv do clone hu8H9 S7.22) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRPEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSIPGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000302] A SEQ ID NO.: 22 (scFv do clone hu8H9 S7.28) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLGSEDTAV YFCTRQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSSGGGSEIVMT QSPATLSVSPGERVTLSCRASQSIGDYLYWYQQKSHESPRLLIKYAS QSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000303] A SEQ ID NO.: 23 (scFv do clone hu8H9 S7.29) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYLELSSLGSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000304] A SEQ ID NO.: 24 (scFv do hu8H9 3.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000305] A SEQ ID NO.: 25 (scFv do hu8H9 4.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTNYDINWVRQRPEQGLE WIGWIFPGDGSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKSHQAPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000306] A SEQ ID NO.: 26 (scFv do hu8H9 5.1) é QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVM TQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHQAPRLLIKYA SQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTISSLQPEDFGVYYCQNGHSFPLTFG QGTKLELKR
[000307] A SEQ ID NO.: 27 (scFv do ch8H9 6.1) é QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLE WIGWIFPGDDSTQYNEKFKGKATLTTDTSSSTAYMQLSRLTSEDSAV YFCARQTTGTWFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVM TQSPATLSVTPGDRVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYA SQSISGIPSRFSGSGSGSDFTLSINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTF GAGTKLELKR
[000308] A SEQ ID NO.: 28 (scFv do ligante huOKT3 (anti-CD3)) é GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTF TRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNS KNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSY MNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSL QPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
[000309] A SEQ ID NO.: 29 (scFv do ligante C825 (anti-DOTA)) é GGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLT DYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKN QVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASN YANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGT QTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG
Anticorpos biespecíficos
[000310] Os anticorpos biespecíficos são amplamente conhecidos e utilizados na técnica. Os anticorpos biespecíficos são proteínas artificiais que incluem fragmentos de dois ou mais diferentes anticorpos e, consequentemente, se ligam a dois ou mais tipos diferentes de antígenos.
[000311] Em algumas modalidades da presente invenção, anticorpos biespecíficos incluem duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes.
[000312] Em algumas modalidades da presente invenção, um agente de anticorpo biespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico, tem duas especificidades, uma das quais se liga ao B7H3 e a outra que se liga ao CD3 nas células T ou DOTA.
[000313] Em algumas modalidades da presente invenção, uma cadeia leve da imunoglobulina aqui descrita é fundida a um polipeptídeo, conforme é definido na SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 31 (definidas abaixo). A SEQ ID NO: 30 inclui uma sequência do ligante peptídico e uma sequência peptídica de um huOKT3 de ligação ao scFv (anti-CD3), que faz parte do complexo do receptor de célula T. Da mesma forma, a SEQ ID NO.: 31 inclui uma sequência do ligante peptídico e uma sequência peptídica de um fragmento de anticorpo scFv C825 anti- DOTA. As proteínas de fusão de cadeia leve-scFv resultantes são, em seguida, combinadas com qualquer uma das cadeias pesadas aqui descritas.
[000314] SEQ ID NO.:30 (scFv do ligante huOKT3 (anti-CD3)) GGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTF TRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDRFTISRDNS KNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSY MNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSL QPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR
[000315] SEQ ID NO.: 31 (scFv do ligante C825 (anti-DOTA)) GGGGSGGGGSGGGGSHVKLQESGPGLVQPSQSLSLTCTVSGFSLT DYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGGTAYNTALISRLNIYRDNSKN QVFLEMNSLQAEDTAMYYCARRGSYPYNYFDAWGCGTTVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSQAVVIQESALTTPPGETVTLTCGSSTGAVTASN YANWVQEKPDHCFTGLIGGHNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTIAGT QTEDEAIYFCALWYSDHWVIGGGTRLTVLG
[000316] A fusão das cadeias leves de imunoglobulina com a SEQ ID NO: 30 ou com a SEQ ID NO: 31 e o subsequente pareamento com uma cadeia pesada da imunoglobulina cria anticorpos biespecíficos que se ligam aos diferentes tipos de antígenos. Entende-se que a geração de proteínas de fusão de anticorpo é padrão na técnica e rotineiramente feita usando técnicas biológicas moleculares amplamente conhecidas e utilizadas. Anticorpos biespecíficos podem ser usados, por exemplo, para ligar as células tumorais e as células do sistema imunológico umas às outras (um dos antígenos ligados está localizado na célula tumoral, e o outro antígeno está localizado na célula do sistema imunológico).
Conjugados
[000317] Em algumas modalidades, um agente de anticorpo, conforme descrito na presente invenção, está associado com uma entidade de carga. Em algumas modalidades, uma entidade de carga é ou compreende um agente terapêutico; em algumas modalidades, uma entidade de carga é ou compreende um agente da detecção.
Agentes terapêuticos
[000318] Os agentes terapêuticos podem ser ou compreender qualquer classe de entidade química, incluindo, por exemplo, mas sem se limitar, às proteínas, lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos, pequenas moléculas orgânicas, polímeros não biológicos, metais, íons, radioisótopos, etc. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção podem ter uma atividade biológica relevante para o tratamento de um ou mais sintomas ou causas do câncer. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção podem ter uma atividade biológica relevante para a modulação do sistema imunológico e/ou a intensificação da citotoxicidade e/ou supressão mediada pelas células T do efeito inibidor do B7H3 sobre a proliferação e a função das células T. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção têm uma ou mais outras atividades.
[000319] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente terapêutico conjugado é um radioisótopo, um conjugado de fármaco, uma nanopartícula, uma imunotoxina ou qualquer outra carga terapêutica.
Agentes de detecção
[000320] Um agente de detecção compreende qualquer porção que pode ser detectada usando um ensaio, por exemplo, devido às suas propriedades funcionais e/ou características químicas específicas. Exemplos não limitantes de tais agentes incluem enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimiluminescentes, cromóforos, moléculas luminescentes, moléculas de fotoafinidade, partículas coloridas ou ligantes, como a biotina.
[000321] Muitos agentes de detecção são conhecidos na técnica, uma vez que são sistemas para a ligação dos mesmos aos anticorpos (consulte, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas Nos. 5.021.236; 4.938.948; e 4.472.509, cada um dos quais sendo incorporado nesse documento por referência). Exemplos de tais agentes de detecção incluem íons paramagnéticos, isótopos radioativos, fluorocromos, substâncias detectáveis por RMN e agentes de imagem de raio-x, entre outros. Por exemplo, em algumas modalidades, um íon paramagnético é um ou mais de cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III), gadolínio (III), vanádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III), érbio (III), lantânio (III), ouro (III), chumbo (II) e/ou bismuto (III).
[000322] O isótopo radioativo pode ser um ou mais de actínio-225, astato-211, bismuto-212, carbono-14, cromo-51, cloro-36, cobalto-57, cobalto-58, cobre-67, európio-152, gálio-67, hidrogênio-3, iodo-123, iodo-124, iodo-125, iodo-131, índio-111, ferro-59, chumbo-212, lutécio- 177, fósforo-32, rádio-223, rádio-224, rênio-186, rênio-188, selênio-75, enxofre-35, tecnécio-99, tório-227, ítrio-90 e zircônio-89. Os agentes de anticorpo radioativamente marcados podem ser produzidos de acordo com tecnologias bem conhecidas na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser iodados pelo contato com iodeto de sódio e/ou potássio e um agente oxidante químico, como hipoclorito de sódio ou um agente de oxidação enzimático, como a lactoperoxidase. Os agentes de anticorpo fornecidos podem ser marcados com tecnécio- 99m pelo processo de troca de ligante, por exemplo, reduzindo o pré- tecnato com solução de estanho, quelando o tecnécio reduzido em uma coluna Sephadex e aplicando o anticorpo a esta coluna. Em algumas modalidades, os agentes de anticorpo fornecidos são marcados usando técnicas de marcação diretas, por exemplo, incubando o pré-tecnato, um agente redutor como SNCl2, uma solução tampão como solução de ftalato de sódio-potássio e o anticorpo. Grupos funcionais intermediários que são usados frequentemente para ligar radioisótopos que existem como íons metálicos ao anticorpo são o ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ou o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ou o ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclodecano-1,4,7,10-etilenodiaminotetracético (DOTA) ou p- aminobenzil-DOTA (DOTA-Bn). Os isótopos radioativos podem ser detectados, por exemplo, por dosimetria.
[000323] Um marcador fluorescente pode ser ou pode compreender um ou mais de Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, azul cascata, Cy3, Cy5,6-FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6- JOE, verde Oregon 488, verde Oregon 500, verde Oregon 514, azul pacífico, REG, verde rodamina, vermelho rodamina, renografina, ROX, TAMRA, TET, tetametilrodamina e/ou vermelho Texas, dentre outros.
[000324] Em algumas modalidades da presente invenção, o agente de detecção conjugado é um agente de diagnóstico ou de imagem.
Preparação de conjugados
[000325] Várias tecnologias são conhecidas na arte para a ligação ou conjugação de um agente de anticorpo a um agente terapêutico ou de detecção. Algumas tecnologias de ligação envolvem o uso de um complexo de metal quelado utilizando, por exemplo, um agente quelante orgânico, tal como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA); ácido etilenotriaminotetracético; N-cloro-p-toluenossulfonamida; e/ou tetracloro-3□-6□-difenilglicuril-3 ligado ao anticorpo (Patentes Norte- Americanas Nos. 4.472.509 e 4.938.948, cada uma incorporada nesse documento por referência). Os agentes de anticorpo fornecidos também podem reagir com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, como glutaraldeído ou periodato. Os conjugados com marcadores de fluoresceína, por exemplo, são preparados na presença destes agentes de acoplamento ou pela reação com um isotiocianato.
Identificação e/ou Caracterização dos Agentes de Anticorpo anti-B7H3 Úteis
[000326] A presente divulgação fornece a primeira demonstração de que agentes de anticorpo, incluindo agentes de anticorpo 8H9, que alvejam a alça FG de B7H3, podem ser usados para bloquear a função imunoinibidora do B7H3. A presente divulgação, portanto, demonstra a conveniência de identificar e/ou caracterizar os agentes de anticorpo com tal atividade. A presente divulgação também fornece uma variedade de sistemas para realizar tal identificação e/ou caracterização. Em algumas modalidades, por exemplo, a ligação é diretamente avaliada. Em algumas modalidades, o efeito sobre a proliferação de células T, ativação e/ou função é avaliado. Em algumas modalidades, a imunomodulação é avaliada. Em algumas modalidades, a inibição e/ou o bloqueio do ponto de controle imune é avaliado. Em algumas modalidades, a morte das células tumorais, o alvejamento das células tumorais e/ou a morte das células efetoras é avaliado. Em algumas modalidades, a competição com um agente de anticorpo 8H9, conforme descrito na presente invenção, é avaliada. Em algumas modalidades, a eficácia terapêutica em comparação com um agente de anticorpo 8H9, conforme descrito na presente invenção, é avaliada.
Composições
[000327] A presente invenção fornece também uma composição farmacêutica, incluindo um agente do anticorpo, scFv, ou anticorpo humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000328] As composições farmacêuticas aqui apresentadas podem ser fornecidas em uma forma injetável estéril (por exemplo, em uma forma que é apropriada para a injeção subcutânea ou infusão intravenosa). Por exemplo, em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são fornecidas em uma forma de dosagem líquida que é adequada para injeção. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são fornecidas como pós (por exemplo, liofilizadas e/ou esterilizadas), opcionalmente sob vácuo, que são reconstituídas com um diluente aquoso (por exemplo, água, tampão, solução salina, etc.) antes da injeção. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são diluídas e/ou reconstituídas em água, solução de cloreto de sódio, solução de acetato de sódio, solução de álcool benzílico, solução salina tamponada com fosfato, etc. Em algumas modalidades, o pó deve ser misturado suavemente com o diluente aquoso (por exemplo, não agitado).
[000329] As composições farmacêuticas contempladas como parte da presente invenção não estão limitadas às composições farmacêuticas que são injetáveis, mas incluem todos os tipos de composições farmacêuticas comumente conhecidas e usadas na técnica.
[000330] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas fornecidas compreendem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais conservantes. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas não compreendem conservante. Os excipientes, conforme utilizado na presente invenção, podem ser ou compreender solventes, meios de dispersão, diluentes ou outros veículos líquidos, adjuvantes de dispersão ou suspensão, agentes tensoativos, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e similares, tal como é adequado para a forma de dosagem específica desejada. Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edição, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) divulga uma variedade dos excipientes utilizados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação das mesmas. Exceto na medida em que qualquer meio excipiente convencional é incompatível com uma substância ou seus derivados, como pela produção de qualquer efeito biológico indesejável ou, diferentemente, pela interação de forma deletéria com qualquer/quaisquer outro(s) componente(s) da composição farmacêutica, o seu uso é contemplado para estar dentro do escopo dessa invenção.
[000331] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são fornecidas em uma forma que pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são fornecidas em uma forma que não pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, as soluções reconstituídas e/ou formas de dosagem líquidas podem ser armazenadas por um determinado período de tempo após a reconstituição (por exemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 2 semanas, um mês, dois meses ou mais).
[000332] As formas de dosagem líquidas e/ou soluções reconstituídas podem compreender material particulado e/ou descoloração antes da administração. Em algumas modalidades, uma solução não deve ser usada se estiver descolorida ou turva e/ou se material particulado permanecer após a filtração.
[000333] As formulações das composições farmacêuticas aqui descritas podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou doravante desenvolvido na técnica da farmacologia. Em algumas modalidades, tais métodos preparatórios incluem a etapa de associar o ingrediente ativo com um ou mais excipientes e/ou um ou mais outros ingredientes acessórios e, em seguida, se for necessário e/ou desejável, moldar e/ou embalar o produto em uma unidade de dose unitária ou de múltiplas doses.
[000334] Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser preparada, embalada e/ou vendida a granel, como uma dose unitária única e/ou como uma pluralidade de doses unitárias únicas. Conforme utilizado na presente invenção, uma "dose unitária" é uma quantidade discreta da composição farmacêutica que compreende uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual a uma dose, que seria administrada a um indivíduo e/ou uma fração conveniente de tal dose como, por exemplo, metade ou um terço de tal dose.
[000335] As quantidades relativas de ingrediente ativo, excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica de acordo com a invenção podem variar, dependendo da identidade, tamanho e/ou condição do indivíduo tratado e/ou dependendo da via pela qual a composição deve ser administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (p/p) de ingrediente ativo.
Usos Tratamento de câncer & alívio da imunossupressão
[000336] A presente invenção também fornece métodos de tratamento do câncer por meio da administração a um paciente que necessita de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de anticorpo, scFv ou anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Pode-se determinar se a administração de um agente de anticorpo trata o câncer por metodologias conhecidas, incluindo aquelas descritas nos Exemplos nesse documento.
[000337] A presente invenção também fornece métodos de modulação do sistema imunológico e/ou aumento da citotoxicidade mediada pelas células T e/ou supressão do efeito inibidor do B7H3 sobre a proliferação de células T e a função em um indivíduo pela administração a um paciente que necessita disso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de anticorpo, scFv ou anticorpo humanizado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Pode-se determinar se a administração de um agente de anticorpo modula o sistema imunológico e/ou aumenta a citotoxicidade mediada pelas células T por metodologias conhecidas, incluindo aquelas descritas nos Exemplos nesse documento.
[000338] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos de modulação do sistema imunológico e/ou aumento das funções mediadas por células NK e/ou supressão do efeito inibidor do B7H3 sobre a atividade e/ou função das células NK em um indivíduo, por exemplo, pela administração a um paciente que necessita disso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de anticorpo, scFv ou anticorpo humanizado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Pode-se determinar se a administração de um agente de anticorpo modula o sistema imunológico e/ou aumenta a atividade e/ou função da célula NK pelas metodologias conhecidas, incluindo aquelas descritas nesse documento.
[000339] Em algumas modalidades, a quantidade exata administrada pode variar de indivíduo para indivíduo, dependendo de um ou mais fatores, tal como é bem conhecido nas artes médicas. Tais fatores podem incluir, por exemplo, uma ou mais das espécies, idade, condição geral do indivíduo, gravidade da infecção, composição específica, seu modo de administração, seu modo de atividade, o distúrbio a ser tratado e a gravidade da doença; a atividade do agente de anticorpo específico utilizado; a composição farmacêutica específica administrada; a meia- vida da composição após a administração; a idade, o peso corporal, o estado de saúde geral, sexo e dieta do indivíduo; o tempo de administração, a via de administração e a taxa de excreção do composto específico utilizado; a duração do tratamento; os fármacos usados juntamente ou coincidentes com o composto específico utilizado; e similares. As composições farmacêuticas podem ser formuladas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Será compreendido, no entanto, que o uso diário total das composições da presente invenção será decidido pelo clínico responsável, dentro do escopo da boa avaliação médica.
[000340] Em algumas modalidades, a quantidade exata administrada pode ser uma quantidade de um agente de anticorpo conforme descrito na presente invenção, para efetivamente alcançar um ou mais efeitos de modulação descritos nesse documento, que, pelo menos em algumas modalidades, inclui a modulação da supressão do B7H3, a inibição ou o bloqueio da atividade e/ou função das células T e/ou NK.
[000341] Os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e as composições farmacêuticas dos mesmos de acordo com a presente invenção podem ser administrados de acordo com qualquer via e regime adequado. Em algumas modalidades, uma via ou regime é aquele que foi correlacionado com um benefício terapêutico positivo. Em algumas modalidades, uma via ou regime é aquele que foi aprovado pelo FDA e/ou EP
[000342] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer via, tal como será estimado pelas pessoas versadas na técnica. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção são administradas pela via oral (PO), intravenosa (IV), intramuscular (IM), intra-arterial, intramedular, intratecal, subcutânea (SQ), intraventricular, transdérmica, interdérmica, intradérmica, retal (PR), vaginal, intraperitoneal (IP), intragástrica (IG), tópica (por exemplo, por pós, unguentos, cremes, géis, loções e/ou gotas), pela via mucosa, intranasal, bucal, enteral, vítrea ou sublingual; por instilação intratraqueal, instilação brônquica e/ou inalação; como um spray oral, spray nasal e/ou aerossol, e/ou através de um cateter da veia porta.
[000343] Em algumas modalidades, os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou composições farmacêuticas dos mesmos podem ser administrados por via intravenosa, por exemplo, por infusão intravenosa. Em modalidades específicas, os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou as composições farmacêuticas dos mesmos podem ser administrados por injeção intramuscular. Em modalidades específicas, os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou as composições farmacêuticas dos mesmos podem ser administrados por injeção subcutânea. Em modalidades específicas, os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou as composições farmacêuticas dos mesmos podem ser administrados por cateter da veia porta. No entanto, a invenção engloba a administração dos agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou composições farmacêuticas dos mesmos, por qualquer via adequada, tendo em conta a avanços prováveis nas ciências da administração de medicamentos.
[000344] Em algumas modalidades, os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou as composições farmacêuticas dos mesmos, de acordo com a invenção podem ser administrados em níveis de dosagem suficientes para administrar de cerca de 0,001 mg/Kg a cerca de 100 mg/Kg, de cerca de 0,01 mg/Kg a cerca de 50 mg/Kg, de cerca de 0,1 mg/Kg a cerca de 40 mg/Kg, de cerca de 0,5 mg/Kg a cerca de 30 mg/Kg, de cerca de 0,01 mg/Kg a cerca de 10 mg/Kg, de cerca de 0,1 mg/Kg a cerca de 10 mg/Kg ou de cerca de 1 mg/Kg a cerca de 25 mg/Kg de peso corporal do indivíduo por dia para obter o efeito terapêutico desejado. A dosagem desejada pode ser administrada mais de três vezes por dia, três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada dois meses, a cada seis meses ou a cada doze meses. Em certas modalidades, a dosagem desejada pode ser administrada usando várias administrações (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou mais administrações).
Terapia de combinação
[000345] Será notado pela pessoa normalmente versada na técnica que os agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção e/ou composições farmacêuticas dos mesmos podem ser utilizados nas terapias de combinação.
[000346] A combinação particular de terapias (por exemplo, substâncias terapêuticas ou procedimentos) para utilizar em um regime de combinação levará em conta a compatibilidade das substâncias terapêuticas e/ou procedimentos desejados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Também será estimado que as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser utilizadas em terapias de combinação (por exemplo, nas terapias de combinação de anticorpo), ou seja, as composições farmacêuticas podem ser administradas ao mesmo tempo que, antes de ou após um ou mais outros procedimentos terapêuticos desejados.
[000347] As quantidades terapeuticamente eficazes dos agentes de anticorpo de acordo com a invenção podem ser combinadas, em uma composição farmacêutica fornecida, com pelo menos um outro ingrediente ativo. Em algumas modalidades, outro ingrediente ativo é um agente anticâncer, anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, inibidores da RNA polimerase, inibidores da protease, inibidores da helicase, imunomoduladores, compostos antissentido, RNAs interferentes curtos, RNAs hairpin curtos, microRNAs, aptâmeros de RNA, ribozimas e combinações dos mesmos. A combinação particular de terapias para utilizar em um regime de combinação levará em conta a compatibilidade das substâncias terapêuticas e/ou procedimentos desejados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será também percebido que as terapias utilizadas podem alcançar um efeito desejado para o mesmo distúrbio, ou elas podem alcançar diferentes efeitos.
[000348] Será percebido que as terapias utilizadas podem alcançar um efeito desejado para a mesma finalidade, ou elas podem alcançar diferentes efeitos (por exemplo, o controle de quaisquer efeitos adversos). A invenção engloba a administração das composições farmacêuticas juntamente com agentes que podem melhorar a sua biodisponibilidade, reduzir e/ou modificar o seu metabolismo, inibir a sua excreção e/ou modificar a sua distribuição dentro do corpo.
[000349] Em algumas modalidades, os agentes utilizados em combinação serão utilizados em níveis que não excedam os níveis em que eles são utilizados individualmente. Em algumas modalidades, os níveis utilizados em combinação serão menores do que aqueles utilizados individualmente.
[000350] Em algumas modalidades, a terapia de combinação pode envolver as administrações de uma pluralidade de agentes de anticorpo direcionados para um único epítopo (por exemplo, um único epítopo conformacional). Em algumas modalidades, a terapia de combinação pode compreender uma pluralidade de agentes de anticorpo que reconhecem epítopos distintos, por exemplo, para interferir simultaneamente com vários mecanismos na tumorigênese do processo.
[000351] Será estimado por uma pessoa versada na técnica que qualquer permutação ou combinação de agentes de anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser combinada com qualquer outro agente de anticorpo para formular composições e/ou regimes de terapia de combinação que compreendem uma pluralidade de agentes de anticorpo diferentes.
Ácidos Nucleicos
[000352] Em certas modalidades, a presente invenção fornece os ácidos nucleicos (que inclui o DNA e RNA, por exemplo) que codificam um agente de anticorpo aqui descrito. Em algumas modalidades, a invenção fornece ácidos nucleicos que são complementares aos ácidos nucleicos que codificam um agente de anticorpo aqui descrito.
[000353] Em algumas modalidades, a invenção fornece moléculas de ácido nucleico que hibridizam para os ácidos nucleicos que codificam um agente de anticorpo. Tais ácidos nucleicos podem ser usados, por exemplo, como iniciadores ou como sondas. Apenas para dar alguns exemplos, tais ácidos nucleicos pode ser usados como iniciadores na reação em cadeia da polimerase (PCR), como sondas para a hibridização (incluindo a hibridização in situ) e/ou como iniciadores para a PCR via transcrição reversa (RT-PCR).
[000354] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos podem ser DNA ou RNA, e podem ser de fita simples ou dupla. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos podem incluir um ou mais nucleotídeos não naturais. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos incluem apenas nucleotídeos naturais.
[000355] A geração e a manipulação dos ácidos nucleicos que codificam agentes de anticorpo e, em anticorpos particulares e fragmentos de ligação ao epítopo dos mesmos, são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, mas sem se limitar, a Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012.
[000356] Os ácidos nucleicos descritos nesse documento podem ser clonados em qualquer um dos muitos vetores de expressão e sistemas conhecidos na técnica e, em seguida, transfectados em células de escolha para expressar os ácidos nucleicos na cultura de tecidos, usando tecnologias amplamente conhecidas na arte. Exemplos não limitantes de células dentro do escopo da invenção, sob este aspecto, são, em geral, células do sistema imunológico, e células T e outras células apresentadoras de antígeno, de modo mais particular. Consulte, por exemplo, Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012.
[000357] Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a invenção, mas não devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção sob qualquer aspecto.
[000358] Todas as referências de patente e não patentes citadas na presente invenção são incorporadas por referência nas suas totalidades.
EXEMPLOS Resultados Cristalização do ch8H9
[000359] A estrutura cristalina do fragmento Fab ch8H9 foi determinada pela substituição molecular usando o registro PDB (3D85) e refinada até uma resolução de 2,5 Â. As estatísticas de coleta e refinamento são definidas na tabela 2 (estatísticas para a camada de maior resolução são mostradas entre parênteses). O modelo final foi depositado no banco de dados de proteínas (código de acesso 5CMA).
[000360] A estrutura Fab ch8H9 possui domínios de dobra de imunoglobulina comuns a todas as estruturas Fab, e as seis alças de CDR (H1, H2, H3, L1, L2 e L3) que formam o sítio de reconhecimento do antígeno tinham densidades eletrônicas bem definidas (consulte a figura 1). O potencial eletrostático de superfície do sítio de ligação ao antígeno foi calculado utilizando DelPhi (Figura 1C; Rocchia, W. et al., 2002, J. Comput. Chem. 23:128-137). O centro do sítio de ligação tem uma grande área superficial positivamente carregada dominada pelas alças L3 e H3. Dois bolsos de área superficial negativamente carregada (nas regiões de alça H2 e L1) flanqueiam a região central, indicando que o antígeno reconhecido pelo 8H9 tem uma distribuição de carga de superfície mista. TABELA 2
Humanização do m8H9
[000361] As CDRs das cadeias pesada e leve do m8H9 foram enxertadas em estruturas da IgG1 com base em sua homologia às sequências da linhagem germinativa humana IGHV1-46 para a cadeia pesada e IGKV-7 para a cadeia leve. Duas versões, H1 e H2, da cadeia pesada humanizada foram geradas, com H1 contendo sequências de molde humanas. Duas versões, L1 (SEQ ID NO: 2) e L2 (SEQ ID NO: 3), da cadeia leve humanizada também foram geradas, com L1 contendo mais sequências de molde humanas. Quatro versões do anticorpo IgG1 8H9 humanizado foram, em seguida, clonadas, expressas e purificadas (H1L1 [SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 2], H1L2 [SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 3], H2L1 [SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 2], e H2L2 [SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 3]), juntamente com uma IgG1 8H9 (ch) quimérica.
[000362] A figura 3 e a Tabela 3 abaixo mostram as propriedades de ligação do m8H9 e do ch8H9 contra B7H3, conforme determinado pela ressonância de plasmônio de superfície. Ambos os anticorpos tinham cinéticas de ligação muito semelhantes (KD de 0,28 nM e 0,74 nM, respectivamente).
[000363] A figura 4 e a tabela 4 abaixo mostram as propriedades de ligação das quatro IgG1s 8H9 (hu8H9) humanizadas. A variante H1L1 (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 2), que continha o conteúdo mais humano, se ligou ao B7H3 com menos força (KD de 112 nM) do que as três outras variantes, que, no entanto, também exibiram apenas capacidade de ligação subótima (KD de 34,8 a 38,6 nM). TABELA 3 TABELA 4
[000364] Para melhorar a ligação do hu8H9 ao B7H3, um modelo estrutural de m8H9 foi gerado e simulado usando os campos de força CHARMm. A mutagênese in silico foi realizada para analisar os efeitos de cada única mutação humanizadora possível. A tabela 5 abaixo mostra as 6 mutações (cadeia leve: S20T, S69T, L106I; cadeia pesada: V12K, R40A, E42G) na região de estrutura que levaria à desestabilização da estrutura inerente do m8H9. O reverso dessas 6 mutações (cadeia leve: T20S, T69S, I106L; cadeia pesada: K12V, A40R, G42E) foram introduzidos no H1L2 hu8H9 para criar o H3L3 hu8H9 (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO.: 4). As mutações foram feitas com base nos cálculos de energia in silico, que é um método não padronizado de humanização e otimização do anticorpo. O método padrão de humanização do anticorpo envolve o enxertamento com CDR e fazer mutações reversas com base na homologia de sequência e na proximidade aos resíduos de CDR. Os constructos H1L1, H1L2, H2L1 e H2L2 foram feitos por métodos de enxertamento com CDR padrão. TABELA 5
[000365] Posteriormente ao design de H3L3 hu8H9 (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 4) com base na modelagem de homologia, a estrutura cristalina do fragmento Fab ch8H9 foi resolvida a 2,5 Â. Em um esforço para aumentar o conteúdo humano do H3L3 hu8H9, a estrutura cristalina do fragmento Fab ch8H9 foi simulada com campos de força CHARMm e a mutagênese in silico foi realizada para analisar os efeitos de cada única mutação humanizante possível mais uma vez. A tabela 6 e a tabela 7, ambas abaixo, mostram 7 mutações na cadeia leve (S20T, E42Q, S43A, N76S, V78L, E79Q, V83F) e 5 mutações na cadeia pesada (L20V, K67R, A68V, L70M, and A79V) que foram previstas para estabilizar a estrutura 8H9. Essas 12 mutações humanizantes foram incorporadas no H3L3 hu8H9 para gerar o hu8H9 4.1 (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6). Essas mutações foram feitas com base nos cálculos de energia in silico, que é um método não padronizado de humanização e otimização do anticorpo. TABELA 6 TABELA 7
Maturação de afinidade por exibição de levedura
[000366] Um constructo B7H3 biotinilado foi usado para ajudar na seleção de anticorpos 8H9 humanizados de afinidade maturada particularmente desejáveis. Para esta abordagem, o 4Ig-B7H3 fundido ao Fc de camundongo foi expresso nas células de CHO DG44. PAra a biotinilação, a biotina ativada por NHS foi utilizada para reagir eficientemente com grupos amino primários (-NH2) na cadeia lateral dos resíduos de lisina (K) e o N-terminal dos polipeptídeos. O excesso de biotina que não reagiu foi removido por exclusão de tamanho usando colunas de ultrafiltro. A biotinilação bem sucedida do antígeno B7H3- mFc foi validada pela coloração com estreptavidina conjugada com HRP em um ELISA (Figura 5A). A detecção do B7H3-Fc biotinilado por IgG 8H9 quimérico de camundongo/ser humano confirmou que a porção de biotina não dificultou a ligação específica pelo anticorpo 8H9 ao B7H3- Fc (Figura 5B).
[000367] Para aumentar a afinidade do H3L3 hu8H9 humanizado, ele foi convertido em um scFv e aleatoriamente modificado por PCR propenso a erro. Anteriormente, utilizamos com sucesso a exibição de levedura para a maturação adicional dos anticorpos porque ela permite uma boa discriminação entre os mutantes por citometria de fluxo. Portanto, a biblioteca mutante foi exibida em células de levedura por recombinação homóloga com um vetor que contém uma etiqueta c-myc. Uma biblioteca de levedura mutante de tamanho relativamente grande (até 108) foi gerada e submetida primeiramente a uma pré-seleção usando esferas magnéticas conjugadas com o B7H3-mFc biotinilado, permitindo a eliminação das células de levedura que não expressam anticorpos ou que se ligam fracamente ao antígeno. A biblioteca mutante foi, em seguida, classificada várias vezes por FACS para selecionar a ligação ao B7H3 sob condições rigorosas (Figura 6). As variantes de scFv selecionadas foram adicionalmente modificadas por PCR propenso a erro do gene inteiro para produzir uma nova sub- biblioteca. O processo de classificação e mutagênese foi, em seguida, ciclicamente repetido. Os clones que se ligam mais forte ao B7H3 foram obtidos a partir do ciclo final de maturação (Figura 6). As leveduras derivadas do último (7°) ciclo de classificação mostraram ligação significativamente mais forte do que as leveduras exibindo H3L3 hu8H9 parental (SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 4) (Figura 7), quando foram marcadas com o antígeno B7H3-mFc. Estes resultados indicaram que os mutantes de levedura enriquecidos tinham afinidade de ligação significativamente aumentada em comparação com o original que não sofreu mutagênese. Os clones de maior afinidade do ciclo final de maturação foram identificados. Os dados de sequência dos ligantes fortes foram agrupados por análise de cluster. As seguintes variantes de scFv foram selecionadas repetidamente: S7.2 (SEQ ID NO.: 19), S7.17 (SEQ ID NO.: 20), S7.22 (SEQ ID NO.: 21), S7.28 (SEQ ID NO.: 22) e S7.29 (SEQ ID NO.: 23) (FIG. 8).
Propriedades de Ligação dos Mutantes scFv Selecionados
[000368] Em um ELISA, as variantes de scFv selecionadas por FACS exibiram a melhor ligação às formas 4Ig ou 2Ig do B7H3 do que aquelas observadas com o H3L3 hu8H9 original ou com S3.3 (Sort3) (Figura 9). A ligação de diferentes variantes de 8H9 ao antígeno 4Ig-B7H3 revestido em pedaços de CM5 foi comparada por ressonância de plasmônio de superfície usando Biacore T-100. Os valores de KD obtidos de todas as variantes selecionadas, incluindo H3L3 hu8H9 e S3.3, estão listados na tabela 8 abaixo. TABELA 8
[000369] As variantes de scFv do sétimo tipo ligadas ao antígeno com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 6 nM, 2 nM, 1 nM, 277 nM e 3 nM, em comparação com as constantes de dissociação (KD) de 144 nM e 10 nM foram observadas para o H3L3 hu8H9 e S3.3 original, respectivamente. Dentre as variantes de scFv da sétima classificação, os scFvs S7.17, S7.22 e S7.29 exibiram a maior afinidade de ligação, alcançando uma melhoria de afinidade maior do que 50 vezes. O scFv S7.22 (SEQ ID NO: 21), particularmente, resultou em uma melhoria de mais de 100 vezes de ligação em comparação com o scFv hu8H9 H3L3 original (SEQ ID NO: 17).
Imunomarcação das células tumorais pelas variantes de scFv de afinidade maturada
[000370] Foi comparada a ligação das variantes scFv H3L3 hu8H9 (SEQ ID NO.: 17), S3.3 (SEQ ID NO.: 18) e S7.22 (SEQ ID NO.: 21) com as células M14 do neuroblastoma (Figura 10). Verificamos que o scFv S7.22 mostrou melhor ligação do que as variantes de scFv Hu8H9 e S3.3. Determinação das Mutações de aumento de afinidade chave A Tabela 9 abaixo lista as seis mutações identificadas a partir das sequências selecionadas de maturação de afinidade (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G). Quatro das mutações (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G) foram derivadas do terceiro ciclo de classificação (clone S3.3 [SEQ ID NO: 18]) e estavam, posteriormente, presentes na maioria dos clones da sétima rodada de classificação. TABELA 9
[000372] O clone de maior afinidade, S7.22, tem duas mutações adicionais (HC: G56D, HC: A102G). Três das mutações identificadas estão diretamente na região CDR (LC: H34Y, HC: G56D, HC: A102G). Duas das mutações (LC: S20T, HC: E42G) são da mesma sequência que o molde da linhagem germinativa humana usado para humanização.
Afinidade aumentada e variantes humanizadas
[000373] As seis mutações de maturação de afinidade (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G) foram incorporadas na sequência de H3L3 hu8H9 (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO.: 4) para gerar o scFv hu8H9 3.1 (SEQ ID NO: 24) e as variantes da IgG1. A sequência do hu8H9 4.1 (SEQ ID NO: 25) já continha uma das mutações identificadas a partir da maturação de afinidade (LC: S20T) e as cinco mutações adicionais (LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G) foram incorporadas para gerar o scFv 5.1 hu8H9 (SEQ ID NO: 26) e variantes da IgG1.
[000374] A cinética de ligação das variantes scFv H3L3 hu8H9 (SEQ ID NO.: 17), 3.1 (SEQ ID NO.: 24), 4.1 (SEQ ID NO.: 25) e 5.1 (SEQ ID NO.: 26) estão apresentadas na tabela 10 abaixo. TABELA 10
[000375] Como pode ser notado, a adição das mutações de aumento de afinidade resultaram em afinidades de ligação substancialmente maiores (KD de 0,9 nM para hu8H9 3.1 e KD de 1,7 nM para hu8H9 5.1), em comparação com a afinidade de ligação das sequências de não afinidade maturada.
[000376] A cinética da ligação pelos anticorpos IgG1 ch8H9 (SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 1), H1L2 (SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 3), H3L3 (SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 4), 3.1 (SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 5) e 5.1 (SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 7) ao 4Ig-B7H3-Fc estão apresentadas na figura 11 e na tabela 11 abaixo. TABELA 11
[000377] A variante humanizada H1L2 (SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3), que foi desenhado por tecnologias de enxertamento com CDR padrão, tem ligação substancialmente mais fraca do que o ch8H9 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO.: 1) (KD de 42,7 nM para H1L2 hu8H9 e KD de 1,2 nM para ch8H9). Conforme descrito na presente invenção, um novo método de modelagem computacional baseado em cálculos de energia e simulações de dinâmica molecular foi utilizado de acordo com a presente invenção para gerar o H3L3 hu8H9, resultando em uma melhoria substancial na afinidade (6,6 nM). A incorporação das mutações que aumentam a afinidade resultou em melhorias adicionais e também nos hu8H9 3.1 (SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 5) e 5.1 (SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 7) (2.0 e 1.3 nM KD, respectivamente), que possuem características de ligação comparáveis às do ch8H9. Melhorias similares foram observadas na ligação ao 2Ig-B7H3-Fc (Figura 12 e na tabela 12 abaixo). TABELA 12
[000378] A ligação do ch8H9 (SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 1) e do hu8H9 H1L2 (SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 3), 3.1 (SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 5), e do 5.1 (SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 7) às células tumorais M14 de melanoma positivas para B7H3 foi testada, e os dados resultantes estão apresentados na figura 13. A ligação do Hu8H9 3.1 e 5.1 foi comparável com a ligação do ch8H9 e substancialmente mais forte do que a do hu8H9 H1L2.
[000379] As cinéticas de ligação para os constructos de IgG (m8H9, ch8H9, hu8H9 H3L3 e hu8H9 3.1) para tanto o 4Ig-B7-H3 como para o 2Ig-B7-H3 sem a fusão Fc foram determinadas (tabela 13). Tanto o anticorpo m8H9 como o ch8H9 se ligaram ao 2Ig-B7-H3 com maior afinidade do que o 4Ig-B7-H3, indicando que o epítopo de ligação pode ser mais totalmente exposto no formato 2Ig-B7-H3. A IgG hu8H9 H3L3 (KD de 33 nM para 4Ig-B73H3 e KD de 45 nM para o 2Ig-B7-H3) apresentaram perda parcial de afinidade em comparação com o ch8H9 (KD de 7,7 nM para o 4Ig-B73H3 e KD de 2,7 nM para o 2Ig-B7-H3). O hu8H9 3.1 de afinidade maturada tinha um aumento de 2,5 a 9 vezes de afinidade (KD de 13 nM para o 4Ig-B73H3) e KD de 5,0 nM para o 2Ig- B7-H3) em comparação com o hu8H9 H3L3 parental. Devido ao fato de o hu8H9 3.1 não ter afinidade maior do que o ch8H9, as mutações de maturação de afinidade (LC: S20T, LC: H34Y, HC: A24T, HC: E42G, HC: G56D, HC: A102G) foram incorporadas na IgG ch8H9 para gerar o ch8H9 6.1. A cinética de ligação do ch8H9 6.1 foi KD de 3,7 nM para o 4Ig-B73H3 e KD de 0,6 nM para o 2Ig-B7-H3, que demonstrou uma melhoria de 2 a 4 vezes na ligação em relação ao ch8H9. TABELA 13 Cinética de ligação para os constructos de IgG ao 4Ig-B7-H3 e ao 2Ig-B7-H3 sem fusão Fc
Propriedades de morte do tumor in vitro dos anticorpos 8H9
[000380] Em seguida, nós testamos as propriedades de morte do tumor in vitro ADCC de cinco constructos de anticorpo IgG (m8H9, ch8H9, ch8H9 6.1, hu8H9 H3L3, and hu8H9 3.1) utilizando células tumorais do neuroblastoma LAN-1 como alvos e PBMC humano como células efetoras. A citotoxicidade foi medida pela liberação do cromo 51 (figura 14 e tabela 14). O m8H9 não tinha nenhuma função ADCC com o PBMC humano, o que é esperado para o isotipo IgG1 de murino. Os constructos ch8H9 e hu8H9 H3L3 exibiram potente ADCC (1,4 e 0,7 μg/mL de EC50, respectivamente). O ch8H9 6.1 (0,1 μg/mL de EC50) teve uma melhoria de 14 vezes na citotoxicidade em relação ao ch8H9 e o hu8H9 3.1 (EC50 0,3 μg/mL) teve um aumento de 2 vezes na morte em relação ao hu8H9 H3L3 e um aumento de 5 vezes na morte em relação ao ch8H9. TABELA 14
Alvejamento in vivo dos xenoenxertos de neuroblastoma humano
[000381] A biodistribuição in vivo dos constructos de anticorpo 8H9 (hu8H9 3.1 e ch8H9 6.1 em comparação com o m8H9 e ch8H9) foi determinada utilizando os xenoenxertos de camundongo. Resumidamente, todos os anticorpos foram radiomarcados com 131I e a sua imunorreatividade in vitro contra as células LAN-1 foi determinada (m8H9:69%, ch8H9:75%, ch8H9 6.1:73% e hu8H9 3.1:54%). As biodistribuições in vivo de cada anticorpo 48 horas após a injeção foram analisadas usando camundongos com xenoenxertos LAN-1 de neuroblastoma subcutâneos (Figura 15 e tabela 15 [Avg: média]). A absorção do tumor, conforme medida pela porcentagem de dose injetada por grama (%ID/gm) foi 8,9% para m8H9, 6,1% para ch8H9, 6,8% para ch8H9 6.1 e 10,6% para hu8H9 3.1. As razões de tumor para tecido normal são mostradas na tabela 16 (Avg: média). Todos os anticorpos testados tinham razões de tumor para não tumor comparáveis para a maioria dos tecidos. A maior absorção do tumor foi observada para hu8H9 3.1, que foi estatisticamente superior ao ch8H9 (p < 0,05) e uma maior razão de tumor:sangue do que ch8H9 (1,26 em comparação com 0,72, p < 0,05). Uma captação de tumor levemente inferior foi observada para ch8H9 6.1, porém com uma razão tumor:sangue comparável. TABELA 15 TABELA
Determinação de epítopo
[000382] As tecnologias de acoplamento molecular foram usadas para prever o epítopo molecular preciso no B7H3 responsável pela ligação ao 8H9. Especificamente, foi gerado um modelo de homologia de 2Ig- B7H3 humano e experimentos de acoplamento foram, em seguida, realizados com a estrutura cristalina do Fab ch8H9 usando ZDOCK. A figura 16 mostra o modelo previsto derivado dos cálculos de acoplamento. O modelo mostra que o 8H9 se liga especificamente à sequência IRDF (resíduos 126 a 129, SEQ ID NO: 32) da alça FG no domínio V do 2Ig-B7H3. No 4Ig-B7H3, essa sequência está presente duas vezes (resíduos 126 a 129 do domínio V1 e resíduos 344 a 347 do domínio V2). As energias de interação previstas para cada um dos resíduos 2Ig-B7H3 que interagem do complexo acoplado são mostradas na tabela 17 abaixo. Arg127 e Asp128 têm a maior energia de interação (-55,2 e -46,3 kcal/mol, respectivamente). TABELA 17
[000383] Com base na modelagem molecular, as mutações pontuais R127A e D128A foram feitas em dois constructos 2Ig-B7H3-mFc separados e recombinantemente expressos. A figura 17 mostra as cinéticas de ligação do ch8H9 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO.: 1) para os mutantes R127A e D128A do 2Ig-B7H3, juntamente com a cinética de ligação de três MAbs anti-B7H3 comercialmente disponíveis (MIH42 e 6A1, junto à Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL) e o clone 185504, junto à R&D Systems (Mineápolis, MN)). A RU máxima da ligação para o 2Ig-B7H3-Fc WT, bem como a ligação relativa dos mutantes R127A e D128A, são mostradas na tabela 18. ch8H9 mostra a perda quase total da ligação (99,9%) quanto à mutação R127A e a perda parcial de ligação (40%) em relação à mutação D128A em comparação com o constructo tipo selvagem. Nenhum dos três outros anticorpos anti-B7H3 apresentaram perda substancial de ligação a qualquer proteína mutante B7H3 (ou seja, os anticorpos MIH42 e o clone 185504 reteram ~ 70 a 75% de sua respectiva ligação aos mutantes R127A e D128A; o anticorpo 6A1 apresentou uma fraca ligação global ao 2Ig-B7H3 WT e a mesma ligação ao R127A ou ligação elevada aos mutantes D128A). Semelhante ao ch8H9 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO.: 1), as variantes hu8H9 3.1 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5) e 5.1 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 7) também mostraram uma perda total e parcial de ligação (Figura 18). Estes estudos de ligação demonstraram que o ch8H9 era exclusivamente específico para a sequência IRDF do B7H3. A perda de ligação aos mutantes R127A e D128A B7-H3 pelo SPR para os constructos 8H9 humanizados também foi confirmada. TABELA 18
Uso do MAb 8H9 para a imunomodulação
[000384] Foi anteriormente demonstrado que a alça FG do domínio IgV do B7H3 desempenha um papel crítico na função inibitória das células T das proteínas em camundongo. O camundongo B7H3 só existe sob a forma 2Ig-B7H3, em que a sequência crítica responsável pela função inibidora é IQDF (resíduos 126 a 129 da SEQ ID NO: 86). Nós demonstramos que todos dentre o m8H9 e os clones 3.1 e 5.1 se ligam à sequência IRDF homóloga (resíduos 126 a 129) no B7H3 humano (SEQ ID NO: 32) e, especificamente, à Arg127. Além disso, o m8H9 e suas formas humanizadas não se ligam ao B7H3 murino, que contém Gln127. Ao contrário de outros anticorpos anti-B7H3 testados, apenas o 8H9 pode ser usado para bloquear a função imunoinibidora do B7H3.
[000385] A figura 19 apresenta dados mostrando que as células IMR- 32 de neuroblastoma positivas para B7H3 podem inibir a proliferação das células T. Neste ensaio, uma redução de 60% na proliferação de células T foi observada quando células IMR-32 estavam presentes. O 8H9 quimérico suprime este efeito inibidor na proliferação de células T de forma dose-dependente e ainda aumenta a proliferação das células T na presença de células tumorais (Figura 20).
[000386] Também foi testado se o m8H9 pode superar o efeito inibidor do B7H3 sobre a função das células T. Usando de um anticorpo biespecífico anti-Her2 x anti-CD3 (trastuzumab fundido ao scFv huOKT3), testou-se se o m8H9 poderia aumentar a citotoxicidade mediada por células T do Her2-positivo, das células de carcinoma cervical humano B7H3-positivas (HeLa) (Figura 21). Foi observado que quando as células tumorais são pré-incubadas com 8H9, a taxa de morte máxima aumenta de 58% (sem pré-tratamento) para 71% (com pré-tratamento com 8H9).
[000387] Estes conjuntos de experimentos são a primeira demonstração de que o m8H9 e os seus derivados podem ser usados para a terapia de imunomodulação.
Métodos Modelagem de homologia
[000388] Os modelos de homologia da região variável do 8H9 foram gerados usando o servidor de modelagem de anticorpo ROSETTA e o Discovery Studio 3.0 (Accerlys, São Diego, CA).
Cristalografia de raios x
[000389] Os fragmentos Fab do ch8H9 foram gerados por digestão da papaína usando um kit de preparação Fab padrão (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). O fragmento Fab purificado foi concentrado até 10 mg/mL em HEPES 20 mM, pH 6,5 e foi, em seguida, cristalizado em uma gota de suspensão por difusão de vapor a 16°C, contra um reservatório de reagente de Hampton Index contendo sulfato de lítio mono-hidratado 0,2 M, BIS-TRIS 0,1 M pH 6,5 e polietilenoglicol 3350 25% p/v (Hampton research, Aliso Viejo, CA). A gota foi formada pela mistura de 1 μL de solução de proteína e 1 μL de solução de reservatório. Os dados foram coletados na linha de luz da fonte de fótons Argonne Advanced 24IDE. A estrutura do Fab foi resolvida por substituição molecular usando MolRep (suite CCP4) (Mccoy, A. J., et al., 2007, J. Appl. Crystallogr. 40:658-674). O melhor modelo de substituição molecular foi refinado usando Phenix (Adams, P. D. et al., 2010, Acta crystallographica Section D Biological crystallography 66:213-221), e o ajuste manual foi realizado com O (Bailey, S., 1994, Acta Crystallogr. D 50:760-763). A estrutura dos cristais foi resolvida em 2,5 Â.
Simulações moleculares da estrutura ch8H9
[000390] A estrutura cristalina do ch8H9 foi simulada usando os campos de força CHARMm (CHemistry at Harvard Molecular mechanics) e o efeito de cada mutação pontual foi calculado a partir da diferença entre a energia livre de dobramento da proteína modificada e da proteína tipo selvagem. A aproximação de Born generalizada foi usada para representar o efeito do solvente e todos os termos eletrostáticos foram calculados como uma soma de interações colômbicas e contribuições polares para a energia de solvatação. Uma soma ponderada dos termos de van der Waals, eletrostática, entropia e não polares foi calculada para cada mutação pontual. Todos os cálculos foram realizados usando o Discovery Studio 3.0 (Accelrys, São Diego, CA). As mutações para frente e para trás foram sendo testadas quanto ao seu efeito sobre a estabilidade da hu8H9 da próxima geração. As simulações de acoplamento foram geradas utilizando o software ZDOCK (disponível junto à Universidade de Boston, Boston, MA). As simulações de acoplamento foram geradas utilizando o ZDOCK (Chen, R. et al. 2003, Proteins 52:80-87) e a modelagem por homologia do B7H3 foi feita usando MODELLER (Sanchez, R., e Sali, A., 1997, Proteins Suppl. 1:50-58). Os potenciais de superfície eletrostáticos foram gerados usando DelPhi (Rocchia, W. et al., 2002, J. Comput. Chem. 23:128-137).
Biotinilação do antígeno B7H3
[000391] O gene para a proteína de fusão B7H3 humano-Fc de camundongo (mFc) foi otimizado para expressão em células CHO (Genscript, Piscataway, NJ). Usando o vetor pBluescript (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), o gene foi transfectado em células de CHO DG44 e expresso como descrito anteriormente (Cheung et al., 2012 OncoImmunology 1:477-486). A biotinilação da proteína de fusão B7H3-mFc foi realizada usando EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin e um kit de biotinilação (Thermo Scientific, Tewksbury, MA), de acordo com as instruções do fabricante. A proteína biotinilada foi posteriormente concentrada usando um tubo de centrífuga Vivaspin 50.000 MWCO (Sartorius Stedim, Goettingen, Alemanha) e testada quanto à sua biotinilação em um ELISA de ligação à estreptavidina.
Mutagênese por PCR propenso a erro
[000392] O PCR propenso a erro de todo o gene scFv hu8H9 (V3) foi realizado usando o kit de mutagênese aleatória Stratagene GeneMorph® II de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, a PCR foi realizada em uma reação de 50 μL contendo 1 x tampão reacional Mutazyme II, 0,5 μM de cada um dos iniciadores ERRORF (5’ TCAGTTTTGGCCCAGGCGGCC 3’; SEQ ID NO.: 81) e ERRORR (5’ ACCACTAGTTGGGCCGGCCTG 3’; SEQ ID NO.: 82), 0,2 mM de (cada) dNTPs, 1 ng de molde de DNA, 2 μM de trifosfato de 8- oxodesoxiguanosina, 2 μM de 2'-desóxi-p-nuclesídeo-5'-trifosfato e 2,5 U da DNA polimerase Mutazyme II. As misturas reacionais foram desnaturadas a 95 °C durante 2 min, submetidas a um ciclo 35 vezes a 95 °C, durante 1 min, a 60 °C durante 1 min e a 72 °C por 1 min e, finalmente, estendidas a 72 °C durante 10 min. Os produtos da PCR foram purificados por eletroforese em gel de agarose a 1%, e cada um foi amplificado em quatro reações de PCR de 100 μL contendo 1 x mistura reacional de PCR NEB, 1 μM de iniciadores
[000393] YDRDF (5’CTTCGCTGTT TTTCAATATT TTCTGTTATT GCTTCAGTTT TGGCCCAGGC GGCC 3’; SEQ ID NO.: 83) e YDRDR (5’GAGCCGCCAC CCTCAGAACC GCCACCCTCA GAGCCACCAC TAGTTGGGCC GGCCTG 3’; SEQ ID NO.: 84), 120 ng de produto do PCR propenso a erro e 2,5 U de DNA polimerase. As reações foram termicamente ciclizadas usando 30 ciclos e, de outro modo, como acima descrito. Os produtos da reação foram purificados por eletroforese em gel de agarose a 1% e concentrados por ultrafiltração com água.
Seleção dos mutantes hu8H9 das bibliotecas de leveduras
[000394] A construção e o crescimento das bibliotecas de levedura para a maturação de afinidade foram modificados a partir do protocolo anteriormente publicado (Zhao et al. 2011 Mol Cancer Ther 10:16771685). Antes da separação de células ativadas por fluorescência (FACS), a biblioteca de levedura (1 x 109 células) foi pré-incubada com IgG 3F8 de camundongo em temperatura ambiente durante 1 h, e depois ela foi panoramizada contra 10 μg de esferas magnéticas conjugadas com B7H3-mFc durante 1 h em temperatura ambiente em tampão PBSA (BSA 0,1% em PBS), seguido pela separação com um suporte magnético. As esferas isoladas foram lavadas por 3 vezes com tampão PBSA, ressuspensas em 10 mL de meio SDCAA e cultivadas de um dia para o outro em um agitador a 30 °C a 250 rpm. As células de levedura recuperadas das esferas magnéticas foram incubadas em meio SG/RCAA durante 18 h a 20 °C com agitação a 250 rpm. Para a primeira seleção de FACS, cerca de 1 x 108 células de levedura foram peletizadas, lavadas duas vezes com tampão PBSA e ressuspensas em 1 ml de tampão PBSA contendo 10 μg/mL de B7H3-mFc biotinilado e um anticorpo anti-c-myc de camundongo (Jackson Research Laboratories, Bar Harbor, Maine). Após a incubação, as células de levedura foram lavadas 3 vezes e, em seguida, ressuspensas em 1 mL de tampão PBSA. Tanto uma diluição de 1:100 de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina (BD Bioscience) como (Fab)2 anticamundongo de cabra conjugado com FITC (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionados às células de levedura a serem classificado, depois do que as células foram incubadas a 4°C durante 30 min, lavadas 3 vezes com tampão PBSA e, então, ressuspensas em tampão PBSA para fins de classificação. Os gates de triagem foram determinados para selecionar os maiores sinais de ligação ao antígeno. As células coletadas foram cultivadas de um dia para o outro em meio SDCAA a 30°C e, em seguida, elas foram incubadas em SG/RCAA para a próxima rodada de seleção. Para as próximas duas seleções, aproximadamente 1 a 2 x 107 células fúngicas foram utilizadas para marcar com 3 μg/mL e 1 μg/mL de B7H3 biotinilado, respectivamente. Os plasmídeos de levedura foram isolados usando kit Mimiprep II de plasmídeo de levedura Zymoprep (Zymo Research, Irvine, CA) de acordo com as instruções do fabricante e usados como moldes para a segunda construção da biblioteca. A construção e seleção da segunda biblioteca foram feitas em relação à primeira biblioteca de levedura. No entanto, a segunda biblioteca de levedura foi submetida a quatro seleções de FACS com 1, 0,2, 0,05 e 0,01 μg/mL de B7H3-mFc biotinilado, respectivamente. As células da última seleção foram espalhadas em placas de SDCAA. As células de levedura monoclonal foram caracterizadas e os plasmídeos codificando scFvs isolados com maior afinidade foram sequenciados.
Expressão e purificação de scFv solúvel
[000395] Os ScFvs foram expressos e purificados como anteriormente descrito (Zhao et al., 2011, Mol. Cancer Ther. 10: 1677-1685). As células bacterianas HB2151 foram transformadas com o plasmídeo pComb3x contendo as sequências scFv. Colônias frescas individuais foram inoculadas em meio 2YT contendo 100 μg/mL de ampicilina e 0,2% de glicose. A cultura foi induzida por isopropil-L-tio-h-D-galactopiranosídeo (concentração final de 0,5 mM). Após o crescimento de um dia para o outro a 30°C, as bactérias foram centrifugadas a 5.000 x g durante 15 min. O ScFv solúvel foi liberado do periplasma bacteriano incubando bactérias a 30 °C durante 30 minutos. O sobrenadante límpido foi recuperado e purificado em uma coluna Ni-NTA. Todos os scFvs recombinantes tinha etiquetas FLAG e His.
Expressão e purificação dos constructos de IgG
[000396] Os constructos de genes (baseados no vetor pBluescript (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)) codificando a cadeia pesada e leve do 8H9 foram transfectados nas células CHO-S e selecionados com G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA). As linhagens produtoras de anticorpos foram cultivadas em meio isento de soro OptiCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o sobrenadante foi, em seguida, coletado. Uma coluna de afinidade de proteína A foi pré-equilibrada com 25 mM de tampão citrato de sódio/NaCl 0,15 M a pH 8,2. O 8H9 ligado foi eluído com tampão de ácido cítrico/citrato de sódio 0,1 M, pH 3,9, e dialisado em citrato de sódio 25 mM e NaCl 150 mM em pH 8,2.
ELISA
[000397] O B7H3-mFc (100 ng/poço) ou 2IgB7H3 (R&D, Mineápolis, MN) (25 ng/poço) foram revestidos em placas de microtitulação de polivinila em PBS de um dia para o outro. As placas foram, em seguida, bloqueadas com BSA 0,5% em PBS a 150 μL por poço durante 1 h em temperatura ambiente. Os anticorpos foram adicionados em triplica com diluição em série de BSA 0,5%. Após a incubação durante 1 h em temperatura ambiente e lavagem com PBS, o anticorpo Fc anti-humano de camundongo HRP, HRP-estreptavidina ou o anticorpo anti-Flag de HRP-camundongo foi adicionado. Após incubação durante 1 h em temperatura ambiente e lavagem adicional, a cor foi desenvolvida e quantificada usando um leitor de placas de ELISA a 490 nm.
Análise de citometria de Fluxo
[000398] Para a marcação das células de levedura exibindo scFv na sua superfície, as células foram incubadas com antígeno B7H3-mFc em diferentes concentrações (0,1 e 1 μg/ml) em PBSA durante 30 min em gelo, seguido pela incubação com um anticorpo anti-camundongo conjugado com APC (BD Bioscience, San Jose, CA), como o anticorpo secundário. Para a marcação das células tumorais, as células foram coletadas em meio de cultura e incubadas com 1 μg/mL de scFvs purificado, seguido por incubação sequencial com um anticorpo anti-His de camundongo e um anticorpo anticamundongo PE. A citometria de fluxo foi realizada usando FACScalibur™ (BD Bioscience, São José, CA).
Determinação de afinidade por ressonância de plasmônio de superfície
[000399] Em resumo, o antígeno B7H3 (2Ig-B7H3, 4Ig-B7H3, 2Ig- B7H3-mFc ou 4Ig-B7H3-mFc), estava diretamente imobilizado no chip sensor CM5 através de interação hidrofóbica. A superfície de referência foi montada para a ligação não específica e alterações no índice de refração. Para a análise da cinética de interações, diferentes concentrações de scFvs foram injetadas a uma vazão de 30 μL/min usando tampão de análise contendo HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo P-20 0,05% (pH 7,4). Os dados das fases de associação e dissociação foram ajustados simultaneamente para um modelo 1:1 usando BIAevaluation 3.2. Todos os experimentos foram realizados a 25°C. Para a determinação do epítopo, 2Ig-B7H3 WT, R127A e D128A foram imobilizados sobre o chip, 400 nM de ch8H9, MIH42, 6A1 e do clone 185504 foram injetados conforme descrito acima (tempo de contato de 180s, tempo de dissociação de 600s).
Ensaio de proliferação de células T
[000400] As células T foram purificadas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) usando um kit de isolamento de células T Pan (Miltenyi Biotec, Cambridge, MA). As células IMR-32 de neuroblastoma foram irradiadas a 80 Gy e ressuspensas em RPMI (GIBCO) a 0,1 milhão/mL. 1 x 104 células IMR- 32/poço (100 μL), com diferentes concentrações de ch8H9 (50 μL) foram adicionadas a uma placa de cultura de células com 96 poços e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente. Posteriormente, as 2 x 105 células T purificadas por poço foram misturadas com 1,5 μL de dinaesferas CD3/CD28 (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionadas aos poços com as células IMR-32. As células foram cultivadas e mantidas em RPMI suplementado com FBS e 30 U/mL de IL-2 a 37 °C durante 6 dias. A proliferação de células T foi quantificada usando o ensaio de contagem de células Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Mol, Rockville, MD), de acordo com o protocolo do fabricante.
Ensaio de citotoxicidade mediada por células T
[000401] As células de carcinoma cervical humano HER2(+) e B7H3(+) (HeLa) foram cultivadas a 37°C com RPMI + FBS 10%, L- glutamina 2% e P/S 1%. As células foram coletadas com tripsina/EDTA e 1 x 106 células foram incubadas com 100mCi de 51Cr durante 60 min a 37°C e com ou sem 100 mg/mL de anticorpo de camundongo 8H9 específico para B7H3. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes e 5.000 células alvo foram plaqueadas em cada poço de uma placa de fundo redondo com 96 poços, juntamente com as células T na razão de 1:10, respectivamente. Diferentes concentrações (a partir de 1 a 1 x 10-6 1 mg/mL) de um anticorpo biespecífico anti-HER2 x anti-CD3 (trastuzumab fundido ao scFv huOKT3) e 10 mg/mL de anticorpo 8H9 de murino foram, em seguida, adicionadas (este último apenas para células pré-incubadas com o anticorpo 8H9). Os sobrenadantes foram coletados após quatro horas de incubação e a sua radioatividade foi medido em um contador de cintilação. A lise específica das células tumorais foi calculada com base na seguinte fórmula: % de Lise específica = (cpm da amostra - cpm espontânea)/(cpm máxima - cpm espontânea) x 100%.
Ensaio de cultura de células tumorais e de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)
[000402] As células tumorais de neuroblastoma LAN-1 foram obtidas do Hospital de Crianças Los Angeles. As células foram cultivadas em RPMI1640 (Cellgro, Manassas, VA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Life Technologies, Grand Island, NY) a 37 °C em uma incubadora umidificada e com CO2 a 5%. Os ensaios de ADCC foram realizados conforme descrito anteriormente (Cheung, N.K. et al., 2012, Oncoimmunology 1:477-48652). Resumidamente, as células tumorais de neuroblastoma LAN-1 foram radiomarcadas com 51Cr e as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram usadas como efetores em uma razão de efetor-alvo igual a 25:1. A citotoxicidade foi medida pela liberação de 51Cr.
Biodistribuição do anticorpo em camundongos xenoenxertados
[000403] Os camundongos fêmeas sem pelo atímicos (6 a 8 semanas de idade) foram comprados do Harlan Sprague Dawley, Inc. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional do Centro de Câncer do Memorial Sloan-Kettering e as diretrizes institucionais para o adequado e humano usam de animais em pesquisa. As células tumorais (LAN-1) foram coletadas e implantadas por via subcutânea (s.c.) ao flanco dos camundongos (5 x 106 células por cada camundongo). Quando os volumes de tumor foram aproximadamente 200 mm3, grupos de ratos distribuídos aleatoriamente (n = 4 a 5/grupo, uma preparação de anticorpo radiomarcado/grupo) foram injetados por via intravenosa com 50 μCi de anticorpo radiomarcado com 131I (preparado de acordo com o método de IODOGEN (Salacinski, P.R. et al., 1981, Analytical biochemistry 117:136-146; Harlow, E. e D. Lane, 1999, Using antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) seguido por purificação por filtração em gel usando colunas Sephadex G-25 comerciais pré-empacotadas em PBS + BSA 1%; atividade específica: 1,67 a 3,81 mCi/mg; 13 a 30 μg de anticorpo/dose). A imunorreatividade de cada marcador foi avaliada usando um ensaio de ligação in vitro com LAN-1 recém-coletado. Os camundongos foram escarificados em 48 horas após a injeção (p.i.),os órgãos foram removidos e contados em um contador gama (Perkin Elmer Wallac Wizard 3). Estes órgãos incluíam pele, fígado, baço, rim, adrenal, estômago, intestino delgado, intestino grosso, fêmur, músculo, tumor, coração, pulmão, coluna e cérebro. As taxas de contagem foram corrigidas quanto ao sinal de fundo e à degradação, convertidas para as atividades utilizando um fator do sistema de calibração específico para o isótopo, normalizadas para a atividade administrada e expressas como a dose injetada porcentual por grama (% ID/g). As razões de tumor para não tumor de % ID/gm também foram calculadas.
Uso clínico do 8H9 em radioimunoterapia compartimental Metástase para o sistema nervoso central (SNC)
[000404] A metástase cerebral é uma complicação devastadora e um grande obstáculo para a cura do câncer para a maioria dos tumores sólidos; sua biologia é mal compreendido, inadequadamente controlada e a cura é rara (Maher EA et al., Cancer Res 69:6015-20, 2009). As células tumorais do sangue ou de metástases cerebrais podem invadir o CSF e se disseminar pelo neuroeixo pelo constante fluxo do CSF dos ventrículos para o canal medular e sobre as convexidades corticais, uma condição chamada carcinomatose leptomeníngea (LM) (Grossman, S.A. et al., 1999, Oncology 13:144-152; Bruno, M.K. et al., 2005, Cancer Treat. Res. 125:31-52; Gleissner, B. et al., 2006, Lancet Neurol. 5: 44352).
[000405] A carcinomatose LM é mais comum em pacientes com metástase sistêmica disseminada (Wasserstrom, W.R. et al.,1982, Cancer 49:759-72; Balm, M. et al., 1996, Arch. Neurol. 53:626-32; Chamberlain, M.C. et al., 2005, J. Clin. Oncol. 23:3605-13). As metástases cerebrais parenquimatosas simultâneas não são incomuns (11% a 31% dos pacientes)(Wasserstrom, W.R. et al., 1982, Cancer 49:759-72; Freilich, R.J et al., 1995, Annals of Neurology 38:51-57; Posner, J.B., Neurologic Complications of Cancer, Comtemporary Neurology Series, Philadelphia, F.A. Davis Company, 1995). Ao contrário da leucemia, onde a metástase LM é bem controlada pela quimioterapia intratecal (Littman, P. et al., 1987, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 13:1443-9), o prognóstico em relação aos tumores sólidos é extremamente reservado apesar do uso de terapia de quimioterapia e radioterapia (Wasserstrom, W.R. et al., 1982, Cancer 49:759-72; Grossman, S.A. et al., 1991, Neurol. Clin. 9:843-56).
Ascite maligna
[000406] A ascite maligna (carcinomatose peritoneal) acompanha um amplo espectro de tumores abdominais e extra-abdominais. A obstrução linfática e a permeabilidade vascular são fatores importantes em sua patogênese (Holm-Nielsen, P., 1953, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 33:10-21; Sangisetty, S.L. et al., 2012, World J. Gastrointest. Surg. 4:87-95). A ascite maligna reduz significativamente a qualidade de vida dos pacientes porque resulta em perda de proteína, desequilíbrio eletrolítico, edema difuso e sepse abdominal. Dentre os tumores abdominais, as malignidades gástricas, ovarianas, endometriais, colorretais, pancreáticas e peritoneais estão associadas com a ascite maligna. Em alguns estudos, até 15% de todos os pacientes com cânceres gastrintestinais desenvolvem ascite maligna em algum estágio de sua doença (Smith, E.M. et al., 2003, Clin. Oncol. (R. Coll. Radiol.) 15:59-72; Koppe, M.J. et al., 2006, Ann. Surg. 243:21222). Embora o câncer de ovário epitelial é responsável por 25% (22.240 casos novos, 14.030 mortes por ano nos Estados Unidos) de todos os cânceres do trato genital feminino, dois terços dessas pacientes desenvolvem ascite maligna (Eskander, R.N. et al., 2012, Int. J. Womens Health 4:395-404).
[000407] Também os tumores extra-abdominais, por exemplo, câncer de mama, cânceres de pulmão e linfoma, são conhecidos por causar ascite maligna. Em até 20% de todos os pacientes com ascite maligna, o local do tumor primário é desconhecido (Saif, M.W. et al., 2009, Ann. Saudi Med. 29: 369-77).
[000408] De acordo com o estudo multicêntrico de evolução da carcinomatose peritoneal (EVOCAPE), a ascite maligna é um fator de prognóstico adverso, resultando em uma sobrevida mediana de alguns meses (Sadeghi, B. et al, 2000, Cancer 88:358-63). Não existem terapias curativas, enquanto os tratamentos paliativos são inadequados, muitas vezes levando a uma morte dolorosa (Sangisetty, S.L. et al., 2012, World J. Gastrointest. Surg. 4:87-95; Sugarbaker, P.H. et al., 2006, Ann. Surg. Oncol. 13:635-44).
Experiência anterior com radioimunoterapia compartimentai (cRIT)
[000409] Uma abordagem para a ascite maligna e a carcinomatose LM é a radioimunoterapia compartimental (cRIT), onde os anticorpos radiomarcados são injetados diretamente no compartimento (cavidade peritoneal ou espaço CSF) para alvejar a radiação para os tumores. A administração intraperitoneal do anticorpo 90Y-CC49 (anti-TAG-72 de camundongo, < 24 mCi/m2) (Alvarez, R.D. et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8: 2806-11) e do anticorpo 90Y-HMFG1 (anti-MUC1 de camundongo, 666 MBq/m2) (Verheijen, R.H. et al., 2006, J. Clin. Oncol. 24: 571-8) foi tolerada pelos pacientes com câncer de ovário recorrente, embora o estudo não mostrou nenhuma evidência de ganho de sobrevivência. A administração intratecal e intraventricular para o tratamento da carcinomatose LM e terapia intra-tumoral de tumores cerebrais malignos usando o anticorpo 131I-816 (MAb anti-tenascina) prolongou a sobrevida do paciente (Reardon et al., 2006, J. Clin. Oncol. 24:115-22; Reardon, D.A. et al., 2008, Neuro. Oncol. 10:182-9). O uso do anticorpo At-81C6 é um exemplo de terapia de partícula □ para a doença residual mínima no glioma maligno (Zalutsky, M.R. et al., 2008, J. Nucl. Med. 49:30-8).
O compartimento do CSF é idealmente adequado para o cRIT alcançar um índice terapêutico altamente favorável
[000410] O espaço do CSF (saco tecal) tem características únicas apropriadas para o cRIT: (1) a barreira hematoencefálica (BBB) evita a recirculação do MAb; (2) comparado ao sangue, o CSF tem poucos leucócitos e, portanto, nenhum FcR(N) e ~ 1000 vezes menos IgG (Davson, H., Segal MB: Physiology of the CSF and blood-brain barriers. Boca Raton, FL, CRC Press, 1996, pp 489-523). (3) O MAb injetado no compartimento CSF é melhor protegido da imunidade do hospedeiro, com menos sequestro pelos receptores Fc ou degradação por enzimas; (4) o teor de proteínas 200 vezes menor de CSF (em comparação com o soro) facilita a ligação do MAb ao alvo tencionado; (5) como o volume de CSF é pequeno (140 mL), o MAb alcança uma concentração compartimental muito elevada; (6) o compartimento CSF é renovado a cada 7 a 8 horas, proporcionando uma etapa de lavagem interna; (7) o fluxo de CSF pode ser reduzido farmacologicamente, permitindo mais tempo de reação do MAb; (8) a aparente ausência de uma barreira anatômica facilita o movimento do MAb entre o CSF e o espaço extracelular do cérebro (Davson H, Segal MB: Physiology of the CSF and blood-brain barriers. Boca Raton, FL, CRC Press, 1996, pp 489523; Spector, R., Mock D.M., 1988, Neurochem. Res. 13:213-9) especialmente se há danos nas meninges, causados por tumor ou por cirurgia.
Metástase do neuroblastoma no SNC
[000411] A metástase de neuroblastoma ao SNC foi considerada rara. Em uma análise retrospectiva de 61 pacientes com neuroblastoma metastático ao SNC no Centro de Câncer Memorial Sloan Kettering, na última década, 34 pacientes com SNC NB (com nenhuma evidência de doença óssea no crânio) tiveram a doença MYCN amplificada, enquanto 9 tinham uma punção lombar no diagnóstico inicial, ambos sendo conhecidos fatores de risco (Kramer, K. et al., 2001, Cancer 91:1510-9). Dois pacientes apresentavam a doença CNS na apresentação inicial do NB, ambos com dores de cabeça e pressão intracraniana elevada, exigindo implantes. 57 pacientes tinham CNS NB dos 5 aos 61 meses (mediana de 21,7) do diagnóstico, mediana de 18,5 meses no grupo MYCN amplificado. Quarenta pacientes (68%) tinham reincidência isolada no SNC, incluindo 26 (44%) com um único foco parenquimatoso. A propagação leptomeníngea ocorreu em 19 pacientes (32%), o restante tendo doença multifocal. Como a história natural do NB mudou, a reincidência isolada no SNC tornou a cura evasiva, afligindo agora > 20% dos pacientes no MSKCC cuja doença sistêmica havia sido "erradicada" (Cheung, N.K et al., 2012, J. Clin. Oncol. 30: 3264-70). As modalidades de tratamento convencional, incluindo ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, não melhoraram o resultado do paciente (Caussa, L. et al., 2010, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 79(1):214-9; Croog, V.J. et al., 2010, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 78(3): 849-54).
cRIT do câncer metastático para o sistema nervoso central em um estudo de fase I/II usando Intra-Ommaya 131I-8H9
[000412] O primeiro em uso humano do anticorpo monoclonal 131I intratecal foi testado com êxito em um ensaio clínico de fase I, com perfil de toxicidade e resultados com o paciente favoráveis (Kramer, K. et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25:5465-70). Usando esta plataforma, o 131I-8H9 foi testado em um estudo de fase I/II. Os pacientes foram estudados com SPECT (tomografia computadorizada por emissão de fóton único) depois de receber 2 mCi de 131I-8H9, ou PET (tomografia por emissão de pósitrons) depois de receber 124I-8H9 injetado através de um reservatório de Ommaya. Amostras de sangue e CSF em série foram coletadas durante 48 horas para fins de cálculos de dosimetria. Os exames SPECT ou PET foram obtidos em cerca de 4, 24 e 48 horas. O cérebro e a medula espinham MR, bem como a citologia CSF, foram obtidos antes de e 4 semanas após a injeção. Uma segunda injeção de 131I-8H9 foi dada, a menos que os pacientes desenvolveram a doença progressiva. Os efeitos colaterais agudos incluíram febre em grau 1 ou 2, dor de cabeça ou vômitos e elevação transitória ocasional de ALT grau 3. A dose de radiação média calculada para o CSF foi 36,3 (faixa de 12,8 a 106) cGy/mCi; a dose média sanguínea foi 2,5 cGy/mCi. O 124I- 8H9/PET proporcionou imagens de alta resolução de distribuição de fármaco dentro do espaço do CSF e correlacionou bem com a dose prevista administrada pela terapia com 131I-8H9. A resposta radiográfica da doença LM foi observada; os efeitos colaterais agudos eram limitados. O 131I-8H9 Intra-Ommaya parece ser relativamente seguro, tem uma razão terapêutica favorável e, diferente da toxicidade medular, o MTD ainda não foi atingido (80 mCi por dose).
Sobrevivência prolongada para pacientes com neuroblastoma no SNC (Kramer K et al., J Neurooncol 97:409-18, 2010; Kramer K et al., Advances in Neuroblastoma Research A-0241, 2014)
[000413] Pacientes no Memorial Sloan Kettering Cancer Center passaram por um regime de recuperação do SNC À base de temozolamida/irinotecano, incorporando cRIT usando 131I-8H9 (n = 37) e 131I-3F8 (n = 5), e mais a imunoterapia sistêmica usando 3F8 + GMCSF (fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos) (Gp1). Os tratamentos de não regime usaram outras terapias +/- cRIT (Gp2, todos os 131I-8H9). A avaliação de doença incluiu MR em série do cérebro/medula espinhal, MIBG, CT e medulas ósseas. Dos 83 pacientes com CNS NB, o cRIT foi possível em 56 (67%), 42 (51%) seguindo o regime de salvamento (Gp1), 33% apresentando várias massas parenquimatosas +/- a doença leptomeníngea. No Gp1, 26/42 (62%) dos pacientes estão vivos e bem, com a sobrevivência geral média de (OS) 82,6 meses, incluindo 5/14 (35%) com doença leptomeníngea ou várias massas parenquimatosas; 3/42 (7%) mortes ocorreram devido a complicações não-NB. O OS para os pacientes Gp2 foi 15% (média de 21 meses). Os únicos sobreviventes em longo entre os pacientes Gp2 incluíam 7 que recebem cRIT (OS média de 42,8 meses). Como um todo, 47 pacientes (56%) morreram de NB envolvendo apenas o SNC (n = 12, 25%) apenas sistêmico (n = 14, 30%), o SNC e o sistêmico (n = 16, 34%) ou por toxicidade (n = 5, 11%). A toxicidade relacionada ao tratamento incluiu hemorragia do SNC (1) e insuficiência pulmonar durante a quimioterapia (1). As mortes nos sobreviventes de longo prazo incluíram infecção (1), fibrose pulmonar (1) e AML (1). A radionecrose foi rara. (Kramer, K. et al., 2014, Advances in Neuroblastoma Research A-0246). Esta é uma melhoria significativa na sobrevivência para os pacientes tratados com cRIT em sua primeira reincidência no SNC. O regime de cRIT foi bem tolerado por pacientes jovens, apesar de seu histórico prévio de terapias citotóxicas intensivas. Ele tem o potencial para aumentar a sobrevida com qualidade de vida melhor do que a esperada.
cRIT intraperitoneal (IP) com 131I-8H9 (Modak, MJ et al., ASCO Annual Meeting, J Clin Oncol 2013)
[000414] Um estudo de fase I do cRIT intraperitoneal (IP) com 131I-8H9 para pacientes com tumores desmoplásicos de pequenas células redondas (DSRCT) e outros tumores sólidos envolvendo o peritônio está perto de ser concluído em crianças e jovens adultos (clinicaltrials.gov NCT01099644). O DSRCT. um raro sarcoma de adolescentes e jovens adultos, geralmente decorrente do peritônio, é letal em > 80% dos pacientes, apesar da terapia agressiva multimodalidade. As recorrências muitas vezes se apresentam como implantes peritoneais multifocais, tornando-se excepcionalmente adequadas para o alvejamento IP. O cRIT IP, em virtude do tempo de residência prolongado e da transferência lenta/incompleta para a circulação, pode seletivamente alvejar a doença IP, minimizando com isso a toxicidade do órgão. Neste estudo, grupos de 3 a 6 pacientes foram tratados com 131I-8H9 em doses escaladas de 30 mCi/m2 a 60 mCi/m2 como uma única injeção IP. Uma dose de marcador de 2 mCi de 124I-8H9 foi administrada IP antes do 131I-8H9 para obter as imagens PET e dados de biodistribuição. A farmacocinética (PK) foi estudada coletas de sangue em série. 15 pacientes que foram anteriormente pesadamente tratados foram tratados (dos quais 13 tinham TDCRP e 2 tinham rabdomiossarcoma) receberam 30, 40 ou 50 mCi/m2 131I-8H9 (3 em cada nível de dose) ou 60 mCi/m2 (n = 6). A toxicidade limitante da dose não foi observada. Três toxicidades de grau 3 transitórias, autolimitantes e possivelmente relacionadas com a terapia foram notadas em 3 pacientes, que foram neutropenia, elevação do nível de transaminase hepática e trombocitopenia, respectivamente. Nenhum paciente precisou de resgate de células-tronco hematopoiéticas. A meia-vida sanguínea foi de 32,5 ± 11,5 h (n = 12) e o tempo de residência médio no peritôneo foi 14,6 h (n = 3). A dose média absorvida para o sangue com base na amostragem sanguínea foi 0,56 ± 0,21 rad/mCi (n = 14). As doses médias absorvidas (rad/mCi) para o rim, fígado, pulmão e baço foram 1,72, 1,92, 0,64 e 1,03, respectivamente (n = 3). A desalogenação foi insignificante: > 80% de iodo permaneceu ligado à proteína no sangue (n = 10). 6/7 pacientes com DSRCT tratados sem doença avaliável permanecem em remissão em uma média de 11,1 meses após o 131I-8H9. O cRIT usando IP 131I-8H9 era seguro e o 124I- 8H9 forneceu dados valiosos de PK e dosimetria. Como a dose tolerada máxima não foi atingida, o aumento do paciente foi expandido até tratar 90 mCi/m2.
Administração aumentada por convecção (CED) de 124I-8H9 para pacientes com gliomas pontinos difusos não progressivos previamente tratados com terapia de radiação de feixe externo (Clinicaltrials.gov NCT01502917)
[000415] O glioma pontino difuso (DPG) na infância é uma condição uniformemente letal com uma expectativa de vida mediana de apenas 8 a 10 meses a partir do diagnóstico. (Dunkel, I.J. et al., 1998, J. Neurooncol. 37:67-73; Kaplan, A.M et al., 1996, Pediatr. Neurosurg. 24:185-92). Apesar dos ensaios clínicos inovadores, incluindo radioterapia hiperfracionada e quimioterapia de alta dose, a sobrevida dos pacientes com DPG não mudou. CED, também conhecida como infusão intersticial, é um modo de administração de fármaco local que se baseia em um gradiente dependente de pressão para aumentar a dispersão uniforme do infusado e o volume de distribuição. (Laske, D.W. et al., 1997, J. Neurosurg. 87:586-94; Morrison, P.F. et al., 1994, Am. J. Physiol. 266: R292-305). Uma cânula de pequeno calibre é colocada de forma estereotáxica no parênquima ou tumor, e o infusado é administrado a uma taxa lenta e constante. Isso evita a BBB, que representa um obstáculo natural à alta concentração regional e distribuição dos agentes terapêuticos administrados sistemicamente no cérebro. No caso do DPG, onde a BBB está em grande parte intacta, terapias anticâncer administradas oralmente ou por via sistênica têm penetrância limitada no SNC. Estudos pré-clínicos mostraram que o CED do 8H9 no tronco cerebral de roedores era seguro. (Luther, N. et al., 2008, Neurosurgery 63:1166-74; Occhiogrosso, G. et al., 2003, Neurosurgery 52:388-94; Luther, N. et al., 2014, Neuro. Oncol., impresso). Além disso, o CED intratumoral do 8H9 (Luther, N. et al., 2008, Neurosurgery 63:1166-74) ou a sua imunotoxina (exotoxina de pseudomonas 8H9) (Luther, N. et al., 2010, Mol. Cancer. Ther. 9:103946) em xenoenxertos U87 imunorreativos no cérebro de rato, também foi considerado seguro, com uma distribuição semelhante à que foi encontrada em cérebros virgens. Finalmente, o 124I-8H9 foi bem tolerado no roedor, bem como no tronco cerebral de primatas após a infusão intersticial (Luther, N. et al., 2014, Neuro. Oncol., impresso). Aumentando a dose ou o volume de infusão de anticorpos, o volume de distribuição de 8H9 pode aumentar. O 124I-8H9 é um agente teranóstico ideal para fins de dosimetria e terapia. No ensaio clínico de fase I, os pacientes com DIPG que se submeteram à terapia de radiação de feixe externo como parte do padrão de atendimento receberam CED de 124I- 8H9 com 4 níveis de doses (0,25, 0,5, 0,75 e 1 mCi/injeção) com 3 a 6 pacientes em cada grupo. A 1 mCi/injeção, o MTD não foi atingido. Por PET, o 124I-8H9 mostrou uma excelente localização do tumor. Não há complicações do CED, bem como nenhuma toxicidade significativa (> grau 2) observada. Os pacientes tratados com os níveis mais elevados de dose de 124I-8H9 sobreviveram além do tempo médio histórico até a morte. O ensaio está sendo alterado para continuar a aumentar a dose com 3 níveis de dose adicionais (2,5, 3,5 e 4 mCi). O CED do 8H9 radiomarcado pode ser aplicado a outros tumores cerebrais infiltrativos primários ou metastáticos.
EQUIVALENTES E ESCOPO
[000416] As pessoas versadas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de reconhecer usando no máximo a experimentação de rotina, vários equivalentes das modalidades específicas descritas neste documento. O escopo da presente invenção não pretende limitar-se à descrição acima, mas sim, a tal como está estabelecido nas reivindicações em anexo.
[000417] Nas reivindicações, os artigos como "um", "uma" e "o/a" podem significar um ou mais de um, a menos que seja indicado ao contrário ou se, de outro modo, for evidente a partir do contexto. As reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais um ou todos os membros do grupo estiverem presentes em, forem utilizados em ou, de outro modo, forem relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que seja indicado de outra forma ou, de outro modo, for evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo está presente em, é utilizado em ou é, de outro modo, relevante para um determinado produto ou processo. A invenção inclui modalidades em que mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes, são utilizados em ou, de outro modo, são relevantes para um determinado produto ou processo. Além disso, deve ser compreendido que a invenção engloba todas as variações, combinações e permutações em que uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos, etc., de uma ou mais das reivindicações listadas é/são introduzido(s) em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para incluir uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação base. Além disso, onde as reivindicações citam uma composição, deve-se compreender que os métodos de uso da composição para qualquer uma das finalidades divulgadas nesse documento estão incluídos, e os métodos de fazer a composição de acordo com qualquer um dos métodos de fabricação aqui divulgados, ou outros métodos conhecidos na técnica estão incluídos, a menos que seja indicado de outra forma ou a menos que seja evidente para uma pessoa normalmente versada na técnica que uma contradição ou inconsistência pode surgir.
[000418] Onde os elementos são apresentados como listas, por exemplo, no formato de grupo Markush, deve-se compreender que cada subgrupo dos elementos também é divulgado, e que qualquer/quaisquer elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo. Deve-se compreender que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, é (são) designados compreendendo elementos particulares, características, etc, certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em tais elementos, características, etc. Para fins de simplicidade, essas encarnações não foram especificamente definidas in haec verba nesse documento. Nota- se que o termo "compreendendo" destina-se a ser aberto e permite a inclusão de elementos ou etapas adicionais.
[000419] Onde os intervalos são informados, os pontos extremos estão incluídos. Além disso, deve-se compreender que, a menos que seja indicado de outra forma ou que seja, de outro modo, evidente a partir do contexto e do entendimento de uma pessoa normalmente versada na técnica, os valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor específico ou subfaixa dentro das faixas declaradas em diferentes modalidades da invenção, ao décimo da unidade do limite inferior da faixa, e a menos que o contexto claramente diga de outra forma.
[000420] Além disso, deve-se compreender que qualquer modalidade particular da presente invenção que se enquadre na técnica anterior pode ser explicitamente excluída qualquer uma ou mais das reivindicações. Como tais modalidades são consideradas como sendo conhecidas pela pessoa normalmente versada na técnica, elas podem ser excluídas, mesmo se a exclusão não for explicitamente definida nesse documento.
[000421] As publicações discutidas acima e neste texto são fornecidas unicamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada na presente invenção deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antedatar tal divulgação em virtude da invenção da técnica anterior.
[000422] As pessoas versadas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de reconhecer usando no máximo a experimentação de rotina, vários equivalentes das modalidades específicas descritas neste documento. O escopo da presente invenção não pretende limitar-se à descrição acima, mas sim, a tal como está estabelecido nas reivindicações a seguir.
REFERÊNCIAS
[000423] I, Coukos G, Dranoff G: Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480:480-9, 2011
[000424] Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM: Targeting the PD-1/B7- H1(PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr. Opin. Immunol. 24:207-12, 2012
[000425] Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et al: Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N. Engl. J. Med., 2012
[000426] Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al: Safety and Activity of Anti-PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer. N. Engl. J. Med., 2012
[000427] Romagne F, Andre P, Spee P, et al: Preclinical characterization of 1-7F9, a novel human anti-KIR receptor therapeutic antibody that augments natural killer-mediated killing of tumor cells. Blood 114:2667-77, 2009
[000428] Godal R, Bachanova V, Gleason M, et al: Natural killer cell killing of acute myelogenous leukemia and acute lymphoblastic leukemia blasts by killer cell immunoglobulin-like receptor-negative natural killer cells after NKG2A and LIR-1 blockade. Biol. Blood Marrow Transplant 16:612-21, 2010
[000429] Tarek N, Gallagher MM, Zheng J, et al: Unlicensed natural killer cells dominate neuroblastoma killing in the presence of anti-GD2 monoclonal antibody. J. Clin. Invest. (impresso), 2012
[000430] Zhao XW, van Beek EM, Schornagel K, et al: CD47-signal regulatory protein-alpha (SIRPalpha) interactions form a barrier for antibody-mediated tumor cell destruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:18342-7, 2011
[000431] Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al: CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138:286-99, 2009
[000432] Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, et al: Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 71:1374-84, 2011
[000433] Chao MP, Jaiswal S, Weissman-Tsukamoto R, et al: Calreticulin is the dominant pro-phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47. Sci. Transl. Med. 2:63ra94, 2010
[000434] Chao MP, Alizadeh AA, Tang C, et al: Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell 142:699-713, 2010
[000435] Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, et al: The CD47- signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:6662-6667, 2012
[000436] Wilcox RA, Ansell SM, Lim MS, et al: The B7 Homologues and their Receptors in Hematologic Malignancies. Eur . J. Haematol., 2012
[000437] Chapoval AI, Ni J, Lau JS, et al: B7-H3: a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gamma production. Nat. Immunol. 2:269-74, 2001
[000438] Steinberger P, Majdic O, Derdak SV, et al: Molecular characterization of human 4Ig-B7-H3, a member of the B7 family with four Ig-like domains. J. Immunol. 172:2352-9, 2004
[000439] Sun M, Richards S, Prasad DV, et al: Characterization of mouse and human B7-H3 genes. J. Immunol. 168:6294-7, 2002
[000440] Suh WK, Gajewska BU, Okada H, et al: The B7 family member B7-H3 preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses. Nat. Immunol. 4:899-906, 2003
[000441] Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, et al: Identification of 4Ig-B7-H3 as a neuroblastoma-associated molecule that exerts a protective role from an NK cell-mediated lysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12640-5, 2004
[000442] Roth TJ, Sheinin Y, Lohse CM, et al: B7-H3 ligand expression by prostate cancer: a novel marker of prognosis and potential target for therapy. Cancer Res. 67:7893-900, 2007
[000443] Zang X, Thompson RH, Al-Ahmadie HA, et al: B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:19458-63, 2007
[000444] Crispen PL, Sheinin Y, Roth TJ, et al: Tumor cell and tumor vasculature expression of B7-H3 predict survival in clear cell renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res. 14:5150-7, 2008
[000445] Boorjian SA, Sheinin Y, Crispen PL, et al: T-cell coregulatory molecule expression in urothelial cell carcinoma: clinicopathologic correlations and association with survival. Clin. Cancer Res. 14:4800-8, 2008
[000446] Zang X, Sullivan PS, Soslow RA, et al: Tumor associated endothelial expression of B7-H3 predicts survival in ovarian carcinomas. Mod. Pathol. 23:1104-12, 2010
[000447] Lemke D, Pfenning PN, Sahm F, et al: Costimulatory protein 4IgB7H3 drives the malignant phenotype of glioblastoma by mediating immune escape and invasiveness. Clin. Cancer Res. 18:105-17, 2012
[000448] Wang L, Zhang Q, Chen W, et al: B7-H3 is overexpressed in patients suffering osteosarcoma and associated with tumor aggressiveness and metastasis. PLoS One 8:e70689, 2013
[000449] Yamato I, Sho M, Nomi T, et al: Clinical importance of B7-H3 expression in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer 101:1709-16, 2009
[000450] Gregorio A, Corrias MV, Castriconi R, et al: Small round blue cell tumours: diagnostic and prognostic usefulness of the expression of B7-H3 surface molecule. Histopathology 53:73-80, 2008
[000451] Sun X, Vale M, Leung E, et al: Mouse B7-H3 induces antitumor immunity. Gene Ther. 10:1728-34, 2003
[000452] Wu CP, Jiang JT, Tan M, et al: Relationship between costimulatory molecule B7-H3 expression and gastric carcinoma histology and prognosis. World J. Gastroenterol. 12:457-9, 2006
[000453] Loos M, Hedderich DM, Ottenhausen M, et al: Expression of the costimulatory molecule B7-H3 is associated with prolonged survival in human pancreatic cancer. BMC Cancer 9:463, 2009
[000454] Hofmeyer KA, Ray A, Zang X: The contrasting role of B7-H3. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:10277-8, 2008
[000455] Vigdorovich V, Ramagopal UA, Lazar-Molnar E, et al: Structure and T cell inhibition properties of B7 family member, B7-H3. Structure 21:707-17, 2013
[000456] Zhou Z, Luther N, Ibrahim GM, et al: B7-H3, a potential therapeutic target, is expressed in diffuse intrinsic pontine glioma. J. Neurooncol. 111:257-64, 2013
[000457] Calabro L, Sigalotti L, Fonsatti E, et al: Expression and regulation of B7-H3 immunoregulatory receptor, in human mesothelial and mesothelioma cells: immunotherapeutic implications. J. Cell Physiol. 226:2595-600, 2011
[000458] Modak S, Kramer K, Gultekin SH, et al: Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors. Cancer Res. 61:4048-54, 2001
[000459] Xu H, Cheung IY, Guo HF, et al: MicroRNA miR-29 modulates expression of immunoinhibitory molecule B7-H3: potential implications for immune based therapy of human solid tumors. Cancer Res. 69:6275-81, 2009
[000460] Modak S, Guo HF, Humm JL, et al: Radioimmunotargeting of human rhabdomyosarcoma using monoclonal antibody 8H9. Cancer Biother. Radiopharm. 20:534-46, 2005
[000461] Luther N, Cheung NK, Dunkel IJ, et al: Intraparenchymal and intratumoral interstitial infusion of anti-glioma monoclonal antibody 8H9. Neurosurgery 63:1166-74; discussion 1174, 2008
[000462] Juhl H, Petrella EC, Cheung NK, et al: Additive cytotoxicity of different monoclonal antibody-cobra venom factor conjugates for human neuroblastoma cells. Immunobiology 197:444-59, 1997
[000463] Onda M, Wang QC, Guo HF, et al: In vitro and in vivo cytotoxic activities of recombinant immunotoxin 8H9(Fv)-PE38 against breast cancer, osteosarcoma, and neuroblastoma. Cancer Res. 64:1419-24, 2004
[000464] Luther N, Cheung NK, Souliopoulos EP, et al: Interstitial infusion of glioma-targeted recombinant immunotoxin 8H9scFv-PE38. Mol. Cancer Ther. 9:1039-46, 2010
[000465] Cheung NK, Guo HF, Modak S, et al: Anti-idiotypic antibody facilitates scFv chimeric immune receptor gene transduction and clonal expansion of human lymphocytes for tumor therapy. Hybrid Hybridomics 22:209-18, 2003
[000466] Kramer K, Modak S, Kushner BH, et al: Radioimmunotherapy of metastatic cancer to the central nervous system: Phase I study of intrathecal 131I-8H9. American Association for Cancer Research LB-4 (Presentation), 2007
[000467] Kramer K, Kushner BH, Modak S, et al: Effective Intrathecal Radioimmunotherapy-Based Salvage Regimen for Metastatic Central Nervous System (CNS) Neuroblastoma (NB). Apresntado no ISPNO 2008, 2008
[000468] Kramer K, Kushner BH, Modak S, et al: Compartmental intrathecal radioimmunotherapy: results for treatment for metastatic CNS neuroblastoma. J. Neurooncol. 97:409-18, 2010
[000469] Loo D, Alderson RF, Chen FZ, et al: Development of an Fc- enhanced anti-B7-H3 monoclonal antibody with potent antitumor activity. Clin. Cancer Res. 18:3834-45, 2012
[000470] Cheung NK, Guo H, Hu J, et al: Humanizing murine IgG3 anti-GD2 antibody m3F8 substantially improves antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity while retaining targeting in vivo. OncoImmunology 1:477-486, 2012
[000471] Zhao Q, Feng Y, Zhu Z, et al: Human monoclonal antibody fragments binding to insulin-like growth factors I and II with picomolar affinity. Mol. Cancer Ther. 10:1677-85, 2011
[000472] Cheung, I. Y., Farazi, T. A., Ostrovnaya, I., et al: Deep MicroRNA sequencing reveals downregulation of miR-29a in neuroblastoma central nervous system metastasis. Genes, chromosomes & cancer 53:803-814, 2014
[000473] Chen, R., Li, L., e Weng, Z.: ZDOCK: an initial-stage protein-docking algorithm. Junho de 52; 80-87: 2003].
[000474] Sanchez, R., e Sali, A.: Evaluation of comparative protein structure modeling by MODELLER-3. Proteins Suppl. 1:50-58, 1997
[000475] Rocchia, W., Sridharan, S., Nicholls, A. et al: Rapid grid based construction of the molecular surface and the use of induced surface charge to calculate reaction field energies: Applications to the molecular systems and geometric objects. J. Comput. Chem. 23:128137, 2002
[000476] Salacinski, P. R., McLean, C., Sykes, J. E. et al: Iodination of proteins, glycoproteins, and peptides using a solid-phase oxidizing agent, 1,3,4,6-tetrachloro-3 alpha,6 alpha-diphenyl glycoluril (Iodogen). Analytical biochemistry 117:136-146, 1981
[000477] Harlow, E., e Lane, D., 1999, Using antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
[000478] Ahmed, M., Hu, J., e Cheung, N. K.: Structure Based Refinement of a Humanized Monoclonal Antibody That Targets Tumor Antigen Disialoganglioside GD2. Frontiers in immunology 5:372, 2014
[000479] Zhao, Q., Ahmed, M., Tassev, D. V. et al: Affinity maturation of T-cell receptor-like antibodies for Wilms tumor 1 peptide greatly enhances therapeutic potential. Leukemia , 2015
[000480] Zhao, Q., Ahmed, M., Guo, H. F., Cheung, I. Y., e Cheung, N. K.: Alteration of Electrostatic Surface Potential Enhances Affinity and Tumor Killing Properties of Anti-ganglioside GD2 Monoclonal Antibody hu3F8. J. Biol. Chem. 290:13017-13027, 2015
[000481] Lin, D. Y., Tanaka, Y., Iwasaki, M. et al: The PD-1/PD-L1 complex resembles the antigen-binding Fv domains of antibodies and T cell receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:3011-3016, 2008
[000482] Lazar-Molnar, E., Yan, Q., Cao, E. et al: Crystal structure of the complex between programmed death-1 (PD-1) and its ligand PD-L2. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 105:10483-10488, 2008
[000483] Stamper, C. C., Zhang, Y., Tobin, J. F. et al: Crystal structure of the B7-1/CTLA-4 complex that inhibits human immune responses. Nature 410:608-611, 2001
[000484] Schwartz, J. C., Zhang, X., Fedorov, A. A. et al: Structural basis for co-stimulation by the human CTLA-4/B7-2 complex. Nature 410:604-608, 2001
[000485] Maher EA, Mietz J, Arteaga CL, et al: Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Res. 69:601520, 2009
[000486] Grossman SA, Spence A: NCCN clinical practice guidelines for carcinomatous/lymphotous meningitis. Oncology 13:144-152, 1999
[000487] Bruno MK, Raizer J: Leptomeningeal metastases from solid tumors (meningeal carcinomatosis). Cancer Treat. Res. 125:31-52, 2005
[000488] Gleissner B, Chamberlain MC: Neoplastic meningitis. Lancet Neurol. 5:443-52, 2006
[000489] Wasserstrom WR, Glass JP, Posner JB: Diagnosis and treatment of leptomeningeal metastases from solid tumors: experience with 90 patients. Cancer 49:759-72, 1982
[000490] Balm M, Hammack J: Leptomeningeal carcinomatosis. Presenting features and prognostic factors. Arch. Neurol. 53:626-32, 1996
[000491] Chamberlain MC: Neoplastic meningitis. J. Clin. Oncol. 23:3605-13, 2005
[000492] Freilich RJ, FRACP, Krol G, et al: Neuroimaging and Cerebrospinal Fluid Cytology in the Diagnosis of Leptomeningeal Metastasis. Annals of Neurology 38:51-57, 1995
[000493] Posner JB: Neurologic Complications of Cancer, Comtemporary neurology series. Philadelphia, F.A. Davis Company, 1995
[000494] Littman P, Coccia P, Bleyer WA, et al: Central nervous system (CNS) prophylaxis in children with low risk acute lymphoblastic leukemia (ALL). Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 13:1443-9, 1987
[000495] Grossman SA, Moynihan TJ: Neoplastic meningitis. Neurol. Clin. 9:843-56, 1991
[000496] Holm-Nielsen P: Pathogenesis of ascites in peritoneal carcinomatosis. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 33:10-21, 1953
[000497] Sangisetty SL, Miner TJ: Malignant ascites: A review of prognostic factors, pathophysiology and therapeutic measures. World J. Gastrointest. Surg. 4:87-95, 2012
[000498] Smith EM, Jayson GC: The current and future management of malignant ascites. Clin. Oncol. (R. Coll. Radiol.) 15:59-72, 2003
[000499] Koppe MJ, Boerman OC, Oyen WJ, et al: Peritoneal carcinomatosis of colorectal origin: incidence and current treatment strategies. Ann. Surg. 243:212-22, 2006
[000500] Eskander RN, Tewari KS: Emerging treatment options for management of malignant ascites in patients with ovarian cancer. Int. J. Womens Health 4:395-404).
[000501] Saif MW, Siddiqui IA, Sohail MA: Management of ascites due to gastrointestinal malignancy. Ann. Saudi Med. 29:369-77, 2009
[000502] Sadeghi B, Arvieux C, Glehen O, et al: Peritoneal carcinomatosis from non-gynecologic malignancies: results of the EVOCAPE 1 multicentric prospective study. Cancer 88:358-63, 2000
[000503] Sugarbaker PH, Alderman R, Edwards G, et al: Prospective morbidity and mortality assessment of cytoreductive surgery plus perioperative intraperitoneal chemotherapy to treat peritoneal dissemination of appendiceal mucinous malignancy. Ann. Surg. Oncol. 13:635-44, 2006
[000504] Alvarez RD, Huh WK, Khazaeli MB, et al: A Phase I study of combined modality (90)Yttrium-CC49 intraperitoneal radioimmunotherapy for ovarian cancer. Clin. Cancer Res. 8:2806-11, 2002
[000505] Verheijen RH, Massuger LF, Benigno BB, et al: Phase III trial of intraperitoneal therapy with yttrium-90-labeled HMFG1 murine monoclonal antibody in patients with epithelial ovarian cancer after a surgically defined complete remission. J. Clin. Oncol. 24:571-8, 2006
[000506] Reardon DA, Akabani G, Coleman RE, et al: Salvage radioimmunotherapy with murine iodine-131-labeled antitenascin monoclonal antibody 81C6 for patients with recurrent primary and metastatic malignant brain tumors: phase II study results. J. Clin. Oncol. 24:115-22, 2006
[000507] Reardon DA, Zalutsky MR, Akabani G, et al: A pilot study: 131I-antitenascin monoclonal antibody 81c6 to deliver a 44-Gy resection cavity boost. Neuro Oncol. 10:182-9, 2008
[000508] Zalutsky MR, Reardon DA, Akabani G, et al: Clinical experience with alpha-particle emitting 211At: treatment of recurrent brain tumor patients with 211At-labeled chimeric antitenascin monoclonal antibody 81C6. J. Nucl. Med. 49:30-8, 2008
[000509] Davson H, Segal MB: Physiology of the CSF and blood-brain barriers. Boca Raton, FL, CRC Press, 1996, pp 489-523
[000510] Spector R, Mock DM: Biotin transport and metabolism in the central nervous system. Neurochem. Res. 13:213-9, 1988
[000511] Kramer K, Kushner B, Heller G, et al: Neuroblastoma metastatic to the central nervous system. The Memorial Sloan-kettering Cancer Center Experience and A Literature Review. Nature 91:1510-9 (2001)).
[000512] Cheung NK, Cheung IY, Kushner BH, et al: Murine Anti-GD2 Monoclonal Antibody 3F8 Combined With Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and 13-Cis-Retinoic Acid in High-Risk Patients With Stage 4 Neuroblastoma in First Remission. J. Clin. Oncol. 30:3264-70, 2012
[000513] Caussa L, Hijal T, Michon J, et al: Role of Palliative Radiotherapy in the Management of Metastatic Pediatric Neuroblastoma: A Retrospective Single-Institution Study. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2010
[000514] Croog VJ, Kramer K, Cheung NK, et al: Whole Neuraxis Irradiation to Address Central Nervous System Relapse in High-Risk Neuroblastoma. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2010
[000515] Kramer K, Humm JL, Souweidane MM, et al: Phase I study of targeted radioimmunotherapy for leptomeningeal cancers using intra- Ommaya 131-I-3F8. J. Clin. Oncol. 25:5465-70, 2007
[000516] Kramer K, Kushner B, Modak S, et al: Recurrent Neuroblastoma Metastatic to the Central Nervous System: Is it curable? Advances in Neuroblastoma Research 2014:A-0241, 2014
[000517] Kramer K, Kushner B, Modak S, et al: Radionecrosis in Children treated with Conventional Radiation Therapy and Intrathecal Radioimmunotherapy for CNS Neuroblastoma: Is it a Concern? Advances in Neuroblastoma Research 2014:A-0246, 2014
[000518] Modak MJ, LaQuaglia M, Carrasquillo JA, et al: Intraperitoneal radioimmunotherapy (RIT) for desmoplastic small round cell tumor (DSRCT): Initial results from a phase I trial (clinicaltrials.gov NCT01099644), ASCO Annual Meeting 2013, J. Clin. Oncol., 2013
[000519] Dunkel IJ, Garvin JH, Jr., Goldman S, et al: High dose chemotherapy with autologous bone marrow rescue for children with diffuse pontine brain stem tumors. Children's Cancer Group. J. Neurooncol. 37:67-73, 1998
[000520] Kaplan AM, Albright AL, Zimmerman RA, et al: Brainstem gliomas in children. A Children's Cancer Group review of 119 cases. Pediatr. Neurosurg. 24:185-92, 1996
[000521] Laske DW, Morrison PF, Lieberman DM, et al: Chronic interstitial infusion of protein to primate brain: determination of drug distribution and clearance with single-photon emission computerized tomography imaging. J. Neurosurg. 87:586-94, 1997
[000522] Morrison PF, Laske DW, Bobo H, et al: High-flow microinfusion: tissue penetration and pharmacodynamics. Am. J. Physiol. 266:R292-305, 1994
[000523] Occhiogrosso G, Edgar MA, Sandberg DI, et al: Prolonged convection-enhanced delivery into the rat brainstem. Neurosurgery 52:388-93; discussion 393-4, 2003
[000524] Luther N, Zhou Z, Zanzonico P, et al: The potential of theragnostic 124I-8H9 convection-enhanced delivery in diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro Oncol.:in press, 2014
[000525] Compte, M., Nunez-Prado, N., Sanz, L. & Alvarez-Vallina, L. Immunotherapeutic organoids: a new approach to cancer treatment. Biomatter 3, doi:10.4161/biom.23897 (2013).
[000526] Noel, D. et al. In vitro and in vivo secretion of cloned antibodies by genetically modified myogenic cells. Hum. Gene Ther. 8:1219-1229, doi:10.1089/hum.1997.8.10-1219 (1997).
[000527] Noel, D. et al. High in vivo production of a model monoclonal antibody on adenoviral gene transfer. Hum. Gene Ther. 13:1483-1493, doi:10.1089/10430340260185111 (2002).
[000528] Jooss, K. & Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno- associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10:955-963, doi:10.1038/sj.gt.3302037 (2003).
[000529] Xiao, P. J., Lentz, T. B. & Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus: clinical application and development as a genetherapy vector. Therapeutic delivery 3:835-856 (2012).
[000530] Nathwani, A. C. et al. Adenovirus-associated virus vector- mediated gene transfer in hemophilia B. N. Engl. J. Med. 365:23572365, doi:10.1056/NEJMoa1108046 (2011).
[000531] Patel, N., Reiss, U., Davidoff, A. M. & Nathwani, A. C. Progress towards gene therapy for haemophilia B. International journal of hematology 99:372-376, doi:10.1007/s12185-014-1523-0 (2014).
[000532] Fang, J. et al. Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide. Nat. Biotechnol. 23:584-590 (2005).
[000533] Watanabe, M., Boyer, J. L. & Crystal, R. G. Genetic delivery of bevacizumab to suppress vascular endothelial growth factor-induced high-permeability pulmonary edema. Hum. Gene Ther. 20:598-610, doi:10.1089/hum.2008.169 (2009).
[000534] Ho, D. T. et al. Growth inhibition of an established A431 xenograft tumor by a full-length anti-EGFR antibody following gene delivery by AAV. Cancer Gene Ther. 16:184-194, doi:10.1038/cgt.2008.68 (2009).
[000535] Wang, G. et al. Persistent expression of biologically active anti-HER2 antibody by AAVrh.10-mediated gene transfer. Cancer Gene Ther. 17:559-570, doi:10,1038/cgt.2010.11 (2010).
[000536] Vigna, E. et al. "Active" cancer immunotherapy by anti-Met antibody gene transfer. Cancer Res. 68:9176-9183, doi:10.1158/0008- 5472.CAN-08-1688 (2008).
[000537] Balazs, A. B. et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature 481:81-84, doi:10.1038/nature10660 (2012).
[000538] Arafat, W. O. et al. Effective single chain antibody (scFv) concentrations in vivo via adenoviral vector mediated expression of secretory scFv. Gene Ther. 9:256-262, doi:10.1038/sj.gt.3301639 (2002).
[000539] Sanz, L., Kristensen, P., Russell, S. J., Ramirez Garcia, J. R. & Alvarez-Vallina, L. Generation and characterization of recombinant human antibodies specific for native laminin epitopes: potential application in cancer therapy. Cancer Immunol. Immunother. 50:557565 (2001).
[000540] Sanz, L. et al. A novel cell binding site in the coiled-coil domain of laminin involved in capillary morphogenesis. Embo J. 22:1508-1517, doi:10.1093/emboj/cdg150 (2003).
[000541] Sanz, L. et al. Single-chain antibody-based gene therapy: inhibition of tumor growth by in situ production of phage-derived human antibody fragments blocking functionally active sites of cell-associated matrices. Gene Ther. 9:1049-1053, doi:10.1038/sj.gt.3301725 (2002).
[000542] Sanchez-Arevalo Lobo, V. J. et al. Enhanced antiangiogenic therapy with antibody-collagen XVIII NC1 domain fusion proteins engineered to exploit matrix remodeling events. Int. J. Cancer 119:455462, doi:10.1002/ijc.21851 (2006).
[000543] Afanasieva, T. A. et al. Single-chain antibody and its derivatives directed against vascular endothelial growth factor: application for antiangiogenic gene therapy. Gene Ther. 10:1850-1859, doi:10.1038/sj.gt.3302085 (2003).
[000544] Liu, X., Wu, J., Zhang, S., Li, C. & Huang, Q. Novel strategies to augment genetically delivered immunotoxin molecular therapy for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 16:861-872, doi:10.1038/cgt.2009.30 (2009).
[000545] Blanco, B., Holliger, P., Vile, R. G. & Alvarez-Vallina, L. Induction of human T lymphocyte cytotoxicity and inhibition of tumor growth by tumor-specific diabody-based molecules secreted from gene- modified bystander cells. J. Immunol. 171:1070-1077 (2003).
[000546] Compte, M. et al. Inhibition of tumor growth in vivo by in situ secretion of bispecific anti-CEA x anti-CD3 diabodies from lentivirally transduced human lymphocytes. Cancer Gene Ther. 14: 380-388, doi:10.1038/sj.cgt.7701021 (2007).

Claims (14)

1. Agente de anticorpo IgG humanizado, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3, em que o agente de anticorpo inclui um domínio variável de cadeia leve compreendendo CDRL1, CDRL2, e CDRL3 que são representados na SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO .: 36, e SEQ ID NO: 38, respectivamente, e um domínio variável de cadeia pesada compreendendo CDRH1, CDRH2, e CDRH3 que são representados na SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, e SEQ ID NO: 62, respectivamente (numeração de Kabat).
2. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma cadeia leve da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 5 e uma cadeia pesada da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 13; (ii) uma cadeia leve da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 7 e uma cadeia pesada da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 15; ou (iii) uma cadeia leve da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 8 e uma cadeia pesada da imunoglobulina representada na SEQ ID NO: 16.
3. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de imunoglobulina é fundida a um polipeptídeo representado na SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 31.
4. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de anticorpo é conjugado a um agente terapêutico ou agente de detecção, em que o referido agente terapêutico ou agente de detecção: (i) é um radio-isótopo, um conjugado de fármaco, uma nanopartícula, uma imunotoxina, ou qualquer outra carga; ou (ii) é um agente de diagnóstico ou de imagiologia, ou ambos.
5. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de anticorpo é um anticorpo biespecífico.
6. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que possui uma primeira e uma segunda especificidade, e em que a primeira especificidade se liga à proteína 2Ig-B7H3 ou 4Ig-B7H3, e a segunda especificidade se liga a CD3 nas células T ou DOTA.
7. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de anticorpo é um scFv ou um scFv que compreende uma sequência de polipeptídeo representada em uma SEQ ID NO selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, 24, 26 e 27.
8. Agente de anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: (ii) o scFv é fundido a um segundo polipeptídeo representado na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29; (iii) o scFv é conjugado a um agente terapêutico ou agente de detecção; e/ou (iv) o scFv é parte de um receptor de antígeno quimérico.
9. Agente de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: (i) o agente de anticorpo suprime o efeito inibitório de B7H3 na proliferação e/ou função de células T; ou (ii) o agente de anticorpo suprime o efeito inibitório de B7H3 na atividade e/ou função das células NK.
10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um agente de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
11. Uso de: (1) um agente de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para o tratamento de câncer.
12. Uso de um agente de anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para modular o sistema imunológico.
13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o câncer é ou compreende: (i) um neuroblastoma; ou (ii) um câncer cervical.
14. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um agente de anticorpo, como definido na reivindicação 1.
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Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9963509B2 (en) 2014-12-23 2018-05-08 Full Spectrum Genetics, Inc. Anti-B7H3 binding compounds and uses thereof
US10865245B2 (en) 2014-12-23 2020-12-15 Full Spectrum Genetics, Inc. Anti-B7H3 binding compounds and uses thereof
CA2990411A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-b7h3-antibodies
CA3026588A1 (en) * 2016-07-01 2018-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Inhibitory immune receptor inhibition methods and compositions
JP2020505034A (ja) 2017-01-20 2020-02-20 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞表面コンジュゲートならびに関連する細胞組成物および方法
WO2018161872A1 (zh) * 2017-03-06 2018-09-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN109937212B (zh) 2017-03-31 2022-06-21 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
EP3619235A1 (en) 2017-04-11 2020-03-11 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
AU2018265888A1 (en) * 2017-05-12 2019-11-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of anti-B7H3 antibodies for treating cancer in the central nervous system
WO2019024911A1 (zh) * 2017-08-04 2019-02-07 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
CA3073227A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Michael D. Miller Firearm assembly system and method
AU2018328291B2 (en) 2017-09-08 2022-10-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
JP7035299B2 (ja) * 2017-10-26 2022-03-15 イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） カンパニー リミテッド 新規組換融合タンパク質、ならびにその調製および使用
BR112020008512A2 (pt) 2017-10-31 2020-10-06 Pantarhei Bioscience B.V. métodos imunoterapêuticos para tratamento e/ou prevenção do câncer pulmonar
CN109939231A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 关于cd3×b7h3双特异性抗体定向杀伤膀胱癌细胞t24的应用
CN109939126A (zh) * 2017-12-21 2019-06-28 张曼 Cd3×b7h3双特异抗体定向杀伤耐阿霉素膀胱癌细胞pumc-91/adm的应用
KR20200110688A (ko) * 2018-01-15 2020-09-24 스티흐팅 산퀸 불드포르지닝 인자 h 강화 항체 및 이의 사용
EP3740507A4 (en) * 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
WO2019225787A1 (ko) * 2018-05-24 2019-11-28 에이비엘바이오 주식회사 항-b7-h3 항체 및 그 용도
CA3103629A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
WO2020041626A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Affibody proteins specific for b7-h3 (cd276)
WO2020076970A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020103100A1 (en) * 2018-11-22 2020-05-28 Suzhou Kanova Biopharmaceutical Co., Ltd. An anti-b7-h3 antibody
CN114390938A (zh) * 2019-03-05 2022-04-22 武田药品工业有限公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
CN109929039A (zh) * 2019-03-28 2019-06-25 郑州大学第一附属医院 基于cd276抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
US20220235134A1 (en) * 2019-05-28 2022-07-28 Single Cell Technology, Inc. Anti-b7-h3 antibodies
CA3142634A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-b7-h3 antibody and methods of use thereof
KR20210006637A (ko) * 2019-07-09 2021-01-19 주식회사 와이바이오로직스 B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
JP2022541275A (ja) 2019-07-17 2022-09-22 ジェミニ・セラピューティクス・サブ・インコーポレイテッド Ｈ因子増強性抗体及びその使用
EP4022313A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Y-Mabs Therapeutics, Inc. Immunohistochemical assessment of b7-h3 expression
CN110642948B (zh) * 2019-10-09 2021-06-29 达石药业(广东)有限公司 B7-h3纳米抗体、其制备方法及用途
KR20220115572A (ko) * 2019-11-18 2022-08-17 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항-b7-h3 단클론성 항체 및 이의 사용 방법
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
EP4138931A1 (en) * 2020-04-24 2023-03-01 Y-Mabs Therapeutics, Inc. B7h3 antibodies with chelators
CA3178510A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Ahmed Mahiuddin Anti-b7h3 antibodies for the treatment of cancer
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
CN112961241B (zh) * 2020-06-30 2022-04-22 广州百暨基因科技有限公司 抗b7h3抗体及其应用
US11883432B2 (en) 2020-12-18 2024-01-30 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor system with adaptable receptor specificity
EP4257154A1 (en) 2021-02-09 2023-10-11 Medilink Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Bioactive substance conjugate, preparation method therefor and use thereof
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240026507A (ko) 2021-06-29 2024-02-28 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션을 촉진시키도록 엔지니어링된 면역 세포 및 이의 용도
WO2023134716A1 (zh) * 2022-01-14 2023-07-20 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种结合b7h3和nkp30的双特异性抗体及其应用
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
CN116836281A (zh) * 2022-03-25 2023-10-03 英诺湖医药(杭州)有限公司 B7h3抗体及包含其的双功能抗体
WO2023222017A1 (en) * 2022-05-18 2023-11-23 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-b7h3 antibody and uses thereof
WO2024037627A1 (zh) * 2022-08-19 2024-02-22 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种双特异性抗体及其应用
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
CN115819608A (zh) * 2022-10-08 2023-03-21 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种纯化融合蛋白的方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
EP0804070B1 (en) 1993-03-09 2000-05-24 Genzyme Corporation Process of isolation of proteins from milk
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US7737258B2 (en) * 2000-10-18 2010-06-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8414892B2 (en) 2000-10-18 2013-04-09 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US8501471B2 (en) 2000-10-18 2013-08-06 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Uses of monoclonal antibody 8H9
US7666424B2 (en) 2001-10-17 2010-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods of preparing and using single chain anti-tumor antibodies
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP2121008A4 (en) * 2007-03-22 2010-03-31 Sloan Kettering Inst Cancer USES OF MONOCLONAL ANTIBODY 8H9
CA2791658C (en) * 2010-03-04 2019-10-01 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
KR101834026B1 (ko) 2010-06-19 2018-03-02 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 항-ｇｄ2 항체
US9963509B2 (en) * 2014-12-23 2018-05-08 Full Spectrum Genetics, Inc. Anti-B7H3 binding compounds and uses thereof

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