WO2023134716A1

WO2023134716A1 - 一种结合b7h3和nkp30的双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: WO2023134716A1
Application number: PCT/CN2023/071850
Authority: WO
Inventors: 周冲; 姜晓玲; 殷刘松
Original assignee: 盛禾(中国)生物制药有限公司
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2023-01-12
Publication date: 2023-07-20

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种双特异性抗体，包含（a）特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和（b）特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段。具体地，所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为NKP30；或者，所述第一抗原为NKP30，并且所述第二抗原为B7H3。

Description

一种结合B7H3和NKP30的双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结合B7H3和NKP30的双特异性抗体及其应用。

背景技术

2001年，B7H3（CD276）被鉴定为B7家族成员，TLT-2被鉴定为其潜在受体。近年来的研究表明，B7H3既是免疫共刺激分子，又是协同抑制分子，具有抗肿瘤活性，又能引发免疫逃逸。因此，在抗体药物开发上，多运用其肿瘤相关抗原特性，通过ADC药物、ADCC机制等，杀伤高表达B7H3的肿瘤细胞。

Northern印迹分析表明，B7H3 mRNA在肝、小肠、胰腺、睾丸、心脏和结肠等多种正常组织中广泛表达，而在人外周血白细胞中不表达。然而，B7H3蛋白仅在低水平表达，但可通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）或脂多糖（LPS）刺激在B细胞、T细胞、单核细胞或NK细胞中诱导其表达。

可溶性B7H3（sB7H3）已被证明是由单核细胞、树突状细胞（DC）和活化的T细胞释放的。在乳腺癌患者中，B7H3的高表达与肿瘤大小呈负相关。与正常卵巢组织相比，93%的卵巢肿瘤表达B7H3，B7H3的表达与卵巢肿瘤的分期、高复发率和低生存率有关。B7H3在大肠癌中的表达也明显升高，可能参与了大肠癌的发生发展。此外，B7H3蛋白在前列腺癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和胃癌中也有过表达。B7H3在许多肿瘤中的异常表达提示B7H3可能是研究肿瘤发生、发展、诊断和治疗的有用标记物。

因此，我们可以针对B7H3在肿瘤生长、迁移和侵袭方面的生理功能，开发靶向肿瘤微环境中B7H3的ADC药物、ADCC机制抗体药物等，杀伤高表达B7H3的肿瘤细胞。

人NKP30（Natural cytotoxicity triggering receptor 3）蛋白，由NCR3基因编码，属于自然细胞毒性引发受体（NCRs）家族成员，是NK细胞表面的激活型受体。

NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。NKP30表达于所有静息与活化的NK细胞、多种效应NKT细胞、γδT-细胞、MAIT细胞，能激活NK细胞、γδT-细胞等肿瘤杀伤性细胞，进而杀伤肿瘤。

NKP30是杀伤某些肿瘤的主要触发受体，如黑色素瘤MEL15。NKP30也可协同其他激活性受体增强NK细胞的活性。因此，开发靶向肿瘤相关抗原与NKP30的双特异性抗体，桥接肿瘤细胞与NK细胞，仅激活肿瘤微环境中的NK细胞，可能有助于减少副作用，避免因全身性NK细胞的高度活化，降低对丢失MHC分子的异常细胞敏感性。

发明内容

本发明提供了一种双特异性抗体，包含：（a）特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和（b）特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；其中：所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为NKP30；或者，所述第一抗原为NKP30，并且所述第二抗原为B7H3。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和第二抗体或其抗原结合片段包含VHH；其中，所述VHH连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。

在可选的实施方案中，所述的双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个VHH。

在可选的实施方案中，所述的双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个VHH，所述VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。

在可选的实施方案中，所述的双特异性抗体包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个VHH。

在可选的实施方案中，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端；或者，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的C端。

在可选的实施方案中，所述的双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：（a）所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述VHH；和（b）所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链。

在可选的实施方案中，所述的双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，对于所述每条多肽链：（a）所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链；和（b）所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述VHH。

在可选的实施方案中，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。

在可选的实施方案中，所述两个VHH通过Linker分别与所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端连接。

在可选的实施方案中，所述Linker具有如（G ₄S） _x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，x为选自1-3的整数。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。

在可选的实施方案中，第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。

在可选的实施方案中，所述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM。

在可选的实施方案中，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。

在可选的实施方案中，所述Fc区选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG3，或选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG2c。

在可选的实施方案中，所述Fc区选自人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，并且所述VHH特异性结合NKP30，其中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：20所示的HCDR2，如SEQ ID NO：21所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，或为与SEQ ID NO：3具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或为与SEQ ID NO：4具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的IgG1重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或为与SEQ ID NO：5具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的IgG4重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，或为与SEQ ID NO：6具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，或为与SEQ ID NO：7具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在可选的实施方案中，所述VHH的HCDR1选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28的任一氨基酸序列具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的序列；HCDR2选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的任一氨基酸序列具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的序列；HCDR3选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的序列。

在可选的实施方案中，所述VHH的重链可变区VH选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的任一氨基酸序列具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的序列。

在可选的实施方案中，所述VHH为驼源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。

在可选的实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：3所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区VL；
并且，所述VHH包含：（a）如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH；或（b）如SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH。

在可选的实施方案中，所述双特异性抗体的第一多肽链选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的任一氨基酸序列具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列，第二多肽链如SEQ ID NO：11所示，或为与SEQ ID NO：11具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）同一性的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，所述双特异性抗体包含：

（1）如SEQ ID NO：12所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（2）如SEQ ID NO：13所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（3）如SEQ ID NO：14所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（4）如SEQ ID NO：15所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（5）如SEQ ID NO：16所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；或

（6）如SEQ ID NO：17所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链。

本发明还提供了一种编码上述任一项所述的双特异性抗体的核酸。

本发明还提供了一种含上述所述核酸的载体或质粒。

本发明还提供了一种表达上述所述载体或质粒的细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述任一项所述的双特异性抗体以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

本发明还提供了上述任一项所述双特异性抗体的应用，其应用包括：（a）制备治疗肿瘤疾病的药物，所述肿瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、大肠癌、膜腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肺泡横纹肌肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节细胞瘤、髓母细胞瘤、高级别胶质瘤、弥漫性内在脑桥胶质瘤、多层菊形团胚胎性肿瘤中的一种或多种；或（b）制备检测B7H3和/或NKP30分子的试剂或试剂盒。

附图说明

图1：本发明中构建抗体的结构示意图1。

图2：本发明中构建抗体的结构示意图2。

图3：ELISA检测构建抗体对B7H3蛋白的结合活性，其中，阴参为IgG1同型对照；阳参为B7H3嵌合抗体。

图4：ELISA检测构建抗体对NKP30蛋白的结合活性，其中，阴参为IgG1同型对照；阳参为NKP30单抗。

图5：ELISA检测构建抗体可两端结合B7H3蛋白与NKP30蛋白，其中，阴参为IgG1同型对照。

图6：本发明的构建抗体激活NK细胞，分泌IFN-γ的实验结果，其中，阳参为NKP30单抗，阴参为IgG1同型对照。

图7：本发明的构建抗体的浓度对MCF-7细胞裂解率的影响结果。

图8：本发明的构建抗体的浓度对胃癌细胞HS-746T裂解率的影响结果，其中，阴参为IgG1同型对照。

图9：构建抗体的浓度对乳腺癌细胞JIMT-1裂解率的影响结果。

实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例用于描述本发明的一些具体实施方案，而非用于限制本发明的保护范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本申请的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。在矛盾的情况下，以专利说明书为准。

如本文中所用，“抗体”也称为“免疫球蛋白”，其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。抗体存在两种类型的轻链，即λ（l）和κ（k）；存在五种主要的重链种类（或同型），即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其决定抗体分子的功能活性。每条链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，即可变结构域（VL）和恒定结构域（CL）。重链包括四个结构域，即重链可变区（VH）和三个恒定区（CH1、CH2和CH3，统称为CH）。轻链（VL）和重链（VH）的可变区都决定对抗原的结合识别的特异性。轻链的恒定结构域（CL）和重链的恒定区（CH）具有重要的生物学作用如抗体链结合、分泌、补体结合和与Fc受体（FcR）的结合等。抗体的轻链和重链各具有3个CDR，分别称为LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3。常规抗体抗原结合位点因此包括6个CDR，包含来自每个重链和轻链可变区的CDR集合。CDR依据不同的编号系统，可以产生不同的序列。本发明中列举的CDR使用Kabat编号系统标注。

如本文中所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。双特异性抗体可以是异种抗体，例如它们可以是或可以包含两个或更多个连接在一起的抗体或抗原结合片段（例如Fab），其中每个抗体或抗原结合片段具有不同的结合特异性。本发明中，“双特异性抗体”与“双特异性抗原结合蛋白”、“双抗”可以互换使用。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”、“单抗”具有相同的含义，指由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。

如本文中所用，术语“VHH”亦称为重链单域抗体、单域抗体、VHH结构域、VHH抗体片段或VHH抗体，是指只包含一个重链可变区的单一抗原结合多肽。在某些实施例中，VHH指来源于驼源抗体或者鲨鱼抗体的单域抗体，仅有一个重链可变区。在另一些实施例中，VHH指来源于单克隆抗体的重链可变区（VH）的单域抗体，仅有一个重链可变区。

如本文中所用，术语“多肽接头”、“linker”具有相同的含义，通常是指连接或联接两个多肽序列（例如联接两个多肽结构域）的合成氨基酸序列。多肽接头可以通过肽键连接两个氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明中使用的linker为（GGGGS）n，当n=1时，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:9。

如本文中所用，术语“同一性”通常是指两个或多个多核苷酸序列之间或两个或多个多肽序列之间的序列相似性或可交换性。在一些实施方案中，同一性高的多核苷酸是在严格条件下杂交的那些序列，并且相较于那些序列具有至少80%（如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的序列同一性。

如在本文中所用，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移至宿主细胞中和/或在宿主细胞之间转移。该术语可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞的载体，主要用于DNA或RNA的复制的载体，以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种上述功能的载体。“表达载体”是当被引入合适的宿主细胞时可被转录并翻译成多肽的多核苷酸。

如本文中所用，术语“同型对照”是指与实验组抗体相同亚型但与靶点无关的抗体。

实施例1核苷酸序列的获得与优化

本发明中的构建抗体是采用B7H3抗体与NKP30蛋白构建得到的双特异性抗体。B7H3抗体的轻链和重链氨基酸序列信息来源于公开的B7H3靶点单克隆抗体序列信息，分析获得该序列的可变区和恒定区信息（B7H3抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；B7H3抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，IgG1重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，IgG4重链恒定区序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示）。将NKP30（氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2）通过Linker连接至B7H3抗体轻链或重链上的任意位置。根据需要，调整所述抗体氨基酸序列的Fc为其他IgG类型，如IgG1、IgG4等，并进一步在各重链中设计所需形式的氨基酸突变，由此得到目标抗体氨基酸序列，图1与图2列出部分结构示意图，表1为示例结构示意图所构建的双抗组合，其中构建抗体A24、B23、A25、B26的结构如图1所示，C27、D28的结构如图2所示。

表1构建抗体的氨基酸序列组合

构建抗体	第一多肽链的氨基酸序列	第二多肽链的氨基酸序列	VHH的氨基酸序列（NKP30序列）	亚型
B23	SEQ ID NO：12	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：2	IgG4
A24	SEQ ID NO：13	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：2	IgG1
A25	SEQ ID NO：14	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：1	IgG1
B26	SEQ ID NO：15	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：1	IgG4
C27	SEQ ID NO：16	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：1	IgG1
D28	SEQ ID NO：17	SEQ ID NO：11	SEQ ID NO：1	IgG4

采用pcDNA3.1-G418载体作为表达所述构建抗体的轻链和重链的专用载体。pcDNA3.1-G418载体含有重链所使用的启动子CMVPromoter、真核筛选标记G418标签和原核筛选标签Ampicilline。在构建表达载体时，在抗体的重链和轻链的5’端均加上信号肽序列（氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示）。基因合成分别得到抗体表达的重链、轻链编码基因的核苷酸序列，得到目的基因，用HindIII和XhoI对载体和目的基因进行双酶切，回收后通过DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑选出阳性克隆并进行质粒提取和酶切验证，获得含所述抗体重链、轻链编码基因的重组质粒。

实施例3质粒抽提

根据《分子克隆实验指南》（2002年，科学出版社）所述方法，将含有上述各目的基因的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化细菌涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选质粒克隆至液体LB培养基中培养，260rpm摇菌14h，由无内毒素质粒大抽试剂盒抽提质粒，用无菌水溶解并用核酸蛋白定量仪进行浓度测定。

实施例4质粒转染、瞬转表达与抗体纯化

在37℃、8%CO ₂、100rpm下培养ExpiCHO至细胞密度6×10 ⁶个/mL。使用脂质体分别将构建的载体质粒按照质量浓度1:1转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1mg/mL，脂质体配比体系参照ExpiCHO™ExpressionSystem试剂盒确定，在32℃、5%CO ₂，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。将上述培养产物置于离心机中，以4000g转速离心，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化所得的抗体蛋白并收集洗脱液。

ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用GE的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS（pH7.4），细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸（pH3.0）洗脱目的蛋白，利用Tris缓冲液调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于等电点pI1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据SDS-PAGE选择目的蛋白所在的收集管合并保存。然后，将纯化后所得的洗脱液超滤换液至缓冲液中。

实施例5ELISA检测抗体对B7H3的结合活性

采用pH7.4的PBS缓冲液将huB7H3-his（购于ACROBiosystems）稀释至0.5µg/mL，每孔100µL加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。用1%BSA封闭液封闭1小时后。PBST洗板3次后，将纯化得到的抗体用0.5%BSA样品稀释液稀释至10µg/mL，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设IgG1同型对照作为阴性对照，B7H3嵌合抗体（重链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示）作为阳性对照，每孔100µL，37℃孵育1h。再用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgG-Fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100µL，室温孵育1h。PBST洗板4次后，每孔加入100µLTMB底物，室温避光孵育10min，每孔加入100µL1MHCl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值（OD）=OD450nm-OD570nm。将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidaldose-response（VariableSlope）方式（GraphPadPrism软件，GraphPadSoftware，SanDiego，California）进行非线性回归，得到目标抗体与B7H3蛋白的结合曲线。

构建抗体与B7H3蛋白结合的ELISA结果如图3所示，结果显示构建抗体在多浓度范围下均与B7H3蛋白有很好的结合活性，EC ₅₀为0.02302-0.05261µg/mL，与阳性对照无明显差异，显著优于阴性对照，且不同抗体结构与亚型均显示较高的与B7H3蛋白的结合活性。

实施例6 ELISA检测抗体对NKP30的结合活性

采用pH 7.4的PBS缓冲液将人-NKP30-His（购于ACROBiosystems）稀释至0.5µg/mL，每孔100µL加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。用1%BSA封闭液封闭1小时后。PBST洗板3次后，将构建的表达抗体用0.5%BSA样品稀释液稀释至10µg/mL，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设阴性对照（空白孔与IgG1同型对照）与阳性对照，阳性对照为NKP30单抗（氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示），每孔100µL，37℃孵育1h。再用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgG-Fc用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100µL，室温孵育1小时。PBST洗板4次后，每孔加入100µL TMB底物，室温避光孵育10分钟，每孔加入100µL 1M HCl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值（OD）=OD _450nm-OD _570nm。将构建抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidaldose-response（VariableSlope）方式（GraphPadPrism软件，GraphPadSoftware，SanDiego，California）进行非线性回归，得到目标抗体与NKP30蛋白的结合曲线。

构建抗体的ELISA结果如图4所示，构建抗体在多浓度下均与NKP30蛋白有很好的结合活性，EC ₅₀为0.006368-0.03572µg/mL，与阳性对照无明显差异，显著优于阴性对照，且不同抗体结构与亚型均显示较高的NKP30蛋白结合活性。

实施例7构建抗体两端的结合活性

采用pH7.4的PBS缓冲液将huB7H3-人 FC（购于ACROBiosystems）稀释至0.5µg/mL，每孔100µL加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。用1%BSA封闭液封闭1小时后。PBST洗板3次后，将纯化得到的抗体用0.5%BSA样品稀释液稀释至20µg/mL，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共11个梯度，并设IgG1同型对照作为阴性对照，每孔50µL，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，将NKP30-his蛋白稀释至1µg/mL，每孔加入100µL，室温孵育1h，再用PBST洗板3次，而后将HRP标记的his抗体用样品稀释液按1:20000稀释，每孔加入100µL，室温孵育1h。PBST洗板4次后，每孔加入100µLTMB底物，室温避光孵育10min，每孔加入100µL1MHCl液终止显色反应。在多功能酶标仪上选择波长450nm，参比波长570nm测定96孔板中各孔的吸光值，每孔吸光值（OD）=OD450nm-OD570nm。将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidaldose-response（VariableSlope）方式（GraphPadPrism软件，GraphPadSoftware，SanDiego，California）进行非线性回归分析，得到目标抗体与B7H3、NKP30蛋白两端结合的曲线。

构建抗体的ELISA结果如图5所示，阴性对照不可与B7H3、NKP30蛋白两端结合，而不同结构与抗体亚型的构建抗体在各浓度下均与NKP30及B7H3蛋白两端有很好的结合活性，EC ₅₀为0.04711-0.4454µg/mL。该结果说明，构建抗体与B7H3及NKP30结合相互影响较小，进一步说明构建抗体可桥接表达B7H3的肿瘤细胞与NK细胞。

实施例8构建抗体对NK细胞的激活作用

使用PBS缓冲液稀释抗体至150nM，3倍稀释，共稀释8个梯度，200µL/孔放入96孔平底板4℃孵育过夜。取孵育好的96孔板，吸除抗体稀释液，再使用PBS清洗2次。加入培养基含有IL-2（400U）的NK细胞，4×10 ⁴个细胞、总体积200µL加入处理的96孔板中，37℃孵育24h。而后离心取细胞培养上清，检测IFN-γ的含量。

如图6所示，使用商业化IFN-γ细胞因子检测试剂盒检测经过抗体刺激的NK细胞培养上清的IFN-γ含量，反应抗体对NK细胞的激活作用。实验结果显示，经过NKP30单抗与构建抗体刺激的NK细胞，均分泌IFN-γ，EC ₅₀为1.589nM-8.834nM，而各浓度的阴性对照刺激NK细胞均未产生IFN-γ，说明NKP30单抗与构建抗体均可特异激活NK细胞。构建抗体刺激NK细胞分泌IFN-γ的水平与NKP30单抗对照相当，这表明构建抗体未减弱NKP30的激活NK细胞活性。

实施例9构建抗体介导NK细胞对B7H3阳性细胞的特异性杀伤实验

选择构建抗体，分别检测其对高表达B7H3的MCF-7肿瘤细胞、高表达B7H3的肿瘤细胞HS-746T和高表达B7H3的肿瘤细胞JIMT-1的特异性杀伤实验，采用LDH法检测肿瘤细胞死亡率（CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay，Cat：G1780）。

使用形态正常、处于对数期的MCF-7细胞（或肿瘤细胞HS-746T，或肿瘤细胞JIMT-1），胰酶消化后使用完全培养基中和，1000rpm室温离心4min并使用RPMI1640基础培养基（含5%FBS）重悬后，以2×10 ⁴/孔、50µL/孔铺于96孔板；使用RPMI1640基础培养基（含5%FBS）稀释构建的抗体至50nM，而后5倍梯度稀释，共8个浓度梯度，100µL/孔，设置三重复（同样的实验条件，铺三个孔）；重悬NK细胞，以6×10 ⁴/孔、50µL/孔加入对应孔中，使效靶比为3：1，同时设置靶细胞最大裂解孔（M）、靶细胞自发释放孔（ST）、效应细胞自发释放孔（SE）、总体积校正空白孔（BV）和培养基空白对照孔（BM）。静置10min后，1000rpm室温离心4min，于5%CO ₂、37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育4h。提前45min在M、B-V孔加入裂解液，混匀，孵育结束后1000rpm室温离心4min。吸取50µL上清至LDH分析板，再加入50µL/孔分析缓冲液（assaybuffer）溶解的底物，室温避光反应30min。而后加入50µL/孔终止液，静置10min后于490nm进行读数。计算细胞裂解率，公式为OD（样品孔，ST，SE）-OD（B-M）、OD（M）-OD（B-V）、细胞裂解率=OD（样品孔-ST-SE）×100/OD（M-ST），利用GraphPadPrism软件绘制细胞裂解率与浓度拟合数据图。实验结果如图7、图8和图9所示。

由图7可知，阴性对照与NKP30单抗均未显示对肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用，构建抗体与B7H3单抗显示对MCF-7细胞的裂解死亡作用，且呈浓度依赖性，说明B7H3单抗与构建抗体介导NK细胞对MCF-7细胞的杀伤作用是特异性的。而各浓度条件下的构建抗体显示比B7H3单抗更高的对MCF-7细胞的靶向肿瘤裂解率，说明构建抗体具有更高的靶向裂解肿瘤活性，且各结构与亚型的构建抗体均可靶向裂解肿瘤。构建抗体可同时结合B7H3与NKP30，桥接NK细胞与靶细胞，使NK细胞产生更近的免疫突触，杀死靶细胞。

由图8可知，阴性对照无靶向裂解肿瘤细胞HS-746T活性，而构建抗体显示较高的裂解肿瘤细胞HS-746T活性，且呈浓度依赖性，说明构建抗体介导NK细胞对HS-746T细胞的杀伤作用是特异性的。

由图9可知，阴性对照无靶向裂解肿瘤细胞JIMT-1活性，而构建抗体显示较高的裂解肿瘤细胞JIMT-1活性，且呈浓度依赖性，说明构建抗体介导NK细胞对JIMT-1细胞的杀伤作用是特异性的。

应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

一种双特异性抗体，其特征在于，包含：

（a）特异性结合第一抗原的第一抗体或其抗原结合片段；和

（b）特异性结合第二抗原的第二抗体或其抗原结合片段；

其中：

所述第一抗原为B7H3，并且所述第二抗原为NKP30；或者，所述第一抗原为NKP30，并且所述第二抗原为B7H3。
根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，

第一抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链；和

第二抗体或其抗原结合片段包含VHH；

其中，所述VHH连接于第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的一条重链的重链可变区与一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位，另一条重链的重链可变区与另一条轻链的轻链可变区形成抗原结合部位。
根据权利要求2或3所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个或多个VHH。
根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和一个VHH，所述VHH连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端。
根据权利要求4所述的双特异性抗体，其特征在于，其包含一个第一抗体或其抗原结合片段和两个VHH。
根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端；或者，两个所述VHH分别连接于所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的C端。
根据权利要求7所述的双特异性抗体，其包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：

（a）所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链和所述VHH；和

（b）所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链。
根据权利要求7所述的双特异性抗体，其包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其特征在于，对于所述每条多肽链：

（a）所述第一多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的重链；和

（b）所述第二多肽链各自独立地包含所述第一抗体或其抗原结合片段的轻链和所述VHH。
根据权利要求8或9所述的双特异性抗体，其特征在于，两条第一多肽链相同或不同，和/或两条第二多肽链相同或不同。
根据权利要求8-10任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述两个VHH通过Linker分别与所述第一抗体或其抗原结合片段的两条重链或两条轻链的N端或C端连接。
根据权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Linker具有如（G ₄S） _x所示的氨基酸序列，x为选自1-6的整数；优选地，x为选自1-3的整数。
根据权利要求1-12任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含重链可变区和重链恒定区，并且所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区；优选地，所述第一抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
根据权利要求1-13任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段的重链包含第一Fc区和第二Fc区。
根据权利要求14所述的双特异性抗体，其特征在于，第一Fc区和第二Fc区是相同的Fc或不同的Fc。
根据权利要求14或15所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE和/或IgM。
根据权利要求16所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。
根据权利要求14或15所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc区选自小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG3，或选自大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和/或IgG2c。
根据权利要求1-18任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段特异性结合B7H3，并且所述VHH特异性结合NKP30，其中，

所述第一抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：20所示的HCDR2，如SEQ ID NO：21所示的HCDR3；以及，如SEQ ID NO：22所示的LCDR1，如SEQ ID NO：23所示的LCDR2，如SEQ ID NO：24所示的LCDR3；并且，

所述VHH的HCDR1选自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的序列；HCDR2选自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的序列；HCDR3选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：30的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的序列。
根据权利要求19所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：3所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区VL；

并且，所述VHH的重链可变区VH选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的序列。
根据权利要求20所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO：3所示的重链可变区VH，如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区VL；

并且，所述VHH包含：

（a）如SEQ ID NO：1所示的重链可变区VH；或

（b）如SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH。
根据权利要求1-21任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的第一多肽链选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的任一氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的任一氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；所述双特异性抗体的第二多肽链如SEQ ID NO：11所示，或为与SEQ ID NO：11具有至少80%同一性的氨基酸序列。
根据权利要求1-22任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的双特异性抗体包含：

（1）如SEQ ID NO：12所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（2）如SEQ ID NO：13所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（3）如SEQ ID NO：14所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（4）如SEQ ID NO：15所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；

（5）如SEQ ID NO：16所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链；或

（6）如SEQ ID NO：17所示的第一多肽链，如SEQ ID NO：11所示的第二多肽链。
一种编码权利要求1-23任一项所述的双特异性抗体的核酸。
一种含权利要求24所述核酸的载体或质粒。
一种表达权利要求25所述载体或质粒的细胞。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-23任一项所述的双特异性抗体以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
权利要求1-23任一项所述双特异性抗体的应用，其特征在于，所述应用包括：（a）制备治疗肿瘤疾病的药物，所述肿瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、大肠癌、膜腺癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、肺泡横纹肌肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节细胞瘤、髓母细胞瘤、高级别胶质瘤、弥漫性内在脑桥胶质瘤、多层菊形团胚胎性肿瘤中的一种或多种；或（b）制备检测B7H3和/或NKP30分子的试剂或试剂盒。