KR101834026B1 - 항-gd2 항체 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 키메라, 인간화, 친화도 성숙, 안정성 향상된, 및 이중특이성 항-GD2 항체 및 그의 단편을 기재한다. 또한, GD2-관련 질환, 특히 신경아세포종의 검출, 예방 및/또는 치료적 치료를 위한 개개의 항체 또는 그의 조성물의 사용 방법이 제공된다.
Description
<도입>
모노클로날 항체 (MoAb) 요법은 암에 대해 허용된 치료 방식으로, 5개의 MoAb가 결장직장암 및 유방암, 비소세포폐암, 편평상피 세포 암종, 및 흑색종을 비롯한 성인에서의 고형 종양에 대해 FDA 승인을 받았다 (문헌 [Boyiadzis et al., 2008, Expert Opin Biol Ther 8, 1151-8]; [Yan et al., 2008, Cancer J 14, 178-83]). 그러나, 상기 방식은 소아 암의 치료에 대한 활용이 부적절한 상태로 남아있었다. 화학요법 또는 방사선과는 달리, MoAb 요법은 골수저하성 및 유전자독성이 없으며, 일반적으로 장기 독성이 거의 없다. 이는 어린 아동을 위해 중요한 고려사항이다. 보다 중요하게는, MoAb는 전형적으로 위험성이 높은 신경아세포종 (NB)에서 발견되는, 혈액, 골수 및 골에서의 전이성 암에 대하여 효과적이다. 소정 부류의 작용제로서, 인간 또는 인간화 IgG1 항체의 약동학 및 독성은 광범위하게 연구되어 왔다. 게다가, 항체는 면역 기반이든, 방사성 동위원소이든, 독소이든 또는 효소이든 세포독성 페이로드(payload)를 운반할 수 있고, 이에 따라 표적화된 요법에 대한 선택권을 증가시킨다.
신경아세포종 (NB)은 아동의 가장 흔한 두개외 고형 종양이다. 약 50%의 경우에서, 치유 전략은 골수 (BM)에서의 연조직 질량 및 전이를 모두 다루어야 한다. 용량-집중 화학요법은 종양의 절제가능성을 향상시키고, 수술-후의 방사선은 1차 부위에서의 재발 위험을 10% 미만으로 감소시킨다 (문헌 [Kushner et al., 2001, J Clin Oncol 19, 2821-8]). 그러나, 조직학 또는 메타요오도벤질구아니딘 (MIBG) 스캔에 의해 입증된 BM 질환은 종종 치명적인 결과를 지속시키고 예감하게 한다 (문헌 [Matthay et al., 2003, J Clin Oncol 21, 2486-91]; [Schmidt et al., 2008, Eur J Cancer 44, 1552-8]). 게다가, 유도 요법 후의 거의 완전한 차도의 달성에도 불구하고, 골수질의 재발은 흔하다. 치료 강화의 시도는 젊은 환자에 대한 심각한 우려인 급성 및 장기 부작용을 모두 직면하게 되었다. 많은 유망한 선두자들의 지속적인 축적에도 불구하고, 지금까지 유망한 신규 작용제의 결핍이 있었고, NB를 가진 환자에서의 주요한 임상적 이점을 제시한 표적/경로-특이적 소분자는 거의 없었다. 18개월 초과의 나이에서 진단된 단계 4 환자 중에서 독성 한계의 30% 미만의 치유 속도로, 실질적인 개선 여지가 있다 (문헌 [Pearson et al., 2008, Lancet Oncol 9, 247-56]).
몇몇 인자는 NB가 MoAb 표적화된 면역요법에 상당히 적합하도록 한다. 첫째로, MoAb는 인간 백혈구의 존재하에 매우 효율적인 NB의 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 매개한다. 둘째로, MoAb는 붕괴촉진인자 CD55 (문헌 [Cheung et al., 1988, J Clin Invest 81, 1122-8]) 및 상동제한인자 CD59 (문헌 [Chen et al., 2000, Cancer Res 60, 3013-8])가 부족한 NB 세포의 보체 매개 세포독성 (CMC)을 유도한다. NB 세포상의 보체 침착은 호중구에 대한 iC3b 수용체의 활성화를 통하여 ADCC를 증진시키고 (문헌 [Kushner and Cheung, 1992, Blood 79, 1484-90], [Metelitsa et al., 2002, Blood 99, 4166-73]), 이는 콜로니 자극 인자가 주어지는 경우에 용량-집중 화학요법 또는 골수형성 화학요법, 및 줄기 세포 이식 후에도 이용가능하다 (문헌 [Mackall, CL, 2000, Stem Cells 18, 10-8]). 셋째로, 환자가 쥐과 동물, 키메라 또는 인간화 MoAb를 거부할 가능성이 거의 없도록 (문헌 [Kushner et al., 2007, Pediatr Blood Cancer 48, 430-4]), 임상적 차도를 달성하기 위한 집중 화학요법 (NB를 위한 표준 진료)의 사용은 연장된 림프구 감소증 및 면역억제를 일으킨다 (문헌 [Mackall et al., 2000, Blood 96, 754-762]).
GD2는 정상 조직에서 매우 제한적으로 발현되며, 신경아세포종 및 흑색종을 비롯한 신경외배엽 기원의 종양에 풍부한 디시알로강글리오시드(disialoganglioside)이다. 적어도 2종의 항체 패밀리, 즉 3F8 (문헌 [Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-9]) 및 14.18 (문헌 [Mujoo et al., 1989, Cancer Res 49, 2857-61])이 임상적으로 시험되었다. 키메라 ch14.18은 쥐과 동물 MoAb 14.18의 가변 영역 및 인간 IgG1-K의 불변 영역으로 이루어진다 (문헌 [Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125, 191-202]). 이는 생체내에서 NB 및 흑색종 세포의 ADCC 및 CMC를 나타낸다 (문헌 [Barker et al., 1991, Cancer Res 51, 144-9]; [Barker and Reisfeld, 1993, Cancer Res. 52, 362-7]; [Mueller et al., 1990, PNAS USA 87, 5702-05 0]). 제I상 연구에서 임상 반응을 고무시키는 것을 기반으로, ch14.18이 단계 4 NB를 위한 강화 요법으로서 대규모 제II상 연구 (게르만(German) NB90 및 NB97 연구)에서 시험되었다. 진단시 12개월 초과인 166명의 환자에 대해, 유지 화학요법 중인 환자와 비교한 경우, ch14.18을 받은 환자에서 무사건 생존율 (EFS)은 유사할지라도, 전체 생존율 (OS)이 개선되었으며, BM 재발율은 ch14.18로 치료받은 환자에서 감소하였다 (문헌 [Simon et al., 2004, J Clin Oncol 22, 3549-57]). 2001년에, 아동암협회 (Children's Oncology Group (COG))는, 자가 줄기 세포 이식 (ASCT) 후에 완전한 차도 (CR)의 환자에서 NB 재발을 예방하는 데에 GMCSF 및 IL-2와 ch14.18의 조합의 효능을 연구하기 위해서, 무작위 제III상 시험을 착수하였고 (ClinicalTrials.gov NCT00026312) (문헌 [Gilman et al., J Clin Oncol 27:85-91, 2009]), 여기서 2년의 무진행 생존율 (PFS) 및 OS에서의 유의한 개선이 밝혀졌다 (문헌 [Yu et al., N Engl J Med 363:1324-1334, 2010]). GD2에 대해 특이적인 쥐과 동물 IgG3 MoAb인 3F8은 세포 사망을 유도하고, 시험관내 NB에 대하여 효율적인 ADCC 및 CMC를 매개한다 (상기 문헌 [Cheung et al., 2007]). 용량-집중 유도 및 적극적인 구조 요법에도 불구하고, 화학내성 골수 질환을 갖는 환자 중에서, 일반적으로 5일의 항체 및 GM-CSF 요법 1 내지 2 주기 후에 80%가 BM 차도를 달성하였다 (문헌 [Kushner et al., 2007, Proc Amer Soc Clin Oncol 25, 526s]). 화학내성 골수 질환에 대한 m3F8의 활성에 근거하여, 고무적인 결과를 갖는 제1 차도의 환자로 m3F8의 사용이 확대되었다. m3F8이 가장 높은 재발 위험의 처음 3-5년에 걸쳐 유지 요법으로서 제공되는 경우에, 아동에서의 상기 유리한 임상적 결과가 개선될 수 있었다. 그러나, 화학요법 종료시 면역계가 회복되는 경우, 인간 항-마우스 항체 반응 (HAMA)은 제한 인자이다. HAMA를 감소시키기 위한 하나의 전략은 3F8을 키메라화 또는 인간화하는 것이다.
따라서, 높은 친화도로 GD2와 결합할 수 있고, m3F8보다 우수하며, 항체-의존성 세포독성을 매개할 수 있어서, 이에 따라 질환 재발을 감소시키기 위해 장기 항체 요법을 가능하게 하는 키메라 및/또는 인간화 3F8 항체에 대한 요구가 존재한다.
키메라 3F8 (ch3F8-IgG1) 및 인간화 3F8 (hu3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG4)의 조작 및 단리가 본원에 기재된다. 이러한 항체는 표준 재조합 방법을 사용하여 제조되었고, 혈청 무함유 배지에서의 CHO-DG44 세포주에 의한 높은 발현을 위해 선별되었다. hu3F8-IgG1n의 특정 글리코형(glycoform) (또한, hu3F8-IgG1-MAGE1.5로도 명명됨)은 CHO-Mage1.5 세포주를 사용하여 생산되었다. 상기 특정 글리코형은 푸코스를 가지지 않으며, 유일하게 말단 만노스 및 N-아세틸글루코스 또는 글루코스만을 가진다. 비아코어(Biacore) 시스템에 의해 사용된 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 측정된 경우, 키메라 3F8 및 인간화 3F8은 m3F8의 KD와 유사한 KD를 유지하였다. 다른 항-GD2 항체와는 대조적으로, m3F8, ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG4 및 hu3F8-IgG1n은 실질적으로 더 느린 koff (이는 시험관내의 더 느린 워시 오프(wash off)로 번역됨)를 가졌다. m3F8와 유사하게, 키메라 및 인간화 3F8는 모두 시험관내의 세포 성장을 억제하였고, 이는 다른 항-GD2 항체에 대해 전형적이지 않다. 유사한 측정은 키메라 및 인간화 IgG1 항체가 14.G2a와 비교하여 더 유리한 KD를 갖는다는 것을 나타내었다. ch3F8-IgG1, hu3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG1n의 혈액 단핵 세포 (PBMC)-ADCC 및 호중구 (PMN)-ADCC는 모두 m3F8의 것보다 더 우수한 (10 내지 >1000배) 반면, CMC는 더 열등했다. 이러한 우수성은 ADCC 검정에서, 공여체에 무관하게, 또는 인간 CD16 또는 CD32로 형질감염된 NK92가 킬러로 사용된 경우, 지속적으로 관찰되었다. CD16 매개된 ADCC에 대해, hu3F8-IgG1n은 hu3F8-IgG1와 비교하여 10-40배 더 양호하였다. m3F8와 비교하여, hu3F8-IgG4의 사용으로 PBMC-ADCC 및 CMC의 활성은 매우 감소되었다. 다른 강글리오시드와의 교차반응성은 m3F8의 교차반응성과 유사하였다. 생체분포에서 131I 표지된 항체를 사용한 경우, hu3F8 형태는 m3F8의 비율에 필적할만한 정상 조직에 대한 종양의 비율을 가졌다. Hu3F8-IgG1은 m3F8와 비교하여 NB 이종이식에 대해 우수한 항-종양 효과를 나타내었다.
또한, 응력법을 이용한 컴퓨터 분석과 조합하여, 실험적으로 유도된 m3F8의 결정 구조를 사용하여 안정성 프로파일을 향상시키도록 고안된, 신규한 hu3F8 항체인 hu3F8H3L3가 본원에 기재된다.
<본 발명의 요약>
인간화 전략은, 인간 항체에 상응하는 위치에서 발견되는 잔기를 가진 쥐과 동물 서열을 특징으로 하는 아미노산 잔기의 대체가 인간에서 생성된 항체의 인간에서의 면역원성을 감소시킬 것이라는 전제를 공유한다. 그러나, 종들 사이에서의 서열의 대체는 일반적으로 그의 항원에 결합하는 항체의 감소, 및 친화도의 손실을 야기한다. 따라서, 인간화 기술은 면역원성을 감소시키기 위한 본래의 쥐과 동물 서열을, 치료상 유용하도록 충분한 항원 결합을 보유하는 인간화 분자에 대한 요구사항으로 균형있게 대체하는 것에 있다.
본 발명은, m3F8로부터 유래된 하나 이상의 CDR 서열을 갖는 조작된 및 단리된 키메라 및 인간화 3F8 항체뿐만 아니라, 항체 조성물, 항체의 글리코형, 안정성이 향상된 항체, Fc 수용체에의 결합이 향상된 항체, GD2에 대한 친화도가 향상된 항체, 제2의 별개의 결합 부위를 발현하기 위해 조작된 이중특이성 항체, 또는 이중특이성 T-세포 결합체(engager)를 제공하거나, 또는 이중특이성, 이중특이성 T-세포 결합 (BiTE) 항체, 삼중특이성 또는 다중특이성 항체에 대한 모듈성 IgG 구성에서, 본 발명의 임의의 항체의 Fv 단편의 용도를 제공한다. 상기 항체 및 이를 코딩하거나 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 제제, 장치, 트랜스제닉 동물, 이와 관련된 트랜스제닉 식물, 및 당업계에 공지된 것과 조합하여, 본원에 기재되고 이를 가능하게 하는, 이의 제조 방법 및 사용 방법은 본 발명의 일부이다. 본 발명의 hu3F8-IgG1 항체는 비록 m3F8보다 적은 무손상 보체 매개 세포독성 (CMC)을 가지지만, m3F8 또는 임의의 다른 공지된 항-GD2 항체 (예컨대, 14G.2a, ch14.18 또는 ME361)보다 상당히 더 좋은 PMN-ADCC 및 PBMC-ADCC 활성도를 갖는다. 이러한 우수성은 ADCC 검정에서, 공여체에 무관하게, 또는 인간 CD16 또는 CD32로 형질감염된 NK92가 킬러로 사용되는 경우, 지속적으로 관찰된다. 이는 ADCC가 일반적으로 환자에서 MoAb의 항-종양 효과에 대해 입증된 메카니즘이기 때문에 중요하다. hu3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG1n (hu3F8-IgG1의 글리코형)은 모두 m3F8와 비교하여, 신경아세포종 (NB) 이종이식에 대한 우수한 항-종양 효과를 나타낸다. 항체의 IgG4 형태는 감소된 이펙터 기능을 나타내고, 항-GD2 항체 요법의 통증 부작용을 차단하는데 효과적이다. 중쇄에서 삼중 돌연변이를 가진 Hu3F8-IgG1-DEL (또는 S239D/I332E/A330L)은 Fc 수용체 (FcR)에 대해 증가된 친화도를 나타냈다. 3F8:GD2 상호작용의 분석은, GD2에 대한 증가된 친화도를 부여하기 위해 열역학적으로 계산된 huH1I-감마-1 및 huH3I-감마-1 중쇄를 생산하는 중쇄 돌연변이를 갖는 3F8 항체의 설계를 가져왔다.
본 발명은 본원에 기재된 적어도 하나의 단리되고 조작된 키메라 항체 (ch3F8) 또는 인간화 항체 (hu3F8)를 제공한다. 본 발명에 따른 항체에는, 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분과 조합하여, m3F8로부터 유래된, 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 이의 리간드 결합 부분을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드 분자가 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명은, 각 사슬이 GD2에 대한 특이성을 갖는 m3F8로부터 유래된 적어도 일부의 인간 불변 영역 및 적어도 일부의 가변 영역을 포함하는, 본원에 기재된 경쇄 및 중쇄를 포함하는 hu3F8 항체에 관한 것이고, 예를 들면 상기 항체는 GD2에 높은 친화도로 결합하고, 목적하는 효과 (예컨대, 시험관내의 세포 성장의 억제)를 매개하고, 항-GD2 항체 요법으로 인한 통증 부작용을 차단한다. 또한, 본 발명에는 항체 사슬의 하나 이상의 부분, 예컨대 중쇄의 불변 영역, 연결 영역, 다양성 영역 또는 가변 영역, 또는 경쇄의 불변 영역, 연결 영역 또는 가변 영역과 같은 항체의 단편 또는 유도체가 포함된다. 항체는 IgG, IgM 또는 IgA와 같은 임의의 부류, 또는 IgG1, IgG2a, IgG4 및 당업계에 공지된 다른 서브클래스와 같은 임의의 서브클래스를 가질 수 있다. 또한, 본 발명에 유용한 항체에는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일쇄 Fv (scFv), 단일쇄 항체, 디술피드-연결 Fv 또는 디술피드-안정화 Fv (sdFv 또는 dsFv)를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 본 발명의 항체의 항원-결합 항체 단편이 포함된다. 또한, 본 발명에는 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단일-도메인 항체가 포함된다. 추가로, 항체는 파지 디스플레이와 같은 임의의 방법에 의해 생산되거나, 또는 박테리아, 곤충, 효모 (균류), 포유동물 또는 목적하는 특징을 가진 항체, 예컨대 인간화 항체를 생산하는 다른 유형의 세포 또는 세포주를 비롯하여, 임의의 유기체, 난자 또는 세포주에서 생산될 수 있다. 또한, 항체는 상이한 종으로부터 Fab 부분과 Fc 영역을 조합하거나, 또는 상보성-결정 영역을 유지하고 또다른 종의 것에 대한 프레임워크 영역을 변형함으로써 형성될 수 있다.
항체는 m3F8 또는 hu3F8 (상기 용어는 본원에서 정의됨)로부터 유래된 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) (예컨대, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 또는 CDR3) 중 하나 이상의 특정 부분, 및/또는 적어도 하나의 불변 또는 가변 프레임워크 영역 또는 이의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 추가로, 항체 아미노산 서열은 본원에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 바와 같은 적어도 하나의 특정 치환, 삽입 또는 결실을 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 항체에는 ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-IgG4, hu3F8IgG1n, Hu3F8-IgG1-DEL, hu3F8H1L1S (향상된 hu3F8-IgG1 경쇄 경계면), hu3F8H3L3 (향상된 hu3F8-IgG1 중쇄 및 경쇄 안정성), hu3F8H3L3S (향상된 경계면 및 안정성), hu3F8H1-I-감마-1 (향상된 hu3F8-IgG1 친화도), hu3F8H3-I-감마-1 (향상된 hu3F8-IgG1 안정성 및 친화도)뿐만 아니라 이들의 단편 및 영역이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 GD2에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 모노클로날 항체에 관한 것이고, 여기서 항체 ch3F8-IgG1은 서열식별번호:1의 중쇄 도메인 및 서열식별번호:2의 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체 ch3F8-IgG4는 서열식별번호:3의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:2의 경쇄 도메인을 포함한다. 상기 키메라 항체는 쥐과 동물 3F8 항체로부터 유래되고, 특정 실시양태에서 키메라 항체는, 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2 및 3이 서열식별번호:1의 아미노산 잔기 31-35, 50-64 및 98-108에 의해 각각 정의된 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 CDR 1, 2 및 3이 서열식별번호:2의 아미노산 잔기 24-34, 50-56 및 89-95에 의해 각각 정의된 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 프레임워크 영역 (FR) 1, 2, 3 및 4가 서열식별번호:1의 아미노산 잔기 1-30, 36-49, 65-97 및 109-120에 의해 각각 정의된 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 프레임워크 영역 (FR) 1, 2, 3 및 4가 서열식별번호:2의 아미노산 잔기 1-23, 35-49, 57-88 및 96-108에 의해 각각 정의된 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 GD2에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 모노클로날 항체에 관한 것이고, 여기서 항체 hu3F8-H1L1-IgG1은 서열식별번호:4의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:5의 경쇄 가변 도메인을 포함하고, hu3F8H2L2-IgG1은 서열식별번호:6의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:7의 경쇄 가변 도메인을 포함하고, hu3F8-H1L1-IgG4는 서열식별번호:8의 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:5 또는 7의 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 상기 인간화 항체는 쥐과 동물 3F8 항체의 인간화로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR) 1, 2 및 3이 서열식별번호:4, 6 또는 8의 아미노산 잔기 31-35, 50-64 및 98-108에 의해 각각 정의된 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 CDR 1, 2 및 3이 서열식별번호:5 또는 7의 아미노산 잔기 24-34, 50-56 및 89-95에 의해 각각 정의된 경쇄를 포함한다.
또한, 본 발명은, 증가된 이펙터 기능을 가진, 변형된 탄수화물 조성물로 조작된 항-GD2 인간화 항체인 hu3F8-IgG1n에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 hu3F8-IgG1 또는 hu3F8-IgG1n의 중쇄에서 삼중 돌연변이 DEL (S239D/A330L/I332E)을 가진 Hu3F8-IgG1-DEL 항체에 관한 것이다. Hu3F8-IgG1-DEL은 서열식별번호:4, 6 또는 8의 S239D, A330L 및 I332E로 이루어진 중쇄에서의 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 결정 구조의 컴퓨터 분석, 및 항체의 안정성을 향상시키기 위한 복귀 돌연변이 및 전진 돌연변이에 의한 아미노산 서열의 조정으로부터 유도된 hu3F8H3L3에 관한 것이다. 안정성이 향상된 huH3 중쇄 서열은 서열식별번호:9에 개시되고, huL3 경쇄 서열은 서열식별번호:10에 개시된다. 또한, 상기 돌연변이는 본원에 기재된 다른 중쇄 돌연변이와 조합하여, 또는 단독으로 중쇄 서열 내로 도입될 수 있다.
VH-VL 경계면에서의 안정성을 향상시키기 위한 추가의 돌연변이가 경쇄의 위치 43에 부가되어 huL3S를 생성한다. 따라서, huL3S은 서열식별번호:10의 Ala43Ser으로 이루어진 치환체를 포함한다. 이러한 위치 43에서의 세린으로의 변화가 hu3F8-IgG1의 경쇄 안으로 혼입되는 경우, 상기 경쇄는 huL1S로 언급된다. 유사하게, huL1S는 서열식별번호:5 또는 7의 Ala43Ser로 이루어진 치환을 포함한다.
컴퓨터 모델링은, 중쇄의 CDR3에서의 Ile로의 위치 54에서의 Gly의 치환이 결합 포켓의 형태를 변화시키고, GD2 리간드와의 접촉을 증가시킬 것을 추가로 밝혀냈다. 상기 돌연변이 Gly54Ile의 huH1-IgG1 및 huH3-IgG1 서열의 CDR 영역으로의 부가는 각각 huH1I-감마1 및 huH3I-감마를 생성한다. 따라서, huHI-감마1은 서열식별번호:4, 6 또는 8에서의 Gly54Ile 치환을 포함한다. huH3I-감마1은 서열식별번호:9에서의 Gly54Ile 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 항체는 인간 GD2와 결합하고, 목적하는 기능, 즉 이펙터 기능, 통증의 차단, 또는 세포 성장의 억제를 수행하는 항체이다. 경쟁적 억제에 의한 모노클로날 항체의 특이성 및 친화도의 바람직한 측정 방법은 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에서 찾아볼 수 있고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체는 인간 GD2, 그의 서브유닛, 단편, 일부 또는 임의의 조합에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 에피토프는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있고, 바람직하게는 1-5개 이상의 당 잔기, 또는 적어도 하나의 GD2의 일부의 세라마이드로 이루어진다.
한 측면에서, 본 발명은 m3F8로부터의 적어도 하나의 가변 영역, 및 이를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 단리된 인간화 항-GD2 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (i) m3F8로부터 유래된 모든 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 아미노산 서열, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열, 또는 (ii) m3F8로부터의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 m3F8로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 CDR, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 m3F8 CDR을 포함하는, 적어도 하나의 단리된 키메라, 인간화 또는 CDR-이식 항-GD2 항체를 제공하고, 여기서 항체는 1-5개 이상의 당 잔기 또는 인간 GD2의 에피토프의 세라마이드를 포함하는 적어도 하나의 에피토프에서 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 임의의 3F8 MoAb 또는 이의 단편을 포함하는 항체 성분, 또는 본 발명의 임의의 3F8 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 진단/검출 또는 치료 면역접합체를 제공하고, 여기서 항체 성분은 적어도 하나의 진단/검출 작용제 또는 적어도 하나의 치료제에 결합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 방사성핵종, 붕소, 가돌리늄 또는 우라늄 원자, 면역조절제, 예컨대 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림포톡신, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF), 조혈기관관련 인자, 예컨대 인터류킨 (IL), 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 또는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론 (IFN), 예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타 또는 인터페론-감마, 및 줄기 세포 성장 인자, 조혈기관관련 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴, 항체, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성 약물, 예컨대 항유사분열제, 알킬화제, 항대사물질 작용제, 혈관신생-억제제, 세포사멸성 작용제, 알칼로이드 작용제, COX-2-억제제 및 항생제, 세포독성 독소, 예컨대 식물, 미생물 및 동물 독소, 및 이들의 합성 변화, 혈관신생 억제제, 상이한 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제를 포함하는 치료 면역접합체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 또한, 3F8 항체에 의해 인식되는 항원에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 항원-결합 부위, 및 GD2 이외에 에피토프 또는 합텐에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는, 다원자가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 3F8 항체 또는 그의 단편은 키메라화 또는 인간화된다. 또한 바람직하게는, 항체 또는 그의 단편은 완전히 인간 또는 키메라화된다. 한 실시양태에서, 다원자가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 진단/검출 작용제 또는 치료제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 다원자가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계; (ii) 소정량의 비결합 단백질이 대상체의 혈액 흐름에서 제거되도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (iii) 상기 항체의 결합 부위에 결합하는, 진단/검출 작용제, 치료제, 또는 그의 조합물을 포함하는 담체 분자를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 진단/검출 작용제, 치료제, 또는 그의 조합물을 표적에게 전달하는 방법을 제공한다. 진단/검출 작용제 또는 상기 치료제는 동위원소, 염료, 크로마젠, 조영제, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 효소 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 리포좀, 나노입자, RNA 또는 DNA를 포함하는 군으로부터 선택된다. 또한, 제2 특이성에는 기재된 작용제의 군으로부터의 임의의 작용제에 접합된 합텐(들)이 포함된다. 상기 합텐에는 바이오틴 및 그의 유도체, DOTA 및 그의 유도체, DTPA 및 그의 유도체, 플루오레세인 및 그의 유도체, 히스타민 및 그의 유도체, 데페록사민 및 그의 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 임의의 방법에서, 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대 인간 또는 가정용 애완동물이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (A) 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원인 질환 조직-회합 표지에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 군, 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 군을 갖는, 이중특이적 항체 또는 항체 단편을 상기 대상체에게 투여하는 단계; (B) 임의로, 세정 조성물을 상기 대상체에게 투여하고, 상기 조성물이 순환으로부터의 비국소화 항체 또는 항체 단편을 제거하도록 하는 단계; 및 (C) 상기 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 상기 다른 군 중 하나 이상에 의해 인식가능한 에피토프 중 하나 이상을 포함하거나 갖는 담체 부분을 포함하는 제1 표적가능한 접합체, 및 하나 이상의 접합된 치료제 또는 진단제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 조직을 치료하거나 확인하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 군은 인간, 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체, 또는 인간, 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체의 단편이다. 바람직한 실시양태는 본원에 기재된 키메라, 인간화, 또는 인간 항체로서의 적용에 있어서의 3F8 MoAb의 용도이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (A) 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 군 (여기서, 이는 3F8 항체 또는 그의 단편임), 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 군을 포함하는 유효량의 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계; 및 (B) 표적가능한 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원을 발현하는 종양의 검출 또는 치료 방법을 제공한다. 표적가능한 접합체는 (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2; (ii) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (iii) DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2; (iv) DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (v) DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vi) DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (vii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2; (viii) Ac-D-Phe-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-NH2; (ix) Ac-D-Phe-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (x) Ac-D-Phe-D-Lys(Bz-DTPA)-D-Tyr-D-Lys(Bz-DTPA)-NH2; (xi) Ac-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xii) DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xiii) (Tscg-Cys)-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Lys(DOTA)-NH2; (xiv) Tscg-D-Cys-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xv) (Tscg-Cys)-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2; (xvi) Ac-D-Cys-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(DOTA)-D-Cys-NH2; (xvii) Ac-D-Cys-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-NH2; (xviii) Ac-D-Lys(DTPA)-D-Tyr-D-Lys(DTPA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; (xix) Ac-D-Lys(DOTA)-D-Tyr-D-Lys(DOTA)-D-Lys(Tscg-Cys)-NH2; 플루오레세인 및 그의 유도체; 데스페리옥사민 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (A) 이중특이성 항체 F(ab)2 또는 F(ab')2 단편, 또는 단일쇄 Fv 단편을 그러한 절차를 겪어야 하는 대상체에게 주사하고 (여기서, 이중특이성 항체 또는 단편은 3F8 MoAb에 의해 인식되는 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 결합 부위를 갖고, 합텐에 특이적으로 결합하는 제2 항체 결합 부위를 갖음), 항체 단편이 표적 부위에 부착되도록 하는 단계; (B) 임의로, 이중특이성 단편이 주사 후 약 24시간 이내에 순환으로부터 대체로 제거되지 않은 경우, 세정제를 사용하여 비표적화된 항체 단편을 제거하고, 분해를 위해 비표적화된 항체 또는 단편을 간으로 빠르게 제거하는 합텐-변형 덱스트란, 덴드리머 또는 중합체를 주사하는 단계; (C) 제1 주사 후 수시간 이내에, 스캐너 또는 프로브를 사용한, 표적 부위에서의 상승된 수준의 부착된 표지의 핵 영상법 또는 근거리 검출에 의해 합텐의 존재를 검출하고, 상기 절차를 수행하는 단계 (여기서, 상기 검출은 조영제 또는 공제제 (subtraction agent)를 사용하지 않고 수행됨)를 포함하는 표적화 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 합텐은 진단/검출 방사성 동위원소, MRI 영상-향상제, 형광 표지 또는 화학발광 표지를 사용하여 표지된다. 형광 표지에는 로다민, 플루오레세인, 레노그라핀, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민이 포함될 수 있다. 화학발광 표지에는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 포함될 수 있다. MRI 영상-향상제에는 가돌리늄 및 강자성 물질이 포함된다. 항체-합텐 국소화 영상법은 종양 시기결정, 치료에 반응하는 종양의 측정, 조기 재발의 검출 및 종양 감시에 중요한 GD2를 운반하는 무손상 종양 세포를 검출한다. 암을 위한 치유 요법의 일부로서 완전한 외과 절제술이 가능하도록, 항체-합텐 국소화의 검출은 수술 중에 종양의 정확한 위치를 제공하고, 질환의 잠재 부위를 밝혀낸다.
또한, 본 발명에서, 3F8 항체에 의해 인식되는 항원에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 항원-결합 부위, 및 세포 (림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 골수성 세포, 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 백혈병 세포, 세포독성 림프구 및 B-림프구) 상의 에피토프 또는 합텐에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는, 다원자가의 다중특이성 항체 또는 그의 단편이 고려된다. 이러한 이중특이성 항체 또는 단편은, 내인성 세포, 부위 또는 조직으로 외인성으로 주입된 세포, 또는 항원 GD2를 운반하는 세포를 표적하기 위해, 정맥내, 협막내 및 종양내를 비롯한 다양한 경로를 통하여, 인간을 비롯한 포유동물 내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 세포는 인간을 비롯한 포유동물 내로의 투여 전에 상기 이중특이성 항체 또는 단편을 사용하여 생체외 무장될 수 있다.
또한, 본 발명에서, 진단 적용 및 치료 적용 둘 모두를 위해, 유전자 방법을 사용하여 GD2에 특이적인 키메라 표면 수용체를 만들어내고 세포 (림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 골수성 세포, 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 백혈병 세포, 세포독성 림프구 및 B-림프구)를 조직, 장기 또는 종양을 갖는 GD2로 재전송하기 위한 3F8의 서열 또는 그의 단편의 용도가 고려된다.
한 측면에서, 본 발명은, 적어도 하나의 특정 서열, 도메인, 그의 부분 또는 변형체를 포함하는 상기 언급한 특정 항-GD2 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 상보적이거나, 또는 혼성화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 보다 특정 측면에서, 본 발명은 Hu3F8-H1L1-IgG1 (또한, hu3F8-IgG1로도 약칭됨) 경쇄가 서열식별번호:11에 의해 코딩되고 Hu3F8-H1L1-IgG1 중쇄가 서열식별번호:12에 의해 코딩되고, Hu3F8-H1L1-IgG4 경쇄가 서열식별번호:13에 의해 코딩되고 Hu3F8-H1L1-IgG4 중쇄가 서열식별번호:14에 의해 코딩되고, Hu3F8-H1L2-IgG1 경쇄 L2가 서열식별번호:15에 의해 코딩되고 Hu3F8-H2L2-IgG1 중쇄 H2가 서열식별번호:16에 의해 코딩되는, 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. hu3F8-H1L1-IgG1의 중쇄 및 경쇄는 항-GD2 항체 hu3F8-H1L2-IgG1 및 hu3F8-H2L1-IgG1을 형성하는, hu3F8-H2L2-IgG1의 중쇄 및 경쇄와 교체가능하다. 추가로, ch3F8-IgG1 경쇄는 서열식별번호:17에 의해 코딩되고 ch3F8-IgG1 중쇄는 서열식별번호:18에 의해 코딩되고, ch3F8-IgG4 경쇄는 서열식별번호:19에 의해 코딩되고 ch3F8-IgG4 중쇄는 서열식별번호:20에 의해 코딩되고, hu3F8H3L3-IgG1 경쇄 L3은 서열식별번호:21에 의해 코딩되고 중쇄 H3은 서열식별번호:22에 의해 코딩되는, 뉴클레오티드 서열이 본원에서 제공된다.
추가로, 본 발명은 상기 항-GD2 항체 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 핵산 및/또는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포뿐만 아니라, 이러한 항체 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포의 제조 방법 및/또는 사용 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산, 단리된 핵산을 포함하는 단리된 핵산 벡터, 및/또는 단리된 핵산을 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, CHO-S, DG44, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 또는 림프종 세포, 또는 임의의 유도체, 그의 불멸화된 세포 또는 변형된 세포로부터 임의로 하나 이상 선택될 수 있다. 또한, dhfr (디히드로폴레이트 리덕타제) 또는 GS (글루타민 신타제)가 포함되나 이에 한정되지는 않는 효소, 또는 대사 경로의 조절하에 성장 및 생존 선별로 단백질 발현의 증폭이 가능하도록 하는 벡터의 사용 방법을 비롯하여, 항체가 검출가능한 또는 회수가능한 양으로 발현되도록, 시험관내, 생체내 또는 동일계내의 조건하에 항체 코딩 핵산을 번역하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 항-GD2 항체의 생산 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은, 적어도 하나의 항-GD2 항체가 검출 또는 회수할 수 있는 양으로 발현되는 조건하에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 적어도 하나의 상기 언급한 항-GD2 항체를 발현하기 위한 하나 이상의 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, (a) 본원에 기재된 단리된 항-GD2 항체 코딩 핵산 및/또는 항체; 및 (b) 적합한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다. 공지된 담체 또는 희석제에 따라, 담체 또는 희석제는 임의로 제약상 허용될 수 있다. 임의로, 조성물은 적어도 하나의 추가 화합물, 단백질 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 몇몇 조성물에서, 키메라 또는 인간화 항체는 세포독성 약물, 독소 또는 방사성핵종과 같은 세포독성제 (즉, 세포의 생존능 및/또는 기능을 손상시키는 작용제)에 접합된다.
본 발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GD2 관련 병태를 조절 또는 치료하기 위해, 및/또는 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 관련 병태 전에, 후에 또는 중에, 치료 유효량을 투여하기 위한, 하나 이상의 항-GD2 항체 방법 또는 조성물을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 유효량의 단리된 항-GD2 항체 또는 그의 단편 중 하나 이상을 포함하는 조성물을, 세포, 조직, 장기 또는 동물에 접촉시키거나 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 장기 또는 동물에서 GD2 관련 병태의 진단 또는 치료 방법을 제공한다. 임의로, 상기 방법은 0.001-50 mg/킬로그램의 본 발명의 유효량의 항-GD2 항체를 세포, 조직, 장기 또는 동물에 사용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내(intracerebroventricular), 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 경막내, 옴마야내(intra-Ommaya), 유리체내, 안내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내 또는 경피로부터 선택된 적어도 하나의 방식에 의해 접촉시키거나 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스, 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 항체 또는 항체 유도 접합체, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성의약품, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 그의 유사체, 세포독성 또는 다른 항암 작용제, 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 항증식성 작용제, 사이토카인, 인터류킨, 성장 인자, 사이토카인 길항제, 및 항-TNFa, 백혈구, T-세포, LAK 세포, TIL 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, NKT 세포, 조작된 T 세포 또는 NK 세포 또는 단핵구 또는 과립구 중 적어도 하나로부터 선택된 유효량의 화합물, 단백질 또는 세포 중 하나 이상을 포함하는 적어도 하나의 조성물을, 항체가 접촉하거나 투여되기 이전에, 동시에 또는 이후에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 GD2 관련 병태를, 및/또는 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 관련 병태 전에, 후에 또는 중에 진단하기 위한, 적어도 하나의 항-GD2 항체 방법을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따라, 적어도 하나의 항-GD2 항체 병태를 진단하기 위한, 하나 이상의 조성물, 장치 및/또는 전달 방법을 제공한다.
또한, 적어도 하나의 단리된 인간화 항-GD2 항체 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 임의로, 상기 조성물은 검출가능한 표지 또는 리포터, 세포독성 또는 다른 항암 작용제, 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트, 항증식성 작용제, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제, TNF 길항제, 항류마티스, 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NTHE), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 에리스로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성의약품, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체 중 적어도 하나로부터 선택된 유효량의 화합물 또는 단백질 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 적어도 하나의 단리된 포유동물 항-GD2 항체를 포함하는 의료 장치가 제공되고, 여기서 상기 장치는 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 유리체내, 안내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내, 또는 경피로부터 선택된 방식 중 하나 이상에 의해, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 접촉시키거나 투여하는데 적합하다.
추가의 측면에서, 개시내용은, 동결건조된 형태의 개시내용의 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체 또는 단편 중 하나 이상을 포함하는 제1 용기, 및 멸균수, 멸균 완충수, 또는 수성 희석제 중의 페놀, m-크레솔, p-크레솔, o-크레솔, 클로로크레솔, 벤질 알콜, 질산 페닐수은산, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 마그네슘 클로라이드, 알킬파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살, 만니톨, 수크로스, 만노스, 다른 당, 트윈(TWEEN) 80, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 보존제 중 하나 이상을 포함하는 임의의 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 한 측면에서, 키트 중 제1 용기의 항-GD2 항체 또는 특정 부분 또는 변형체의 농도는 제2 용기의 내용물을 사용하여 약 0.1 mg/ml 내지 약 500 mg/ml의 농도로 재구성된다. 또다른 측면에서, 제2 용기는 등장제를 추가로 포함한다. 또다른 측면에서, 제2 용기는 생리학상 허용되는 완충액을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 개시내용은 적어도 하나의 GD2를 특징으로 하는 병태의 치료를 필요로 하는 환자에게, 키트에서 제공되고 투여 전에 재구성된 제제를 투여하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 GD2를 특징으로 하는 병태의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 적어도 하나의 단리된 키메라 또는 인간화 항-GD2 항체의 용액 또는 동결건조된 형태를 포함하는 패키징 물질 및 용기를 포함하는, 인간 제약학적 용도 또는 진단 용도를 위한 제조품이 제공된다. 상기 제조품은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 유리체내, 안내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내, 또는 경피 전달 장치 또는 시스템의 구성요소로서의 용기를 갖는 것을 임의로 포함할 수 있다.
<상세한 설명>
재조합 DNA 및 면역학에서 사용된 다수의 용어가 하기 설명에서 광범위하게 사용되었다. 이러한 용어가 제공되는 범위를 비롯한 명세서 및 청구항의 보다 명확하고 일관적인 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다.
용어 "항체"는 당업계에서 인식된 용어이고, 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 단편의 예에는 Fab 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 이러한 활성 단편은 많은 기술에 의해 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체는 펩신과 같은 효소로 분리되고, HPLC 겔 여과에 적용될 수 있다. 이어서, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획은 막 여과 등에 의해 수집되고 농축될 수 있다. 항체의 활성 단편의 단리를 위한 일반적인 기술의 추가 설명을 위해, 예를 들어 문헌 [Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)]을 참조한다. 또한, 용어 "항체"에는 이중특이성 및 키메라 항체가 포함된다.
본원에 기재된 항체는 전장 (즉, 자연 발생하거나, 정상 면역글로불린 유전자 단편 재조합 방법에 의해 형성됨) 면역글로불린 분자 (예컨대, IgG 항체), 또는 항체 단편과 같은 면역글로불린 분자의 면역 활성 (즉, 특이적 결합) 부분을 지칭한다.
항체 단편은 F(ab').sub.2, F(ab).sub.2, Fab', Fab, Fv, sFv 등과 같은 항체의 일부이다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 무손상 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 예를 들어, 3F8 모노클로날 항체 단편은 3F8에 의해 인식된 에피토프와 결합한다. 또한, 용어 "항체 단편"에는 복합체를 형성하기 위해 특이적 항원에 결합함으로써 항체와 같이 작용하는 임의의 합성 단백질 또는 유전자 조작된 단백질이 포함된다. 예를 들어, 항체 단편에는 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자 ("scFv 단백질"), 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위가 포함된다.
용어 "모노클로날 항체"는 당업계에서 인식된 용어이다. 모노클로날 항체는 모든 클론의 고유한 모세포인 한 유형의 면역 세포에 의해 제조되기 때문에, 이들은 동일한 단일특이적 항체이다.
모노클로날 항체의 생산을 위해 당업계에는 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 문맥에서, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵, 파지 또는 원핵 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여 (예컨대, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화, 또는 다른 공급원으로부터의 상기 쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 서열이 밝혀질 수 있다. 단리되고 나면, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻기 위해, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있으며, 이어서 NS0 세포, 시미안(Simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 효모 세포, 조류 세포, 난자 또는 골수종 세포 (면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않음)와 같은 숙주 세포 내로 형질전환된다. 또한, DNA는, 예를 들어 동종 인간 서열 대신에 목적하는 종의 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 상기 문헌 [Morrison et al.]), 또는 모든 또는 일부의 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합적으로 연결함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 치환될 수 있거나, 또는 키메라 2가 항체를 만들어내기 위해 본 발명의 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인에 대해 치환될 수 있다.
용어 "에피토프"는 당업계에 인식되어 있다. 이는 항체와 상호작용하는 항원 또는 항원들의 영역을 지칭하기 위해 일반적으로 당업자에 의해 인식되어 있다. 펩티드 또는 단백질 또는 당 항원의 에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있거나, 또는 인접한 또는 비인접한 아미노산 및/또는 항원의 당 서열에 의해 형성될 수 있다. 많은 탄수화물과 같은 GD2 분자는 많은 에피토프를 함유한다. 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프 또는 당, 및 항체, GD2 항원의 화학 모방체의 펩티드, 및 항-유전자형 항체에 의해 여전히 인식되는 상기 당의 보존적 치환체는 본 발명의 실시양태이다. 상기 당, 또는 모방체 펩티드/화학 물질, 또는 항-유전자형 항체는 면역친화도 컬럼상에서 MoAb에 대해 GD2를, 또는 GD2로부터 MoAb를 용리시키는데 편리한 방법을 제공한다. 추가로, 상기 에피토프의 말단절단(truncation)이 가능할 수 있다.
네이키드(naked) 항체는 일반적으로 치료제에 접합되지 않는 전체 항체이다. 이는 항체 분자의 Fc 부분이, 세포 용균을 초래할 수 있는 작용으로 메카니즘을 설정하는, 보체 고정 및 ADCC (항체-의존 세포독성)와 같은 이펙터 기능을 제공하기 때문이다. 네이키드 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 다뿐만 아니라, 키메라, 인간화 또는 인간 항체와 같은 특정 재조합 항체가 포함된다. 그러나, Fc 부분은 치료 기능에 대해 요구되지 않고, 오히려 항체가 세포 주기 휴지기 및 아폽토시스의 유도와 같은, 다른 메카니즘을 통한 그의 치료 효과를 가하는 것이 가능하다. 이러한 경우에서, 네이키드 항체에는 또한 상기 정의된 접합되지 않은 항체 단편이 포함된다.
키메라 항체는 하나의 종으로부터 유래된 항체, 바람직하게는 설치류 항체의 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변 도메인을 함유하는 재조합 단백질인 반면, 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 불변 도메인으로부터 유래된다. 수의학적 적용을 위해, 키메라 항체의 불변 도메인은 고양이 또는 개와 같은 다른 종의 불변 도메인으로부터 유래될 수 있다.
인간화 항체는, 하나의 종으로부터의 항체, 예컨대 설치류 항체로부터의 CDR이 설치류 항체의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 옮겨지는 재조합 단백질이다. 항체 분자의 불변 도메인은 인간 항체의 것으로부터 유래된다.
인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 "조작된" 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 항체이다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 로커스의 요소가, 내인성 중쇄 및 경쇄 로커스의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 균주로 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원에 대해 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 인간 항체-분비성 하이브리도마를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법은 문헌 [Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)], 문헌 [Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)] 및 [Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)]에 기재되어 있다. 또한, 완전한 인간 항체는 유전자 또는 염색체 형질감염 방법뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술에 의해 구성될 수 있으며, 이들은 모두 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 그의 단편의 시험관내 생산을 위해 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 참조한다. 상기 기술에서, 항체 가변 도메인 유전자는 필라멘트형 박테리오파지의 주 또는 부 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 피라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선별은 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 초래한다. 상기 방식에서, 파지는 B-세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 그들의 검토를 위해서는 예를 들어 문헌 [Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)]을 참조한다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다. 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조하고, 이들의 전문이 참조로 포함된다.
치료제는, 항체 모이어티와 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여되거나 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편, 또는 하위단편에 접합되는 분자 또는 원자이고, 이는 질환의 치료에 유용하다. 치료제의 예에는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성 작용제 또는 염료 및 방사성 동위원소가 포함된다.
진단제는 투여되거나, 또는 항체 모이어티, 즉 항체 또는 항체 단편 또는 하위단편에 접합되는 분자 또는 원자이고, 이는 항원을 함유하는 세포를 찾아냄으로써 질환을 진단하거나 검출하는데 유용하다. 유용한 진단제에는 자기 공명 영상법 (MRI)을 위한 방사성 동위원소, 염료 (예컨대, 바이오틴-스트렙타비딘 복합체와 함께), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 향상제 (예컨대, 상자성 이온)가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 미국 특허 제6,331,175호는 MRI 기술 및 MRI 향상제에 접합된 항체의 제조를 기재하며, 그의 전문이 참조로 포함된다. 바람직하게는, 진단제는 방사성 동위원소, 자기 공명 영상법에 사용하기 위한 향상제, 및 형광 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방사성 금속 또는 상자성 이온을 가진 항체 성분을 로딩하기 위해서, 이온에 결합하기 위한 다수의 킬레이팅 기에 부착된 긴 테일을 가진 시약과 항체 성분을 반응시키는 것이 필수적일 수 있다. 이러한 테일은, 폴리라이신, 다당류, 또는 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심, 및 상기 목적에 유용한 것으로 공지된 기와 같이 킬레이팅 기에 결합될 수 있는 팬던트 기를 갖는 다른 유도체화된 또는 유도체화할 수 있는 쇄와 같은 중합체 일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 이용하여 항체와 결합된다. 보통, 킬레이트는 최소의 면역 반응성 손실 및 최소의 응집과 함께 분자로의 결합의 형성을 가능하게 하는 기에 의해 항체에 연결되고/거나, 보다 흔치 않은, 킬레이트를 항체로 접합시키기 위한 내부 가교의 다른 방법 및 시약은 미국 특허 제4,824,659호 (호손(Hawthorne), 발명의 명칭 "Antibody Conjugates", 1989년 4월 25일 허여)에 개시되어 있으며, 그의 개시내용 전문이 본원에 참조로 포함된다. 특히, 유용한 금속-킬레이트 조합물에는 방사성-영상법을 위한 진단 동위원소와 함께 사용된 2-벤질-DTPA 및 그의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체가 포함된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비방사성 금속과 착제를 형성하는 경우, 동일한 킬레이트는 본 발명의 항체와 함께 사용되는 경우 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 마크로시클릭 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성금속, 가장 특히 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종과 함께 각각 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 복합체는 관심있는 금속에 대해 고리 크기를 맞춤화함으로써 매우 안정하게 제조될 수 있다. RAIT를 위한 223Ra와 같은 핵종에 안정하게 결합하는 것에 대해 관심있는 다른 고리형 킬레이트, 예컨대 마크로시클릭 폴리에테르가 본원에 포함된다.
면역접합체는 치료제 또는 진단제를 사용한 항체 성분의 접합체이다. 진단제는 방사성 또는 비방사성 표지, 조영제 (예컨대, 자기 공명 영상법, 컴퓨터 단층촬영 또는 초음파용)를 포함할 수 있고, 방사성 표지는 감마-, 베타-, 알파-, 오제 전자-, 또는 양전자 방출 동위원소일 수 있다.
면역조절제는 존재하는 경우 전형적으로 대식세포, B-세포 및/또는 T 세포와 같은 면역 반응 캐스케이드에서 증식하거나 활성화되기 위해 면역 세포를 자극하는, 본 발명에서 정의된 치료제이다. 본원에 기재된 면역조절제의 예에는 사이토카인이 있다. 당업자가 이해할 것인 바, 특정 인터류킨 및 인터페론은 T 세포 또는 다른 면역 세포 증식을 자극하는 사이토카인의 예이다.
발현 벡터는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 유전자 발현은 구성적 프로모터 또는 유도가능 프로모터, 조직-특이적 조절 요소 및 증진제를 비롯한 특정 조절 요소의 조절하에 있다. 이러한 유전자는 상기 조절 요소에 "작동가능하게 연결"되는 것을 의미한다.
재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 또한, 상기 용어에는 상기 원핵 또는 진핵 세포뿐만 아니라, 숙주 세포의 염색체 또는 게놈 또는 숙주 세포의 세포에서 클로닝된 유전자(들)을 함유하기 위해 유전학적으로 조작된 트랜스제닉 동물이 포함된다.
다중특이성 항체는 상이한 구조를 갖는 적어도 2종의 표적, 예컨대 2개의 상이한 항원, 동일한 항원 상의 2종의 상이한 에피토프, 또는 합텐 및 항원 또는 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 한 특이성은, 예를 들어 B-세포, T-세포, 골수성-, 프라즈마-, 또는 비만-세포 항원 또는 에피토프에 대한 특이성일 것이다. 또다른 특이성은 B-세포 상에서 CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74 또는 CD22와 같은 동일한 세포 유형의 상이한 항원에 대한 특이성일 수 있다. 다원자가의 다중특이성 항체는 하나 초과의 결합 부위를 갖는 구성체이고, 결합 부위는 상이한 특이성을 갖는다. 예를 들어, 하나의 결합 부위가 하나의 항원과 반응하고 다른 결합 부위가 또다른 항원과 반응하는 이중특이성 디아바디(diabody)가 있다.
이중특이성 항체는 상이한 구조를 갖는 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 이중특이성 항체 (bsAb) 및 이중특이성 항체 단편 (bsFab)은, 예를 들어 GD2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 군, 및 치료제 또는 진단제를 갖는 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 군을 갖는다. 다양한 이중특이성 융합 단백질은 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다. 한 형태에서, 이중특이성 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 항원에 대해 단일 결합 부위를 가진 scFv, 및 제2 항원에 대해 단일 결합 부위를 가진 Fab 단편으로 이루어진 2가이다. 또다른 형태에서, 이중특이성 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 항원에 대해 2개의 결합 부위를 가진 IgG, 및 제2 항원에 대해 2개의 동일한 scFv로 이루어진 4가이다.
최근 이중특이성 MoAb의 생산 방법에는, 보다 흔한 면역글로불린 이소형보다 더 강하게 가교되도록 추가의 시스테인 잔기를 갖는, 조작된 재조합 MoAb가 포함된다. 예컨대, 문헌 [FitzGerald et al., Protein Eng. 10 (10): 1221-1225, 1997]을 참조한다. 또다른 접근은, 요구되는 이중특이성을 가진 2개 이상의 상이한 단일쇄 항체 또는 항체 단편 세그먼트를 연결하는 재조합 융합 단백질을 조작하는 것이다. 예컨대, 문헌 [Coloma et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997]을 참조한다. 다양한 이중특이성 융합 단백질은 분자 공학을 이용하여 생산될 수 있다.
2개 이상의 상이한 단일쇄 항체 또는 항체 단편을 연결하는 이중특이성 융합 단백질은 유사한 방식으로 생산된다. 재조합 방법은 다양한 융합 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 가요성 링커는 scFv를 3F8 항체의 중쇄의 불변 영역으로 연결한다. 대안적으로, scFv는 또다른 인간화 항체의 경쇄의 불변 영역으로 연결될 수 있다. 중쇄 Fd를 scFv로 인-프레임 연결하는데 필요한 적절한 링커 서열은 PCR 반응을 통해 VL 및 Vkappa 도메인으로 도입된다. 이어서, scFv를 코딩하는 DNA 단편은, CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 스테이징 벡터 내로 라이게이션된다. 생성된 scFv-CH1 구성체는 절개되고, 3F8 항체의 VH 영역을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터로 라이게이션된다. 생성된 벡터는 이중특이성 융합 단백질의 발현을 위해 포유동물 세포와 같은 적절한 숙주 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 3F8 항체 및 그의 단편은 기능성 이중특이성 단일쇄 항체 (bscAb) (또한 디아바디로 명명함)를 제조하기 위해 사용될 수 있고, 재조합 방법을 사용하여 포유동물 세포에서 생산될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, bscAb는 재조합 방법을 사용하여 글리신-세린 링커를 통해 2개의 단일쇄 Fv 단편을 연결함으로써 생산된다. 관심있는 2개의 항체의 V 경쇄 및 V 중쇄 도메인은 당업계에 공지된 표준 PCR 방법을 이용하여 단리된다. 이중특이성 단일쇄 항체 및 이중특이성 융합 단백질은 본 발명의 범주내에 포함된다.
본원에 기재된 이중특이성 디아바디의 궁극적인 용도는 진단/검출 작용제 또는 치료제의 후속적인 특이적 전달을 위한, GD2 양성 세포의 예비표적화를 위한 것이다. 이러한 디아바디는 증가된 친화도 및 목적하는 위치에서의 보다 장기간의 체류 시간을 가능하게 하는 표적화된 항원에 선택적으로 결합한다. 게다가, 비-항원 결합 디아바디는 신체로부터 빠르게 제거되고, 정상 조직의 노출이 최소화된다. 진단/검출 작용제 및 치료제에는 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 성장 인자, 접합체, 방사성핵종 및 금속이 포함될 수 있다. 예를 들어, 가돌리늄 금속은 자기 공명 영상법 (MRI)을 위해 사용된다. 또한, 특히 60 내지 4,000 keV의 범위의 에너지에 있는 방사성핵종은 진단제 및 치료제로서 사용가능하다.
표적가능한 구성체는 다양한 구조를 가질 수 있으나, 면역 반응을 유발하는 것을 피하기 위해서뿐만 아니라, bsAb 표적화 방법에서 사용되는 경우 빠른 생체내 제거를 위해서 선별된다. 소수성 작용제는 강한 면역 반응을 유발하는데 최상인 반면, 친수성 작용제는 빠른 생체내 제거를 위해 바람직하기 때문에, 소수성 및 친수성의 균형이 확립될 필요가 있다. 이것은, 부분적으로 다수의 유기 모이어티의 고유 소수성을 상쇄시키기 위한 친수성 킬레이팅 작용제의 사용으로 변화시켜 달성된다. 또한, 반대 용액 특성을 갖는 표적가능한 구성체의 서브유닛, 예를 들어 아미노산 중 일부는 소수성이고 아미노산 중 일부는 친수성인 아미노산을 함유하는 펩티드가 선택될 수 있다. 펩티드 이외에, 탄수화물이 사용될 수 있다.
2개 정도의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드가 사용될 수 있으며, 또한 킬레이팅 작용제와 같은 다른 모이어티와 결합하는 경우, 2개 내지 10개의 잔기를 갖는 펩티드가 바람직하다. 링커는 저분자량 접합체, 바람직하게는 킬레이트 중의 금속 이온을 포함하여 50,000 달톤 미만, 및 유리하게는 약 20,000 달톤, 10,000 달톤 또는 5,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 접합체이어야 한다.
링커 잔기 상의 친수성 킬레이트 잔기의 존재는 신속한 생체내 제거를 돕는다. 킬레이터는 친수성 뿐만 아니라 그의 금속-결합 특성에 대해 선택되며, 적어도 링커의 bsAb 에피토프가 펩티드의 일부이거나 비-킬레이트 화학 합텐인 경우에는 금속-킬레이트 착체의 인식이 더 이상 문제가 되지 않으므로, 임의로 교체된다.
검출가능한 표지, 예컨대 형광 분자, 또는 세포독성제, 예컨대 중금속 또는 방사성핵종을 킬레이터, 예컨대 DTPA, DOTA, TETA 또는 NOTA, 또는 적합한 펩티드에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 치료상 유용한 면역접합체는 광활성제 또는 염료를 항체 융합 단백질에 접합시켜 얻어질 수 있다. 형광 조성물, 예컨대 형광색소, 및 다른 발색체 또는 염료, 예컨대 가시광선에 민감한 포르피린을 사용하여 적합한 광선을 병변에 조사함으로써 병변을 검출 및 치료하였다. 요법상 이는 광방사(photoradiation), 광요법 또는 광역동요법으로 명명된다 (문헌 [Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985)]; [van den Bergh, Chem. Britain 22:430 (1986)]). 또한, 광요법을 달성하기 위해서 모노클로날 항체를 광활성 염료와 커플링하였다 (문헌 [Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983)]; [idem., Cancer Res. 45:4380 (1985]); [Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986)]; [idem., Photochem. Photobiol. 46:83 (1987)]; [Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989)]; [Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989)]; [Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)]). 그러나, 이러한 선행 연구는, 특히 항체 단편 또는 하위단편을 사용하는 내시경 요법 적용의 이용을 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명은 광활성제 또는 염료를 포함하는 면역접합체의 치료 용도를 고려한다.
동일한 킬레이터가 비-방사성 금속, 예컨대 Mn, Fe 및 Gd와 착체를 형성하는 경우, 이는 본 발명의 bsAb와 함께 사용시 MRI에 이용될 수 있다. 대환식 킬레이터, 예컨대 NOTA (1,4,7-트리아자-시클로노난-N,N',N''-트리아세트산), DOTA 및 TETA (p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테트라아세트산)가 다양한 금속 및 방사금속, 가장 특히 Ga, Y 및 Cu 각각의 방사성핵종과 함께 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제 투여의 결과로서 대상체에서 장애의 하나 이상의 증상의 재발 또는 발병의 예방을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "조합하여"는 하나 초과의 예방제 및/또는 치료제의 사용을 나타낸다. 용어 "조합하여"의 사용은 예방제 및/또는 치료제가 장애를 가진 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 제1 예방제 또는 치료제는 제2 예방제 또는 치료제의 투여 전에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전에), 이와 동시에 또는 투여 후에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후에) 장애를 가진 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로 인한 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능에는, 이들로 한정되지는 않지만, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 항체 의존성 세포 매개된 식세포작용 (ADCP) 및 보체 매개 세포독성 (CMC)이 포함된다. 이펙터 기능에는 항원의 결합 후에 작동하는 것과 항원 결합과 무관하게 작동하는 것 둘 다가 포함된다.
본원에서 사용된 "이펙터 세포"는, 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 이펙터 세포에는, 이들로 한정되지는 않지만, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, 대형 과립 림프구, 랑게르한스 세포(Langerhans' cell), 자연 살해 (NK) 세포, T-림프구, B-림프구가 포함되고, 이들로 한정되지는 않지만, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함한 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다.
본원에서 사용된 "Fc 리간드"는, 항체의 Fc 영역과 결합하여 Fc-리간드 복합체를 형성하는, 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드에는, 이들로 한정되지는 않지만, Fc-감마-RIIA (CD32A), Fc-감마-RIIB (CD32B), Fc-감마-RIIIA (CD16A), Fc-감마-RIIIB (CD16B), Fc-감마-RI (CD64), Fc-엡실론-RII (CD23), FcRn, C1q, C3, 포도상구균 단백질 A, 포도상구균 단백질 G 및 바이러스 Fc.감마.R이 포함된다. Fc 리간드는 Fc와 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다.
바람직한 특정 실시양태에서, 본 발명은 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함하고, 여기서 상기 변이체 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여 상기 분자가 FcγR에 대해 변경된 친화도를 갖게 하되, 단, 상기 변이체 Fc 영역은 문헌 [Sondermann et al., 2000 (Nature, 406: 267-273)] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 Fc-FcγR 상호작용의 결정학적 및 구조적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 위치에서의 치환을 갖지는 않는다. FcγR과 직접 접촉하는 Fc 영역 내의 위치의 예는 아미노산 234-239 (힌지 영역), 아미노산 265-269 (B/C 루프), 아미노산 297-299 (C'/E 루프) 및 아미노산 327-332 (F/G) 루프이다. 몇몇 실시양태에서, 변이체 Fc 영역을 포함하는 본 발명의 분자는 구조적 및 결정학적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함한다.
본 발명의 한 측면은, 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는, 활성 및/또는 억제 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는 3F8 항체를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 239에서의 아스파르트산으로의 치환, 위치 330에서의 류신으로의 치환 및 위치 332에서의 글루탐산으로의 치환이다 (실시예 13 참조).
본 발명은, 본 발명의 항체의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산에 대해 부가, 결실 및/또는 치환을 가져 이펙터 기능을 변경하거나 또는 FcR에 대한 항체의 친화도를 향상 또는 감소시킨 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이러한 돌연변이는 당업계의 기술 범위 내에 있다. 따라서, 본 발명은, 보다 높은 친화도로 하나 이상의 FcγR과 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이러한 분자는 바람직하게는 하기에서 논의되는 바와 같이 보다 효과적으로 이펙터 기능을 매개한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 보다 약한 친화도로 하나 이상의 FcγR과 결합하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정 사례에서, 예를 들어 작용 메커니즘이 표적 항원을 가진 세포를 차단하거나 길항하지만 사멸시키지는 않는 것을 포함하는 항체의 사례에서 바람직하다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 이펙터 세포에서 FcγR 활성 수용체를 차단하는 자가면역질환의 사례에서 바람직할 것이다 (상기 유형의 기능은 숙주 세포에서 존재함). 일반적으로, 증가된 이펙터 기능은 종양 및 외래 세포를 향할 것이다.
본 발명의 Fc 변이체는, 이들로 한정되지는 않지만, 이펙터 기능을 변경하는 변형체를 포함한 다른 Fc 변형체와 조합될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 Fc 변이체를 다른 Fc 변형체와 조합하여 항체 또는 Fc 융합체에 부가, 상승 또는 신규 특성을 제공하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 Fc 변이체는 이들과 조합하는 변형체의 표현형을 향상시킨다. 예를 들어, 본 발명의 Fc 변이체가, 야생형 Fc 영역을 포함하는 비교가능한 분자보다 높은 친화도로 FcγRIIIA와 결합하는 것으로 공지된 돌연변이체와 조합하는 경우, 본 발명의 돌연변이체와의 조합물은 FcγRIIIA 친화도를 보다 큰 배수로 향상시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 하나 이상의 조작된 글리코형, 즉, Fc 영역을 포함하는 분자에 공유 부착된 탄수화물 조성물을 포함하는 항체 또는 Fc 융합체로 혼입되고, 여기서 상기 탄수화물 조성물은 Fc 영역을 포함하는 모 분자의 것과 화학적으로 상이하다.
본 발명은 바람직하게는 항체의 기능성, 예를 들어 GD2 결합 활성의 변경 없이 변형된 글리코실화 부위를 갖는 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 "글리코실화 부위"는 올리고사카라이드 (즉, 서로 연결된 2개 이상의 단순 당을 함유한 탄수화물)가 특이적으로 및 공유 부착될 항체 내 임의의 특정 아미노산 서열을 포함한다. 올리고사카라이드 측쇄는 통상 N- 또는 O-연결기를 통해 항체의 주쇄에 연결된다. N-연결된 글리코실화는 올리고사카라이드 잔기의 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 부착을 나타낸다. O-연결된 글리코실화는 올리고사카라이드 잔기의 히드록시아미노산, 예를 들어 세린, 트레오닌으로의 부착을 나타낸다. Fc-글리코형인 hu3F8-H1L1-IgG1n (푸코스 및 말단 N-아세틸글루코사민을 포함한 특정 올리고사카라이드가 결여됨)은 전용 CHO 세포에서 생산되고, 향상된 ADCC 이펙터 기능을 나타내었다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 글리코실화 부위를 부가 또는 제거하여 본 발명의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,218,149호; EP 0 359 096 B1; 미국 공보 제2002/0028486호; WO 03/035835; 미국 공보 제2003/0115614호; 미국 특허 제6,218,149호; 미국 특허 제6,472,511호 (이들 모두는 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 항체의 하나 이상의 내인성 탄수화물 잔기를 제거하여 본 발명의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 위치 297을 아스파라긴에서 알라닌으로 변형시켜 항체의 Fc 영역의 글리코실화 부위를 제거하는 것을 포함한다.
조작된 글리코형은, 이들로 한정되지는 않지만, 이펙터 기능의 향상 또는 감소를 포함한 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 글리코형은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서, 예를 들어 조작되거나 변이된 발현 균주를 이용하거나, 하나 이상의 효소, 예컨대 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIll)과 함께 발현시키거나, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시키거나, Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물을 변형시켜 생성될 수 있다. 조작된 글리코형을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이들로 한정되지는 않지만, 문헌 [Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473]; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 일련번호 제10/277,370호; 미국 일련번호 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; 포틸레전트(Potillegent)™ 기술 (바이오와, 인크.(Biowa, Inc. 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)); 글리코마브(GlycoMAb)™ 글리코실화 조작 기술 (글리카트 바이오테크놀러지 아게(GLYCART biotechnology AG, 스위스 취리히 소재)) (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; 문헌 [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49] (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본원에서 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 사용된 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "유도체"는, 즉, 임의 유형의 분자의 폴리펩티드 또는 단백질로의 공유 부착에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 항체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등에 의해 변형될 수 있다. 유도체 폴리펩티드 또는 단백질은, 이들로 한정되지는 않지만, 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 비롯한 당업계에 공지된 기술을 이용한 화학적 변형으로 생성될 수 있다. 또한, 유도체 폴리펩티드 또는 단백질 유도체는 이를 유도한 폴리펩티드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "단편"은 또 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 10개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 20개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 25개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 40개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 50개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 60개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 70개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 80개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 90개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 100개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 125개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 150개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 175개의 연속 아미노산 잔기, 적어도 200개의 연속 아미노산 잔기 또는 적어도 250개의 연속 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 단편은 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 보유한다.
유효량: 본원에서 사용된 용어 "유효량"은 소정의 화합물, 접합체 또는 조성물의 목적하는 생물학적 효과를 얻는 데 필요하거나 충분한 양을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따른 소정의 화합물, 접합체 또는 조성물의 유효량은 이러한 선택된 결과를 달성하는 양이며, 이러한 양은 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 검정을 이용하여 당업자가 통상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 암 전이를 치료 또는 예방하기 위한 유효량은 생체내 기저막 또는 내피층을 가로지르는 종양 세포의 이동 및 침습을 방지하는 데 필요한 양일 수 있다. 또한, 상기 용어는 "충분량"과 동의어이다. 임의의 특정 용도에 있어서 유효량은 치료할 질환, 장애 또는 병태, 투여할 특정 조성물, 투여 경로, 대상체의 크기 및/또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 요소에 따라 다양할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 본원에서 제공된 안내에 따라 본 발명의 특정 화합물, 접합체 또는 조성물의 유효량을 실증적으로 결정할 수 있다.
측정량과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "약"은 측정의 객관성 및 사용된 측정 기기의 정확도에 비례하여 측정 및 관리를 수행하는 당업자에 의해 예상되는 측정량에서의 일반적인 변화량을 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, "약"은 제공된 값의 +/-10%의 변화량을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 그의 자연 환경에서는 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 꺼내어질 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분획, 또는 일부 또는 상당히 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 같이 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 고려된다.
또한, 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 발명의 폴리펩티드로서 포함된다. 항-GD2 항체 또는 항체 폴리펩티드를 나타낼 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 항원-결합 특성 중 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드, 즉, GD2 상의 하나 이상의 에피토프와 결합하는 능력을 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본원에서 논의되는 특정 항체 단편 뿐만 아니라 단백질가수분해성 단편 및 또한 결실 단편을 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 항-GD2 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체는 상기 기재된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이유발 기술 또는 비천연 아미노산을 이용하여 생성될 수 있다. 변이 폴리펩티드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 항-GD2 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 천연 폴리펩티드에서는 발견되지 않는 부가적인 특징을 나타내도록 변경된 폴리펩티드이다. 그 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로도 언급될 수 있다. 본원에서 사용된 항-GD2 항체 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 관능성 곁사슬의 반응으로 화학적으로 유도된 하나 이상의 잔기를 갖는 본 발명의 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 20개의 표준 아미노산 중 하나 이상의 자연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린 대신 사용될 수 있고; 5-히드록시리신이 리신 대신 사용될 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신 사용될 수 있고; 호모세린이 세린 대신 사용될 수 있으며; 오르니틴이 리신 대신 사용할 수 있다.
치료: 본원에서 사용된 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 요법을 나타내고, 여기서 특히, 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증의 진행을 예방하거나 지연 (감소) 시키는 것이 목적이다. 유익한 또는 목적하는 임상적 결과에는, 이들로 한정되지는 않지만, 검출가능 여부에 상관없이 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 지체, 질환 상태의 완화 또는 일시적 완화, 및 (일부 또는 완전한) 차도가 포함된다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존률에 비해 연장된 생존률을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들에는 이미 병태 또는 장애를 가진 이들 뿐만 아니라, 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 이들, 또는 병태 또는 장애를 예방할 이들이 포함된다. "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법을 원하는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체에는 인간 및 다른 영장류, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소(cattle, cow) 등이 포함된다.
인간화 항체
한 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 모노클로날 항체이고, 바람직한 실시양태에서 이는 다른 종으로부터 유래된 동족 항-GD2 항체의 인간화 버전이다. 인간화 항체는, 항원 결합을 필요로 하지 않는 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (예를 들어, 불변 영역, 및 가변 도메인의 프레임워크 영역)의 일부 또는 모든 아미노산을 동족의 비인간 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 상응하는 아미노산 대신 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 항체이다. 예로서, 소정의 항원에 대한 쥐과 동물 항체의 인간화 버전은 그의 중쇄 및 경쇄 모두에 (1) 인간 항체의 불변 영역; (2) 인간 항체의 가변 도메인으로부터의 프레임워크 영역; 및 (3) 쥐과 동물 항체로부터의 CDR을 갖는다. 필요한 경우, 인간 프레임워크 영역 내 하나 이상의 잔기를 쥐과 동물 항체 내 상응하는 위치의 잔기로 교체하여 항원에 대한 인간화 항체의 결합 친화도를 보존할 수 있다. 이러한 변화를 종종 "복귀 돌연변이"라 칭한다. 유사하게, 전진 돌연변이는 원하는 이유, 예를 들어 안정성 또는 항원 친화도를 위해 쥐과 동물 서열로의 복귀를 다시 되돌릴 수 있다. 예를 들어, hu3F8-H1L1-IgG1의 경우, 시험관내 결합 친화도를 유지하기 위해서 중쇄 서열의 19 위치 및 경쇄의 17 위치에서의 복귀 돌연변이가 필요하였다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 인간 항체보다 상당히 적은 비-인간 구성요소를 함유하므로 키메라 인간 항체에 비해 인간에서 면역 반응을 유발할 가능성이 적다.
본 발명의 인간화 항체의 적합한 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Winter EP 0 239 400]; [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)]; [Queen et al., Proc . Nat. Acad. ScL USA 86:10029 (1989)]; 미국 특허 6,180,370; 및 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:3833 (1989)] (이들 모두의 개시내용의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 일반적으로, 쥐과 동물 (또는 다른 비-인간) CDR의 인간 항체로의 이식은 다음과 같이 이루어진다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를 하이브리도마로부터 단리한다. CDR을 포함한 가변 도메인의 DNA 서열을 염기서열결정법으로 결정한다. 목적하는 이소형의 인간 불변 영역 유전자 절편 (예를 들어, CH의 경우 γ1 및 CL의 경우 κ)에 부착된, 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 코딩 서열의 상응하는 영역에 삽입된 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 합성하였다. 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 NSO 세포)에서 함께 발현시켜 적합한 인간화 항체를 생성하였다. 항체의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해, 생산자 세포주에서 DHFR 유전자 또는 GS 유전자를 사용하는 고 발현체(high expressor)를 선택하는 것이 종종 바람직하다. 이러한 생산자 세포주를 생물반응기 또는 중공 섬유 배양 시스템에서 또는 웨이브 기술(WAVE technology)로 배양하여 가용성 항체의 대량 배양물을 생산하거나 또는 우유에서 항체를 발현하는 트랜스제닉 포유동물 (예를 들어, 염소, 소 또는 양)을 생산한다 (예를 들어, 미국 특허 5,827,690 참조).
상술한 접근법을 이용하여 3F8 항체의 인간화 및 키메라 버전을 생성하였다. 본원 실시예에 기재된 바와 같이, 경쇄 및 중쇄의 쥐과 동물 3F8 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 사용하여, 쥐과 동물 3F8 가변 영역이 인간 IgG1 (중쇄의 경우) 및 인간 카파 (경쇄의 경우) 불변 영역에 연결된, 쥐과 동물-인간 키메라의 발현을 위한 벡터를 구축하였다. 또한, 다양한 글리코실화를 갖는 신규한 형태의 hu3F8을 만들어 Fc 수용체와의 결합을 향상시키고, 항원 친화도를 향상시켰다.
인간화 3F8 항체를 생성하기 위해서, 인간 수용체 프레임워크 도메인을 인간 생식세포 서열에 대한 상동성 매칭으로 선택하였다. 이러한 선택된 인간 수용체 프레임워크를 이용하여, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 고안하고, 이들 각각의 다수의 변이체/버전을 생성 및 발현하였다.
본 발명의 MoAb의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 본 출원에 기재되어 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 엄격한 또는 보다 낮은 엄격 혼성화 조건 하에 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 이제 당업계에 공지된 임의의 방법으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있으므로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 어셈블리할 수 있는데 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기재된 바와 같음), 요컨대 이는, 항체를 코딩하는 서열의 부분들을 함유하는 오버래핑 올리고뉴클레오티드의 합성, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션, 및 이어서 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭을 포함한다.
별법으로, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유한 클론은 이용불가능하지만 항체 분자의 서열은 공지되어 있는 경우, 면역글로불린을 코딩하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단과 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해서, 또는 예를 들어 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부 cDNA 클론을 확인하는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해서 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본 발명의 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리)으로부터 얻어질 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당업계에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝할 수 있다.
항체의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 결정되어 있으므로, 항체의 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열의 조작에 관한 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.] (이는 둘 다 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 기술 참조)을 이용하여 조작함으로써, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 일어난 다양한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 RNA의 형태, 예컨대 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 DNA의 형태, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 클로닝으로 얻어지거나 합성으로 생성된 cDNA 및 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합의 형태일 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥 중 임의의 부분이 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나 또는 안티-센스 가닥으로도 불리는 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 임의로 하나 이상의 인트론을 갖는 오픈 리딩 프레임 (ORF), 예를 들어 이들로 한정되지는 않지만, 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3과 같은 하나 이상의 CDR의 적어도 하나의 명시된 부분을 포함하는 핵산 분자; 항-GD2 항체 또는 가변 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상술한 바와 실질적으로 상이하지만, 유전자 코드의 동의성으로 인해 본원에 기재되고/거나 당업계에 공지된 적어도 하나의 항-GD2 항체를 여전히 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 선택적 혼성화 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 상기 실시양태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 기탁된 라이브러리에서 일부 또는 전장 클론을 확인, 단리 또는 증폭시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유동물의 핵산 라이브러리로부터 단리되거나 또는 다르게는 이로부터의 cDNA와 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열이다.
핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함한 다중-클로닝 부위를 핵산에 삽입하여 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 또한, 번역가능한 서열을 삽입하여 번역된 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열이 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산 (코딩 서열 제외)은 임의로 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가 서열을 부가하여 클로닝 및/또는 발현에서 이들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입을 개선시킬 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel] 또는 [Sambrook] 참조).
상술한 단리된 또는 정제된 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 상기 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것을 임의의 적합한 벡터로 클로닝할 수 있고, 이를 사용하여 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있다. 벡터를 선택하고 구축하는 방법은 당업계에 통상 공지되어 있으며, 일반 기술 문헌 (일반적으로, 문헌 ["Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 바람직하게는, 벡터는 적합한 경우에 및 벡터가 DNA인지 또는 RNA인지를 고려하여, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 숙주의 속에 특이적인 조절 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 벡터는 숙주의 종에 특이적인 조절 서열을 포함한다.
복제 시스템 및 삽입될 핵산 뿐만 아니라, 구축물도 하나 이상의 마커 유전자를 포함하여 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 할 수 있다. 마커 유전자는 살생제 내성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성(prototrophy)을 제공하는 영양요구성 숙주에서의 보완 등을 포함한다.
적합한 벡터는 증식 및 팽창을 위해서 또는 발현을 위해서 또는 이들 둘 다를 위해서 고안된 것을 포함한다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 pUC 시리즈, pBluescript 시리즈 (스트라타진(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)), pET 시리즈 (노바겐(Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)), pGEX 시리즈 (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재)) 및 pEX 시리즈 (클론테크(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII (스트라타진), λEMBL4 및 λNM1149를 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 예에는 pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (클론테크)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예에는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo (클론테크)가 포함된다. 또한, 제조업자의 권유에 따라 TOPO 클로닝 시스템 (인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포이나주 칼스배드 소재))을 사용할 수 있다.
발현 벡터는 상기 기재된 바와 같이 단리 또는 정제된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어 강, 약, 유도성, 조직-특이적 및 발생-특이적 프로모터의 선택은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 유사하게, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 그의 단편과 프로모터의 조합도 또한 당업계의 기술 범위 내에 있다.
적합한 바이러스 벡터에는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 파보바이러스-기재 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기재 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터 및 아데노바이러스-기재 벡터, 및 렌티바이러스 벡터, 예컨대 단순포진바이러스 (HSV)-기재 벡터가 포함된다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래한다. 레트로바이러스는 다양한 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 RNA 바이러스이다. 감염 후, 레트로바이러스 게놈은 그의 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 세포 DNA와 함께 복제됨으로써, 레트로바이러스 게놈에 혼입되는 바이러스 RNA 및 임의의 핵산 서열을 지속적으로 생산한다. 따라서, 레트로바이러스의 사용시 치료 인자의 장기 발현을 달성할 수 있다. 병원성 레트로바이러가 존재하기는 하지만, 유전자 요법에서 사용이 고려되는 레트로바이러스는 비교적 비-병원성이다. 병원성 레트로바이러스, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 (HTLV)를 사용하는 경우, 바이러스 게놈을 변경하여 숙주에 대한 독성을 제거하는 관리가 수행되어야 한다. 또한, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 복제가 결핍되도록 조작될 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 벡터는 생체내 안정한 유전자 도입에 특히 유용한 것으로 고려된다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대 HIV-기재 벡터는 유전자 전달에 사용되는 레트로바이러스 벡터의 전형이다. 다른 레트로바이러스와 달리, HIV-기재 벡터는 그의 외래 유전자를 비-분열 세포로 혼입하여 질환의 지속적인 형태를 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 공지되어 있다.
임의로, 단리 또는 정제된 핵산 분자 또는 그의 단편이 또 다른 핵산 분자와 연결된 후 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 융합 단백질의 생성은 당업계의 통상의 기술 범위 내에 있으며, 제한 효소 또는 재조합 클로닝 기술의 이용을 포함할 수 있다 (예를 들어, 상표명 게이트웨이(Gateway.TM. (인비트로겐)) 참조). 또한, 미국 특허 제5,314,995호를 참조한다.
상술한 바를 고려하여, 본 발명은 또한 상기 기재된 단리 또는 정제된 핵산 분자를 임의로 벡터의 형태로 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 본원에 추가 기재된 다른 구성요소를 포함할 수 있다.
또한, 상술한 바를 고려하여, 본 발명은 상기 기재된 단리 또는 정제된 핵산 분자를 임의로 벡터의 형태로 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 세포가 벡터를 발현시켜 올리고뉴클레오티드 또는 그의 단편이 세포에 의해 효율적으로 전사 및 번역되도록 하는 것이 가장 바람직하다. 세포의 예에는, 이들로 한정되지는 않지만, 인간 세포, 인간 세포주, 이. 콜라이(E. coli) (예를 들어, 이. 콜라이 TB-1, TG-2, DH5α, XL-Blue MRF' (스트라타진), SA2821 및 Y1090), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 피. 애루기노사(P. aeruginosa), 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 엔. 크라사(N. crassa), 곤충 세포 (예를 들어, Sf9, Ea4) 및 하기 본원에 명시된 기타 집합이 포함된다. 숙주 세포는 동물, 예컨대 포유동물, 특히 인간일 수 있는 숙주에 존재할 수 있다.
용어 "폴리펩티드"는 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 나타내는 일반 용어로서 본원에서 사용된다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열식별번호:1, 2, 4, 7, 8로 나타낸 중쇄 면역글로불린 분자 및 서열식별번호:2, 5, 6으로 나타낸 경쇄 면역글로불린 분자, 및 또한 중쇄 면역글로불린 분자와 경쇄 면역글로붙린 분자, 예컨대 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합 및 그 반대에 의해 형성된 항체 분자, 및 이들의 단편 및 유사체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 통상의 재조합 DNA 기술을 이용하여 본원에서 확인된 CDR 중 하나 이상을 프레임워크 영역 내로 삽입할 수 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 컨센서스(consensus) 프레임워크 영역, 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수 있다 (예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 열거에 대해서는 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998)] 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역과 CDR의 조합으로 생성된 폴리뉴클레오티드는 GD2와 특이적으로 결합하는 항체를 코딩한다. 하나 이상의 아미노산 치환이 프레임워크 영역 내에서 일어날 수 있고, 바람직하게는 아미노산 치환은 항체와 그의 항원의 결합을 개선시킨다. 또한, 이러한 방법을 이용하여 쇄내 디술피드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 수행함으로써, 하나 이상의 쇄내 디술피드 결합이 결여된 항체 분자를 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변경도 본 발명 및 당업계의 기술 범위 내에 포함된다.
완전 인간 항체는 인간 환자의 치유적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 상기 기재된 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 방법으로 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호 및 동 제4,716,111호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/60433, WO 98/24893, WO 98/16664, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741 (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 또한, 콜(Cole) 등 및 뵈더(Boerder) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다 (문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95, (1991)]).
다른 기술을 이용하여 생성되지만 본 발명의 항-GD2 항체의 가변 영역을 보유하는 인간 항체는 본 발명의 일부이다. 인간 항체는 또한, 기능성 내인성 마우스 면역글로불린은 발현시킬 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자는 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 마우스 배아 줄기 세포에 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 도입할 수 있다. 다르게는, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 뿐만 아니라, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 마우스 배아 줄기 세포에 도입할 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별개로 또는 동시에 비기능화될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실은 내인성 항체 생성을 막는다. 변형된 배아 줄기 세포를 팽창시키고, 배세포로 미세주입하여 키메라 마우스를 생성한다. 이어서, 상기 키메라 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다. 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 이용하여 통상의 방식으로 면역화한다. 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 이용하여 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 제공된 인간 면역글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 중에 재배열되고, 이어서 종류 변환 및 체세포 돌연변이가 수행된다. 따라서, 이러한 기술을 이용하여 치료상 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성하는 상기 기술의 개관을 위해 문헌 [Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생성하는 상기 기술 및 이러한 항체를 생성하는 프로토콜에 대한 자세한 논의는, 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,886,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598호 (이들의 전문은 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc., 미국 캘리포니아주 프리몬트 소재), 젠팜(Genpharm, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc., 미국 뉴저지주 프린스톤 소재)와 같은 회사가 상기 기재된 바와 유사한 기술을 이용하여, 선택된 항원에 대해 지정된 인간 항체를 제공하기로 계약할 수 있다.
또한, 인간 MoAb는 인간 말초 혈액 백혈구, 비장세포 또는 골수가 이식된 면역화 마우스에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, XTL의 트리오마(Trioma) 기술). 선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "안내된 선별"이라 불리는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 상기 접근법에서, 선별된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선별을 안내할 수 있다 (문헌 [Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)]).
본원에서 사용된 "항-GD2 항체", "항-GD2 항체 부분" 또는 "항-GD2 항체 단편" 및/또는 "항-GD2 항체 변이체" 등은, 본원에 기재된 키메라 또는 인간화 모노클로날 항체 중 임의의 것으로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분을, 비-쥐과 동물 기원, 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이들의 임의의 부분과 조합하여 함유하는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하고, 이는 본 발명의 항체에 혼입될 수 있다. 다르게는, 용어 "항-GD2 항체"는 키메라 항체 ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, 인간화 모노클로날 항체 hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8H1L2-IgG1, hu3F8H2L1-IgG1 hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1-I-감마-1, huH3-I-감마-1, hu3F8-IgG1-DEL 항체, 및 또한 이들의 단편 및 영역을 집합적으로 또는 개별적으로 나타낸다. 이러한 항체는 시험관내, 동일계내 및/또는 생체내 적어도 하나의 세포 기능을 조정, 감소, 길항, 진정, 경감, 차단, 억제, 완화 및/또는 방해할 수 있고, 여기서 상기 세포는 GD2를 발현한다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 적합한 항-GD2 항체, 특정 부분 또는 변이체는 인간 GD2의 에피토프와 높은 친화도로 결합할 수 있다.
용어 "항체"는 항체, 그의 소화 단편, 특정 부분 및 변이체, 예컨대 항체 모방체, 또는 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방한 항체의 부분, 예컨대 단일쇄 항체 및 그의 단편을 추가로 포함하고, 이들 각각은 항-GD2 항체로부터 유래된 적어도 하나의 CDR을 함유한다. 기능성 단편은 포유동물 GD2와 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, GD2와 결합할 수 있는 항체 단편 또는 그의 부분, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, Fab (예를 들어, 파파인 소화에 의해 생성됨), Fab' (예를 들어, 펩신 소화 및 일부 환원에 의해 생성됨) 및 F(ab')2 (예를 들어, 펩신 소화에 의해 생성됨), facb (예를 들어, 플라스민 소화에 의해 생성됨), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 소화에 의해 생성됨), Fd (예를 들어, 펩신 소화, 일부 환원 및 재결합에 의해 생성됨), Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자 생물학 기술에 의해 생성됨) 단편이 본 발명에 포함된다 (예를 들어, 상기 문헌 [Colligan, Immunology] 참조).
항체 단편은 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 효소 절단, 합성 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 정지 코돈이 본래의 정지 코돈의 상류에 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 말단절단형으로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 조합 유전자가 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 고안될 수 있다. 항체의 다양한 부분을 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 결합할 수 있거나, 또는 유전자 조작 기술을 이용하여 연속 단백질로 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 "키메라" 항체 또는 "인간화" 항체 또는 "CDR-그라프팅된"은 비-쥐과 동물, 바람직하게는 인간 항체로부터 유래된 하나 이상의 단백질 또는 펩티드와 조합한 본원에 기재된 항-GD2 Ab 또는 이로부터 유래한 임의의 CDR의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에 따라, 키메라 또는 인간화 항체는, CDR이 본원에 기재된 항-GD2 Ab 및 적어도 하나의 부분 중 하나 이상으로부터 유래하거나 또는 항체의 나머지가 하나 이상의 인간 항체로부터 유래한 것들을 포함한다. 따라서, 항체의 인간 부분은 인간에서 실질적으로 비-면역원성인 프레임워크, CL, CH 도메인 (예를 들어, CH1, CH2, CH3), 힌지 영역을 포함할 수 있다. 인간 항체로부터 유래된 항체의 영역은 인간 항체와 100% 동일성을 가질 필요는 없다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성이 무시되도록 가능한 많은 인간 아미노산 잔기를 보유하지만, 필요에 따라 항체의 인간화를 최대화함과 동시에 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위를 지지하도록 인간 잔기를 변형할 수 있다. 이러한 변화 또는 변동은 임의로 및 바람직하게는 비-변형 항체에 비해 인간 또는 다른 종에서 면역원성을 유지 또는 감소시킨다. 인간화 항체가, 기능상 재배열된 인간 면역글로불린 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵 또는 진핵 세포에 의해 생산될 수 있다는 점에 주목한다. 또한, 항체가 단일쇄 항체인 경우, 천연 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 링커 펩티드, 예컨대 2 내지 약 20개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 15개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결한다. 이러한 링커 펩티드는 인간 기원인 것으로 고려된다.
항체 인간화는, 예를 들어 개별 인간 프레임워크의 풀에 인 프레임 융합된 비-인간 표적 모노클로날 항체의 6개의 CDR을 포함하는 조합 라이브러리를 합성하여 수행될 수 있다. 모든 공지된 중쇄 및 경쇄 인간 생식세포 유전자를 대표하는 유전자를 함유하는 인간 프레임워크 라이브러리를 이용할 수 있다. 이어서, 생성된 조합 라이브러리를 관심 있는 항원과의 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 접근법은 모 항체에 대한 결합 활성을 유지한다는 점에서 전체 인간 프레임워크의 가장 유리한 조합의 선택을 가능하게 한다. 이어서, 인간화 항체를 다양한 기술로 추가로 최적화할 수 있다.
항체 인간화를 이용하여 마우스 또는 다른 비-인간 항체를 "완전 인간" 항체로 변화시킬 수 있다. 생성된 항체는 오직 인간 서열만을 함유하고, 마우스 또는 비-인간 항체 서열은 함유하지 않으면서 출발 항체와 유사한 결합 친화도 및 특이성을 유지한다.
전장 항체 분자의 경우, 면역글로불린 유전자는 하이브리도마 세포주의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 얻어질 수 있다. 항체 중쇄 및 경쇄를 포유동물 벡터 시스템에서 클로닝한다. 어셈블리는 이중 가닥 서열 분석으로 증명된다. 항체 구축물은 다른 인간 또는 포유동물 숙주 세포주에서 발현될 수 있다. 이어서, 구축물을 관심 있는 발현 항체의 일시적 형질감염 검정 및 웨스턴 블럿 분석으로 확인할 수 있다. 생산성이 가장 높은 안정한 세포주를 단리하고, 급속 검정 방법을 이용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 항-GD2 항체는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 세포주, 혼합 세포주, 불멸 세포 또는 불멸 세포의 클론 집단에 의해 임의로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001)]; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; [Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)] (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
한 접근법에서, 하이브리도마는 적합한 불멸 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A 등), 또는 헤테로골수종(heteromyeloma), 이들의 융합 생성물, 또는 이로부터 유래된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 세포주 (예를 들어, www.atcc.org, www.lifetech.com 참조) 등을, 내인성 또는 이종 핵산으로서, 재조합 또는 내인성, 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유동물, 설치류, 말류, 양류, 염소, 양, 영장류, 진핵, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록체 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 등, 또는 이들의 임의의 조합으로서 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변 또는 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 항체 생산 세포, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 단리 또는 클로닝된 비장, 말초 혈액, 림프, 편도선, 또는 다른 면역 또는 B 세포 함유 세포, 또는 임의의 다른 세포와 융합하여 생산된다. 예를 들어, 완전히 본원에 참조로 포함된 상기 문헌 [Ausubel] 및 [Colligan, Immunology], 챕터 2를 참조한다.
또한, 임의의 다른 적합한 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 항체, 그의 특정 단편 또는 변이체를 코딩하는 이종 또는 내인성 핵산을 발현할 수 있다. 융합 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포를 선택적 배양 조건 또는 다른 적합한 공지된 방법을 이용하여 단리할 수 있고, 한계 희석 또는 세포 선별, 또는 다른 공지된 방법으로 클로닝할 수 있다. 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포를 적합한 검정 (예를 들어, ELISA)으로 선별할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 코딩하는 핵산을 이용하여 우유에서 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물 또는 포유동물, 예컨대 염소, 소, 말, 양 등을 제공함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 공지된 방법을 이용하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 미국 특허 제5,827,690호; 동 제5,849,992호; 동 제4,873,316호; 동 제5,849,992호; 동 제5,994,616호; 동 제5,565,362호; 동 제5,304,489호 등 (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 항체는 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 코딩하는 핵산을 이용하여 식물의 일부 또는 이로부터 배양된 세포에서 이러한 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어, 이들로 한정되지는 않지만, 담배 및 옥수수)를 제공함으로써 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담뱃잎이, 예를 들어 유도성 프로모터를 이용하여 다량의 재조합 단백질을 제공하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 또한, 트랜스제닉 옥수수를 사용하여, 다른 재조합 시스템에서 생산되거나 또는 자연 공급원으로부터 정제된 것과 동일한 생물학적 활성을 갖는 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현시켰다. 예를 들어, 문헌 [Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 또한, 항체 단편, 예컨대 단일쇄 항체 (scFv's)를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자, 예컨대 담배 종자 및 감자 덩이줄기로부터 항체를 다량 생산하였다. 예를 들어, 문헌 [Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998)] 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트렌스제닉 식물을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (October, 1999)], [Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995)]; [Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6 (1995)]; [Whitelam et al., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994)]; 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 상기 참고문헌은 각각 완전히 본원에 참조로 포함된다.
항-GD2 항체는 널리 공지된 방법, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 단백질 A 정제, 단백질 G 정제, 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예컨대 챕터 1, 4, 6, 8, 9 및 10 (이들 각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 항체는 천연 정제된 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 진핵 숙주, 예컨대 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에서 이용되는 숙주에 따라 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있는데, 글리코실화되는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 많은 표준 실험 지침서, 예컨대 상기 문헌 [Sambrook], 섹션 17.37-17.42; 상기 문헌 [Ausubel], 챕터 10, 12, 13, 16, 18 및 20, 상기 문헌 [Colligan, Protein Science], 챕터 12-14 (이들 모두는 완전히 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다
정제된 항체를, 예를 들어 ELISA, ELISPOT, 유동세포계수법, 면역세포학, 비아코어(Biacore)™ 분석, 사피다인 킨엑사(Sapidyne KinExA)™ 운동 배제 검정, SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿, 또는 HPLC 분석, 및 또한 본원에 개시된 다수의 다른 기능 검정에 의해 특성화할 수 있다.
전형적인 포유동물 발현 벡터는 mRNA의 전사 개시를 매개하는 적어도 하나의 프로모터 요소, 항체 코딩 서열, 및 전사 종결 및 전사체의 폴리아데닐화에 필요한 신호를 함유한다. 추가 요소에는 인핸서, 코자크 서열, 및 RNA 스플라이싱을 위해 공여 및 수용 부위에 의해 플랭킹된 개재 서열이 포함된다. SV40으로부터의 전기 및 후기 프로모터, 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLVI, HIVI로부터의 장형 반복 말단 (LTRS), 및 거대세포바이러스 (CMV)의 전기 프로모터를 이용하여 높은 효율의 전사를 달성할 수 있다. 그러나, 또한 세포 요소 (예를 들어, 인간 액틴 프로모터)를 사용할 수도 있다. 본 발명의 수행시 사용하기에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN 또는 pLNCX (클론테크 랩스(Clonetech Labs, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) 또는 pcDNA3.1/Hygro (+/-) (인비트로겐), PSVL 및 PMSG (파마시아, 스웨덴 웁살라 소재), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) 및 pBC12MI (ATCC 67109)와 같은 벡터가 포함된다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포에는 인간 헬라(Hela) 293, H9 및 주르카트(Jurkat) 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 메추리 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 포함된다.
다르게는, 유전자는 염색체로 통합되는 유전자를 함유한 안정한 세포주에서 발현될 수 있다. 선별가능한 마커, 예컨대 DHFR, GPT, 네오마이신 또는 하이그로마이신을 이용한 공동-형질감염은 형질감염된 세포의 확인 및 단리를 가능하게 한다.
또한, 형질감염된 유전자를 증폭시켜 다량의 코딩된 항체를 발현시킬 수 있다. DHFR (디히드폴레이트 리덕타제) 마커가 수백 또는 심지어 수천 개의 관심 유전자 카피를 갖는 세포주를 나타나게 하는 데 유용하다. 또다른 유용한 선별 마커는 효소 글루타민 신타제 (GS)이다 (문헌 [Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279(1991)]; [Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)]). 이들 마커를 사용하여, 포유동물 세포를 선별 배지에서 성장시키고, 가장 높은 내성을 갖는 세포를 선별한다. 이들 세포주는 염색체로 통합된 증폭된 유전자를 함유한다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 NSO 세포를 항체 생산을 위해 종종 사용한다.
본 발명에 따르면, 항-GD2 항체는 ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-감마-1, huH3I-감마-1, hu3F8-IgG1-DEL 항체, 또는 가변 영역 또는 CDR이 ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-감마1, huH3I-감마1, hu3F8-IgG1-DEL 항체 중 어느 하나로부터 유래하고 항체의 프레임워크 및 불변 영역이 하나 이상의 인간 항체로부터 유래한 항체 중 어느 하나를 포함한다. 상기 항체로부터 유래된 가변 영역 또는 CDR은, 항체가 GD2와 결합하는 능력을 유지하는 한 자연 돌연변이 또는 인간 조작에 의한 치환, 삽입 및 결실을 포함하는 임의의 및 모든 변형이 고려되더라도, 바람직하게는 ch3F8-IgG1, ch3F8-IgG4, hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L1-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1, hu3F8-H1L1-IgG1n, hu3F8-H1L1-IgG4, hu3F8-H3L3, hu3F8-H1L1S, hu3F8-H3L3S, huH1I-감마1, huH3I-감마1, hu3F8-IgG1-DEL 중 어느 하나의 가변 영역 또는 CDR과 약 90% 내지 약 100% 동일성을 갖는다. 인간 항체로부터 유래된 키메라, 인간화 또는 CDR-그라프팅된 항체의 영역은 인간 항체와 100% 동일성을 가질 필요는 없다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성이 무시되도록 가능한 많은 인간 아미노산 잔기가 보유되지만, 인간 잔기, 특히 프레임워크 영역의 잔기는 본 발명에 따라 하기 본원에서 요구 및 교시되는 바와 같이 치환된다. 본원에 개시된 이러한 변형은 항체의 인간화를 최대화함과 동시에 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위를 지지하는 데 필요하다.
본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 보존적 아미노산 치환, 및 또한 아미노산 결실 및/또는 삽입을 포함한 서열을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 제1 아미노산을 제1 아미노산과 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성 (예를 들어, 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성)을 갖는 제2 아미노산으로 대체하는 것을 나타낸다. 보존적 치환은 하기 군에 속하는 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다: 리신 (K), 아르기닌 (R) 및 히스티딘 (H); 아스파르테이트 (D) 및 글루타메이트 (E); 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 세린 (S), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), K, R, H, D 및 E; 알라닌 (A), 발린 (V), 류신 (L), 이소류신 (I), 프롤린 (P), 페닐알라닌 (F), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 시스테인 (C) 및 글리신 (G); F, W 및 Y; C, S 및 T.
물론, 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것들을 포함한 여러 요소에 따라 당업자가 결정할 것이다. 일반적으로 말해서, 임의의 소정의 항-GD2 항체, 단편 또는 변이체에 대한 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 수는 본원에서 명시된 바와 같이 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 이하, 예컨대 1-30, 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값일 것이다.
기능에 필수적인 본 발명의 항-GD2 항체 내 아미노산을 당업계에 공지된 방법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel], 챕터 8, 15; 문헌 [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 절차는 분자의 모든 잔기에 하나의 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이체 분자를 생물학적 활성, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만 적어도 GD2와의 결합에 대해 시험한다. 또한, 항체 결합에 중요한 부위를 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화도 표지법과 같은 구조 분석으로 확인할 수 있다 (문헌 [Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 [de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]).
항-GD2 항체는 추가로 본원에 기재된 서열 중 적어도 하나로부터 유래된 CDR의 연속 아미노산의 70-100% 중 적어도 하나의 폴리펩티드를 임의로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 면역글로불린 쇄 또는 그의 일부 (예를 들어, 가변 영역, CDR)의 아미노산 서열은 표 1 내지 4 중 적어도 하나의 서열의 아미노산 서열에 대해 약 70-100% (예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값)의 동일성을 갖는다.
예시적인 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 본원에서 제공된다. 본 발명의 항체 또는 그의 특정 변이체는 본 발명의 항체로부터의 임의의 수의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 여기서 상기 수는 항-GD2 항체 내 연속 잔기의 수의 10-100%로 이루어진 정수의 군으로부터 선택된다. 임의로, 이러한 연속 아미노산의 하위서열은 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 또는 그 초과의 아미노산 길이, 또는 이들 중 임의의 범위 또는 값의 아미노산 길이이다. 또한, 이러한 하위서열의 수는 1 내지 20, 예컨대 적어도 2, 3, 4 또는 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 정수일 수 있다.
본 발명에 따라, 핵산 서열은 서열식별번호:11 내지 22로 명시되고, 항-GD2 항체의 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)의 추정 아미노산 서열은 서열식별번호:1 내지 10으로 명시된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각, 조합하여 항원 결합 부위를 형성하는 3개의 CDR을 함유한다. 3개의 CDR은 주로 CDR을 지지하는 기능을 하는 4개의 프레임워크 영역으로 둘러싸여 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 서열 내 CDR의 서열은 문헌 [Kabat et al. (1987) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., United States Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.]에 따른 컴퓨터-지원 정렬에 의해서 또는 예를 들어 문헌 [Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595]에 기재된 바와 같이 ENCAD 프로그램을 이용한 가변 영역의 분자 모델링에 의해서 확인할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체, 단편 및 영역의 불변 (C) 영역을 코딩하는 인간 유전자는 공지된 방법에 의해 인간 태아 간 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 인간 면역글로불린을 발현 및 생산하는 인간 세포를 비롯하여 임의의 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 인간 CH 영역은 감마, 뮤, 알파, 델타, 엡실론을 포함한 인간 H 쇄의 공지된 부류 또는 이소형, 및 이들의 하위유형, 예컨대 G1, G2, G3 및 G4 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. H 쇄 이소형은 항체의 다양한 이펙터 기능의 역할을 하므로, CH 영역의 선택은 목적하는 이펙터 기능, 예컨대 보체 고정 또는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)에서의 활성에 의해 좌우될 것이다. 바람직하게는, CH 영역은 감마 1 (IgG1) 또는 감마 4 (IgG4)로부터 유래된다.
인간 CL 영역은 인간 L 쇄 이소형인 카파 또는 람다, 바람직하게는 카파로부터 유래될 수 있다.
인간 면역글로불린 C 영역을 코딩하는 유전자는 표준 클로닝 기술 (문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology (1987-1993)])에 의해 인간 세포로부터 얻어진다. 인간 C 영역 유전자는 2가지 부류의 L 쇄, 5가지 부류의 H 쇄 및 이들의 하위부류를 나타내는 유전자를 함유하는 공지된 클론으로부터 용이하게 이용가능하다.
항체의 가변 영역의 서열은, 키메라 항체가 인간 GD2와 결합하는 능력을 유지하는 정도로 삽입, 치환 및 결실에 의해 변형될 수 있다. 당업자는 하기 기재된 기능 검정을 수행하여 상기 활성의 유지를 알 수 있다. 가변 영역은, 예를 들어 하기에서 확인된 가변 영역과 약 50% 내지 약 100% 상동성을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체의 가변 영역은 하기에서 확인된 가변 영역과 약 80% 내지 약 100% 상동성을 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가변 영역은 하기에서 확인된 가변 영역과 약 90% 내지 약 100% 상동성을 갖는다.
한 특정 측면에서, 본 개시내용의 바람직한 항-GD2 Mab는 본원에서 확인된 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 상동성을 갖는 가변 경쇄 영역을 포함하고, 추가로 본원에서 확인된 서열과 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 상동성을 갖는 가변 중쇄 영역을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 또는 그의 특정 부분 또는 변이체는 인간 GD2와 결합하여 하나의 GD2 단백질 또는 단편을 부분적으로 또는 실질적으로 중화함으로써 GD2를 통해 매개된 활성을 억제한다. 본원에서 사용된 용어 "중화 항체"는 GD2-의존성 활성을 검정에 따라 약 20-120%, 바람직하게는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 또는 그 초과만큼 억제할 수 있는 항체를 나타낸다. 항-GD2 항체의 GD2-의존성 활성을 억제하는 능력은 바람직하게는 본원에 기재되고/거나 당업계에 공지된 하나 이상의 적합한 검정에 의해 평가된다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 또한 실질적으로 본원에 기재된 아미노산 서열과 동일한 서열의 아미노산을 포함하는 항체, 항원-결합 단편, 면역글로붙린 쇄 및 CDR에 관한 것이다. 이러한 항-GD2 항체는 본원에 명시된 바와 같이 자연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체 또는 항원-결합 단편, 및 이러한 쇄 또는 CDR을 포함하는 항체는 높은 친화도로 인간 GD2와 결합할 수 있다. 당업자는 본 발명이 본 발명의 적어도 하나의 생물학적으로 활성인 항체를 포함한다는 것을 알 것이다. 생물학적으로 활성인 항체는 천연 (비-합성), 내인성 또는 관련 및 공지된 항체의 특이적 활성의 적어도 20%, 30% 또는 40%, 및 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90% 또는 95%-100%의 특이적 활성을 갖는다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정을 검정 및 정량화하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유기 잔기의 공유 부착에 의해 변형된 본원에 기재된 인간 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 개선된 약동학적 특성 (예를 들어, 생체내 혈청 반감기 증가)을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. 유기 잔기는 선형 또는 분지형 친수성 중합성 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 친수성 중합성 기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있으며, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 항체 및 항원-결합 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 유기 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합된 각각의 유기 잔기는 독립적으로 친수성 중합성 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 디-카르복실산을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "친수성 중합성 기"는 옥탄에서보다는 물에서 보다 가용성인 유기 중합체, 예를 들어 폴리리신을 나타낸다. 따라서, 폴리리신의 공유 부착으로 변형된 항체가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜 (예를 들어, PEG, 모노에톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG), PPG 등), 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 중합체 (예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥시드 (예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 변형시키는 친수성 중합체는 각각의 분자 물질로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20 ,000 (여기서, 아래첨자는 중합체의 평균 분자량 (달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합성 기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방상 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트와 커플링할 수 있고, 지방상 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트 (예를 들어, N,N-카르보닐 디이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실 기와 커플링될 수 있다.
본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 또는 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체를 변형시키기에 적합한 지방산에는, 예를 들어 n-도데카노에이트, n-테트라데카노에이트, n-옥타데카노에이트, n-에이코사노에이트, n-도코사노에이트, n-트리아콘타노에이트, n-테트라콘타노에이트, 시스-.델타.9-옥타데카노에이트, 모든 시스-.델타.5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트, 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등이 포함된다. 적합한 지방산 에스테르에는 선형 또는 분지형 저급 알킬 기를 포함하는 디카르복실산의 모노-에스테르가 포함된다. 저급 알킬 기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법을 이용하여, 예컨대 하나 이상의 변형제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 나타낸다. "활성화 기"는 적합한 조건 하에 제2 화학 기와 반응하여 변형제와 제2 화학 기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 기 또는 관능성 기이다. 예를 들어, 아민-반응성 활성화 기에는 친전자성 기, 예컨대 토실레이트, 메실레이트, 할로 (클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS) 등이 포함된다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기에는, 예를 들어 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴로일, 피리딜 디술피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올 (TNB-티올) 등이 포함된다. 알데히드 관능성 기는 아민- 또는 히드라진-함유 분자와 커플링할 수 있고, 아지드 기는 3가 인 기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 연결기를 형성할 수 있다. 활성화 기를 분자에 도입하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hernanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화 기는 유기 기 (예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)와 직접 또는 링커 잔기, 예를 들어 2가 C1-C12 기 (여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 헤테로원자, 예컨대 산소, 질소 또는 황으로 대체될 수 있음)를 통해 결합할 수 있다. 적합한 링커 잔기에는 몇 가지 예로서 테트라에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-가 포함된다. 링커 잔기를 포함하는 변형제는, 예를 들어 모노-Boc-알킬디아민 (예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이드 (EDC)의 존재 하에 지방산과 반응시켜 유리 아민 및 지방산 카르복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 생성될 수 있다. Boc 보호기를 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 처리하여 생성물로부터 제거함으로써 1차 아민을 노출시킬 수 있고, 이를 기재된 바와 같이 또 다른 카르복실레이트와 커플링시킬 수 있거나 또는 말레산 무수물 및 고리화된 수득 생성물과 반응시켜 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thompson, et al., WO 92/16221] (그의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함됨) 참조).
본 발명의 변형된 항체는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 변형제와 반응시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 유기 잔기를 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용하여 비-부위 특이적 방식으로 항체와 결합시킬 수 있다. 변형된 인간 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 항체 또는 항원-결합 단편의 디술피드 결합 (예를 들어, 쇄내 디술피드 결합)을 감소시켜 제조할 수 있다. 이어서, 감소된 항체 또는 항원-결합 단편을 티올-반응성 변형제와 반응시켜 본 발명의 변형된 항체를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체의 특정 부위와 결합한 유기 잔기를 포함하는 변형된 인간 항체 및 항원-결합 단편은 적합한 방법, 예컨대 역 단백질가수분해 (문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; [Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; [Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; [Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; [Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)]), 및 문헌 [Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 하기에 나타낸 바와 같은 광범위한 친화도 (KD)로 인간 GD2와 결합할 수 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합활성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험상 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984)]; [Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 여기에 기재된 방법 참조). 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 다양한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에 측정시 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원, 및 표준화된 완충제, 예컨대 본원에 기재된 완충제의 표준화된 용액을 사용하여 이루어진다.
본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항-GD2 항체는 GD2와의 결합 및 바람직하게는 낮은 독성을 갖는 것으로 특성화된다. 특히, 본 발명의 항체, 특정 단편 또는 변이체 (여기서, 각 구성요소, 예컨대 가변 영역, 불변 영역 및 프레임워크는 개별적으로 및/또는 집합적으로, 임의로 및 바람직하게는 낮은 면역원성을 가짐)는 본 발명에서 유용하다. 임의로, 본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 증상의 측정가능한 경감 및 낮은 및/또는 허용가능한 독성과 함께 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 그의 능력을 특징으로 한다. 낮은 또는 허용가능한 면역원성 및/또는 높은 친화도, 및 또한 다른 적합한 특성은 달성된 치료 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은 치료를 받은 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만에서 유의한 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응을 일으키고/거나 치료를 받은 환자에서 낮은 역가를 일으키는 것으로 본원에서 정의된다 (문헌 [Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)], 완전히 본원에 참조로 포함됨).
2가지 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 인간화, 항체인 이중특이성, 이종특이성 이종접합체 또는 유사 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 발명에서, 결합 특이성 중 하나는 적어도 하나의 GD2 단백질에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상, 이중특이성 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초하고, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 다양한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이들 중 단 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 오히려 번거로우며, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가, 예를 들어 WO 93/08829, 미국 특허 제6,210,668호, 동 제6,193,967호, 동 제6,132,992호, 동 제6,106,833호, 동 제6,060,285호, 동 제6,037,453호, 동 제6,010,902호, 동 제5,989,530호, 동 제5,959,084호, 동 제5,959,083호, 동 제5,932,448호, 동 제5,833,985호, 동 제5,821,333호, 동 제5,807,706호, 동 제5,643,759호, 동 제5,601,819호, 동 제5,582,996호, 동 제5,496,549호, 동 제4,676,980호, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)], [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)]; [Chan and Carter, 2010, Nature Rev. 10, 301-316]; [Weiner et al., 2010, Nature Rev. 10, 317-327] (각각은 완전히 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
특정 실시양태에서, GD2와 결합한 항체는 비접합된 형태로 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, GD2와 결합한 항체는 예를 들어 검출가능한 표지, 약물, 전구약물 또는 이소형과 접합될 수 있다.
하기 보다 자세히 기재된 본 발명의 특정 방법, 예컨대 종양 세포의 전이 가능성의 측정으로서 세포 또는 조직 내 GD2 발현을 검출하는 방법 또는 조직 내 제자리(in situ) 암종 (예를 들어, DCIS 또는 LCIS)을 확인하는 방법에서 항-GD2 항체를 하나 이상의 검출가능한 표지에 접합시킨다. 이러한 사용에서, 항체는 색원체, 효소, 방사성동위원소, 동위원소, 형광, 독성, 화학발광, 핵 자기 공명 조영제 또는 다른 표지의 공유 또는 비-공유 부착으로 검출가능하게 표지될 수 있다.
적합한 색원체 표지의 예에는 디아미노벤지딘 및 4-히드록시아조-벤젠-2-카르복실산이 포함된다.
적합한 효소 표지의 예에는 말레이트 데히드로게나제, 스타필로코칼 뉴클레아제, Δ-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 데히드로게나제, α-글리세롤 포스페이트 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제가 포함된다.
적합한 방사성동위원소 표지의 예에는 3H, 111In, 1251, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd 등이 포함된다. 111In은 125I 또는 131I-표지된 GD2-결합 항체의 간에 의한 탈할로겐화 문제를 피할 수 있으므로, 생체내 영상화의 이용시 바람직한 동위원소이다. 또한, 상기 방사성뉴클레오티드는 영상화를 위한 보다 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다 (문헌 [Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985)]; [Carasquillo et ah, J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)]). 예를 들어, 1-(P-이소티오시아네이토벤질)-DPTA를 갖는 모노클로날 항체와 커플링된 111In은 비-종양 조직, 특히 간에서 거의 흡수되지 않는 것으로 나타났고, 이에 따라 종양 위치의 특이성을 향상시킨다 (문헌 [Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).
적합한 비-방사성 동위원소 표지의 예에는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe가 포함된다.
적합한 형광 표지의 예에는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 녹색 형광 단백질 (GFP) 표지, o-프탈데히드 표지 및 플루오레사민 표지가 포함된다.
적합한 독소 표지의 예에는 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소가 포함된다.
화학 발광 표지의 예에는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 에쿼린 표지가 포함된다.
핵 자기 공명 조영제의 예에는 중금속 원자핵, 예컨대 Gd, Mn 및 철이 포함된다.
상기 기재된 표지와 항-GD2 항체와의 결합을 위한 통상적인 기법은 문헌 [Kennedy et at., Clin. CMm. Acta 70:1-31 (1976)] 및 [Schurs et al, Clin. CMm. Acta 81:1-40 (1977)]에 의해 제공된다. 후자에서 언급되는 커플링 기법은 글루타르알데히드 방법, 페리오데이트 방법, 디말레이미드 방법, m-말레이미도벤질-N-히드록시-숙신이미드 에스테르 방법이며, 이들 방법 모두는 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 소정의 치료 방법, 예컨대 수술 후의 잔류 종양 세포의 제거 또는 전이의 예방에서 사용하기 위하여, 항-GD2 항체를 하나 이상의 약물, 전구약물 또는 동위원소와 접합시킬 수 있다. 바람직한 이러한 접합체는 하나 이상의 세포독성제와 접합된, GD2에 결합하는 하나 이상의 리간드, 예를 들어 적어도 하나의 항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 변형체를 포함하며, 이러한 접합체는 본 발명에 의해 제공되는 종양 전이의 치료 또는 예방 방법에서 유용하다. 본 발명의 소정의 이러한 실시양태에 따르면, 항-GD2 항체는 세포독성제와 접합된다. 항-GD2 항체-세포독성제 접합체의 생성에 유용한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 멜파란, 독소루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 블레오마이신, 미세소관 독 및 안노나세오스 아세토게닌(annonaceous acetogenin)이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 이러한 측면에 따라 사용하기에 적합한 다른 화학요법제는 잘 알려져 있으며, 당업자들에게 친숙할 것이다.
적어도 하나의 항-GD2 항체 및 하나 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리키마이신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020), 트리코텐(trichothene) 및 CC1065의 접합체의 사용 또한 본원에서 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-GD2 항체는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들어, 1개의 항-GD2 항체 당 약 1개 내지 약 10개의 메이탄신 분자)와 접합된다. 예를 들어, 메이탄신은 May-SS-Me로 전환될 수 있으며, 이는 May-SH3으로 환원되고 변형된 항-GD2 항체와 반응하여 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)]), 메이탄시노이드-항-GD2 항체 접합체를 생성한다.
다르게는, 항-GD2 항체는 하나 이상의 칼리키마이신 분자와 접합될 수 있다. 칼리키마이신 군의 항생제는 피코몰 이하 농도에서 이중 나선 DNA 손상을 생성할 수 있다. 칼리키마이신의 구조적 유사체를 사용할 수 있다 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)] 및 [Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)]).
적어도 하나의 항-GD2 항체와의 접합체를 생성하는데 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토락카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭톡신(restrictocin), 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 영문으로 공개된 WO 93/21232를 참조하며, 그 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 마이탄시노이드(Mytansinoid) 또한 적어도 하나의 항-GD2 항체에 접합될 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase)과 접합된 항-GD2 항체를 고려한다.
또한, 다양한 방사성 동위원소가 본 발명의 치료 방법에서 사용하기 위한 방사선-접합된 항-GD2 항체의 생산에 이용가능하다. 예에는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.
항-GD2 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-I-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 히스-아지도 화합물 (예컨대, 비스-(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨릴렌-2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)]에 기재된 것과 같이 제조할 수 있다. 14탄소-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드와 항-GD2 항체와의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드-함유 링커를 사용할 수 있다 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]).
다르게는, 항-GD2 항체 리간드 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 예를 들어 재조합 기법 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 비-자연 발생 조성물, 혼합물 또는 형태로 제공되는, 본원에 기재된 것과 같고/거나 당업계에 알려진 것과 같은 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 또는 그보다 많은 그의 항-GD2 항체를 포함하는, 하나 이상의 항-GD2 항체 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 항체 또는 그의 특정 단편, 도메인 또는 변형체의 CDR 영역의 70-100%의 연속 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-GD2 항체 아미노산 서열의 1개 또는 2개의 전장, C- 및/또는 N-말단 결실된 변형체, 도메인, 단편 또는 특정 변형체를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 포함한다. 바람직한 항-GD2 항체 조성물은 본원에 기재된 항-GD2 항체 서열의 하나 이상의 CDR 또는 LBR 함유 부분과 같은 적어도 1개 또는 2개의 전장, 단편, 도메인 또는 변형체를 포함한다. 추가의 바람직한 조성물은 40-99%의 본원에서 기재된 항-GD2 Ab의 CDR 영역의 70-100% 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 조성 백분율은 당업계에 알려져 있거나 본원에 기재된 것과 같은 액체, 또는 건조 용액, 혼합물, 현탁액, 에멀젼 또는 콜로이드로서의 중량, 부피, 농도, 몰농도 또는 몰랄농도 기준이다.
추가적으로, 본 발명의 항-GD2 항체 조성물은 이러한 조절, 치료, 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에 대해 1종 이상의 임의의 적합하며 유효한 양의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 이는 임의로 1종 이상의 TNF 길항제 (예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 그의 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제 (이들로 제한되지는 않음)), 항류마티스제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 술페이트, 레플루노미드, 술파살라진), 근육 이완제, 마약제, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 술폰아미드, 테트라시클린, 또 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 당뇨병 관련 작용제, 미네랄, 영양제, 갑상선 작용제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 지사제, 진해제, 항구토제, 항궤양제, 설사제, 항응고제, 에리스로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류킨(Leukine)), 면역화제, 면역글로불린, 면역억제 (예를 들어, 바실릭시맙, 시클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성의약품, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경 흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입용 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도마제 알파 (플모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제, 및 세포 요법제로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 사이토카인의 비제한적인 예에는 IL-1 내지 IL-34 중 어느 하나가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; [PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 이러한 항암 또는 항감염제는 본 발명의 적어도 하나의 항체와 회합, 결합, 공동-제제화 또는 공동-투여되는 독소 분자를 포함할 수 있다. 임의로, 독소는 병리 세포 또는 조직을 선택적으로 사멸시키도록 작용할 수 있다. 병리 세포는 암 또는 다른 세포일 수 있다. 이러한 독소는, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소, 독 독소 또는 박테리아 독소 중 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 기능성 세포독성 도메인을 포함하는 정제 또는 재조합 독소 또는 독소 단편일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 용어 독소에는 독소 쇼크를 비롯한 인간 또는 다른 포유동물에서 임의의 병리 증상을 유발할 수 있는 임의의 자연 발생, 돌연변이체 또는 재조합 박테리아 또는 바이러스에 의해 생성된 내독소 및 외독소 둘 모두가 포함되며, 이는 사망을 유발할 수 있다. 이러한 독소에는 장독소생성 이. 콜라이 열-불안정성 장독소 (LT), 열-안정성 장독소 (ST), 시겔라 세포독소, 아이로모나스 장독소, 독소성 쇼크 증후군 독소-1 (TSST-1), 스타필로콕쿠스 장독소 A (SEA), B (SEB) 또는 C (SEC), 스트렙토콕쿠스 장독소 등이 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 박테리아에는 장독소생성 이. 콜라이 (ETEC) 종, 장출혈성 이. 콜라이 종 (예를 들어, 혈청형 0157:H7의 균주), 스타필로콕쿠스 종 (예를 들어, 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로콕쿠스 피오게네스(Staphylococcus pyogenes)), 시겔라 종 (예를 들어, 시겔라 디센테리아이(Shigella dysenteriae), 시겔라 플레크스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii) 및 시겔라 손네이(Shigella sonnei)), 살모넬라 종 (예를 들어, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 콜레라이수스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)), 클로스티리디움 종 (예를 들어, 클로스티리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 클로스티리디움 디피킬레(Clostridium difficile), 클로스티리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)), 캄필로박테르 종 (예를 들어, 캄필로박테르 예유니(Campylobacter jejuni), 캄필로박테르 페투스(Campylobacter fetus)), 헬리코박테르 종 (예를 들어, 헬리코박테르 파일로리(Helicobacter pylori)), 아이로모나스 종 (예를 들어, 아이로모나스 소브리아(Aeromonas sobria), 아이로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 아이로모나스 카비아이(Aeromonas caviae)), 플레시오모나스 시겔로이데스(Plesiomonas shigelloides), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 비브리오 종 (예를 들어, 비브리오 콜레라이(Vibrio cholerae), 비브리오 파라하이몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)), 클렙시엘라 종, 프세우도모나스 아이루기노사 및 스트렙토콕쿠스 종의 균주가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990)]; [Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991)]; [Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, N.Y. (1990)]; [Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992]; [Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991)]; [Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990)]을 참조하며, 이들 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가적으로, 본 발명의 항-GD2 항체 화합물, 조성물 또는 조합물은 하나 이상의 임의의 적합한 보조제, 예컨대 희석제, 결합제, 안정화제, 완충액, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등 (이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액 및 그의 제조 방법의 비제한적인 예는 문헌 [Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.sup.th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990] (이로 제한되지는 않음)과 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 통상적으로, 항-GD2 항체, 단편 또는 변형체 조성물의 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성에 적합한 제약상 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 것과 같이 선택할 수 있다.
본 조성물에 유용한 제약학적 부형제 및 첨가제에는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드, 디-, 트리-, 테트라-, 및 올리고사카라이드를 비롯한 당; 유도체화된 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않으며, 이들은 단독으로 또는 조합하여 존재할 수 있으며, 단독으로 또는 조합하여 1-99.99 중량% 또는 부피%를 차지한다. 예시적인 단백질 부형제에는 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카세인 등이 포함된다. 대표적인 아미노산/항체 성분에는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등이 포함되며, 이는 또한 완충 능력의 기능을 할 수 있다. 한 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제에는 예를 들어 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨 (글루시톨), 미오이노시톨 등이 포함된다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.
또한, 항-GD2 항체 조성물은 완충액 또는 pH 조절제를 포함할 수 있으며, 통상적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액에는 유기산 염, 예컨대 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스(Tris), 트로메트아민 히드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액이 포함된다. 본 조성물에서 사용하기에 바람직한 완충액은 유기산 염, 예컨대 시트레이트이다.
추가적으로, 본 발명의 항-GD2 항체 조성물은 중합체성 부형제/첨가제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 피콜 (중합체성 당), 덱스트레이트 (예를 들어, 시클로덱스트린, 예컨대 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 "트윈 20" 및 "트윈 80"), 지질 (예를 들어, 인지질, 지방산), 스테로이드 (예를 들어, 콜레스테롤) 및 킬레이트제 (예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항-GD2 항체, 부분 또는 변형체 조성물에서 사용하기에 적합한 이들 및 추가의 알려진 제약학적 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19.sup.th ed., Williams & Williams, (1995)] 및 ["Physician's Desk Reference", 52.sup.nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]에서 열거된 것과 같이 당업계에 알려져 있으며, 이들 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물 (예를 들어, 사카라이드 및 알디톨) 및 완충액 (예를 들어, 시트레이트) 또는 중합체성 작용제이다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명은 제약상 허용되는 제제 내에 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는, 안정한 제제 (이는 바람직하게는 염수 또는 선택된 염과의 포스페이트 완충액임), 및 또한 보존제를 함유하는 보존 용액 및 제제, 및 또한 제약학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존 제제를 제공한다. 보존 제제는 수성 희석제 중 하나 이상의 알려진 보존제, 또는 하나 이상의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 페닐머큐릭 니트라이트, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 헥사히드레이트), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 임의로 선택되는 것을 함유한다. 임의의 적합한 농축물 또는 혼합물은 예컨대 0.001-5%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예컨대 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값 (이들로 제한되지는 않음)으로 당업계에 알려진 것과 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로는, 보존제 없음, m-크레졸 0.1-2% (예를 들어, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 벤질 알콜 0.1-3% (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 티메로살 0.001-0.5% (예를 들어, 0.005, 0.01), 페놀 0.001-2.0% (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 알킬파라벤 0.0005-1.0% (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0% 등이 포함된다.
상기 언급된 것과 같이, 본 발명은 패키징 재료, 및 임의로 수성 희석제 중에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체와 소정의 완충액 및/또는 보존제와의 용액을 포함하는 하나 이상의 바이알을 포함하는 제조품을 제공하며, 여기서 상기 패키징 재료는 이러한 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 언급하는 표지를 포함한다. 추가적으로, 본 발명은 패키징 재료, 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 제1 바이알, 및 소정의 완충액 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제조품을 포함하며, 여기서 상기 패키징 재료는 수성 희석제에 적어도 하나의 항-GD2 항체를 재구성하여 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 환자에게 알려주는 표지를 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 적어도 하나의 항-GD2 항체는 본원에서 기재되거나 또는 당업계에 알려진 것과 같이 포유동물 세포로부터를 비롯한 재조합 수단 또는 트랜스제닉 제조에 의해 생산될 수 있거나, 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
비록 보다 낮은 농도 또는 높은 농도가 사용될 수 있지만, 본 발명의 생산에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체의 범위는 습윤/건조 시스템에서인 경우에 재구성시 약 1.0 마이크로그램/ml 내지 약 1000 mg/ml의 농도를 수득하는 양을 포함하며, 이는 원하는 전달 비히클에 의존적이고, 예를 들어 용액 제제는 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투압 또는 마이크로 펌프 방법과는 다를 것이다.
바람직하게는, 수성 희석제는 임의로 제약상 허용되는 보존제를 추가로 포함한다. 바람직한 보존제에는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것들이 포함된다. 제제에서 사용되는 보존제의 농도는 항-미생물 작용을 수득하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택되는 보존제에 따르며, 당업자들에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
임의로 및 바람직하게는, 다른 부형제, 예를 들어 등장성 작용제, 완충액, 항산화제, 보존 증진제가 희석제에 첨가될 수 있다. 등장성 작용제, 예컨대 글리세린이 알려진 농도로 흔히 사용된다. 바람직하게는, 생리학상 허용되는 완충액이 개선된 pH 제어를 제공하도록 첨가된다. 제제는 광범위한 pH, 예컨대 약 pH 4 내지 약 pH 10, 바람직하게는 약 pH 5 내지 약 pH 9, 가장 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0의 범위를 포괄할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 갖는다. 바람직한 완충액에는 포스페이트 완충액, 가장 바람직하게는 나트륨 포스페이트, 특히 포스페이트 완충 염수 (PBS)가 포함된다.
임의로, 다른 첨가제, 예컨대 트윈 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 트윈 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), 트윈 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), 플루로닉(Pluronic) F68 (폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체) 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜)와 같은 제약상 허용되는 가용화제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80, 또는 폴록사머 184 또는 188, 플루로닉® 폴리올, 다른 블록 공중합체, 및 킬레이터, 예컨대 EDTA 및 EGTA를 제제 또는 조성물에 첨가하여 응집을 감소시킬 수 있다. 특히, 이들 첨가제는 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제의 투여에 사용되는 경우에 특히 유용하다. 제약상 허용되는 계면활성제의 존재는 단백질이 응집하는 성향을 완화시킨다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 및 보존제를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 완충된 용액 중의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 완충된 용액 중의 원하는 보존제와 단백질 및 보존제를 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 당업자들에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 성분이 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대하여 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 제제는 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중 물, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 포스페이트 완충액 및/또는 염수 및 선택된 염을 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
본 청구되는 제조품은 즉시 내지 24시간 이상의 기간에 걸친 투여에 유용하다. 따라서, 본 청구되는 제조품은 환자에게 상당한 이점을 제공한다. 임의로, 본 발명의 제제는 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 보관될 수 있으며, 연장된 기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 유지하여, 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 이상의 기간에 걸쳐 유지 및/또는 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 표지가 가능하도록 한다. 보존 희석제가 사용되는 경우, 이러한 표지는 최대 1 내지 12개월, 6개월, 1년 6개월, 및/또는 2년까지의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체의 용액은 적어도 하나의 항체를 수성 희석제 중에서 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 희석제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 항체를 단백질 및 임의로 보존제 또는 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 당업자들에게 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제가 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 제품은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 이용가능한 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
청구되는 제품은 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원 또는 다른 이러한 기관 및 시설에 제공하여 환자에게 간접적으로 제공될 수 있다. 이 경우에서의 투명한 용액은 크기가 최대 1 리터이거나 또는 그보다 더 커서, 보다 큰 저장기를 제공하며, 이로부터 보다 적은 부분의 적어도 하나의 항체 용액이 보다 작은 바이알로의 수송을 위해 1회 또는 수회 회수되고, 약국 또는 병원에서 그의 소비자 및/또는 환자에게 제공될 수 있다.
이러한 단일 바이알 시스템을 포함하는 알려져 있는 장치에는 예를 들어 벡톤 딕킨슨(Becton Dickensen; 뉴저지주 프랭클린 레이크(Franklin Lakes, N.J.)), 디세트로닉(Disetronic; 스위스 부르그도르프(Burgdorf, Switzerland)), 바이오젝트(Bioject; 오레건주 포틀랜드(Portland, Oreg.)), 네셔널 메디컬 프로덕츠(National Medical Products), 웨스톤 메디컬(Weston Medical; 영국 페테르보로우(Peterborough, UK)), 메디-젝트 코프(Medi-Ject Corp; 미네소타주 미네아폴리스(Minneapolis, Minn.))에서 제조되거나 또는 개발된 것들과 같은 용액의 전달을 위한 펜-주입기 장치, 예컨대 BD 펜, BD 오토젝터(Autojector)®, 휴마젝트(Humaject)®가 포함된다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 알려져 있는 장치에는 재구성된 용액의 전달을 위한 카트리지에서의 동결건조된 약물의 재구성을 위한 펜-주입기 시스템, 예컨대 휴마트로펜(HumatroPen)®이 포함된다.
본원에서 청구되는 제품에는 패키징 재료가 포함된다. 패키징 재료는 관리 기관에 의해 요구되는 정보 이외에, 제품이 사용될 수 있는 병태를 제공한다. 본 발명의 패키징 재료는 적어도 하나의 항-GD2 항체를 수성 희석제 중에서 재구성하여 용액을 형성하고, 2개 바이알, 습윤/건조 제품에 대하여 2 내지 24시간 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 용액을 사용하는 것에 대하여 환자에게 지시사항을 제공한다. 단일 바이알, 용액 제품에 대하여, 표지는 이러한 용액이 2 내지 24시간 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에서 청구되는 제품은 인간 의약품 용도에 유용하다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 염수 또는 선택된 염을 함유하는 선택된 완충액, 바람직하게는 포스페이트 완충액을 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제 중에서의 적어도 하나의 항체 및 완충액의 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위하여, 예를 들어 측정된 양의 물 또는 완충액 중의 적어도 하나의 항체를 물 중의 원하는 완충제와 단백질 및 완충액을 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 합한다. 이러한 방법의 변형은 당업자들에게 이해될 것이다. 예를 들어, 성분이 첨가되는 순서, 추가의 첨가제가 사용되는지의 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 모두 사용되는 농도 및 투여 수단에 대해 최적화될 수 있는 요인이다.
청구되는 안정한 또는 보존된 제제는 투명한 용액으로서, 또는 수성 희석제 중에 보존제 또는 완충액 및 부형제를 함유하는 제2 바이알로 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 항-GD2 항체의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 단일 용액 바이알 또는 재구성을 요구하는 이중 바이알 중 어느 하나는 수회 재사용될 수 있으며, 단일 또는 다수 주기의 환자 치료에 충분할 수 있으며, 따라서 현재 사용되는 것에 비해 보다 편리한 치료 요법을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 안정한 또는 보존된 제제 또는 용액 중 어느 하나에서의 적어도 하나의 항-GD2 항체는, 당업계에 잘 알려진 것과 같이, SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프, 또는 당업자들에게 이해되는 다른 수단을 비롯한 다양한 전달 방법을 통해 본 발명에 따라서 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 명세서의 항-GD2 항체를 포함하는 제약 조성물은 인간화 항체의 유기체, 바람직하게는 동물, 바람직하게는 포유동물에의 투여를 용이하게 한다. 바람직한 포유동물에는 소과, 개과, 말과, 고양이과, 양과 및 돼지과 동물, 비-인간 영장류, 및 인간이 포함된다. 특히, 인간이 바람직하다.
높은 친화도의 GD2에 대한 중화 키메라 또는 인간 항체는 GD2가 발현되는 질환에서 사용되는 것이 바람직할 것이며, 예를 들어 GD2는 50% 초과의 흑색종에서 발현되며 (문헌 [Zhang et al., 1997, Int. J. Cancer. 73, 42-49]), 88%의 골육종에서 발현되며 (문헌 [Heiner et al., 1987, Cancer Res. 47, 5377-5388]), 93%의 지방육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 평활근육종 및 방추상 세포육종을 비롯한 연조직 육종에서 발현되며 (문헌 [Chang et al., 1992, Cancer 70, 633-638]), 뇌종양에서 발현된다 (문헌 [Longee et al., 1991, Acta Neuropathol. 82, 45-54]). 항-GD2 항체는, 흑색종 (문헌 [Saleh et al, 1992, Hum. Antibody Hybridomas 3, 19-24]; [Cheung et al., 1987, J. Clin. Oncol. 5, 1430-1440]; [Choi et al., 2006, Cancer Immunol. Immunother. 55, 761-774]), 육종 (문헌 [Choi et al., 2006, supra]; [Yeh et al., 1992, The fifth Asia and Oceania Congress of Nuclear Medicine and Biology Proceedings, p. 104]), 소세포폐암 (문헌 [Grant et al., 1996, Eur. J. Nucl. Med. 23, 145-149]), 뇌종양 (문헌 [Arbit et al., 1995, Eur. J. Nucl. Med. 22, 419-426])을 갖는 환자에서 iv 주사 및 또한 옴마야(Ommaya) 저장기를 사용한 구획화 요법(compartmental therapy)에 의해 시험되었다 (문헌 [Kramer et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25, 5465-5470]). 또한, GD2는 망막아세포종 (문헌 [Chantada et al., 2006, J. Pediatr. Hematol. Oncol. 28, 369-373]) 및 HTLV-1 감염된 T 세포 백혈병 세포 (문헌 [Furukawa et al., 1993, PNAS USA 90, 1972-1976])에 대한 종양 표적이다. 한 바람직한 측면에서, 명세서의 항-GD2 항체를 사용하여 신경아세포종을 치료할 수 있다. 항-GD2 항체 또는 그의 유도체는 단일 작용제로서 또는 다른 치료제와 함께 사용할 수 있다. 추가적으로, 이러한 Mab를 화학민감제(chemosensitizer)로서 사용하여, 이에 의해 그의 사용이 세포독성제의 치료 효능을 증가시킬 수 있다. 이러한 항체를 방사선민감제(radiosensitizer)로서 사용하여, 이에 의해 그의 사용이 방사선의 효능을 개선시킬 수 있다. 또한, 이들은 다른 종양-면역조절 작용제, 예컨대 IL-2, IL-12 및/또는 IFN알파와 함께 사용할 수 있다. 추가적으로, 항-GD2 항체는 다른 모노클로날 항체, 예컨대 항-TNF-알파, IL-12/IL-23, IL-2, GpIIb/IIIa 수용체, CD52, CD20, RSV 단백질, HER2/neu 수용체 등; 및 또한 리툭산(Rituxan), 헤르셉틴(Herceptin), 밀로타르그(Mylotarg), 캄파스(Campath), 제발린(Zevalin), 벡사르(Bexxar), 에르비툭스(Erbitux), 아바스틴(Avastin) 및 벡티빅스(Vectibix)를 비롯한 시판 승인된 항체와 함께 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 사용하여 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 당업계에 알려져 있거나 또는 본원에 기재된 것과 같은 적어도 하나의 GD2 관련 질환을 조절하거나 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 다발성 골수종, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨 질환, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 신장 세포 암종, 췌장의 암종, 전립선 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증, 악성 종양의 부신생물 증후군/과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 흡수, 암 관련 골 통증; 암 전이의 억제; 암 악액질의 개선; 및 염증성 질환, 예컨대 혈관간 증식성 사구체신염의 치료 등 중 하나 이상을 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 하나 이상의 악성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 포함한다. 임의로, 이러한 방법은 이러한 GD2 항체의 투여 전, 동시 또는 투여 이후의 방사선 치료, 항맥관형성제, 화학요법제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 등과 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 전신 발병 소아 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 음성혈청반응성 관절병증, 골관절염, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스, 항-인지질 증후군, 홍체섬모체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐 섬유증, 전신성 맥관염/베게네 육아종증, 사르코이드증, 고환염/정관수술 복원(vasectomy reversal) 절차, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 장기 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 전신성 염증성 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그램 양성 패혈증, 그램 음성 패혈증, 배앙 음성 패혈증, 진균 패혈증, 호중구감소성 발열, 요로성 패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 이온화 방사선 노출, 급성 췌장염, 성인 호흡 곤란 증후군, 류마티스성 관절염, 알콜-유발 간염, 만성 염증성 병리 증상, 사르코이드증, 크론 병리 증상, 겸상 적혈구 빈혈증, 당뇨병, 신장증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 통년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 두드러기, 전신성 아나필락시스, 피부염, 악성 빈혈증, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 임의의 장기 또는 조직의 이식편 거부, 신장 이식 거부, 심장 이식 거부, 간 이식 거부, 췌장 이식 거부, 폐 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 피부 동종이식편 거부, 연골 이식 거부, 골 이식편 거부, 소장 이식 거부, 태아 흉선 임플란트 거부, 부갑상선 이식 거부, 임의의 장기 또는 조직의 이종이식편 거부, 동종이식편 거부, 항-수용체 과민 반응, 그레이브스 질환, 레이노 질환, B형 인슐린-저항성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체-매개 세포독성, 제III형 과민 반응, 전신성 홍반성 루푸스, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 김마글로불린병증 및 피부 변화 증후군), 다발신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 김마글로불린병증, 피부 변화 증후군, 항-인지질 증후군, 천포창, 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 특발성 애디슨 질환, 당뇨병, 만성 활동 간염, 원발성 담관 경화증, 백반증, 맥관염, MI 심장절개 후 증후군, 제IV형 과민증, 접촉성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식편 거부, 세포내 유기체로 인한 육아종, 약물 민감성, 대사성/특발성, 윌슨 질환, 혈색소침착증, 알파-1-항트립신 결핍, 당뇨병성 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부-뇌하수체-부신 축 평가, 원발성 담관 경화증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 가족성 혈구포식성 림프조직구증, 피부 병태, 건선, 탈모증, 신장 증후군, 신장염, 사구체 신장염, 급성 신부전, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 요법, 항-cd3 요법, 사이토카인 요법, 화학요법, 방사선 요법 (예를 들어, 무력증, 빈혈증, 악액질을 포함하지만 이들로 제한되지는 않음), 만성 살리실레이트 중독, 수면 무호흡증, 비만증, 심부전, 동염, 염증성 장 질환 등 중 하나 이상을 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 적어도 하나의 GD2 매개 면역 관련 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, N.J. (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999)], [Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]을 참조하며, 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본 발명은, 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염 (A, B 또는 C 등), 패혈성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군/혈전용해 혈소판 감소성 자색반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈만편모충증, 나병, 독소성 쇼크 증후군, 스트렙토콕쿠스 근육염, 가스 괴저, 미코박테륨 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 세포내 미코박테륨 아비움(mycobacterium avium), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii) 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염/부고환염, 레기오넬라, 라임 질환, 인플루엔자 a, 엡스타인-바 바이러스, 바이러스 관련 혈구탐식 증후군, 바이러스성 뇌염/무균 수막염 등을 비롯한 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 및 만성 기생 또는 감염 과정 중 적어도 하나를 비롯한 (이들로 제한되지는 않음), 하나 이상의 감염성 질환을 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
임의로, 이러한 방법 중 어느 하나는 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 임의의 방법은 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 이러한 방법은 이러한 면역 질환 또는 악성 질환의 치료를 위한 공동-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 항-GD2 항체, 그의 특정 부분 또는 변형체의 투여는 하나 이상의 TNF 길항제 (예를 들어, TNF 항체 또는 단편, 가용성 TNF 수용체 또는 단편, 이들의 융합 단백질, 또는 소형 분자 TNF 길항제 (이들로 제한되지는 않음)), IL-18 항체 또는 단편, 소형 분자 IL-18 길항제 또는 IL-18 수용체 결합 단백질, IL-1 항체 (IL-1 알파 및 IL-1 베타 둘 다 포함함) 또는 단편, 가용성 IL-1 수용체 길항제, 항류마티스제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 오라노핀, 오로티오글루코스, 아자티오프린, 에타너셉트, 금 나트륨 티오말레이트, 히드록시클로로퀸 술페이트, 레플루노미드, 술파살라진, 방사선 요법, 항맥관형성제, 화학요법제, 탈리도미드 근육 이완제, 마약성 약물, 비-스테로이드성 소염성 약물 (NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 항진균제, 구충제, 항바이러스제, 카르바페넴, 세팔로스포린, 플루오로퀴놀론, 마크롤리드, 페니실린, 술폰아미드, 테트라시클린, 또 다른 항미생물제), 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용성 스테로이드, 당뇨병 관련 작용제, 미네랄, 영양제, 갑상선 작용제, 비타민, 칼슘 관련 호르몬, 에리스로포이에틴 (예를 들어, 에포에틴 알파), 필그라스팀 (예를 들어, G-CSF, 뉴포겐), 사르그라모스팀 (GM-CSF, 류킨), 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제 (예를 들어, 바실릭시맙, 시클로스포린, 다클리주맙), 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 에스트로겐 수용체 조절제, 동공확대제, 조절마비제, 알킬화제, 항대사제, 유사분열 억제제, 방사성의약품, 항우울제, 항조증제, 항정신병제, 항불안제, 수면제, 교감신경 흥분제, 자극제, 도네페질, 타크린, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 류코트리엔 억제제, 메틸크산틴, 크로몰린, 에피네프린 또는 유사체, 도마제 알파 (플모자임), 사이토카인 또는 사이토카인 길항제로부터 선택되는 하나 이상을 이전에, 동시에 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 적합한 투여량은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; [PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 조성물, 조합 요법, 공동-투여, 장치 및 또는 방법에 적합한 TNF 길항제 (본 발명의 적어도 하나의 항체, 그의 특정 부분 및 변형체를 추가로 포함함)에는 항-TNF 항체, 그의 항원-결합 단편, 및 TNF에 특이적으로 결합하는 수용체 분자; TNF 합성, TNF 방출 또는 표적 세포에서의 그의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도미드, 테니댑, 포스포디에스테라제 억제제 (예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프람), A2b 아데노신 수용체 효능제 및 A2b 아데노신 수용체 증진제; TNF 수용체 신호전달을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키나제 억제제; 막 TNF 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 메탈로프로테이나제 억제제; TNF 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캅토프릴); 및 TNF 생성 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나제 억제제가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 임의의 방법은, 유효량의 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물 또는 제약 조성물을 이러한 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, GD2 매개 장애 또는 GD2 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하기 위한 방법을 포함할 수 있다. 임의로, 이러한 환자는 이러한 면역 질환의 치료를 위한 공동-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 항-GD2 항체, 그의 특정 부분 또는 변형체의 투여는 상기 기재된 것과 같은 하나 이상의 작용제를 이전에, 동시에 및/또는 이후에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
통상적으로, 병리 증상의 치료는 조성물에 함유된 것의 특이적 활성에 따라서, 평균적으로 범위가 용량 당 환자 1 킬로그램 당 적어도 약 0.01 내지 500 밀리그램의 적어도 하나의 항-GD2 항체, 바람직하게는 단일 또는 다중 투여 당 환자 1 킬로그램 당 적어도 약 0.1 내지 100 밀리그램의 항체인 유효량 또는 투여량의 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물의 투여에 의해 수행된다. 다르게는, 유효한 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여 당 0.1-5000 ug/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 투여량은 의학 시술자에게 알려져 있으며, 물론 특정 질환 상태, 투여되는 조성물의 특이적 활성, 및 몇몇 경우에서 치료를 받는 특정 환자에 따를 것이며, 원하는 치료 양을 달성하기 위하여, 반복 투여, 즉 특정한 모니터링 또는 계량된 용량의 반복 개별 투여를 제공하는 것이 필요할 수 있으며, 여기서 개별 투여는 원하는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 반복된다.
바람직한 용량에는 임의로 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및/또는 100-500 mg/kg/투여, 그 안의 임의의 범위, 값 또는 분수가 포함될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여 당 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 20, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 1.6, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 및/또는 5000 .mu.g/ml 혈청 농도, 또는 그 안의 임의의 범위, 값 또는 분수의 혈청 농도가 달성된다.
다르게는, 투여되는 투여량은 알려진 요인, 예컨대 특정 작용제의 약력학적 특성, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 동시 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분의 투여량은 체중 1 킬로그램 당 약 0.1 내지 100 밀리그램일 수 있다. 투여 당 체중 1 킬로그램 당 보통 0.1 내지 50, 바람직하게는 0.1 내지 10 밀리그램 또는 지속 방출 형태가 원하는 결과를 얻기에 효과적이다.
비제한적인 예로서, 인간 또는 동물의 치료는, 단일, 주입 또는 반복 용량을 사용하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40일차 중 하나 이상, 또는 다르게는 또는 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52주차 중 하나 이상, 또는 다르게는 또는 추가적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20년차 중 하나 이상에서 1일 당 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 본 발명의 적어도 하나의 항체 또는 그의 임의의 조합물의 1회 또는 주기적 투여로서 제공될 수 있다.
일반적으로, 내부 투여에 적합한 투여 형태 (조성물)는 단위 또는 용기 당 약 0.1 밀리그램 내지 약 500 밀리그램의 활성 성분을 함유한다. 이러한 제약 조성물에서, 활성 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 보통 약 0.5-99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.
비경구 투여에 대하여, 항체는 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 (또는 별도로 제공됨) 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 또한, 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 불휘발성 오일을 사용할 수 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 완충액 및 보존제)를 함유할 수 있다. 제제는 알려진 기법 또는 적합한 기법에 의해 멸균된다.
적합한 제약 담체는 그 분야에서의 표준 참조 문서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 최신판에 기재되어 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 통상의 부형제, 멸균수 또는 염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 오일성 현탁액은 알려진 방법에 따라 적합한 에멀션화제 또는 보습제(humidifier) 및 현탁화제를 사용하여 제조할 수 있다. 주사용 작용제는 비독성 비경구 투여용 희석제, 예컨대 수용액, 또는 용매 중 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용가능한 비히클 또는 용매로서, 물, 링거액, 등장성 염수 등이 허용되며; 일반적인 용매 또는 현탁화 용매로서, 멸균 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노- 또는 디- 또는 트리글리세리드를 비롯한, 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산을 사용할 수 있다. 비경구 투여는 당업계에 알려져 있으며, 통상적인 주사 수단, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 것과 같은 가스 압력 무바늘 주사 장치, 및 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 것과 같은 레이저 천공기 장치가 포함되지만 이들로 제한되지는 않으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가적으로, 본 발명은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 경막내, 옴마야내, 안내, 유리체내, 대장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비내 또는 경피 수단에 의한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 투여에 관한 것이다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물은, 특히 액체 용액 또는 현탁액 형태의 비경구 (피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 대한 사용; 특히 반고체 형태, 예컨대 크림 및 좌제 (이들로 제한되지는 않음)의 질내 또는 직장내 투여에서의 사용; 구강내 또는 설하 투여, 예컨대 정제 또는 캡슐 형태 (이들로 제한되지는 않음)를 위해; 또는 비내, 예컨대 분말, 점비액 또는 에어로졸 또는 소정의 작용제 형태 (이들로 제한되지는 않음); 또는 경피, 예컨대 겔, 연고, 로션, 피부 구조를 변화시키거나 또는 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위한 화학적 증진제, 예컨대 디메틸 술폭시드 (문헌 [Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90, Marcel Dekker, Inc. New York 1994]; 전문이 본원에 참조로 포함됨) 또는 피부 상에 단백질 및 펩티드를 함유하는 제제의 적용을 가능하게 하는 산화제 (WO 98/53847)를 갖는 패치 전달 시스템, 또는 전기천공법과 같은 일시적인 수송 경로를 생성하기 위한 전기장의 적용, 또는 이온영동(iontophoresis)과 같은 하전된 약물의 피부를 통한 이동을 증가시키기 위한 전기장의 적용, 또는 초음파영동(sonophoresis)과 같은 초음파의 적용 (미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 위해 제조할 수 있다 (상기 공보 및 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
폐 투여를 위하여, 바람직하게는 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물이 폐 또는 부비강의 하 기도에 도달하기에 효과적인 입자 크기로 전달된다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 흡입에 의한 치료제의 투여에 대하여 당업계에 알려진 다양한 흡입 또는 비내 장치 중 어느 하나에 의해 전달될 수 있다. 환자의 부비동 또는 폐포에의 에어로졸화된 제제의 분사를 가능하게 하는 이러한 장치에는 계량식 흡입기, 네뷸라이저, 건조 분말 발생기, 분무기 등이 포함된다. 또한, 항체가 폐 또는 비내 투여되도록 하는데 적합한 다른 장치가 당업계에 알려져 있다. 이러한 장치 모두는 에어로졸로의 항체의 분사를 위한 투여에 적합한 제제를 사용할 수 있다. 이러한 에어로졸은 용액 (수성 및 비-수성 둘 다) 또는 고체 입자 중 하나로 구성되어 있을 수 있다. 통상적으로, 벤톨린(Ventolin)® 계량식 흡입기와 같은 계량식 흡입기는 추진체 가스를 사용하며 흡기 동안의 발동을 요구한다 (예를 들어, WO 94/16970, WO 98/35888 참조). 몇가지 예를 들면, 튜브할러(Turbuhaler)™ (아스트라(Astra)), 로타할러(Rotahaler)® (글락소(Glaxo)), 디스쿠스(Diskus)® (글락소), 인헤일 테라뷰틱스(Inhale Therapeutics)에 의해 판매되는 장치와 같은 건조 분말 흡입기는 혼합된 분말의 호흡-발동을 사용한다 (미국 특허 제4,668,218호 (아스트라), EP 237507 (아스트라), WO 97/25086 (글락소), WO 94/08552 듀라(Dura), 미국 특허 제5,458,135호 (인헤일), WO 94/06498 (피존즈(Fisons)); 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 울트라벤트(Ultravent)® 네뷸라이저(말린크로드트(Mallinckrodt)) 및 아코른 II(Acorn II)® 네뷸라이저 (마르퀘스트 메디컬 프로덕츠(Marquest Medical Products)) (미국 특허 제5,404,871호 (아라디즘), WO 97/22376)와 같은 네뷸라이저 (이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 용액으로부터 에어로졸을 생성하지만, 반면 계량식 흡입기, 건조 분말 흡입기 등은 소립자 에어로졸을 생성한다. 이러한 시판되는 흡입 장치의 특정 예는 본 발명의 실시에 적합한 특정 장치를 대표하려고 하며, 본 발명의 범주를 제한하려고 하는 것은 아니다. 바람직하게는, 적어도 하나의 항-GD2 항체를 포함하는 조성물은 건조 분말 흡입기 또는 분무기에 의해 전달된다. 본 발명의 적어도 하나의 항체의 투여를 위한 흡입 장치의 여러 바람직한 특징이 있다. 예를 들어, 흡입 장치에 의한 전달은 유리하게는 신뢰성 있고, 재현가능하고, 정확하다. 임의로, 흡입 장치는 앙호한 호흡가능성(respirability)을 위해 예를 들어 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1-5 um의 소형 건조 입자를 전달할 수 있다.
GD2 항체 조성물 단백질을 포함하는 스프레이는 적어도 하나의 항-GD2 항체의 현탁액 또는 용액을 가압 하에 노즐을 통과하도록 하여 제조할 수 있다. 노즐 크기 및 형태, 적용되는 압력 및 액체 공급 속도를 원하는 방출량 및 입자 크기를 달성하도록 선택할 수 있다. 전기스프레이는 예를 들어 모세관 또는 노즐 장치와 관련된 전기장에 의해 제조할 수 있다. 유리하게는, 분무기에 의해 전달되는 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um 범위의 입자 크기를 갖는다.
통상적으로, 분무기로의 사용에 적합한 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 제제는 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg 또는 mg/gm, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/ml 또는 mg/gm (이들로 제한되지는 않음)의 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 농도로 수용액 중에서 항체 조성물 단백질을 포함한다. 제제는 작용제, 예컨대 부형제, 완충액, 등장성 작용제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 또한, 제제는 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형제 또는 작용제, 예컨대 완충액, 환원제, 벌크 단백질 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 항체 조성물 단백질의 제제화에 유용한 벌크 단백질에는 알부민, 프로타민 등이 포함된다. 항체 조성물의 제제화에 유용한 통상적인 탄수화물에는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등이 포함된다. 또한, 항체 조성물 단백질 제제는 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이는 에어로졸의 형성에서의 용액의 원자화에 의해 유발되는 항체 조성물 단백질의 표면-유발 응집을 감소 또는 방지할 수 있다. 여러 통상적인 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시 에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 일반적으로, 양은 제제의 0.001 내지 14 중량% 범위일 것이다. 본 발명의 목적에 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 또한, 단백질, 예컨대 GD2 항체 또는 특정 부분 또는 변형체의 제제화를 위한 당업계에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
항체 조성물 단백질은 네뷸라이저, 예컨대 제트 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저에 의해 투여될 수 있다. 통상적으로, 제트 네뷸라이저에서, 압축 공기 공급원을 사용하여 오리피스(orifice)를 통해 고속 공기 제트를 생성한다. 가스가 노즐을 넘어서 팽창되기 때문에, 저압 영역이 생성되며, 이는 항체 조성물 단백질의 용액을 액체 저장기에 연결된 모세관을 통해 빨아들인다. 튜브에 존재하기 때문에, 모세관으로부터의 액체 스트림은 불안정한 필라멘트 및 액적으로 잘려져, 에어로졸을 생성한다. 일련의 형태, 유속 및 배플(baffle) 유형을 이용하여 소정의 제트 네뷸라이저로부터의 원하는 성능 특성을 달성할 수 있다. 초음파 네뷸라이저에서, 고주파 전기 에너지를 사용하여 진동, 기계적 에너지를 생성할 수 있으며, 통상적으로 압전 변환기를 이용한다. 이 에너지는 직접적으로 또는 커플링 유체를 통해 항체 조성물 단백질의 제제에 전달되어, 항체 조성물 단백질을 포함하는 에어로졸을 생성한다. 유리하게는, 네뷸라이저에 의해 전달되는 항체 조성물 단백질의 입자는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um 범위의 입자 크기를 갖는다.
통상적으로, 제트 또는 초음파 네뷸라이저로의 사용에 적합한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제는 용액 1 ml 당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg의 적어도 하나의 항-GD2 항체 단백질의 농도를 포함한다. 제제는 작용제, 예컨대 부형제, 완충액, 등장성 작용제, 보존제, 계면활성제, 및 바람직하게는 아연을 포함할 수 있다. 또한, 제제는 적어도 하나의 GD2 항체 조성물 단백질의 안정화를 위한 부형체 또는 작용제, 예컨대 완충액, 환원제, 벌크 단백질 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물 단백질의 제제화에 유용한 벌크 단백질에는 알부민, 프로타민 등이 포함된다. 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제화에 유용한 통상적인 탄수화물에는 수크로스, 만니톨, 락토스, 트레할로스, 글루코스 등이 포함된다. 또한, 적어도 하나의 항-GD2 항체 제제는 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이는 에어로졸의 형성에서의 용액의 원자화에 의해 유발되는 적어도 하나의 항-GD2 항체의 표면-유발 응집을 감소 또는 방지할 수 있다. 여러 통상적인 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 알콜, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탈 지방산 에스테르를 이용할 수 있다. 일반적으로, 양은 제제의 0.001 내지 4 중량% 범위일 것이다. 본 발명의 목적상 특히 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노-올레에이트, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 등이다. 또한, 단백질, 예컨대 항체 단백질의 제제화를 위한 당업계에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
계량식 흡입기 (MDI)에서, 추진체, 적어도 하나의 항-GD2 항체, 및 임의의 부형제 또는 다른 첨가제가 액화 압축 가스를 포함하는 혼합물로서 캐니스터(canister)에 함유된다. 계량 투입 벨브의 작동은 바람직하게는 약 10 um 미만, 바람직하게는 약 1 um 내지 약 5 um, 가장 바람직하게는 약 2 um 내지 약 3 um의 크기 범위의 입자를 함유하는 에어로졸로서 다이 혼합물을 방출한다. 원하는 에어로졸 입자 크기는 제트-밀링, 스프레이 건조, 임계점 응축 등을 비롯한 당업자들에게 알려진 다양한 방법에 의해 생성되는 항체 조성물 단백질의 제제화를 이용하여 얻을 수 있다. 바람직한 계량식 흡입기에는 3M 또는 글락소에 의해 제조되며 히드로플루오로카본 추진체를 이용하는 것들이 포함된다.
일반적으로, 계량식 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 적어도 하나의 항-GD2 항체의 제제는 예를 들어 계면활성제의 도움으로 추진체 내에 현탁화된, 비-수성 매질 중 현탁액으로서 적어도 하나의 항-IL-6 항체를 함유하는 미분 분말을 포함할 것이다. 추진체는 이 목적상 이용되는 임의의 통상적인 물질, 예컨대 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, HFA-134a (히드로플루오로알칸-134a), HFA-227 (히드로플루오로알칸-227) 등을 비롯한 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 탄화수소일 수 있다. 바람직하게는, 추진체는 히드로플루오로카본이다. 계면활성제는 추진체에서의 현탁액으로서 적어도 하나의 항-GD2 항체를 안정화시키며, 화학적 분해에 대하여 활성제를 보호하는 것 등을 위해 선택될 수 있다. 적합한 계면활성제에는 소르비탄 트리올레에이트, 대두 레시틴, 올레산 등이 포함된다. 몇몇 경우에서, 용매, 예컨대 에탄올을 사용하는 용액 에어로졸이 바람직하다. 또한, 단백질의 제제화를 위한 당업계에 알려진 추가의 작용제가 제제에 포함될 수 있다.
당업자들은 본 발명의 방법이 본원에 기재되지 않은 장치를 통한 적어도 하나의 항-GD2 항체 조성물의 폐 투여에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
경구 투여용 제제는 장 벽의 투과성을 인공적으로 증가시키기 위한 보조제 (예를 들어, 레조르시놀 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르)의 공동-투여, 및 또한 효소적 분해의 억제를 위한 효소적 억제제 (예를 들어, 췌장의 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DFF) 및 트라실올)의 공동-투여에 의존한다. 경구 투여를 위한 고체-형 투여 형태의 활성 성분 화합물을 수크로스, 락토스, 셀룰로스, 만니톨, 트레할로스, 라피노스, 말티톨, 덱스트란, 전분, 한천, 아르기네이트(arginate), 키틴, 키토산, 펙틴, 트래거캔스 검, 아라비아 검, 젤라틴, 콜라겐, 카세인, 알부민, 합성 또는 반합성 중합체, 및 글리세리드를 비롯한 1종 이상의 첨가제와 혼합할 수 있다. 또한, 이러한 투여 형태는 다른 유형의 첨가제, 예를 들어 불활성 희석제, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 파라벤, 보존제, 예컨대 소르브산, 아스코르브산, 알파.-토코페롤, 항산화제, 예컨대 시스테인, 붕해제, 결합제, 증점제, 완충제, 감미제, 향미제, 부향제(perfuming agent) 등을 함유할 수 있다.
추가적으로, 정제 및 환제는 장용 코팅된 제제로 가공될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제에는 의료용으로 허용되는 에멀션, 시럽, 엘릭시르, 현탁액 및 용액 제제가 포함된다. 이러한 제제는 상기 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물을 함유할 수 있다. 또한, 리포좀은 인슐린 및 헤파린에 대한 약물 전달 시스템으로 기재되어 있다 (미국 특허 제4,239,754호). 보다 최근에, 혼합된 아미노산의 인공 중합체 (프로티노이드(proteinoid))의 마이크로구체를 사용하여 약제를 전달한다 (미국 특허 제4,925,673호). 추가적으로, 미국 특허 제5,879,681호 및 미국 특허 제5,5,871,753호에 기재된 담체 화합물이 당업계에 알려져 있는 생물학적 활성제를 경구로 전달하기 위해 사용된다.
점막 표면을 통한 흡수, 조성물 및 투여 방법에 대하여, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 복수개의 마이크로미터 이하의 입자, 점막접착성 거대분자, 생활성 펩티드 및 수성 연속 상을 포함하는 에멀션을 포함하며, 이는 에멀션 입자의 점막접착을 달성하여 점막 표면을 통한 흡수를 촉진한다 (미국 특허 제5,514,670호). 본 발명의 에멀션의 적용에 적합한 점액질 표면은 각막, 결막, 구강내, 설하, 비내, 질내, 폐, 위, 장 및 직장내 투여 경로를 포함한다. 질내 또는 직장내 투여용 제제, 예를 들어 좌제는 부형제로서 예를 들어 폴리알킬렌글리콜, 바셀린, 코코아 버터 등을 함유할 수 있다. 비내 투여용 제제는 고체일 수 있으며, 부형제로서 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 또는 점비액의 수성 또는 오일성 용액일 수 있다. 구강내 투여에 대하여, 부형제에는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화 전분 등이 포함된다 (미국 특허 제5,849,695호).
경피 투여를 위해서, 적어도 하나의 항-GD2 항체는 전달 장치, 예컨대 리포좀 또는 중합체성 나노입자, 마이크로입자, 마이크로캡슐 또는 마이크로구체 (달리 명시하지 않는다면 집합적으로 마이크로입자로 지칭됨)에 캡슐화될 수 있다. 합성 중합체, 예컨대 폴리히드록시산, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 이들의 공중합체, 폴리오르토에스테르, 폴리무수물(polyanhydride), 및 폴리포스파젠, 및 천연 중합체, 예컨대 콜라겐, 폴리아미노산, 알부민 및 다른 단백질, 알기네이트 및 다른 폴리사카라이드, 및 이들의 조합물로 제조된 마이크로입자를 비롯하여 여러 적합한 장치가 알려져 있다 (미국 특허 제5,814,599호).
본 발명의 화합물을 단일 투여로부터 연장된 기간에 걸쳐, 예를 들어 1주 내지 1년 또는 그 이상의 기간 동안 대상체에게 전달하는 것이 때때로 바람직할 수 있다. 다양한 서방형, 데포 또는 임플란트 투여 형태를 이용할 수 있다. 예를 들어, 투여 형태는 체액에서 낮은 용해도를 갖는 화합물의 제약상 허용되는 비독성 염, 예를 들어 (a) 다염기성 산, 예컨대 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌 모노- 또는 디-술폰산, 폴리갈락투론산 등과의 산 부가염; (b) 다가 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등, 또는 예를 들어 N,N'-디벤질-에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과의 염; 또는 (c) (a) 및 (b)의 조합물, 예를 들어 아연 탄네이트 염을 함유할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물, 또는 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염, 예컨대 기재된 것들을 주사에 적합한 것, 예를 들어 참깨 오일과 함께 겔, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 겔에서 제제화할 수 있다. 특히 바람직한 염은 아연 염, 아연 탄네이트 염, 파모에이트 염 등이다. 또 다른 유형의 주사용 서방형 데포 제제는 예를 들어 미국 특허 제3,773,919호에 기재된 것과 같이 서서히 분해되는 비독성 비항원 중합체, 예컨대 폴리락트산/폴리글리콜산 중합체에의 캡슐화를 위해 분산되는 화합물 또는 염을 함유할 수도 있다. 또한, 화합물, 또는 바람직하게는 상대적으로 불용성인 염, 예컨대 상기 기재된 것들은 특히 동물에서 사용하기 위해 콜레스테롤 매트릭스 실라스틱 펠렛에서 제제화될 수 있다. 추가의 서방형, 데포 또는 임플란트 제제, 예를 들어 기체 또는 액체 리포좀은 문헌에서 알려져 있다 (미국 특허 제5,770,222호 및 문헌 ["Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978]).
본 출원을 통해 인용된 모든 인용 참증 (참조 문헌, 등록 특허, 특허 출원 공보 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)의 내용은 이에 의해 명백히 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 주어지며 그를 제한하려고 하지 않는 하기 예시적 실시양태의 설명 과정에서 명백하게 될 것이다.
하기 재료 및 방법을 후속의 실시예에서 사용하였다.
재료 및 방법
세포 배양물 및 인간 조직
인간 신경아세포종 세포주 LAN-1은 로버츠 시거 박사(Dr. Robert Seeger) (칠드런즈 호스피탈 오브 로스 앤젤스(Children's Hospital of Los Angeles; 캘리포니아주 로스 앤젤스(Los Angeles, CA)))에 의해 제공되었으며, NB1691은 피터 호튼 박사(Dr. Peter Houghton) (세인트 주드 칠드런즈 리서치 호스피탈(St. Jude Children's Research Hospital; 테네시주 멤피스(Memphis, TN)))에 의해 제공되었다. NK-92MI는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC; 버지니아주 마나사(Manassas, VA))으로부터 얻었다. 모든 세포주를 37℃에서 5% C02 인큐베이터에서 F10 [10% 소 태아 혈청 (하이클론(Hyclone; 유타주 사우스 로간(South Logan, UT))), 2mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지]에서 성장시켰다. 메모리얼 솔로안-케터링 캔서 센터(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center; MSKCC))에서 얻어진 다양한 조직학적 유형의 정상 조직 및 또한 고형 종양 샘플을 액체 질소에서 급랭시켰다. MSKCC의 기관 감사 위원회의 지침에 따라서 환자 및 그의 후견인으로부터 서면 사전 동의를 얻었다.
모노클로날
항체
쥐과 동물 3F8은 카파 경쇄를 갖는 마우스 IgG3 항체였다 (문헌 [Cheung et al., 1985, Cancer Res 45, 2642-9]). 신경아세포종과 반응성인 모노클로날 항체 3F8 (마우스 IgG3, 카파), 5F11 (마우스 IgM, 카파) 및 8H9 (마우스 IgG1, 카파)는 선행 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Cheung et al, 1985, supra]; [Cheung et al., 2004, J Nucl Med 45, 867-77]; [Modak et al., 2001, Cancer Res 61, 4048-54]). 이들은 복수로서 생성되었으며, 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다: 3F8에 대하여 단백질 A (지이 헬스케어(GE Healthcare; 뉴저지주 피스카타웨이(Piscataway, NJ))), 8H9에 대하여 단백질 G, 및 5F11에 대하여 Clq-세파로스 (피어스(Pierce; 일리노이주 록포드(Rockford, IL))). 이들 항체는 SDS-PAGE에 의해 순도가 90% 초과였다. F(ab')2 단편을 선행 문헌에서 보고된 것과 같이 펩신 소화에 의해 제조하였다 (문헌 [Cheung et al., 1988, J Clin Invest 81, 1122-28]). IgG3 대조군 항체를 분비하는 하이브리도마인 항-GD2 하이브리도마 ME361 및 TIB114 (N.S.7)를 ATCC로부터 얻었다. 14.G2a를 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences; 캘리포니아주 산 호세(San Jose, CA)로부터 구매하였다. 키메라 14.18은 렉시겐 파마슈티칼스(Lexigen Pharmaceuticals; 메사추세츠주 렉싱톤(Lexington, MA))의 스테판 길리 박사(Dr. Stephen Gillies)에 의해 제공되었다. MAB1027 (항-B7-H3 MoAb)은 알앤디 시스템(R&D System; 미네소타주 미네아폴리스(Minneapolis, MN))으로부터 구매하였다. GD2에 특이적인 마우스 IgG3 항체 S220-51은 노스스타 바이오프로덕츠(Northstar Bioproducts; 메사추세츠주 케이프 코드(Cape Cod, MA))로부터 구매하였다.
hu3F8
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IgG1
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hu3F8
-
IgG4
,
ch3F8
-
IgG1
및
ch3F8
-
IgG4
항체 생산 세포주(
antibody
producer
line
)의 구축
m3F8의 인간 상동체를 기초로, m3F8의 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR 서열을 인간 IgG1 프레임워크에 그래프팅하고, 최적화하였다. 2개 중쇄 및 2개 경쇄 유전자로부터, 4가지 형태의 hu3F8을 설계하였다. 이들 hu3F8 유전자를 합성하고, CHO 세포에 대해 최적화하였다 (블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology; 워싱턴주 보스헬(Bothhell, WA)) 또는 겐스크립트(Genscript; 뉴욕주 피스카타웨이(Piscataway, NY)). 블루스크립트 벡터 (유레카(Eureka; 캘리포니아주))를 사용하여, 이들 hu3F8의 중쇄 및 경쇄 유전자를 DG44 세포에 형질감염시키고, G418 (인비트로겐(InVitrogen; 캘리포니아주))로 선별하였다. Mage1.5 CHO 세포 (유레카; 캘리포니아주)에 형질감염되는 경우에, 특정 IgG 글리코형이 생산되었다. 유사하게, 마우스 VH 및 VL 서열을 인간 IgG1 및 IgG4 프레임워크에 그래프팅하여, ch3F8-IgG1 및 ch3F8-IgG4 재조합 항체를 제조하였다.
hu3F8
및
ch3F8
의 정제
hu3F8 및 ch3F8 생산 세포주를 옵티초(Opticho) 무혈청 배지 (인비트로겐; 캘리포니아주)에서 배양하고, 성숙한 상층액을 수확하였다. 단백질 A 친화도 컬럼을 pH 8.2의 0.15 M NaCl를 갖는 25 mM 나트륨 시트레이트 완충액으로 예비-평형화시켰다. 결합된 hu3F8을 0.1 M 시트르산/나트륨 시트레이트 완충액 (pH 3.9)으로 용리시키고, 25 mM 나트륨 시트레이트 (pH 8.2)에서 알칼리화시켰다. 이를 사르토바인드(Sartobind)-Q 막에 통과시키고, pH 8.2의 25 mM 나트륨 시트레이트, 0.15 M NaCl (1:10 v/v 비율) 중에서 5-10 mg/ml로 농축시켰다. 0.7 mg/ml의 트윈 80 (시그마(Sigma))의 존재 또는 부재 하에 25 mM 나트륨 시트레이트 0.15 M NaCl (pH 8.2) 대 PBS (pH 7.4) 중의 hu3F8-IgG1에서 안정성 연구를 수행하였다.
SDS
-
PAGE
각각의 단백질 2 ug을 4-15% 트리스-글리신 레디 겔 시스템(Ready Gel System) (바이오라드(Bio-Rad; 캘리포니아주 허큘러스(Hercules, CA)))을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 인비트로겐 시블루 플러스2(Invitrogen SeeBlue Plus2) 예비-염색된 표준을 단백질 분자 중량 마커로서 사용하였다. 전기영동 후에, 피어스사의 겔코드 블루 스테인(GelCode Blue Stain) 시약을 사용하여 겔을 염색하였다. 바이오-라드 플루오르-S 멀티이미저(Fluor-S MultiImager; 바이오-라드)를 사용하여 겔을 스캔하고, 퀀티티 원(Quantity One) 소프트웨어 (바이오-라드)를 사용하여 밴드 강도를 정량하였다.
ELISA
에 의한
hu3F8
및
ch3F8
의 정량
미량역가 플레이트를 웰 당 20 ng의 GD2로 코팅하였다. 웰 당 150 ul의 PBS 중 0.5% BSA (희석제)를 주위 온도에서 적어도 30분 동안 각 플레이트에 첨가하여 과도한 결합 부위를 차단하고, PBS로 적어도 3회 세척하였다. 정제된 hu3F8-IgG1 배치 (원액 농도 1 mg/ml)를 사용하여 0.5 ug/ml로 출발하며 2배 희석으로 이어지는 표준 곡선을 그렸다. 100 ul의 표준 및 샘플 (또한 2배 희석됨)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 5회 세척한 후, 100 ul의 염소 항 인간-IgG (H+L) (잭슨 리서치 래보라토리(Jackson Research Laboratory))를 희석제에서 1:3500으로 희석시키고, 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 색 반응이 실온에서 30분 동안 암실에서 기질 과산화수소와 함께 크로모겐(chromogen) OPD (시그마)로 발생되었다. 반응을 5N H2SO4로 중지시키고, OD를 490에서 ELISA 플레이트 리더 MRX (다이넥스(Dynex))로 판독하였다. 표준 곡선을 기준으로 하여, hu3F8 상층액의 정량을 단백질의 ug/ml 또는 ug/mg으로 계산하였다.
비아코어
T-100 바이오센서 (
지이
헬스케어(스웨덴
웁살라(Uppsala, Sweden)
의
비아코어
에이비
)에서의
시험관내
결합 속도
CM5 센서 칩 (연구 등급) 및 관련된 시약은 비아코어 USA (뉴저지주 피스카타웨이)로부터 구입하였다. 강글리오시드 GM1은 알렉시스 바이오케미칼스(ALEXIS Biochemicals) (악소라 엘엘씨(AXXORA LLC; 캘리포니아주 샌 디에고(San Diego, CA))로부터 였으며, GD2는 어드벤스드 이뮤노케미칼(Advanced Immunochemical; 캘리포니아주 롱 비치(Long Beach, CA))로부터였다. GM1을 90% 에탄올, 10% 메탄올 (v/v)에 용해시키고 (0.5 mg/ml), GD2를 에탄올에 용해시켰다 (0.5 mg/ml). 강글리오시드를 소수성 상호작용을 통해 CM5 센서 칩에 직접 고정화시켰다. 참조 표면을 GM1로 고정화시켰다. GM1을 100% 에탄올로 1:1 희석시키고, 이후 HBS-E 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 3 mM EDTA)에서 1/5 희석시켰다. 희석된 GM1 (50 μg/ml)을 20분에 걸쳐 15 μl/분의 유속으로 주입하였다 (300 μl). 안정한 기준이 얻어질 때까지 10 mM NaOH (통상적으로, 5 μl/분의 유속에서의 20 μl의 5회 세척)로 철저하게 세척하였다. 활성 표면을 GD2 및 GM1 (1:1 비율)로 고정화시켰다. GD2 및 GM1을 100% 에탄올로 1:1 희석시키고, 1:1 비율로 혼합하였다. GD2 및 GM1의 혼합물을 HBS-E 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 3 mM EDTA)에 1/5 희석시켰다. GD2 및 GM1의 희석된 혼합물 (50 μg/ml)을 20분에 걸쳐 15 μl/분의 유속으로 주입하였다 (300 μl). 그 후 안정한 기준이 얻어질 때까지 10 mM NaOH (통상적으로, 5 μl/분의 유속에서의 20 μl의 5회 세척)로 철저히 세척하였다.
분석 전에, 정제된 항-GD2 MoAbs를 다양한 농도 (50-1600 nM)로 250 mM NaCl를 함유하는 HBS-E 완충액에 희석시켰다. 2. 샘플 (60 μl)을 2분에 걸쳐 30 μl/분의 유속으로 센서 표면에 주입하였다. 결합기(association phase)의 완료 이후, 해리를 동일한 유속에서 300초 동안 250 mM NaCl을 함유하는 HBS-E 완충액에서 모니터링하였다. 각 주기의 종료시, 1분에 걸쳐 50 μl/분의 유속으로 20 mM NaOH 50 μl를 사용하고, 2분에 걸쳐 50 μl/분의 유속에서의 4 M MgCl2 100 μl를 사용하여 표면을 재생시켰다. 고정화된 GD2에의 샘플의 주입 후에 얻어진 바이오센서 곡선을 반응 속도 분석 전에 고정화된 GM1에 주입된 샘플로 얻어진 대조 곡선으로 차감하였다. 비아코어 T-100 평가 소프트웨어를 사용하여 속도 상수에 대하여 2가 분석물 모델 및 디폴트 파라미터 설정에 의해 데이터를 분석하고, 겉보기 결합 속도 상수 (kon, kal), 해리 속도 상수 (koff, kdl) 및 평형 해리 상수 (KD=kdl/kal)를 계산하였다.
추가적으로, Hu3F8 및 ch3F8을 래트 항-3F8 항-이디오타입 항체로 특성분석하였다 (문헌 [Cheung et al., 1993, Int J Can 54, 499-505]). 또한, 이러한 래트 IgG1 항체를 Fab 단편으로 절단하였으며, Fab 제조 키트 (피어스 프로틴 리서치 프로덕츠(Pierce Protein Research Products), 서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 정제하였다. ch3F8 및 hu3F8의 그의 반응성을 ELISA 및 BIACORE에 의해 분석하였다.
다른
강글리오시드와의
교차 반응성에 대한
ELISA
GD2, GM2, GD1a, GD1b, GT1b, 및 또한 GD3, GM3, GM1, GD1a를 90% 에탄올 중 웰 당 20 ng으로 코팅하였다. 공기 건조한 이후, 웰을 실온에서 1시간 동안 웰 당 150 ul의 PBS 중 0.5% BSA로 차단하고, 이후 PBS로 3회 세척하였다. 항체를 0.5% BSA 중에서 1 ug/ml (웰 당 100 ul)로 3벌로 첨가하였다. 배경 차감을 위하여, (1) 항원이 없는 웰 및 (2) 샘플이 없는 웰을 사용하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 5회 세척한 후, 마우스 항체 (예를 들어, 3F8)에 대하여 HRP-염소 항 마우스 IgG (잭슨 래보라토리(Jackson Laboratory), 1:1000로 희석) 또는 인간화 항체에 대하여 HRP-염소 항 인간 IgG (잭슨 래보라토리, 1:1000)를 사용하였다. 4℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하고, 추가로 세척한 후에, OD를 490에서 ELISA 플레이트 리더 MRX (다이넥스)를 사용하여 판독하고, 교차 반응성을 GD2에 대한 % 최대 결합으로 표현하였다.
항체의
바이오틴화
바이오틴 (롱암(Long Arm))-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (BNHS, 벡터 래보라토리즈, 인크.(Vector Laboratories, Inc.; 캘리포니아주 벌링게임(Burlingame, CA))를 50 mg/ml의 농도로 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해시켰다. 비오티닐화 시약을 시약의 1/10 중량비로 항체에 첨가하였다. 가끔 교반하면서, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 비오티닐화된 항체를 실온에서 4시간 동안 또는 4℃에서 밤새 PBS에서 투석하였다. 비오티닐화된 항체의 면역반응성을 천연 항체와 비교하고, EC50이 서로 20% 이내였음이 보장되었다.
면역염색법에 의한 조직 교차-반응성
5 내지 7 마이크로미터 두께의 동결된 부위를 저온 유지 장치(cryostat)를 사용하여 커팅하고, -20℃에서 30분 동안 250 ul의 아세톤으로 고정시켰다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 새롭게 준비한 0.1% 과산화수소에 슬라이드를 15분 동안 실온에서 노출시켰다. 세척 후, 아비딘 차단 용액 (벡터 아비딘-바이오틴 차단 키트)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 바이오틴 차단 용액 (벡터 아비딘-바이오틴 차단 키트) 한 방울을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 추가로 세척한 후, >100 ul의 차단 혈청 (PBS 중에 새롭게 희석된 10% 말 혈청)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 단계는 보다 길어질 수 있다. 주의사항: 혈청을 재사용해서는 안 된다. 각각의 슬라이드로부터 차단 혈청을 흡입한 후, 1% 말 혈청 중에 희석시킨 1 ug/ml 바이오틴화된 MOPC21 (음성 대조군) 또는 바이오틴화된 항체 100 ul를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, PBS 중에 1:100으로 희석된 아비딘-바이오틴 복합체 [ABC] (벡타스테인(Vectastain) ABC 키트, 벡터) 100 ul를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 200 ul의 염료 (DAB 퍼옥시다제 기질 키트, 벡터)를 각각의 부위에 첨가하고, 색이 2분 동안 (표준 색 전개에 기초하여 목적하는 강도의 염색이 달성될 때까지) 전개되도록 하였다. 상기 부위를 흐르는 수돗물에서 5분 동안 세척하고, 마이어(Myer)의 헤마톡실린 저장 용액으로 대비염색시키고, 흐르는 수돗물에서 5분 동안 추가로 세척하였다. 슬라이드를 순차적으로 75%, 이어서 95%, 이어서 100% 에틸 알콜 중에서 탈수시켰다. 최종 탈수 단계는 자일렌 또는 자일렌 치환체 중에서 수행하였다. 새로운 사이토실(Cytoseal) 한 방울을 첨가한 다음, 상기 부위를 커버 슬립으로 밀봉하였다.
직접적인 세포독성
인간 혈청 또는 인간 이펙터 세포의 부재하에서 종양 세포 성장 및 생존에 대한 항체의 직접적인 영향에 대해 시험하였다. 종양 표적을 2mM EDTA 또는 트립신-EDTA로 해리시키고, 세척하고, 각 웰 당 1.2 x 103 내지 3.5 x 104로 F10 중의 96-웰 편평형 바닥 플레이트 내에 플레이팅하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, F10 중의 항체의 농도를 증가시키며 각 웰에 첨가하였다. 대조군 웰은 F10만을 단독으로 수용하였다. 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, WST-8 시약을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2 내지 6시간 동안 CO2 인큐베이터 내 암흑 속에서 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 판독기 MRX (다이넥스(Dynex))를 이용하여 450nm 및 690nm에서 OD를 판독하였다. 트립판 블루(Trypan Blue) (시그마) 또는 베크만 코울터(Beckman Coulter) 계수기 (미국 캘리포니아주 브레아 소재 베크만 코울터)를 사용하는 직접 세포 계수법을 이용하여 WST-8 검정을 입증하였다.
51
크로뮴
방출에 의한 항체 의존성 세포 독성 (
ADCC
)
표적 세포를 Ca2 + Mg2 + 무함유 PBS 중에서 2 mM EDTA를 사용하여 떼어내고, RPMI 1640 (F10) 중의 10% 송아지 배지 (깁코(Gibco))에서 세척하였다. 100 μCi의 51Cr을 106개의 표적 세포와 함께 최종 부피 250 μl로 인큐베이션하고, 37℃에서 1시간 동안 펠렛을 15분 간격으로 부드럽게 재현탁시키며 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 250 ul F10 중에 재현탁시키고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 계수하고, 트립판 블루 (시그마)를 사용하여 생존능을 측정하고, 96웰 U형-바닥 플레이트 상에 신속하게 플레이팅하였다. 정상 지원자로부터의 말초 혈액을 헤파린 처리된 튜브 내에 수집하였다. 혈액을 3% 덱스트란/PBS와 혼합하고, 실온에서 20분 동안 유지하여 적혈구를 침전시켰다. 이어서, 백혈구를 피콜(ficoll) 처리하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)-ADCC 및 과립구 (PMN)-ADCC를 위해 각각 PBMC 및 PMN으로 분리하였다. 세포를 F10 중에서 세척하고, 계수하고, 생존능을 측정하였다. PBMC-ADCC는 10 U/ml의 IL-2의 존재하에 일어났고, PMN-ADCC는 2 ng/ml의 GMCSF의 존재하에 일어났다. ADCC의 최종 부피는 250 ul/웰이었다. 항체를 F10 중에서 1 ug/ml로부터 3배 또는 5배의 희석물로 희석시켰다. 플레이트를 실온에서 스냅 스핀에 대해 500 rpm으로 원심분리한 다음, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. ADCC 상청액 중의 방출된 51Cr을 감마 계수용으로 수집하였다. 총 방출량을 10% SDS를 사용하여 측정하고, 배경의 자연발생적 방출량은 이펙터 없이 F10만을 사용하여 측정하였다. 50:1의 E:T 비율이 일반적으로 사용되었다. 유사하게, 인간 CD16 또는 인간 CD32 Fc 수용체로 안정하게 형질감염된 NK92-MI 세포를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. PBMC 또는 PMN과는 다르게, 상기 검정에 사이토카인은 필요하지 않았다. E:T의 비율은 일반적으로 20:1로 유지되었다.
항체의 요오드화
124I 및 131I를 이용한 요오드화를 요오도젠(iodogen) 방법을 사용하여 수행하였다 (문헌 [Divgi et al., 2007, Lancet Oncol. 8, 304-10]). 유리 바이알을 50 μg의 요오도젠으로 코팅하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 7.4) 중의 100 μg의 IgG를 1 mCi의 124I (또는 131I)와 함께 첨가하였다. MSKCC에서의 사이클로트론(cyclotron)에 의해 소정 부위 상에 요오드 124가 생성되었다. 0.05 M NaOH 중의 10 mCi의 124I (0.02 내지 0.05 mL)를 반응 바이알에서 1 mg의 MoAb (약 0.5 mL), 0.063 mL 1 M 트리스 염기 및 0.4 mL 0.2 M 인산나트륨 (pH 7.4)과 혼합하였다. 반응이 15분 동안 지속되도록 한 후, 용액을 꺼내고, P6 크기 배재 칼럼 및 PBS 중 1% BSA의 용리액을 이용하는 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
방사면역검정
(
RIA
)
린드모(Lindmo)의 방법을 사용하여 면역반응성을 평가하였다 (문헌 [Lindmo et al., 1984, J Immunol Methods 72, 77-89]). 방사성표지된 MoAb를, 50 μl가 약 15,000 내지 20,000 cpm (대략 1 내지 1.5 uCi/3 ml)을 함유할 때까지 1% BSA로 희석시켰다. 50 μl를 625만, 375만, 250만, 220만, 190만 개의 종양 세포를 함유하는 500 μl 0.5% BSA에 첨가하고, 주위 온도에서 1시간 동안 혼합하였다. 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 1 ml 빙냉 0.5%BSA로 세척하였다. 1500 rpm에서 5분 동안 추가로 원심분리한 후, 세포 펠렛을 감마 계수기에서 계수하였다. 세포 또는 요오드화된 항체의 부재하의 배경 계수값은 빼고, 린드모 방법에 의해 면역반응성을 평가하였다 (상기 문헌 [Lindmo et al., 1984]).
이종이식된 마우스에서의
MoAb
의 생체분포
sc LAN1 신경아세포종 종양으로 이종이식된 무흉선증 누드 마우스를 사용하여 약동학/생체분포 및 항-종양 특성을 연구하였다. 종양을 캘리퍼(caliper)를 사용하여 측정하였다. sc 종양이 약 200 mg에 도달했을 때 실험을 시작하였다. 마우스 1마리 당 방사성요오드화된 항체 약 100 uCi를 정맥내 주사하고, 보통 48시간에 동물을 희생시켰으며, 이들의 기관을 꺼내 감마 계수기 (패커드 인스트러먼츠(Packard Instruments), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))로 계수하였다. 이러한 기관에는 피부, 간, 비장, 신장, 부신, 위, 소장, 대장, 방광, 대퇴골, 근육, 종양, 심장, 폐, 척추 및 뇌가 포함되었다. 기관에 축적된 uCi 및 기관 중량을 기준으로, 마우스의 %주사 용량 (ID)/gm을 계산하였다. 종양 대 정상 조직의 비율 (%ID/gm) 또한 계산하였다.
당 분석
복합 탄수화물 리서치 센터(Complex Carbohydrate Research Center) (미국 조지아주 아테네 소재)에 의해 항체의 단당류 및 올리고당류 분석을 수행하였다. 단당류 분석은 HPAEC에 의해 검정하였다. N-글리칸 프로파일링은 MALDI-MS에 의해 수행하였다.
실시예
1
키메라
-
IgG1
및 4가지 인간화
IgG1
의 아미노산 서열.
m3F8의 중쇄 및 경쇄의 CDR을, 각각 인간 프레임워크 IGG HV3-33 및 IGKV3-15와의 이들의 상동성을 기초로 하여 인간 IgG1 프레임워크 상에 이식하였다. 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 디자인으로부터, 4가지 버전의 hu3F8이 유전자 합성되고, DG44 세포에서 발현되었다. 키메라 인간 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열식별번호:1 및 2로 나타내고, 인간화 중쇄 서열 huH1-감마1은 서열식별번호:4로, huH2-감마1은 서열식별번호:6으로 나타내고, 인간화 경쇄 서열 huL1-카파는 서열식별번호:5로, huL2-카파는 서열식별번호:7로 나타낸다.
전체적인 IgG로서 발현되는 경우, 4가지 hu3F8-IgG1은 hu3F8-H1L1-IgG1, hu3F8-H1L2-IgG1, hu3F8-H2L2-IgG1 및 hu3F8-H2L1-IgG1로 명명한다. m3F8 및 hu3F8-H1L1-IgG1의 중쇄 서열을, 인간 IgG4 프레임워크로 대체함으로써 추가의 구성체를 제조하고 (키메라 중쇄 감마4 (서열식별번호:4) 및 인간화 3F8 중쇄 감마4 (서열식별번호:8)), 블루스크립트(bluescript) 벡터를 사용하여 DG44 세포 내로 형질감염시켰다. 또다른 세트의 실시양태에서, hu3F8-H1L1-IgG1 서열을, 특정한 글리코실화 특징에 대해 선별된 특정한 MAGE1.5 CHO 세포주 내로 형질감염시켰다 (재료 및 방법 섹션 참조). 키메라 및 인간화 3F8 둘 모두를 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
SDS 겔 상에서, 키메라 및 인간화 항체는 적합한 크기의 중쇄 및 경쇄를 가진 IgG로서 이동하였고; HPLC에 의해 이들은 모두 <10% 응집 형성을 가지며 전체적인 IgG로서 용리되었다 (데이터는 나타내지 않음). ELISA에 의하면, 이들은 모두 유사한 결합활성을 가지며 GD2에 결합하였다. FACS 분석 (LAN-1, 데이터는 나타내지 않음)에 의하면, 항체는, 보다 높은 항체 농도에서 세포 사멸로 인해 평균 형광 강도 (MFI)가 하락하는 것을 지나는 최적의 항체 농도 (약 0.1 내지 1 ug/백만 개의 세포)를 나타냈다. M14 흑색종의 경우, 백만 개의 세포 당 1 ug을 넘는 과량의 항체를 사용하는 경우 세포 사멸은 발생하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). IgG4는, 형광 제2 항체의 인간 IgG1과의 우선적 반응성으로 인해, 보다 낮은 MFI를 갖는 경향이 있었다. 다른 hu3F8 구성체와 비교하여, hu3F8-H1L1-IgG1은 동결 및 해동 후에, 종양 세포에 대한 이의 결합을 유지하면서 (FACS 및 ELISA에 의함 (데이터는 나타내지 않음)) 가장 안정하였다. 당 분석에 의하면, 거의 동등한 몰농도 비율의 푸코스 및 N-아세틸-글루코사민을 함유한 hu3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG4와는 대조적으로, hu3F8-IgG1n은 주로 만노스를 가지며 N-아세틸-글루코사민은 약간만 가졌다 (표 1).
실시예
2
SPR
(
비아코어
)에 의한 결합활성 측정
CM5 칩 상에 코팅된 GD2를 사용하여, 항체 결합의 동역학 (kon, koff 및 KD)을 GD2 저밀도에서 비아코어 T-100을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 비교하였다 (표 2). GD2 고밀도에서 koff 및 KD 둘 모두는 모든 항체에 대해 비례하여 향상되었다 (데이터는 나타내지 않음). 상이한 항체 농도에서의 대표적 항체의 센서그램(Sensorgram)을 비아코어 CM5 칩 상에서, GD2 저밀도 (데이터는 나타내지 않음) 및 GD2 고밀도 (데이터는 나타내지 않음) 둘 모두에서 비교하였다.
<표 1>: 단당류 조성
항체가 GD2-양성 종양 세포와 반응하는 경우, 항체의 느린 koff는 보다 느린 워시 오프로 해석되었다. 여기서, LAN-1 세포 (데이터는 나타내지 않음) 또는 M14 세포 (데이터는 나타내지 않음)는 모노클로날 항체와 반응하였고, 세척 완충액 중에서 다수의 횟수로 세척되었다. 각각의 세척 시, 세포 표면 상에 남아있는 항체는 2차 FITC-표지된 염소 항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. MFI는 기준선 (즉, 1차 세척 후)의 백분율로서 나타냈다. LAN-1 세포 상에서, 3F8 및 항-B7-H3 8H9 항체는 14.G2a (약 30% 보유율; 데이터는 나타내지 않음)에 비해 느린 워시 오프 (10회의 세척 후 약 80% 보유율)를 나타냈다. M14 종양 세포의 경우에도 유사하게, 5번째 세척에 의해, 종양 세포 상에서의 항체의 보유율에서 실질적인 차이가 존재하였다. 3F8, 3F8-(Fab')2 및 hu3F8-IgG1 (모두 느린 koff를 가짐)이 >80% 보유율을 가진 반면, 다른 항-GD2 항체 14.G2a (mIgG2a), ME361 (mIgG2a) 및 S220-51 (mIgG3) (비아코어에 의하면 모두 빠른 koff를 가짐)는 <30%로 누설되었다. hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG4, ch3F8-IgG1 및 ch3F8-IgG4는 또한 래트 항-3F8 항유전자형 항체 (문헌 [Cheung et al., 1993, Inter J Cancer 54, 499-505]) 및 높은 결합활성을 갖는 이들의 Fab 단편에 특이적으로 반응하였다 (ELISA 및 SPR에 의함) (방법 섹션 참조).
실시예
3
다른 항원과의 교차반응성
교차 반응성 연구에서, hu3F8-H1L1-IgG1은 ch3F8-IgG1 및 m3F8와 유사한 프로파일을 가졌다 (표 3). GD1b와의 낮은 수준의 교차 반응성 (고체상 GD2 상에서의 OD에 대한 OD (ELISA에 의함) 백분율로서 나타냄)이 존재했다. 웨스턴 블랏(Western blot) 또는 SPR (데이터는 나타내지 않음)에 의하면, m3F8, hu3F8 또는 14.G2a의 인간 N-CAM (문헌 [Patel et al., 1989, Br. J. Cancer 60, 861-866])과의 교차 반응성은 존재하지 않았다.
<표 2>: SPR (비아코어-T100)에 의한 키메라 및 인간화 3F8의 결합 동력학
실시예
4
직접적인 세포독성
이러한 항체를 시험관내 신경아세포종 세포에 첨가하는 경우, 이들은 직접적인 세포 사멸을 유도하였으며, 시험관내 세포 성장 속도를 저하시켰다. 3일 배양 시스템에서 WST-8에 의해 검정하는 경우, EC50을 비교하였을 때 (표 4 참조), m3F8 및 hu3F8은 유사한 효력을 가졌지만 14.G2a는 약 10배 더 약했다.
<표 3>: ELISA에 의한 다른 강글리오시드와의 교차 반응성
실시예
5
항체 의존성 세포 매개 세포독성
4가지 hu3F8 IgG1 항체 (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2)를, 이펙터로서 지원자 PBMC (데이터는 나타내지 않음) 및 지원자 PMN (데이터는 나타내지 않음)을 사용한 ADCC 검정에서 비교하였다. H1L2 이외에, 3가지 hu3F8 모두는 비슷한 PBMC-ADCC를 가졌다. 하지만 가장 중요하게는, 이들은 모두 m3F8보다 >10 내지 100의 인자만큼 우수했다.
<표 4>: 항체의 존재하에서의 신경아세포종 LAN-1의 직접적인 세포독성
Hu3F8-H1L1-IgG1 (약어 hu3F8-IgG1)은 시험관내에서 가장 안정하였고, 추가의 특징화를 위해 선별되었다. Ch3F8-IgG1, hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n, 14.G2a 및 m3F8을, 이펙터로서 PBMC (데이터는 나타내지 않음) 또는 PMN (데이터는 나타내지 않음)을 사용한 LAN-1에 대한 ADCC 검정에서 비교하였다. 이들 항체의 ADCC 효력은 (3F8에 대한 EC50)/(MoAb에 대한 EC50)의 비로서 계산하였다 (표 5). m3F8에 비해, hu3F8-IgG1은 PBMC-ADCC에서 217배 더 강력했고, PMN-ADCC에서는 19배 더 강력했다. hu3F8-IgG1n의 경우, 각각 3901배 및 5배 더 강력했다. 또한, 키메라 및 인간화 3F8 둘 모두를 사용하여 달성된 최대의 세포독성은 PBMC-ADCC 또는 PMN-ADCC인지에 관계없이, m3F8 또는 14.G2a보다 실질적으로 그리고 지속적으로 더 높았다.
단리물 중 (억제성 FcR의 부재 하) 각각의 FcR에 대한 ADCC에서의 MoAb의 능력을 조사하기 위해, NK92 세포를 이용하여 ADCC를 시험하였다. NK92 세포는 이들의 세포 표면상에 인간 FcR를 가지고 있지 않다. 인간 CD16 및 CD32로 형질감염되는 경우, 이들은 효율적인 ADCC를 매개할 수 있다. 이러한 이펙터 세포를 신경아세포종 LAN-1 표적에 대하여 시험한 경우, CD16-ADCC에서 hu3F8-IgG1n은 hu3F8-IgG1보다 실질적으로 (약 10배) 더 효율적이었으며, 결과적으로 이는 m3F8 보다 (12배) 더 효율적이었다 (데이터는 나타내지 않음). 반대로, FcR로서 CD32를 사용한 경우, 효력은 hu3F8-IgG1n에 비해 hu3F8-IgG1에 대해 거의 10배 더 높았다 (데이터는 나타내지 않음). 흑색종 M14가 표적으로서 사용되는 경우에, 유사한 경향이 관찰되었다. CD16-ADCC에서 Hu3F8-IgG1n은 hu3F8-IgG1 또는 ch3F8-IgG1보다 약 10배 더 효율적이었으며, 결과적으로 m3F8 또는 14G.2a보다 약 20배 더 효율적이었다 (데이터는 나타내지 않음). 반대로, CD32가 FcR인 경우에 hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n 및 ch3F8-IgG1은 유사했으며, 모두 CD32-ADCC에서 m3F8 보다 >10배 더 효율적이었다 (표 6). IgG4 서브클래스 항체는 <3%의 CMC 활성, 최소의 CD16-ADCC 활성을 가졌지만, C32-ADCC는 m3F8보다 양호하였다.
실시예
6
보체 매개 세포독성
인간 보체 매개 용해 (CMC)에서, 상이한 hu3F8 IgG1 형태들 (H1L1, H1L2, H2L1 및 H2L2)은 효율의 면에서 비교할 만한다 (표 6). Ch3F8 및 hu3F8은 40 내지 60%인 반면, 14G.2a 및 ch14.18은 CMC에서 m3F8가 효율적인 만큼인 4 내지 12%였다 (표 6).
<표 5>: 신경아세포종 LAN-1에 대한 ADCC 및 CMC에서의 상대적인 항체 효력
실시예
7
인간 신경아세포종
이종이식편의
표적화
Hu3F8-IgG1, hu3F8-IgG1n 및 hu3F8-IgG4를 131I로 방사성표지하였으며, 이들은 대략 40 내지 45%의 비슷한 면역반응성을 가졌다 (표 7). 48시간에서의 이들의 생체분포를 sc LAN-1 신경아세포종 이종이식편을 지닌 마우스에서의 131I-m3F8의 생체분포와 비교하였다. %ID/gm에 의해 측정한 경우 종양 흡수는 hu3F8-IgG1 (29.6%)와 m3F8 (28.6%) 간에 비슷했고, 둘 모두는 hu3F8-IgG1n 및 hu3F8-IgG4의 종양 흡수 (데이터는 나타내지 않음)의 거의 2배였다. 종양 대 정상 조직의 비율은 NB LAN-1 이종이식편에 대한 이러한 4가지 항체들 간에 비슷했다. 대조적으로, 흑색종 M14의 경우, 3가지 hu3F8 항체 모두의 종양 대 정상 조직의 비율 및 %ID/gm 둘 모두가 m3F8과 유사했다 (데이터는 나타내지 않음).
<표 6>: 흑색종 M14에 대한 ADCC 및 CMC에서의 상대적인 항체 효력
실시예
8
신경아세포종
이종이식편의
처치
확립된 인간 신경아세포종 LAN-1 (0.5 내지 1 cm 직경)로 이종이식된 마우스를 매주 2회씩 4주 동안 m3F8 또는 hu3F8-H1L1-IgG1로 정맥내(iv) 처치하였다. 종양 반응 및 마우스 생존을 모니터링하였다. 종양 성장에서의 지연은 hu3F8-H1L1-IgG1 항체 용량 (200 ug > 100 ug > 20 ug; 데이터는 나타내지 않음)에 의존적이었다. 100 내지 200 ug을 투여받은 마우스의 생존은 PBS 대조군 또는 m3F8을 투여받은 마우스보다 유의하게 더 길었다 (p=0.003) (데이터는 나타내지 않음).
<표 7>: 생체분포 연구에서의 131I-표지된 항체의 RIA
논의
항-GD2 항체는 GD2-양성 신경아세포종에 대해 증명된 요법이다 (문헌 [Yu et al., N Engl J Med 363:1324-1334, 2010]). 쥐과 동물 항체 14.18 및 그의 유도체 (14.G2a 및 ch14.18)는 항-GD2 요법의 향후 개선점에 대한 기준을 제공하였다. 본 발명자들은 쥐과 동물 IgG3 항체 m3F8의 GD2 결합 동안의 koff가 14.G2a 또는 ch14.18에 비해 10배 더 느리기 때문에, 임상적 개발의 목적으로 쥐과 동물 IgG3 항체 m3F8을 선택했다. 골수 내에 항암화학요법-내성 전이성 신경아세포종을 가진 환자 중에서, m3F8은 GMCSF와 함께 80%의 완전 차도를 유도하였다 (문헌 [Kushner et al., 2001, J Clin Oncol 19, 4189-94]). 하지만, 인간 항-마우스 항체 (HAMA)는 이의 항원에 대한 결합 능력을 무효화시킴으로써, 항체의 직접적인 효과를 차단함으로써, 그리고 순환으로부터의 항체의 제거를 가속화함으로써, 쥐과 동물 항체의 효과를 약화시킬 수 있다. 쥐과 동물을 인간 IgG 프레임워크로 변화시키는 유전자 조작은 HAMA 반응을 감소시켜야 한다. ch14.18 및 hu14.18 (둘 모두 14.G2a의 VH 및 VL로부터 유래됨)은 환자 내에 최소의 면역원성을 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 잠재적인 차세대 항-GD2 항체로서 3F8의 키메라 및 인간화 형태를 시험하였다.
성공적인 키메라화 및 인간화에 대한 하나의 기준은 유전자 조작 동안의 친화도의 보존이다. 이는 특히 인간화 과정에서 CDR 이식 시에 불확실하다. ch3F8 및 hu3F8에서의 느린 koff의 보존에 대해서는 안심할 만했다. 하지만 보다 중요하게는, 시험관내 이펙터 기능의 보존 및 향상뿐만 아니라, 생체내 종양 표적화와 생체내 치료 성질이 중요할 수 있다. ch3F8-IgG1 및 hu3F8-IgG1 둘 모두는 m3F8보다 >200배 더 효율적인 PBMC-ADCC를 나타냈으며, PMN-ADCC보다는 >20배였다. 또한, 특정한 글리코형 hu3F8-IgG1n은 m3F8보다 >3500배 더 효율적인 PBMC-ADCC 및 5배 더 효율적인 PMN-ADCC를 가졌다. 극명하게 대조적으로, CMC에 대하여는, ch3F8 및 hu3F8은 m3F8보다 더 낮은 보체 활성화 능력을 가졌다.
ADCC에서의 이러한 큰 개선은 환자 내 모노클로날 항체의 항-종양 효과에 대한 ADCC의 역할에 대해, 최근에 주어진 가장 바람직한 증거이다. 리툭시맙(rituximab)으로 치료한 림프종 환자 중에서, 높은 친화도의 FcR2A 및 FcR3A 둘 모두는 보다 양호한 반응 및 생존 이점을 갖는 것으로 나타났다 (문헌 [Weng and Levy, 2003, J Clin Oncol 21, 3940-7]). 높은 친화도의 수용체 FcR3A는 시험관내 ADCC에서의 <10의 개선으로 해석되며 (문헌 [Niwa et al., 2004, Clin Cancer Res 10, 6248-55]), 진행에 대한 전체적인 반응 및 시간은 200%만큼 개선되었다 (상기 문헌 [Weng and Levy, 2003]). 전이성 유방암을 허셉틴(Herceptin)으로 치료하는 경우, 높은 친화도의 FcR3A를 가진 환자는 보다 양호한 전체적인 반응 (83% 대 35%, p=0.03) 및 진행이 없는 보다 긴 생존능 (p=0.005)을 가졌다 (문헌 [Musolino et al.,2008, J Clin Oncol 26, 1789-96]). 전이성 결장직장 암을 세툭시맙(Cetuximab)으로 치료하는 경우, 낮은 친화도의 FcR2A 및 FcR3A를 갖는 환자는 돌연변이된 KRAS를 갖는 환자에 필적하는 위험비를 가졌다 (문헌 [Bibeau et al., 2009, J clin Oncol 27, 1122-9]). 쥐과 동물 3F8을 사용하는 경우, 골수양 세포 상에 m3F8에 대한 높은 친화도의 FcR3A 수용체를 갖는 환자는 보다 양호한 생존능을 갖는 것으로 나타났다 (문헌 [Cheung et al., 2006, J Clin Oncol 24, 2885-90]).
결합 친화도 및 이펙터 기능이 치료제 적용에 중요하지만, 교차-반응성은 예상치 못한 독성 문제를 유발할 수 있다. 본 발명자들은 정제된 강글리오시드를 이용하는 ELISA 검정뿐만 아니라 정상 인간 조직의 패널 상에서의 면역조직화학법 둘 모두에 의해, 3F8에 대한 이러한 키메라 및 인간화 형태가 쥐과 동물 3F8과 비슷한 교차-반응성 패턴을 가짐을 나타냈다 (데이터는 나타내지 않음). m3F8과 유사하게, 3F8의 키메라 및 인간화 형태 둘 모두는, GD2에 비해서는 저수준이지만 GD1b에 대해 반응성을 나타냈다. GD1b는 특히 레티노이드에 의해 분화되는 경우에, 신경아세포종 종양 중에서 매우 일반적인 강글리오시드인 것으로 나타났다 (문헌 [Hettmer et al., 2004, Br J Cancer 91, 389-97]; 및 [Gong et al., 2002, Brain 125, 2491-506]). 이는, 시스-레티노산이 고-위험 신경아세포종에 대한 면역요법을 받고 있는 환자에게 통상적으로 제공되기 때문에 관련 있을 수 있다. 하지만, 항-GD1b 항체는 또한 감각 운동실조 신경병증과도 연관이 있었다 (상기 문헌 [Gong et al., 2002]). 그럼에도, 500명 초과의 환자에서의 m3F8 (GD1b에 대해 유사한 교차 반응성 가짐)의 안정성 프로파일은 안심할 만했다 (비영구적이거나 또는 말기의 감각 신경병증은 없음).
보체-매개 세포독성 (CMC)은 CD55 (문헌 [Cheung et al., 1987, Proc Natl Am Assoc Cancer Res 28, 387]) 및 CD59 (상기 문헌 [Chen et al., 2000])의 낮은 발현으로 인해, 인간 신경아세포종에 대해 비정상적으로 효과적이다 (문헌 [Saarinen et al., 1985, Proc Amer Assoc Cancer Res 26, 291]). 모든 항-GD2 항체는 효율적인 보체 매개 세포독성을 매개하고, m3F8이 특히 효율적인 것으로 보인다. 하지만, 리툭시맙에 대한 연구는 ADCC의 하향 조절에서의 보체 활성화의 부정적인 역할을 제시하였다 (문헌 [Wang et al., 2009, Blood 114, 5322-30]). 임상 연구에서, 보체 성분 C1qA의 보다 높은 활성은 리툭시맙 요법에 대해 보다 덜 유리한 반응과 연관이 있었다 (문헌 [Racila et al., 2008, Clin Cancer Res 14, 6697-703]). 항-GD2 항체에 대해, 보체 활성화는 통증 부작용을 담당하는 것으로 생각되었으며 (문헌 [Navid et al.,Curr Cancer Drug Targets 10:200-209, 2010]), 이러한 이유로 임상 시험에서 현재는 Fc-CH2 도메인 돌연변이된 버전 (hu14.18K322A)을 사용한다. 이러한 사항을 고려할 때, CMC의 과도한 진행은 아마도 바람직하지 않다. ch3F8 및 hu3F8 둘 모두가 약간 덜 효율적인 CMC를 가졌다는 것은 안심할만한 사항이다.
실시예
9
항체를 사용한 급성 통증 부작용의 차단
느린 koff를 갖지만 고갈된 ADCC 또는 CMC 활성을 갖는 항체가 혈관주위 공간을 둘러싸는 신경 섬유 상의 GD2를 차단하는 데 사용될 수 있다는 가설을 세웠다. 3F8의 열처리 (HM3F8)는, 3F8의 GD2 결합에 영향을 주지 않으면서 이의 ADCC 및 CMC 활성을 고갈시킨다 (문헌 [Kushner et al. 2011, J Clin Oncol 29, 1168-1174]). 열처리된 3F8을 래트에게 예비-주사하는 경우, 5 내지 10 몰농도를 초과하는 천연 3F8의 후속적 주사에 대한 이들의 통증 반응은 실질적으로 감소하였다. 보다 중요하게는, 항-종양 효과는 손상되지 않았다. 제I상 임상 시험 (IRB-05015, NCT00450307)에서, 저항성 신경아세포종 (NB)을 가진 30명의 환자들은 외래 환자 설정으로, 3F8과 함께 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자를 1 내지 2회 사이클로 투여받았다. 3F8 용량은 20 mg/m2/d에서 시작하여, 용량-제한 독성 (DLT)의 부재하에 20 mg/m2/d만큼 증가시켰다. 전-투약에는 진통제, 항히스타민, 및 2 mg/m2 HM3F8의 5분 주입이 포함되었다. 오피오이드 사용은, 20 mg/m2/d의 3F8로 처치되었지만 HM3F8로는 처치되지 않은 당해 대조군과 비교하였다. 용량의 단계적 상승은 약물 공급 제한으로 인해 160 mg/m2/d에서 중지되었지만, 이러한 투여량 수준 전체에서 진통제 요구량은 과거 대조군과 유사하였으며, DLT는 없었다. 80 mg/m2/d까지의 3F8 투여량 수준에서의 진통제 요구량은 대조군에 비해 유의하게 더 적었다. 항-NB 활성은 모든 투여량에서 발생하였다. 3F8의 이러한 다수배의 단계적 용량 상승은 실현가능했으며, 이는 HM3F8이 항-NB 활성을 약화시키지 않으면서 독성을 변형시킬 수 있음을 제시하였다.
hu3F8
-
IgG4
의 통증 차단 가능성
HM3F8의 임상 결과에 기초하여, 본 발명자들은 혈관주위 통증 섬유가 CMC 또는 ADCC 기능이 전혀 없는 소량의 항체에 의해 우선적으로 차단될 수 있다는 가설을 세웠다. m3F8을 가열하면 이의 CMC 및 ADCC 기능은 파괴되는 반면 (결합은 보유함), 열 변형된 hu3F8은 거의 완전한 CMC 및 ADCC 기능을 보유한다. hu3F8-IgG4가 상이한 NB 세포주, 예컨대 Lan1, NMB7, SKNLP, BE(1)N 및 SHEP1 (표 8; 데이터는 나타내지 않음)에서 CMC 및 ADCC를 활성화되지 못하게 하는 능력은, 이러한 항체 서브클래스를 HM3F8에 대한 실현가능한 대체물이 되게 한다. 가열이 항체 구조 및 면역원성에 대해 공지되지 않은 효과를 갖는 것과는 다르게, hu3F8-IgG4는 조작된 단백질이다. CMC 및 ADCC 기능의 부재 외에, IgG4 서브클래스는 고유의 생화학적 성질을 갖는다. 전형적으로 만성 항원 자극에 의해 유도되는 경우, 이들은 다른 항체 이소형에 의한 면역 복합체 형성을 방해하고, 이에 의해 염증성 반응을 약화시키는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Losen et al., 2008, Ann N Y Acad Sci 1132, 174-9]). 가장 중요하게는, 이는 그 스스로 항균력을 감소시키는 타고난 능력을 갖고 있으며, 이에 의해 혈액에서의 수시간의 기간 후 hu3F8-IgG1과 경쟁하는 능력을 잃어버린다 (문헌 [van der Neut Kolfschoten et al., 2007, Science 317, 1554-7]). 이러한 항균력은, 중쇄 및 부착된 경쇄 (1/2 분자)를 또다른 IgG4 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍으로 교환함으로써 Fab 군을 변화시켜 당해 특이적 항원 (예를 들어, GD2)에 대한 항균력을 생성하는 이의 공지된 성질로부터 유래한다.
래트
이질통
모델
래트 모델을 사용하여, 통증 부작용을 차단하는 hu3F8-IgG4 능력을 시험하였다 (MSK 프로토콜 #09-05-010). m3F8 (래트 보체의 효율적인 활성체; 문헌 [Bergman et al., 2000, Cancer Immunol Immunother 49, 259-66]) 및 hu3F8 둘 모두를 사용하여 이질통을 유도하였다. Hu3F8-IgG4 (0.1, 0.25 또는 0.5 mg/kg)를, m3F8 (5 mg/kg), hu3F8-IgG1 (5 mg/kg) 또는 ch14.18 (5 mg/kg)을 정맥내 주사하기 30분 전에 급속 정맥내 주사(iv push)로서 투여하였다. 다른 군은 hu3F8-IgG4 대신에 열 변형된 m3F8 (HM3F8) 또는 대조군 항체를 투여받았다. 본 프레이 필라멘트(Von Frey filament) 방법을 사용하여, MoAb 주사 전 및 그 후의 기준선에서의 통증을 평가하였다 (문헌 [Chassaing et al., 2006, Br J Clin Pharmacol 61, 389-97]; 및 [Benani et al., 2003, Eur J Neurosci 18, 2904-14]).
생체분포에 대한
hu3F8
-
IgG4
의 효과 및
131
I-
hu3F8
-
IgG1
의 효능
신경아세포종 (LAN-1) 종양을 낮은 혈청 IgG를 갖는 암컷 NOD/SCID/IL2-gcnull 면역결핍 마우스의 군 (각 군 당 n=10)에 피하 이식하였다. 실험 24시간 전에 마우스에 1 gm/kg의 인간 IgG를 주사하였다. Hu3F8-IgG4 (0.1, 0.25 또는 0.5 mg/kg) 또는 대조군 huIgG4 (0.1, 0.25 또는 0.5 mg/kg), 또는 HM3F8 (0.5 mg/kg), 또는 식염수를 급속 정맥내 주사로 투여하고, 30분 후에 131I-표지된 각각의 MoAb (50 uCi/마우스)로 추적 표지된 m3F8, 또는 hu3F8-IgG1 또는 ch14.18 (5 mg/kg)을 투여하였다. 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 및 96시간에 꼬리로부터 혈액을 수집하였다. 생체분포 연구에서, 2회의 시점 (131I-MoAb 주사 후 24h 및 48h)에 조직 계수를 위해 마우스를 희생시켰다. 주요 기관을 꺼내, 공지된 부피의 주사물로 감마 계수기에서 계수하고, 데이터를 %ID/gm (조직)으로서 나타냈다. 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어 프로그램 (파사이트 코포레이션(Pharsight Corp.); 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 이용한 혈청 농도-시간 데이터의 비-구획 분석에 의해 약동학적 분석을 수행하였다. 개별 세트의 실험에서, 이종이식된 마우스를 131I-추적 표지 없이 유사하게 처치하고, 이들의 sc 종양 반응을 2개월 동안의 시간에 걸쳐 측정하였다.
래트에서 이질통을 차단하는 hu3F8-IgG4의 능력은 열-처리된 m3F8의 능력과 비교할 수 있다. 사용된 차단 항체 (천연 m3F8, 또는 hu3F8-IgG1 또는 ch14.18 (모두 5 mg/kg)에 의한 투여는 유지됨)의 용량 반응 곡선에 기초하여, 래트에서의 이질통 차단에 대한 상대적인 효력이 도출될 수 있다. hu3F8-IgG4는 열-처리된 3F8과 비교하여, 이질통 차단에서 동등하거나 또는 보다 효율적일 것으로 예상된다. 이러한 연구는 hu3F8-IgG4를 임상 시험에 이행하는 것에 대한 전임상적 근거를 제공할 것이다.
실시예
10
향상된 안정성을 위한
hu3F8
프레임워크
서열의 최적화
쥐과 동물 항체를 인간화하는 방법에서, 구조적으로 중요한 위치의 프레임워크 잔기는 항체 안정성 및 항원 결합 둘 모두를 보존하기 위해, 빈번하게 쥐과 동물 서열로 역 돌연변이화된다 (문헌 [Honegger, A, 2008, Engineering Antibodies for Stability and Efficient Folding, In: Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology, 181]).
재료 및 방법
m3F8 가변 도메인의 구조적 모델
m3F8 가변 도메인의 상동성 모델을 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) (액셀리스(Accerlys); 미국 샌디에고 소재)에서 모델러(MODELER) (문헌 [Eswar et al., 2006, Curr Prot Bioinfor, Supplement 15, 5.6.1-5.6.30])를 이용하여 생성하였다. 말라리아 항원 AMA1 항체 Fab (단백질 데이터 은행 코드 2Q8A)의 결정 구조를 가변 경쇄에 대한 주형으로서 선택하였다 (84% 동일성). 항체 13G5 Fab (단백질 데이터 은행 코드 2GJZ)의 결정 구조를 가변 중쇄에 대한 주형으로서 선택하였다.
m3F8
Fab
단편의 결정 구조
m3F8의 Fab 단편을 표준 Fab 제조 키트 (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology); 미국 일리노이주 락포드 소재)를 사용하여 파파인 소화(papain digestion)에 의해 생성하였다. 정제된 m3F8을 20mM HEPES (pH 6.5) 중에서 12 mg/ml로 농축시키고, 0.1M 트리스(Tris) (pH 8.5)를 함유하는 햄튼(Hampton) 인덱스 시약 D9, 25% w/v PEG 3350 (미국 캘리포니아주 알리소 비에호 소재 햄튼 리서치)을 함유하는 저장소에 대해, 16℃에서 증기 확산에 의해 현적(hanging drop)으로 결정화하였다. 1 μl의 단백질 용액 및 1 μl의 저장 용액을 혼합하여 액적을 형성하였다. 25% 글리세롤, 0.1M 트리스 (pH 8.5), 25% w/v PEG 3350을 함유하는 동해방지제에 의해 결정을 보호하였다. 데이터를 아르곤 어드밴스드 포톤 소스 빔라인(Argonne Advanced Photon Source beamline) 24IDC에서 수집하였다. 결정은 공간군 C2에 속하며, 1.7 Å 분해능으로 회절한다.
페이저(Phaser) (CCP4 스위트(suite)) (문헌 [McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40, 658-674]) 및 조사 모델로서 PDB 엔트리 2AJU (문헌 [Qin et al., 2008, J Biol Chem 283, 29473-84])를 사용하여 분자 대체에 의해 Fab 구조를 알아내었다. 가장 양호한 분자 대체 모델을 Refmac5 (문헌 [Murshudov et al., 1997, Acta Crystallogr. D: Biol. Crystallogr 53, 240-255])를 사용하여 개선하고, 수동 피팅을 0으로 실행하고 (문헌 [The CCP4 suite: programs for Protein crystallography. Acta Crystallogr., D: Biol. Crystaollogr. 50 (1994) 760-763]), Arp-Warp (문헌 [Lamzin and Wilson, 1993, Acta Crystallogr, D: Biol. Crystallogr. 49, 129-147])를 사용하여 용매를 첨가하였다. 최종 모델은 m3F8 Fab의 2개의 폴리펩티드 쇄 및 585개의 용매 분자를 함유하였다.
m3F8 결정 구조의 컴퓨터 분석
인간 주형 IgHV3-33-HC 및 IGKV3-15-LC에 기초하여, m3F8 상의 프레임워크 내로 도입될 각각의 인간화 돌연변이를 컴퓨터 화학 방법을 이용하여 분석하였다. m3F8의 결정 구조를 CHARMm (하버드 분자 역학(Harvard Molecular mechanics)에서의 화학) 역장(force field) (문헌 [Brooks et al, 2009, J. Comp Chem 30, 1545-1615])을 이용하여 시뮬레이션화하고, 각각의 점 돌연변이의 효과를 돌연변이된 구조 및 야생형 단백질의 접힘 자유 에너지 간의 차이로부터 계산하였다. 일반화된 보른(Born) 근사법을 사용하여 용매의 효과를 설명하였고, 모든 정전기적 항은 용매화 에너지에 대한 쿨롱 상호작용(coulombic interaction) 및 극성 기여도의 총합으로서 계산하였다. 반 데르 발스(van der Waals) 항, 정전기적 항, 엔트로피 항 및 비극성 항의 가중치 총합을 각각의 점 돌연변이에 대해 계산하였다. 모든 계산은 디스커버리 스튜디오 3.0 (엑셀리스; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 실행하였다.
결과
hu3F8-H1L1 중쇄 서열의 경우, 인간 IgG 중쇄 서열 IgHV3-33-HC를 주형으로 사용하고, 위치 5, 9, 16, 19, 20, 24, 28, 29, 30, 40, 48, 49, 67, 71, 76, 78, 81, 86 및 92에서 역 돌연변이화되었다. hu3F8-H1L1 경쇄의 경우, 인간 IgG 경쇄 서열 IGKV3-15-LC를 주형으로 사용하고, 위치 1, 7, 9, 15, 19, 21, 22, 43, 45, 58, 60, 67, 70, 73, 78, 80 및 87에서 역 돌연변이화되었다. 역 돌연변이는 m3F8의 상동성 모델을 기초로 추론되었으며, 돌연변이가 CDR 루프의 접힘에 영향을 미치거나 또는 주쇄 안정성에 영향을 주는지를 결정하는 것에 관여하였다 (Gly 및 Pro가 관여하는 돌연변이).
상동성 모델의 정확성을 입증하고 인간화 전략을 더욱 향상시키기 위해, m3F8의 결정 구조를 1.7 Å에서 알아내었다 (데이터는 나타내지 않음). m3F8 가변 영역의 상동성 모델을, 알아낸 결정 구조와 중첩시켰다 (데이터는 나타내지 않음). CDR 외부의 대다수의 프레임워크 영역에 대한 상동성 모델은 실험적으로 얻은 결정 구조와 밀접하게 매칭(matching)되었다. 하지만, CDR 영역, 특히 루프 H3, H2 및 L3에서, 주목할 만한 차이점이 관찰되었다. 상동성 모델은 또한 Fv 구조의 안정성에 중요한 VH-VL 경계면에서의 임의의 상호작용을 정확하게 예측하는 것에 실패하였다. VH-VL 경계면에서의 수소 결합에 참여하는 6쌍의 아미노산 및 파이-상호작용에 참여하는 2쌍의 아미노산이 존재한다 (표 10). m3F8의 결정 구조를 알아낸 후, 컴퓨터 분석을 적용하여 IgHV3-33-HC 및 IGKV3-15-LC 주형을 기초로 각각의 인간화 돌연변이의 에너지 효과를 결정하였다. 각각의 돌연변이에 대해 접힘 자유 에너지에서의 차이를 계산하였다. 이러한 분석을 기초로, 인간화 돌연변이 중 5가지가 m3F8의 전체 접힘에 불안정화한 것으로 밝혀졌다 (표 9 참조). 이는 중쇄 위치 11 및 21, 및 경쇄 위치 1, 10, 12, 40 및 97을 포함한다. 위치 40 및 97의 경쇄에 각각 Pro 및 Gly을 포함하는 인간화 돌연변이가 주쇄 유연성에 크게 영향을 미치는지를 또한 결정하였다. 2가지 Gly/Pro 돌연변이 외에 이러한 5가지 불안정화 돌연변이가 역 돌연변이에 대한 후보로 고려되었고, 이들을 hu3F8-H3L3 서열 (서열식별번호:9 및 10)에 포함하였다. 또한 m3F8 결정 구조의 컴퓨터 분석을 통해, 항체 안정성에 대해 중립 효과를 갖는 5가지 인간화 돌연변이를 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 돌연변이는 경쇄의 위치 24 및 56, 및 중쇄의 위치 20, 58 및 92이다. 이러한 돌연변이는 상동성 모델을 기초로, hu3F8-H1L1의 서열 (서열식별번호:4 및 5)에 포함하지 않았지만, hu3F8-H3L3의 디자인에는 포함하였다.
hu3F8에서의 각각의 수소 결합 및 파이-상호작용을 보존하기 위해 m3F8의 결정 구조의 VH-VL 경계면에 대해 분석하였다 (표 10). 경계면 상호작용에 관여하는 15가지 아미노산 중에서, 14가지가 hu3F8-H1L1 및 hu3F8-H3L3의 디자인에서 보존되었다. 하나의 소실된 상호작용은 경쇄에 Ser43을 포함한다. 이러한 돌연변이를 hu3F8-L1 및 hu3F8-L3의 디자인에 첨가하여, Hu3F8-L1S 및 Hu3F8-L3S를 생성하였다.
이러한 안정성-향상된 프레임워크는, 상동성 모델을 사용하여 안정한 인간화 프레임워크를 디자인하는 것을 포함하는 당업계의 현재 상태로는 불가능할 것이다. 역장 방법을 이용하는 컴퓨터 분석과 함께, 실험적으로 얻은 m3F8의 결정 구조를 이용하는 것이, 향상된 안정성 프로파일을 갖는 신규한 항체의 디자인에 필요하였다.
<표 9>. m3F8 Fv의 결정 구조 상의 인간화 돌연변이에 대한 컴퓨터 분석
<마우스 구조를 불안정화시키거나 또는 주쇄 유연성을 변경할 돌연변이>
<안정성에 대해 무시할 만한 효과를 가질 돌연변이>
<표 10>. m3F8 Fv 결정 구조의 VH-VL 경계면에서의 아미노산 간의 중요한 상호작용
실시예
11
3F8:
GD2
상호작용에 대한 컴퓨터 분석을 기초로 한,
보다 높은
친화도의
3F8 항체
m3F8의 결정 구조를 컴퓨터 연구를 위한 주형으로 사용하여, 항원 인식에 대한 분자적 세부사항을 결정하였다. GD2 항원은 세라마이드 지질 꼬리에 연결된 5당류 머리 기로 구성된다. 실험적으로 얻은 3F8:GD2 공동-복합체의 부재하에, GD2 5당류 머리 기 (여기서, 세라마이드 잔기는 메틸기로 대체됨)만을 사용하여 컴퓨터 도킹(docking)을 시도하였다. GD2 5당류 분자는 컴퓨터 도킹 분야에 주어진, 도킹 연구에 대한 주요한 연구과제를 제시하였다. 첫째, 유연성이 있는 거대한 리간드의 도킹은 정확하게 예측하기에 어렵다. GD2 머리 기는 30개 초과의 회전가능한 결합을 갖는다. 상기와 같이 높은 정도의 유연성을 갖는 리간드에 대해 정확하게 보고된 확립된 도킹 프로토콜은 없다. 둘째, GD2 머리 기는 탄수화물 분자이고, 역장 방법이 탄수화물 분자에 적용되는 경우 도킹 연구의 정확성에 대한 보고는 거의 없다. 셋째, GD2 머리 기는 이의 시알산 잔기에서 발견되는 전하를 띤 2개의 기를 함유하기 때문에, 이는 특정한 클래스의 탄수화물이다. 이렇게 거대하고 유연하며 전하를 띤 탄수화물의 결합 형태를 정확하게 예측하는 것으로 나타난 확립된 도킹 방법은 없다.
올리고당류 (전하를 띤 시알산 잔기를 함유하지 않지만)의 결합 형태에 대한 예측이 신뢰가능하다고 보고된 하나의 도킹 알고리즘은 글라이드(GLIDE)이다 (문헌 [Agostino et al., 2009, J Chem Inf Model 49, 2749-60]). 상기 보고는, 실험적으로 얻은 공-결정 구조에 비교했을 때, 항체에 대한 올리고당류의 결합 형태의 예측에 있어서 글라이드가 오토도크(AutoDock), 골드(GOLD) 및 플렉스엑스(FlexX)를 능가하는 것으로 나타냈다. 시험한 항원 중 어떠한 것도 4당류보다 크지 않았음을 주목해야 한다. 상기 문헌에서의 또다른 유망한 도킹 알고리즘은, 8개 이상의 회전가능한 결합을 갖는 리간드의 도킹 형태를 정확하게 예측하는 것에 있어서 도크(DOCK), 플렉스엑스 및 골드를 능가하는 것으로 나타난 (문헌 [Erickson et al., 2004, J Med Chem 47, 45-55]) CHARMm 기재 도킹 알고리즘인 씨도커(CDOCKER) (문헌 [Wu et al., 2003, J. Comp Chem 24, 1549])였다. 올리고당류는 상기 연구에서 분석되지 않았으며, 시험된 리간드는 GD2 머리 기보다 훨씬 작고 덜 유연 (>30개의 회전가능한 결합)했음을 주목해야 한다.
단백질 데이터 은행으로부터의 3가지 이용가능한 시험 케이스 (PDB 코드 2HRL: GT1b와 복합된 시글렉(Siglec)-7; PDB 코드 3BWR: GM1과 복합된 시미안(Simian) 바이러스 VP1; 및 PDB 코드 3HMY: GT2와 복합된 파상풍 독소 HCR/T)를 이용하여, GD2 (시알산 함유 올리고당류)와 유사한 리간드 도킹 시에, 머리-대-머리를 글라이드 및 씨도커로 비교하였다. 3가지 시험 케이스 중 2가지 모두에서, 씨도커는 각각의 올리고당류의 올바른 결합 모드를 정확하게 예측할 수 있었다 (2Å의 제곱평균제곱근(root-mean-square) 편차 내에서).
글라이드는 2 내지 3가지 시험 케이스를 부정확하게 도킹했으며 (>2Å의 제곱평균제곱근 편차), 3번째 시험 케이스에서 도킹된 포즈(pose)를 찾는 것에 실패하였다 (표 11 참조). 이러한 분석에 의해, 씨도커는 전하를 띤 올리고당류의 도킹에서 글라이드를 능가했다. 글라이드는 상기 케이스 중 하나에서 실패하였다 (표 11 참조). 이어서, 씨도커를 사용하여 m3F8의 결정 구조의 항원-결합 포켓에 대한 GD2 5당류 머리 기를 도킹하였다. 이어서, 상위 도킹된 구조의 에너지를 CHARMm 역장을 이용하여 최소화하였다. 상기 분석은 GD2 머리 기와 직접적으로 상호작용하는 14가지 아미노산을 나타냈다 (표 12). 이어서, 이들 포즈 각각을 컴퓨터 모의실험(in silico)으로, 가능한 아미노산 모두로 돌연변이화하고, CHARMm 기재 상호작용 에너지를 계산하였다. 가장 높은 상호작용 돌연변이체를 표 13에 열거하였다. 이러한 접근법을 기초로, 하나의 돌연변이 (중쇄 Gly54Ile)가 상호작용 에너지를 유의하게 증가시키는 것으로 예측되었다. 컴퓨터 모델링은, 중쇄의 CDR3에서의 위치 54의 Gly가 Ile로 치환되는 것이 결합 포켓의 형태를 변화시키고 GD2 리간드와의 접촉을 증가시킬 것이라고 나타냈다. 이러한 분석을 이용하여, 중쇄 돌연변이 Gly54Ile를 huH1-감마1 및 huH3-감마1의 서열의 CDR 영역에 첨가하여 각각 huH1I-감마1 및 huH3I-감마를 생성하였다.
도킹 방법
글라이드 도킹은 슈뢰딩거 스위트 2009(Schrodinger Suite 2009) (미국 뉴욕주 뉴욕 소재 슈뢰딩거)를 이용하여 실행하였다. OPLS 역장을 사용하여 단백질 및 리간드를 파라미터로 나타내었다. 상위 리간드 포즈를 2.0 Å의 제곱평균제곱근 편차 내에서 클러스터화하였으며, 글라이드스코어(GlideScore)에 의해 점수를 매겼다.
디스커버리 스튜디오 3.0 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 엑셀리스)을 사용하여 씨도커 도킹 및 상호작용 에너지 측정을 실행하였다. CHARMm 역장을 이용하여 단백질 및 리간드를 파라미터로 나타내었다. 상위 리간드 위치를 2.0 Å의 제곱평균제곱근 편차 내에서 클러스터화하였으며, 씨도커 상호작용 에너지에 의해 점수를 매겼다.
<표 11>. 공지되어 있는 단백질 : 강글리오시드 복합체의 예측에 사용되는 도킹 알고리즘 글라이드 대 씨도커의 비교
실시예
12
항원 및
Fc
수용체 (
FcR
)에 대한 친화도 향상에 의한
이펙터
기능의 개선
항-GD2 MoAb는 항암화학요법-내성 전이성 신경아세포종 (NB)에 대해 증명된 요법이며, ch14.18은 차세대 MoAb에 대한 기준점을 제공한다. 항-GD2 MoAb 마우스 3F8 (m3F8)과 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GMCSF)의 조합은 원발 불응성 NB를 갖는 환자의 80%에서 골수 완전 차도를 지속적으로 유도하였다. 환자들 중에서 이러한 조합과 13-시스-표 12로 함께 치료한 환자는 1차 완전 차도/매우 양호한 부분 차도 (CR/VGPR)를 보였다. 씨도커 및 CHARMm 에너지 최소화 레티노산을 기초로, GD2와 직접 상호작용하는 3F8 아미노산 잔기는 5년 경과하여 PFS를 51% ± 7%로 개선시키고 OS를 80% ± 5%로 개선시켰다. 결과 분석은, NB 및 다른 고형 종양의 MoAb 요법에서의 유전자 다형성에 기초한 FcR 친화도의 중요성을 반복적으로 나타냈다. 특이성을 손상시키지 않으면서 항원 및 FcR에 대한 친화도를 개선시키는 것은 시험관내 및 생체내 MoAb 효능을 개선시켜야 한다.
<표 12>. GD2와 직접적으로 상호작용하는 3F8 아미노산 잔기 (씨도커 및 CHARMm 에너지 최소화에 기초함)
<표 13>. GD2 머리 기와 상호작용하는 3F8 잔기의 컴퓨터 모의실험 돌연변이 분석으로부터의 상위 CDR 돌연변이체
방법:
huIgG1 서브클래스의 키메라 3F8 (ch3F8) 및 인간화 3F8 (hu3F8)을 유전자 조작에 의해 구성하고, CHO 세포에서 발현시켜, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 푸코스 및 N-아세틸글루코사민이 부족한 hu3F8의 Fc-글리코형 (hu3F8n 또는 hu3F8-MAGE1.5)을 특정한 MAGE1.5 CHO 세포에서 생산하였다. GD2 및 FcR에 대한 이러한 MoAb 형태의 친화도를 비아코어 T-100을 사용하여 비교하였다. 이펙터 기능을 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CMC) 검정, 및 MoAb의 EC50으로부터 얻은 이들의 효력을 이용하여 시험하였다. 이러한 전략을 임상적 잠재력을 갖는 다른 종양 항원 시스템 (B7-H3, HER-2, CSPG4, LI CAM)에 대한 MoAb에 적용하였다.
결과:
Ch3F8 및 hu3F8은 m3F8의 Kd와 유사한 Kd를 유지하였으며, 이들은 모두 14G.2a 또는 ch14.18과 비교하여 10배 더 느린 koff를 공유하였고, 그 결과, 보다 유리한 KD 및 보다 긴 체류 시간을 공유하였다. M3F8, ch3F8 또는 hu3F8은 시험관내 NB 세포주의 증식을 억제하였으며, 이 때 다른 항-GD2 항체는 효력이 없었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)-ADCC, 과립구 (PMN)-ADCC 또는 CMC에서, ch3F8 및 hu3F8은 ch14.18보다 10배 초과로 더 강력하였다. hu3F8n에 의한 PBMC-ADCC는 hu3F8보다 10배 더 효율적이었으며, m3F8보다 >100배 더 효력이 있었다. 생체분포 연구에서의 131I-hu3F8은 131I-m3F8과 비슷한 종양 대 정상 조직의 비율을 나타냈지만, hu3F8은 NB 이종이식에 대한 우수한 항-종양 효과를 입증하였다. 유사한 결론이 다른 종양 항원 시스템에 특이적인 키메라 및 인간화 항체에 대해 내려질 수 있었지만, 종양 에피토프/항원의 성질이 종양 사멸의 효능의 결정에 중요하였다.
결론:
항원 또는 FcR에 대한 koff (또는 KD)가 개별적으로 이펙터 기능을 개선시켰지만, 이들의 합쳐진 효과는 항-GD2 MoAb 3F8에 대해 배수의 효과인 듯 하였다. 상기 둘 모두의 친화도의 개선에 관한 향후의 전략은 현재까지 관찰된 MoAb의 임상적 효능을 더욱 확장시켜야 한다.
실시예
13
FcR 결합을 개선시키기 위한 추가의 Fc 변형:
중쇄에 삼중의 돌연변이 DEL (S239D/A330L/I332E) (문헌 [Lazar et al., 2006, PNAS USA 103, 4005-10])을 갖는 Hu3F8-IgG1-DEL (FcR3A 및 FcR2A뿐만 아니라 FcR2B에 대한 친화도가 상당히 증가됨 (표 14의 비아코어 데이터 참조))을 제조하였다. 하지만, hu3F8-IgGn에 대한 활성화 신호 대 억제성 신호의 A/I 비율은 hu3F8-IgG1-DEL에 대해서는 30인 것에 비해 CD16-158V에 대해서는 196이었으며, 이는 임상적 이점을 갖는 것으로 상정되었다 (문헌 [Nimmerjahn and Ravetch, Immunol Rev, 236:265-275, 2010]).
<표 14>: 상대적 친화도. CM5 칩 상의 재조합 FcR 위에 항체를 흘려보냄으로써 비아코어 T-100을 이용하여 KD를 측정하였다. 모든 값을 FcRIII-158F 상에 결합하는 hu3F8-IgG1 값으로 정규화하였다.
신경아세포종 LAN -1 상에서의 CD16 매개된 ADCC .
4시간의 51Cr 방출 검정 시, 상이한 항체 농도에서 5:1의 이펙터:표적 비율로 NK92-CD16 이펙터 세포를 LAN1 신경아세포종 종양 표적에 첨가하였다.
FcR에 대한 친화도의 증가는 CD16 또는 CD32에 의해 매개된 ADCC 효력에서의 증가로 해석되었다. CD16에 의해 매개된 ADCC의 경우 (데이터는 나타내지 않음), hu3F8-IgG1-DEL 및 hu3F8-IgG1n은 동등하였다.
신경아세포종
LAN
-1의
보체
매개된
용해.
4시간의 51Cr 방출 검정 시, 항체 농도를 증가시키며 1:100의 최종 혈청 보체 희석비로, 인간 보체를 신경아세포종 LAN-1 종양 표적에 첨가하였다. 보체 매개 용해 (CMC; 데이터는 나타내지 않음)에서, hu3F8-IgG1-DEL은 hu3F8-IgG1 또는 hu3F8-IgG1n보다 더 불량하지는 않았다. IgG 중쇄 내 삼중 돌연변이가 hu3F8-IGg1n과 조합된 경우, ADCC에서의 추가적인 개선점은 없었다.
실시예
15
T 세포 및
이펙터의
생체내
무장(
Arming
)
T 세포 또는 T 림프구 는 세포-매개된 면역에서 주요한 역할자인 WBC이다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)라 불리는 이들의 세포 표면 상의 특정한 수용체의 존재에 의해, 다른 림프구 유형, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 (NK) 세포와 구별될 수 있다. 이들은 또한 CD3이라 불리는 고유한 표면 마커를 갖는다. T는 T 세포의 성숙을 담당하는 주요한 기관인 흉선을 나타낸다. 여러 서브세트의 T 세포가 존재하며, 이들 각각은 별개의 기능을 갖는다. 보조 T 세포 ( TH 세포)는 면역 과정에서 다른 WBC를 보조한다 (항체를 분비하기 위한 B 세포의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화 포함). 이들은 CD4 단백질을 지니기 때문에 CD4+ T 세포로 불리게 되었다. 활성화되는 경우, 보조 T 세포는 신속하게 분할되고 사이토카인을 분비하여, 면역 반응을 조절하거나 또는 보조한다. 이러한 세포는, 상이한 사이토카인을 분비하여 면역 반응을 조절하는 여러 아류형 (예를 들어 TH1, TH2, TH3, TH17 또는 TFH)으로 분류될 수 있다. 일부 종양 모델에서, CD4+ T 세포는 또한 암 성장 억제에 충분하다. 규칙적인 활성화 신호가 항원 제시 세포 (APC)로부터 나오지만, CD4+ T 세포는 이들의 표면 CD3이 항체에 의해 가교결합되는 경우에 활성화된다. 세포독성 T 세포 ( CTL )는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며, 또한 이식 또는 이식편 거부를 담당한다. 이들은 표면 CD8 당단백질을 발현시키기 때문에 CD8+ T 세포로 불린다. 이들은 주요 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 I 분자와 연관된 항원을 인식함으로써 표적과 결합하며, 이들은 다수의 인간 종양에서 부재하거나 또는 적다. 기억 T 세포는 바이러스 또는 종양 세포가 사멸된 후에 오랜 시간 동안 지속적으로 존재하는 항원-특이적 T 세포이다. 이들은 종양 항원이 투여되는 경우 신속하게 다수로 확대되어, 암에 대한 "기억"을 갖는 면역 시스템이 작동되게 할 수 있다. 자연 살해 T 세포 ( NKT 세포)는 후천성 면역 시스템을 선천적인 면역 시스템과 이어주는 특정한 종류의 T-세포이다. MHC 상의 펩티드 항원을 인식하는 통상의 T 세포와 다르게, NKT 세포는 CD1d라 불리는 분자로 나타낸 당지질 항원을 인식한다. 일단 활성화되면, 이러한 세포는 Th 및 Tc 세포 둘 모두와 유사한 기능 (즉, 사이토카인 생성 및 세포용해/세포 살해 분자의 방출)을 실행할 수 있다. 이들은 종양 세포를 인식하고 제거하는 것으로 공지되어 있다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 이들의 표면 상에 TCR을 지니는 작은 서브세트의 T 세포를 나타낸다. 대다수의 T 세포는 α- 및 β-TCR 쇄로 불리는 2가지 당단백질 쇄로 이루어진 TCR을 갖는다. 하지만, γδ T 세포에서, TCR은 하나의 γ-쇄 및 하나의 δ-쇄로 구성된다. 이들은 총 T 세포 중 겨우 5%이지만, 내장 점막에서 가장 풍부하다 (그리고 상피내 림프구 (IEL)로 명명됨). γδ T 세포를 활성화시키는 항원은 공지되어 있지 않지만, γδ T 세포는 MHC 제한적이지 않으며, 아마도 MHC 상의 펩피드보다는 전체 단백질을 인식할 것이다.
림포카인-활성화된 살해 세포 (LAK) 및 종양 침투 림프구 (TIL)를 사용한 1986년의 후천성 면역요법의 시험에서, 때때로 환자 내 종양 반응이 보고되었다. 공여자 림프구 주입은, 동종이계 줄기 세포 이식 후 만성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 또는 이식후 EBV-연관 림프증식성 질환 (PTLD)을 가진 환자에서 더욱 성공적인 것으로 나타났다. 고형 종양에서, CTL은 악성 흑색종의 치료에서 성공적이었고, 그 동안 고용량 화학요법에 의해 림프구감소가 생성되었다. 2개의 결합 부위를 갖는 하이브리드 면역 글로불린 분자를 생성하기 위해 2가지 하이브리도마를 융합하여, 이중특이성 항체를 생성하였다. 항체는 종양을 T-세포에 구속시킬 뿐만 아니라, 이들은 CD3을 T-세포 상에 가교결합시키고, 활성화 캐스케이드를 개시한다. 이러한 방식으로 TCR-기재 세포독성은, MHC 제한을 우회하는 목적하는 종양 표적으로 다시 향하게 한다. 항-CD3 x 항-TAA ( BsAb 또는 BiTE 항체 )를 이용한 폴리클로날 활성화된 T 세포 (ATC)의 무장은 MoAb (예를 들어, TAA가 GD2인 hu3F8)의 표적화 특이성과 T 세포의 MHC-비제한 퍼포린/그랜자임 매개된 세포독성이 합쳐지게 한다. BsAb 또는 BiTE는 늘어난 활성화된 T 세포를 생체외에서 무장시킨 후, 환자에 주입할 수 있다. 이러한 전략은 모든 ATC를 특이적 CTL로 전환시킨다 (문헌 [Thakur and Lum, 2010, Curr Opin Mol Ther 12, 340-349]; 및 [Grabert et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 569-576]).
종양은 다수의 메커니즘: (예를 들어, NB에서) MHC의 저발현 또는 무발현, T 세포 신호전달의 탈선, MHC 상의 종양 펩티드 표시의 감소, 보조-자극 분자의 부재, 및 CTL 및 체액성 반응을 억제하는 조절 T-세포의 유도에 의해, T 세포를 피한다. BsAb 또는 BiTE 무장된 ATC에 의해 수행되는 사멸이 MHC-비제한적이기 때문에, 이러한 전략은 이러한 종양 회피 메커니즘 중 일부를 극복해야 한다. 종양은 T-세포 면역 반응을 Th2 유형으로 전환시키는 TGF-β를 분비하고, 인터류킨 2 (IL-2) 및 IFN-γ 분비를 하향조절하는 반면, IL-10 및 IL-6은 상향조절하고, 이 모든 것은 면역 억제로 이어진다. BsAb 또는 BiTE에 의해 방향재설정된 T-세포는, 무장된 ATC가 IL-2 비의존성 방식으로 종양 표적을 용해시키기 때문에, 조절 사이토카인의 이러한 부정적 효과를 피할 수 있다. 이들의 종양을 향하는 BsAb 또는 BiTE 무장된 T 세포로 치료받은 환자는 증가된 수준의 TNF-α 및 IFN-γ를 가지며, 이는 T-세포를 Th1 반응을 향하도록 전환시켜야 한다. 또한, 세포독성 T 세포는 종양 세포 상의 Fas 수용체 (CD95)와 결합하는 이들의 Fas 리간드 (FasL)를 통해 사멸된다. 불행하게도, 종양 세포 상의 FasL은 또한 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. CD3 캐스케이드를 통한 TCR 자극은 CD8+ 세포를 CD95-매개된 자멸로부터 보호한다. 무장된 ATC는 TCR의 BsAb 또는 BiTE와의 가교결합을 통해, CD95-유도된 세포 사멸에 저항한다. 연속적으로 사멸시키고 (즉, 하나의 T-세포가 연이은 종양 표적을 사멸시킴), 상기 과정 동안 증식하며, 림프 조직 및 연조직 내로 이동하는 T-세포의 능력은, NB 세포가 골수 공간 밖으로 전이되어 종양 덩어리를 형성하는 동안 이를 포획하는 기회를 증가시켰다. 인간 암을 표적화하는 BsAb 또는 BiTE를 이용한 최근의 연구는 유망한 것으로 나타났다.
특히 동종 조혈기관관련 세포 이식을 받은 환자에 대한 분석으로부터 부상하는 증거가 있는데, 이는 림프종 및 특정 형태의 백혈병을 억제하거나 또는 제거하는 T-세포의 잠재력을 지지한다 (문헌 [O'reilly et al., 2010, Semin Immunol 22, 162-172]). 하지만, 소아 내 고형 종양의 제어에서의 T-세포의 역할을 지지하는 확실한 데이터는 존재하지 않는다. 이는, 이러한 종양의 절단이 유전 클래스 I 또는 II HLA 대립유전자를 발현시키지 않거나 (예를 들어, 신경아세포종) (문헌 [Raffaghello et al., 2005, Oncogene 24, 4634-4644]; 및 [Wolfl et al., 2005, Cancer Immunol Immunother 54, 400-406]) 또는 클래스 I 대립유전자만을 저수준으로 발현시킨다 (예를 들어, 횡문근육종) (문헌 [Prados et al., 2006, Neoplasma 53, 226-231])는 사실과 일관성이 있다. 더욱이, 중요한 보조-자극 분자, 예컨대 B7.1 및 ICAM-1의 발현은 대체로 저조하거나 또는 검출불가능하다. 결과적으로, 이러한 종양의 T-세포 반응을 이끌어 내는 능력은 불량하고, T-세포 수용체를 통해 HLA 대립유전자로 나타낸 종양 항원과 결합함으로써 종양과 결합하는 이펙터 T-세포의 잠재력은 제한된다. 또한, 신경아세포종, 횡문근육종, 유잉(Ewing) 육종 및 결합조직형성 원형 소세포 종양에 대해 현재 이용가능한 가장 효과적인 치료요법은 심각한 T-림프구 감소증을 유도하는 용량에서 면역억제성 알킬화 작용제, 특히 시클로포스파미드를 이용한다. 이중작용성 항체는, 이들의 항원-특이적 HLA-제한된 TCR보다는 HLA-비-제한된 CD3-매개된 활성화를 통한 이들의 이펙터 기능의 이용 및 T-세포의 표적화된 결합을 허용한다. CD3 및 종양 항원 (예컨대, CD-19, HER-2 NEU 또는 CEA)에 대해 특이적인 특정 이중작용성 모노클로날 항체의 연구는, 세포독성 T-세포를 다른 표적화된 항원을 발현시키는 종양 세포에 연결하는 이들 항체의 능력을 입증하였다 (문헌 [Bargou et al., 2008, Science 321, 974-977]; [Topp et al., 2009, Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 114, 840]; [Kiewe et al., 2006, Clin Cancer Res 12, 3085-3091]; 및 [Lutterbuese et al., 2009, J Immnother 32, 341-352]). 일단 항체 수용체 둘 모두가 결합하면, 세포독성 T-세포 반응이 종양 세포에 대해 개시된다. T-세포 반응은 T-세포 수용체 및 종양 세포 간의 세포독성 시냅스의 형성뿐만 아니라, 종양 세포 아폽토시스의 퍼포린 및 그랜자임 매개된 유도에 관여한다 (문헌 [Offner et al., 2006, Mol Immunol 43, 763-771]; 및 [Brischwein et al., 2006, Mol Immunol 43, 1129-1143]). CD3의 결합은 또한 T-세포를 활성화시켜, 항종양 효과를 강력하게 하는 이펙터 사이토카인의 증식 및 생성을 유도한다 (상기 문헌 [Brischwein et al., 2006]; 및 [Brischwein et al., 2007, J Immunother 30, 798-807]). 두드러지게는, 활성화된 T-세포는 T-세포 활성화 동안 생성된 TNF 및 Fas 리간드의 세포독성 효과로부터 이들을 보호하는 항-세포사멸성 단백질 c-FLIP를 상향조절한다 (문헌 [Dreir et al., 2002, Int J Cancer 100, 690-697]). 결과적으로, T-세포 반응은 확대된다. 결과적으로, 이중작용성 항체의 피코그램 수준은 전임상적 동물 모델, 및 특히 B-세포 림프종 및 ALL의 치료에 이중특이적인 CD3/CD19의 초기 임상 시험의 결과에서 나타난 바와 같이 (상기 문헌 [Topp et al., 2009]; 및 [Kiewe et al., 2006]), 시험관내에서 (상기 문헌 [Lutterbuese et al., 2009]; 및 [Brandl et al., 2007, Cancer Immunol Immunother 56, 1551-1563]) 그리고 생체내에서 유의한 항종양 효과를 가할 수 있다. 유도된 T-세포 반응이 천연 T-세포를 동원하여 종양 부위에서 종양-특이적 T-세포의 생성을 자극할 수 있다는 가설이 세워졌다 (문헌 [Koehne et al., 2002, Blood 99, 1730-1740]). 이중특이성 항체는 또한 T-림프구 외의 다른 이펙터 세포를 재표적화하는 데에 사용될 수 있다. GD2를 발현하는 세포, 조직 또는 기관에 대한 이러한 이펙터 세포에는 NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 다른 줄기 세포가 포함된다. 조직이 종양인 경우, 이러한 이펙터 세포를 이용하여, 진단 또는 치료요법을 위한 방사성 동위원소, 단백질 (예를 들어, 사이토카인, 항체, 효소 또는 독소)을 사멸시키거나 또는 침전시킬 수 있다. 조직이 정상 기관인 경우, 이펙터 세포를 유사하게 이용하여, 진단 또는 치료요법을 위한 동위원소 또는 단백질을 전달할 수 있다.
이중특이성 MoAb는 이중 가변 도메인 (하나의 도메인은 항-3F8 가변 도메인을 가지며, 다른 도메인은 종양 세포독성의 경우 T 세포를 재표적화하기 위한 항-OKT3, 또는 다단계 전표적화를 위한 DOTA-금속, C8.2.5, 또는 작용제로서 항-41BB-scFv를 이용하는 ADCC를 위한 클론 35, CD137, 또는 작용제로서 41 BBL를 이용하는 ADC를 위한 41BBL (CD137과 함께)로 이루어진 군으로부터 선택됨)으로 이루어질 수 있다. CH2 도메인에서의 N297A 돌연변이로 비당화가 일어나며, 이는 FcR 또는 C1q 결합의 부재로 이어진다. (hu3F8-LC)-(huOKT3-scFv) (여기서, huOKT3-scFv는 안정화된 디술피드임)의 아미노산 서열은 서열식별번호:23으로 나타냈다. 안정화된 C8.2.5-scFv 디술피드를 포함하는 (hu3F8-LC)-(C8.2.5-scFv)의 아미노산 서열 (문헌 [Orcutt et al., 2010, Protein Eng Design and Selection 23, 221]을 기재로 함)은 서열식별번호:24로 나타냈다.
이중특이성 항체 (항-GD2 및 항-DOTA)는 다단계 전표적화의 제1 단계에 사용될 수 있으며, 이어서 세정 작용제로서 DOTA(금속)-덱스트란을 사용하는 혈액 청소가 이어지며, DOTA(금속)-접합된 치료제, 예컨대 DOTA(금속)-방사성 금속, DOTA(금속)-나노입자, DOTA(금속)-리포좀, DOTA(금속)-약물, DOTA(금속)-DNA, DOTA(금속)-RNA 및 DOTA(금속)-독소를 도입하는 제3 단계가 이어진다. C8.2.5가 DOTA-금속 복합체의 각각의 유형에 대해 상이한 친화도를 갖기 때문에, 세정 작용제 및 DOTA-리간드에 대한 전표적화된 C8.2.5의 친화도는 정밀하게 제어될 수 있다.
3F8, hu3F8 및 이의 변형체의 아미노산 서열은, 다른 항-GD2 항체에 대해 이전에 나타낸 바와 같이 키메라 항원 수용체 (CAR)의 구성에 사용될 수 있다 (문헌 Krause et al., 1998, J Exp Med 188, 619-626]). 면역 이펙터 세포의 재표적화에 대한 CAR 전략은 MHC-펩티드-TCR 상호작용에 독립적이며, 이는 세포가 매우 다양한 세포 표면 항원에 대해 반응할 수 있도록 한다 (문헌 [Davies and Maher, 2010, Achivum immunologiae et therapiae experimentalis 58, 165-178]). 여러 방법이 CAR의 디자인에 사용되었으며, 이들 대부분은 항원 인식을 위해, 단일-쇄 가변 단편 (scFv)의 형태인 모노클로날 항체의 항원 결합 도메인을 이용한다. 초기 T 세포 활성화 수용체는, 연구자들이 CD3ζ 쇄 (문헌 [Irving and Weiss, 1991, Cell 64, 891-901]; 및 [Romeo et al., 1992, Cell 68, 889-897])의 역할을 설명하도록 한 연구로부터 기원하였다. 후속의 연구에서, 흥미있는 scFv를 CD3ζ 쇄 (문헌 [Eshhar et al., 1993, PNAS USA 90, 720-724]) 또는 FcεRIγ (문헌 [Weijtens et al., 1996, J Immunol 157, 836-843])에 융합시켰고, 둘 모두는 T 세포 활성화에 충분한 것으로 밝혀졌다. 이는 CAR 구성을 위한 청사진을 나타냈지만, 제1 세대 CAR이 2 내지 3회의 세포 분열까지만 T 세포 증식을 유도한 후 신속하게 세포 사멸로 이어질 수 있다 (문헌 [Gong et al., 1999, Neoplasia 1, 123-127])고 밝혀진 후에, 보조-자극 분자의 혼입이 일어나게 되었다. CD80을 표적 종양 세포 상에 발현시킴으로써, 연구자들은 CAR 발현 세포가 다시 자극될 수 있으며, 이는 T 세포 수에서의 추가적 증가로 이어질 수 있음을 보여줄 수 있었다. CD3ζ 쇄와 함께 CD28 보조-자극 분자를 혼입한 제1 CAR은 CD3ζ 쇄만을 발현시킨 것보다 광대한 개선점을 나타냈으며 (상기 문헌 [Krause et al., 1998]; [Haynes et al., 2002, Blood 100, 3155-3163]; 및 [Maher et al., 2002, Nature Biotech 20, 70-75]), 이에는 T 세포 수에서의 엄청난 증가뿐만 아니라 IL-2 생성의 증가가 포함되었다. 이 이후로, 여러 다른 군들이 다른 보조-자극 분자를 단독의 CD3ζ와 함께, 또는 CD3ζ 및 CD28 둘 모두와 함께 사용하기 시작하였다. 이러한 추가적인 신호 분자에는 4-1BB (문헌 [Wang et al., 2007, Human Gene Ther 18, 712-725]; [Brentjens et al., 2007, Clin Cncer Res 13, 5426-5432]; [Imai et al., 2004, Leukemia 18, 676-684]; 및 [Finney et al., 2004, J Immunol 172, 104-113]), DAP10 (상기 문헌 [Brentjens et al., 2007]), OX40 (상기 문헌 [Brentjens et al., 2007]; [Finney et al., 2004]; [Wilkie et al., 2008, J Immunol 180, 4901-4909]; [Nguyen and Geiger, 2003, Gene Therapy 10, 594-604]; 및 [Pule et al., 2005, Mol Ther 12, 933-941]) 및 ICOS (상기 문헌 [Finney et al.,2004])가 포함되며, 이들은 T 세포뿐만 아니라 NK 세포의 문맥에서도 적용되었다 (문헌 [Daldrup-Link et al., 2005, Eropean radiology 15, 4-13]; [Imai and Campana, 2004, J Biol Reg Homeostatic Ag 18, 62-71]; [Roberts et al., 1998, J Immunol 375-384]; [Kruschinski et al., 2008, PNAS USA 105, 17481-17486]; 및 [Pegram et al., 2008, J Immunol 181, 3449-3455]). 제1 세대 CAR만이 현재 시점까지 유일하게 임상 시험되었지만, 제2 및 제3 세대 CAR을 이용한 시험관내 및 생체내 비교 둘 모두는 분명한 우수성을 입증하였다 (상기 문헌 [Haynes et al., 2002]; [Brentjens et al., 2007]; [Teng et al., 2004, Human Gene Ther 15, 699-708]; [Haynes et al., 2002, J Immunol 169, 5780-5786]; [Kowolik et al., 2006, Cancer Res 66, 10995-11004]; [Loskog et al., 2006, Leukemia 20, 1819-1928]; [Moeller et al., 2004, Cancer Gene Therapy 11, 371-379]; 및 [Vera et al., 2006, Blood 108, 3890-3897]).
현재, 대부분의 연구자들은 벌크한 인간 말초 T 세포를 사용하지만, 다른 연구자들은 최근에 EBV-특이적 T 세포 (문헌 [Rossig et al., 2002, Blood 99, 2009-2016]), 림프계 전구 세포 (문헌 [Zakrzewski et al., 2006, Nature Med 12, 1039-1047]; 및 [Zakrzewski et al., 2008, Nature Biotech 26, 453-461]), 및 비분획화된 골수 세포 (문헌 [Papapetrou et al., 2009, J clin Invest 119, 157-168]; 및 [Wang et al., 1998, Nature Med 4, 168-172])를 사용하기 시작하였다. 세포용해성이며 배양하기에 쉬운 백혈병 살해 세포주 (예를 들어, NK92, NK92MI, KHYG-1)는 또한 전-임상 시험 및 임상 시험을 위한 CAR 발현 이펙터 세포의 지속적인 공급을 제공할 수 있다. NK92MI는 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종으로부터 유래하여 인간 IL-2 cDNA로 형질도입된 인간 NK 세포주이며, 이전의 연구는 마우스 모델에서 이의 강력한 세포독성 능력을 입증하였다 (문헌 [Tarn et al., 1999, J Hematol 8, 281-290]; 및 [Korbelik and Sun, 2001, Inter J Cancer 93, 269-274]). 또한, NK92 세포는 임상적 세팅에도 사용되었으며, 이는 신장 세포 암종 및 흑색종을 가진 환자에서의 다수의 제I상 연구 후에 안전한 것으로 증명되었다 (문헌 [Arai et al., 2008, Cytotherapy 10, 625-632]). 시험관내 유지의 용이성 및 비교적 짧은 배가 시간으로 인해, 이들 세포는 다양한 표적화 접근법을 시험하는 다양한 세포독성 검정을 위한 이상적인 이펙터이다. 본래의 IL-2-의존성 NK92 세포주를 이용한 연구가 마우스 및 인간 둘 모두에서 최소의 독성을 나타낸 반면, IL-2-형질도입된 NK92MI 세포는 보다 큰 백혈병유발 잠재력을 가질 수 있다. 연구자들이 NK92 세포를 이용하면서도 SCID 마우스에서 시도하여 백혈병유발을 피한 하나의 방법은 이펙터를 3000 cGy로 방사능 처리한 후에 접종하는 것에 의한 것이다. 제I상 임상 시험에서, 이는 면역력이 약화된 환자 내부에서 NK92MI 세포가 비제어적으로 증식하는 것을 방지함에 있어 충분하다. 또다른 안전 메커니즘은 자멸 유전자의 이용을 포함하는 것이다. 하나의 흔한 예는 헤르페스바이러스 티미딘 키나제 유전자를 사용하는 것이며, 이는 아시클로비어(acyclovir) 또는 간시클로비어(ganciclovir)를 투여하여, 상기 유전자를 발현하는 세포를 사멸시킴으로써 작용한다 (문헌 [Helene et al., 1997, J Immunol 5079-5082]).
SEQUENCE LISTING
<110> Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
Cheung, Nai-Kong
Ahmed, Mahiuddin
<120> Anti-GD2 Antibodies
<130> 021/412/SAP
<140> PCT/US2011/41082
<141> June 20, 2011
<150> US 61/397,920
<151> June 19, 2010
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Chimeric 3F8 heavy chain gamma 1
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Chimeric 3F8 light chain kappa
<400> 2
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 446
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Chimeric 3F8 heavy chain gamma 4
<400> 3
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> huH1 - gamma 1
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 5
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> HuL1- kappa
<400> 5
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> huH2 - gamma 1
<400> 6
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> huL2 - kappa
<400> 7
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> huH1-gamma 4
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> huH3-gamma 1, with stability enhanced mutations
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 10
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> HuL3 - kappa
<400> 10
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 11
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcga gatcgtgatg 60
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gcctcccagt ccgtgtccaa cgacgtgacc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 180
cggctgctga tctactccgc ctccaaccgg tactccggcg tgcccgcccg gttctccggc 240
tccggctacg gcaccgagtt caccttcacc atctcctccg tgcagtccga ggacttcgcc 300
gtgtacttct gccagcagga ctactcctcc ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 360
cggaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtcctcccc cgtgaccaag 660
tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 12
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Hu3F8-H1L1-IgG1, heavy chain
<400> 12
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
gtggagtccg gccccggcgt ggtgcagccc ggccggtccc tgcggatctc ctgcgccgtg 120
tccggcttct ccgtgaccaa ctacggcgtg cactgggtgc ggcagccccc cggcaagggc 180
ctggagtggc tgggcgtgat ctgggccggc ggcatcacca actacaactc cgccttcatg 240
tcccggctga ccatctccaa ggacaactcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaactcc 300
ctgcgggccg aggacaccgc catgtactac tgcgcctccc ggggcggcca ctacggctac 360
gccctggact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggcc gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctccgg gtaaatga 1398
<210> 13
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Hu3F8-H1L1-IgG4 light chain
<400> 13
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcga gatcgtgatg 60
acccagaccc ccgccaccct gtccgtgtcc gccggcgagc gggtgaccat cacctgcaag 120
gcctcccagt ccgtgtccaa cgacgtgacc tggtaccagc agaagcccgg ccaggccccc 180
cggctgctga tctactccgc ctccaaccgg tactccggcg tgcccgcccg gttctccggc 240
tccggctacg gcaccgagtt caccttcacc atctcctccg tgcagtccga ggacttcgcc 300
gtgtacttct gccagcagga ctactcctcc ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 360
cggaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtcctcccc cgtgaccaag 660
tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 14
<211> 1389
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Hu3F8-H1L1-IgG4 heavy chain
<400> 14
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
gtggagtccg gccccggcgt ggtgcagccc ggccggtccc tgcggatctc ctgcgccgtg 120
tccggcttct ccgtgaccaa ctacggcgtg cactgggtgc ggcagccccc cggcaagggc 180
ctggagtggc tgggcgtgat ctgggccggc ggcatcacca actacaactc cgccttcatg 240
tcccggctga ccatctccaa ggacaactcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaactcc 300
ctgcgggccg aggacaccgc catgtactac tgcgcctccc ggggcggcca ctacggctac 360
gccctggact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 420
ccctccgtgt tccccctggc cccctgctcc cggtccacct ccgagtccac cgccgccctg 480
ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa ctccggcgcc 540
ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600
tcctccgtgg tgaccgtgcc ctcctcctcc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg 660
gaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagcgggtgg agtccaagta cggccccccc 720
tgcccctcct gccccgcccc cgagttcctg ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc 780
aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 840
gtgtcccagg aggaccccga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900
aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag ttcaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1020
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acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc 1200
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260
ctgtactccc ggctgaccgt ggacaagtcc cggtggcagg agggcaacgt gttctcctgc 1320
tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtccctg 1380
ggcaagtga 1389
<210> 15
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Hu3F8-H2L2-IgG1 light chain
<400> 15
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggctc catcgtgatg 60
acccagaccc ccaagaccct gtccgtgtcc gccggcgagc gggtgaccat cacctgcaag 120
gcctcccagt ccgtgtccaa cgacgtgacc tggtaccagc agaagcccgg ccagtccccc 180
aagctgctga tctactccgc ctccaaccgg tactccggcg tgcccgaccg gttctccggc 240
tccggctacg gcaccgcctt caccttcacc atctcctccg tgcaggccga ggacttcgcc 300
gtgtacttct gccagcagga ctactcctcc ttcggccagg gcaccaagct ggagatcaag 360
cggaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtcctcccc cgtgaccaag 660
tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 16
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Hu3F8-H2L2-IgG1, heavy chain
<400> 16
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
aaggagtccg gccccggcgt ggtgcagccc ggccagtccc tgtccatctc ctgcgccgtg 120
tccggcttct ccgtgaccaa ctacggcgtg cactgggtgc ggcagccccc cggcaagggc 180
ctggagtggc tgggcgtgat ctgggccggc ggcatcacca actacaactc cgccttcatg 240
tcccggctga ccatctccaa ggacaactcc aagtccaccg tgtacctgaa gatgaactcc 300
ctgcaggccg aggacaccgc catgtactac tgcgcctccc ggggcggcca ctacggctac 360
gccctggact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggcc gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
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gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
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agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
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ctgtctccgg gtaaatga 1398
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<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ch3F8-IgG1, light chain
<400> 17
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcag tattgtgatg 60
acccagactc ccaaattcct gcttgtatca gcaggagaca gggttaccat aacctgcaag 120
gccagtcaga gtgtgagtaa tgatgtaact tggtaccaac agaaggcagg gcagtctcct 180
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agtggatatg ggacggcttt cactttcacc atcagcactg tgcaggctga agacctggca 300
gtttatttct gtcagcagga ttatagttcg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaag 360
cggaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtcctcccc cgtgaccaag 660
tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 18
<211> 1395
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ch3F8-IgG1, heavy chain
<400> 18
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
aaggagtcag ggcctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccatcac ttgcactgtc 120
tctgggtttt cagtaaccaa ttatggtgta cactgggttc gccagcctcc aggaaagggt 180
ctggagtggc tgggagtaat atgggctggt ggaattacaa attataattc ggctttcatg 240
tccagactga gcatcagcaa agacaactcc aagagtcaag ttttcttaaa aatgaacagt 300
ctgcaaattg atgacacagc catgtactac tgtgccagtc gggggggtca ctacggctat 360
gctttggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggcc gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960
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ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
ctgtctccgg gtaaa 1395
<210> 19
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ch3F8-IgG4 light chain
<400> 19
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcag tattgtgatg 60
acccagactc ccaaattcct gcttgtatca gcaggagaca gggttaccat aacctgcaag 120
gccagtcaga gtgtgagtaa tgatgtaact tggtaccaac agaaggcagg gcagtctcct 180
aaactgctga tatactctgc atccaatcgc tattctggag tccctgaccg cttcactggc 240
agtggatatg ggacggcttt cactttcacc atcagcactg tgcaggctga agacctggca 300
gtttatttct gtcagcagga ttatagttcg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaag 360
cggaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
ggcaccgcct ccgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 480
tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
tccaaggact ccacctactc cctgtcctcc accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag 600
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtcctcccc cgtgaccaag 660
tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 20
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> ch3F8-IgG4 heavy chain
<400> 20
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
aaggagtcag ggcctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccatcac ttgcactgtc 120
tctgggtttt cagtaaccaa ttatggtgta cactgggttc gccagcctcc aggaaagggt 180
ctggagtggc tgggagtaat atgggctggt ggaattacaa attataattc ggctttcatg 240
tccagactga gcatcagcaa agacaactcc aagagtcaag ttttcttaaa aatgaacagt 300
ctgcaaattg atgacacagc catgtactac tgtgccagtc gggggggtca ctacggctat 360
gctttggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 420
ccctccgtgt tccccctggc cccctgctcc cggtccacct ccgagtccac cgccgccctg 480
ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa ctccggcgcc 540
ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600
tcctccgtgg tgaccgtgcc ctcctcctcc ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg 660
gaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagcgggtgg agtccaagta cggccccccc 720
tgcccctcct gccccgcccc cgagttcctg ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc 780
aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac 840
gtgtcccagg aggaccccga ggtgcagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900
aacgccaaga ccaagccccg ggaggagcag ttcaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960
ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1020
aagggcctgc cctcctccat cgagaagacc atctccaagg ccaagggcca gccccgggag 1080
ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccag gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1140
acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc 1200
cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260
ctgtactccc ggctgaccgt ggacaagtcc cggtggcagg agggcaacgt gttctcctgc 1320
tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtccctg 1380
ggcaag 1386
<210> 21
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hu3F8-H3L3 light chain
<400> 21
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggctc tatcgtcatg 60
actcagaccc ctgccttcct gctggtgtcc gctggagagc gtgtcactat cacttgtcgt 120
gcctcacaga gcgtgtctaa cgacgtgaca tggtaccagc agaaggccgg tcaggctccc 180
agactgctga tctactctgc aagtaatagg tatactggca ttcctgcccg gttctcaggc 240
tccggatatg ggaccgagtt cacctttaca atctccagcg tgcagagcga agattttgct 300
gtctattttt gccagcagga ttattcatca ttcggcggcg gtactaaact ggaaattaag 360
cgcaccgtgg ccgccccctc cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc 420
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tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc aactcccagg agtccgtgac cgagcaggac 540
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tccttcaacc ggggcgagtg ctag 684
<210> 22
<211> 1398
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hu3F8-H3L3 heavy chain
<400> 22
atgggctggt cctgcatcat cctgttcctg gtggccaccg ccaccggcca ggtgcagctg 60
gtcgaaagcg ggcctggtct ggtccagcct ggtcgttctc tgcgtctgac ttgtgccgtg 120
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ctggagtggc tgggagtgat ctgggcaggc ggaattacca actacaattc cgccttcatg 240
agcaggctga ccatctctaa ggacaacagt aaaaatacag tgtatctgca gatgaattcc 300
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ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540
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gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260
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ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> (hu3F8-LC) - (huOKT3-scFv)
<400> 23
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
210 215 220
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
225 230 235 240
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
245 250 255
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val
275 280 285
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
290 295 300
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
305 310 315 320
Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
325 330 335
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
340 345 350
Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
355 360 365
Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
370 375 380
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
405 410 415
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
420 425 430
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln
435 440 445
Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu
450 455 460
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
465 470 475 480
Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
485 490 495
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr
500 505 510
Lys Leu Gln Ile Thr Arg
515
<210> 24
<211> 524
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> (hu3F8-LC) - (C8.2.5-scFv)
<400> 24
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
100 105 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
115 120 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
130 135 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145 150 155 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
180 185 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
195 200 205
Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser His
210 215 220
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
225 230 235 240
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
245 250 255
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly
275 280 285
Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
290 295 300
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp
340 345 350
Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu
355 360 365
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn
370 375 380
Tyr Phe Asp Ala Trp Gly Cys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala
405 410 415
Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Pro Pro Gly Glu Thr Val
420 425 430
Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr
435 440 445
Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Cys Phe Thr Gly Leu Ile
450 455 460
Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
465 470 475 480
Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Thr Gln Thr
485 490 495
Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp
500 505 510
Val Ile Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly
515 520
Claims (36)
- (i) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(ii) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(iii) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(iv) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(v) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(vi) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인; 또는
(vii) 서열식별번호:9의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:10의 가변 경쇄 도메인
중 어느 하나를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서, 말단 만노스, N-아세틸글루코스 또는 글루코스로 글리코실화되지만, 푸코스로는 글리코실화되지 않은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체의 상기 중쇄 도메인 서열에서, S239D, A330L, I332E 및 G54I로 이루어진 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 항체의 상기 경쇄에서 A43S인 아미노산 치환을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 제1항에 있어서, IgG1 또는 IgG4를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 의해 생산되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
- 서열식별번호:4-10 중 어느 하나에 대한 코딩 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
- 제7항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제8항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제9항의 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 가능하게 하는 조건하의 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 진단을 위한 조성물.
- 제11항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 세포독성제에 접합되어 있는 것인 조성물.
- 제11항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출 작용제에 접합되어 있는 것인 조성물.
- 제11항의 조성물의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
- 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 암이 신경아세포종, 흑색종, 육종, 뇌종양 또는 암종인 제약 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 암이 골육종, 지방육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 평활근육종, 방추상 세포육종, 뇌종양, 소세포폐암, 망막아세포종, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, HTLV-1 감염 T 세포 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 결장직장 암종, 신장 세포 암종, 췌장의 암종, 전립선 암종, 비인두 암종, 악성 조직구증 및 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
- 인간화 3F8 항체로부터 유래된 제1 항원 결합 부위, 및 제2 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 제1 항원 결합 부위는
(i) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(ii) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(iii) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(iv) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(v) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(vi) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인; 또는
(vii) 서열식별번호:9의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:10의 가변 경쇄 도메인
중 어느 하나를 포함하는 것인, 이중특이성 항체. - 제18항에 있어서, 제1 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하고, 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편을 추가로 포함하며, 여기서 상기 항체 단편은 scFv, scFab, Fab 또는 Fv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이중특이성 항체.
- 제18항에 있어서, 제2 항원 결합 부위가 T-림프구, NK 세포, B-림프구, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 중간엽 줄기 세포, 및 신경 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포와 연관된 것인 이중특이성 항체.
- 제18항에 있어서, 제2 항원 결합 부위가 CD3에 대해 특이적인 이중특이성 항체.
- 제21항에 있어서, 서열식별번호:23의 서열을 포함하는 이중특이성 항체.
- 제18항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위가 DOTA(금속)에 대해 특이적인 이중특이성 항체.
- 제23항에 있어서, 서열식별번호:24의 서열을 포함하는 이중특이성 항체.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제25항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항의 이중특이성 항체를 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 진단을 위한 제약 조성물.
- 인간화 3F8 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 상기 인간화 3F8 항체는
(i) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(ii) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(iii) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(iv) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(v) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(vi) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인; 또는
(vii) 서열식별번호:9의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:10의 가변 경쇄 도메인
중 어느 하나를 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체. - 제29항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 scFv인 키메라 항원 수용체.
- 제30항에 있어서, 면역 이펙터 세포에 의해 발현되는 키메라 항원 수용체.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 포함하는, GD2 발현을 특징으로 하는 암의 치료 또는 검출을 위한 제약 조성물.
- 인간화 3F8 모노클로날 항체로부터의 scFv을 포함하고, 상기 인간화 3F8 모노클로날 항체는
(i) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(ii) 서열식별번호:4의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(iii) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(iv) 서열식별번호:6의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인;
(v) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:5의 가변 경쇄 도메인;
(vi) 서열식별번호:8의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:7의 가변 경쇄 도메인; 또는
(vii) 서열식별번호:9의 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호:10의 가변 경쇄 도메인
중 어느 하나를 포함하는 것인, 이중특이성 T-세포 결합 모노클로날 항체. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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