ES2863074T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra el gangliósido GD2 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende una combinación de dominio variable de cadena pesada (VH) y dominio variable de cadena ligera (VL) seleccionados de las siguientes combinaciones (i) a (viii): (i) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; (ii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; (iii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-38, los residuos 56-58, y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; (iv) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; (v) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 30, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; (vi) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-32, los residuos 50-52, y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; (vii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-32, los residuos 50-52, y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y (viii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-38, los residuos 56-58, y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos monoclonales humanos contra el gangliósido GD2
Referencia cruzada a solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica el beneficio del documento con número de serie US 62/007.874 presentada el 4 de junio de 2014.
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII.
Antecedentes
La presente enseñanza se refiere en general a anticuerpos dirigidos contra el disialogangliósido GD2. Más específicamente, esta solicitud se refiere a polinucleótidos que codifican anticuerpos humanos anti-GD2 y los correspondientes anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, así como al uso de dichos anticuerpos con fines diagnósticos o terapéuticos. GD2 es atractivo para terapias específicas de tumores, como la terapia con anticuerpos, debido al patrón de expresión selectiva de tumores. Actualmente, se han desarrollado varios anticuerpos anti-GD2, tales como anticuerpos anti-GD2 murinos, anticuerpos anti-GD2 quiméricos humano-ratón (IRIE et al., PNAS, noviembre de 1986, vol. 83, pág. 8694-8698; TSAO et al. al., OncoImmunology, abril de 2015, vol. 4, No. 8, pág. e1023975). Sin embargo, estos anticuerpos todavía tienen efectos inmunes indeseables. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de reducir los efectos inmunes indeseables y potenciar los efectos antitumorales deseables de los anticuerpos anti-GD2. Esta solicitud describe anticuerpos monoclonales humanos (mAb) contra GD2, que satisfacen la necesidad y proporcionan ventajas relacionadas.
Síntesis
De acuerdo con la presente enseñanza, en el presente documento, se proporcionan composiciones para producir anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que se unen a GD2. Las composiciones incluyen un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3) proporcionadas en el presente documento. En un aspecto, el polinucleótido aislado de la enseñanza también puede codificar un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. En otro aspecto, el polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de ácido nucleico proporcionada aquí, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio VH del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
En otra realización de la enseñanza, el polinucleótido aislado puede codificar un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3) proporcionadas en el presente documento. En un aspecto, el polinucleótido aislado de la enseñanza también puede codificar un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. En otro aspecto, el polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de ácido nucleico proporcionada en el presente documento, en el que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio VL del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
Las composiciones de la enseñanza también incluyen un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo se une a GD2. En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio VH que tiene las regiones VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 proporcionadas en el presente documento. En otras realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio VL que tiene regiones VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 proporcionadas en el presente documento. En otras realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye tanto un dominio VH como un dominio VL, donde el dominio VH y el dominio VL incluyen, respectivamente, una secuencia de aminoácidos para los respectivos dominios VH y VL de los aislados clonales proporcionados en el presente documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un conjugado que tiene un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en el presente documento que está conjugado o fusionado en forma recombinante con un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En algunos aspectos de la enseñanza, un conjugado de la enseñanza que incluye un agente detectable puede usarse en un método para detectar y/o diagnosticar la formación de tumores es un sujeto. Dichos métodos pueden incluir la administración de una cantidad eficaz del conjugado a un sujeto que lo necesite.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona composiciones farmacéuticas que tienen uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la enseñanza también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto que lo necesita, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la enseñanza. En otro aspecto más, la enseñanza proporciona la administración de un segundo agente terapéutico en forma concurrente o sucesiva con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 1B7. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 2 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 1B7. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 3 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 2H12. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 4 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 2H12. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 5 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 1G2. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 6 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena ligera variable (VL) del clon 1G2. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 7 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 1E9. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 8 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 1E9. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 9 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 1H3. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 10 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena ligera variable (VL) del clon 1H3. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 11 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 2F5. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 12 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 2F5. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 13 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 2F7. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 14 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 2F7. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 15 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 2E12. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 16 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena ligera variable (VL) del clon 2E12. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 17 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 31F9. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 18 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 31F9V2. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 19 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena ligera variable (VL) del clon 31F9. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 20 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de cadena pesada variable (VH) del clon 32E2. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3).
FIG. 21 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 32E2. La parte superior de la Figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3).
FIG. 22 muestra un alineamiento de las regiones VH de anticuerpos monoclonales anti-GD2 humanos 1B7 (SEQ ID NO: 2), 2H12 (SEQ ID NO: 6), 1G2 (SEQ ID NO: 10), 1E9 (SEQ ID NO: 14), 1H3 (SEQ ID NO: 18), 2F5 (SEQ ID NO: 22), 2F7 (SEQ ID NO: 26), 2E12 (SEQ ID NO: 30), 31F9 (SEQ ID NO: 34), 31F9V2 (SEQ ID NO: NO: 36) y 32E2 (SEQ ID NO: 40), con la secuencia consenso (SEQ ID NO: 43) listada a continuación.
FIG. 23 muestra un alineamiento de las regiones VL de anticuerpos monoclonales anti-GD2 humanos 1B7 (SEQ ID NO: 4), 2H12 (SEQ ID NO: 8), 1G2 (SEQ ID NO: 12), 1E9 (SEQ ID NO: 16), 1H3 (SEQ ID NO: 20), 2F5 (SEQ ID NO: 24), 2F7 (SEQ ID NO: 28), 2E12 (SEQ ID NO: 32), 31F9 (SEQ ID NO: 38) y 32E2 (SEQ ID NO: 38) ID NO: 42), con la secuencia consenso (SEQ ID NO: 44) listada a continuación.
FIG. 24 muestra citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos monoclonales anti-GD2 humanos 1B7, 31F9, 31F9V2, 1G2, 2F7, 32e2 y 2H12. Las actividades de A d CC se midieron mediante el ensayo indicador de Promega utilizando células Jurket modificadas genéticamente como células efectoras. Las células diana son varias células tumorales, incluidas SaOS2, H524, Hs578T, TC71 y Lan1-luc.
FIG. 25 muestra la intemalización de anticuerpos monoclonales humanos anti-GD2 en células H524. Se cultivaron células H524 en presencia de 1B7, 31F9 o 31F9V2 complejadas con Hum-ZAP, una IgG antihumana conjugada con saporina. Los valores se midieron y normalizaron al 100% de crecimiento en ausencia de Fab-ZAP.
FIG. 26 muestra la intemalización de anticuerpos monoclonales humanos anti-GD2 en células Lan1-luc. Se cultivaron células Lan1-luc en presencia de 1B7, 1G2, 2H12, 2F7, 31F9 o 32E2 complejadas con Hum-ZAP, una IgG antihumana conjugada con saporina. Los valores se midieron y normalizaron al 100% de crecimiento en ausencia de Fab-ZAP.
FIG. 27 muestra la cinética de internalización de anticuerpos antigangliósido en células tumorales H524 (SCLC) medida con un indicador sensible al pH por citometría de flujo. Las células que internalizaron los anticuerpos en el entorno de bajo pH de los endosomas muestran una fluorescencia medida por citometría de flujo.
FIG. 28 muestra la cinética de internalización de anticuerpos antigangliósido en células tumorales TC-71 (sarcoma) medida con un indicador sensible al pH por citometría de flujo. Las células que internalizaron los anticuerpos en el entorno de bajo pH de los endosomas muestran una fluorescencia medida por citometría de flujo.
FIG. 29 muestra la supervivencia de ratones SCID injertados con xenoinjerto de SaOS2 humano (osteosarcoma) y tratados con anticuerpos anti-GD2 o control.
FIG. 30 muestra el crecimiento de tumores de xenoinjerto TC-71 (sarcoma) humanos en ratones SCID y tratados con anticuerpos anti-GD2 o control.
Descripción detallada
Los gangliósidos expresados en la superficie de las células tumorales pueden ser dianas para la inmunoterapia del cáncer. Las composiciones proporcionadas en el presente documento se basan, al menos en parte, en la identificación y caracterización de anticuerpos humanos que se generaron a partir de linfocitos sanguíneos de individuos inmunizados con vacunas MabVax (MabVax Therapeutics, San Diego, CA) que contienen los antígenos GD2L, GD3L y GM2 conjugados con KLH como se describe, por ejemplo, en las patentes US Nros. 6.936.253, 7.001.601 y 6.916.476. Se identificaron al menos 11 anticuerpos con alta afinidad por GD2 (1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 y 32E2), se expresaron como anticuerpos recombinantes y además se caracterizaron en modelos in vitro. De los ocho anticuerpos probados, seis (1B7, 2 H12 , 2F7, 2E12, 31F9V2 y 32E2) fueron potentes en los ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en al menos una línea de células cancerosas. Los seis anticuerpos analizados muestran una actividad significativa en ensayos de citotoxicidad dependientes de anticuerpos con cinco líneas celulares cancerosas diferentes, aunque en diferente grado. Los dos anticuerpos probados (1B7 y 31F9) también mostraron una actividad antitumoral significativa in vivo, tanto en un modelo de supervivencia como en un modelo de tumor subcutáneo. La relevancia traduccional de la enseñanza proporcionada en el presente documento es doble: en primer lugar, la vacuna conjugada GD2-KLH puede provocar una respuesta de anticuerpos IgG e IgM anti-GD2 en pacientes con cáncer y las células productoras de anticuerpos pueden recuperarse de muestras de sangre de pacientes. En segundo lugar, los anticuerpos más potentes que se generaron en un ensayo clínico se pueden conservar y, en última instancia, se pueden utilizar como agentes terapéuticos, o en la generación de terapias, para una población diana de cáncer. La alta afinidad de los anticuerpos proporcionados en el presente documento y sus altas funciones efectoras respaldan este potencial de traducción.
Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” pretende significar un producto polipeptídico de células B dentro de la clase de polipéptidos de inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno molecular específico y está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en donde cada par tiene una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kDa) y una cadena ligera (aproximadamente 25 kDa) y cada porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 o más aminoácidos y cada porción carboxi-terminal de cada cadena incluye una región constante (ver Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Edition, W.H. Freeman and Company, New York). En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno molecular específico que puede unirse mediante un anticuerpo de la enseñanza incluye el GD2 diana.
El término “humano” cuando se usa en referencia a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene una región variable humana y/o una región constante humana o una porción de la misma correspondiente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana están descritas por Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242. Un anticuerpo humano, en el contexto de la presente enseñanza, puede incluir un anticuerpo que se une a GD2 y está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es una variante somática de origen natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana. En el Ejemplo I, se proporcionan métodos de ejemplo para producir anticuerpos humanos, pero puede usarse cualquier método bien conocido por los expertos en la técnica.
La expresión “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que es el producto de un clon o hibridoma de una sola célula o una población de células derivadas de una sola célula. También se pretende que un anticuerpo monoclonal se refiera a un anticuerpo producido por métodos recombinantes a partir de genes de inmunoglobulina que codifican cadenas pesadas y ligeras para producir una única especie de inmunoglobulina molecular. Las secuencias de aminoácidos para los anticuerpos dentro de una preparación de anticuerpos monoclonales son sustancialmente homogéneas, y la actividad de unión de los anticuerpos dentro de dicha preparación exhibe sustancialmente la misma actividad de unión al antígeno. Por el contrario, los anticuerpos policlonales se obtienen de diferentes células B dentro de una población, que son una combinación de moléculas de inmunoglobulina que se unen a un antígeno específico. Cada inmunoglobulina de los anticuerpos policlonales puede unirse a un epítopo diferente del mismo antígeno. Los métodos para producir tanto anticuerpos monoclonales como anticuerpos policlonales son bien conocidos en la técnica (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Borrebaeck (ed.), Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp. 103-120 (1991)).
Como se usa en el presente documento, la expresión “fragmento funcional” cuando se usa en referencia a un anticuerpo pretende referirse a una porción del anticuerpo que incluye polipéptidos de cadena pesada o ligera que retiene parte o toda la actividad de unión como el anticuerpo del cual se derivó el fragmento. Dichos fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, un Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, Fv monocatenario (scFv), diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo y minicuerpo. Otros fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada o ligera, polipéptidos de región variable o polipéptidos CDR o porciones de los mismos siempre que dichos fragmentos funcionales retengan la actividad de unión. Tales fragmentos de unión de anticuerpos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990).
La expresión “cadena pesada”, cuando se usa en referencia a un anticuerpo, se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 50-70 kDa, en la que la porción amino-terminal incluye una región variable de aproximadamente 120 a 130 o más aminoácidos y una porción carboxi-terminal que incluye una región constante. La región constante puede ser uno de cinco tipos distintos, denominados alfa (a), delta (8), épsilon (e), gamma (y) y mu (p), según la secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada. Las distintas cadenas pesadas difieren en tamaño: a, 8 y y contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que p y e contienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cuando se combinan con una cadena ligera, estos distintos tipos de cadenas pesadas dan lugar a cinco clases bien conocidas de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas cuatro subclases de IgG, a saber, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Una cadena pesada puede ser una cadena pesada humana.
La expresión “cadena ligera” cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 25 kDa, en la que la porción amino-terminal incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 o más aminoácidos y una porción carboxi-terminal que incluye una región constante. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 aminoácidos. Hay dos tipos distintos, denominados kappa (k) y lambda (A) según la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. Una cadena ligera puede ser una cadena ligera humana.
La expresión “dominio variable” o “región variable” se refiere a una porción de las cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo que generalmente se encuentra en el extremo amino terminal de la cadena ligera o pesada y tiene una longitud de aproximadamente 120 a 130 aminoácidos en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre diferentes anticuerpos. La variabilidad en la secuencia se concentra en las CDR, mientras que las porciones menos variables en el dominio variable se denominan regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. La numeración de las posiciones de aminoácidos utilizadas en el presente documento se realiza de acuerdo con el índice de la UE, como en Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. Una región variable puede ser una región variable humana.
Una CDR se refiere a una de las tres regiones hipervariables (H1, H2 o H3) dentro de la región sin marco del marco de la hoja p de VH de inmunoglobulina (Ig o anticuerpo), o una de las tres regiones hipervariables (L1, L2 o L3) dentro de la región sin marco del marco de la hoja p VL del anticuerpo. Por consiguiente, las CDR son secuencias de regiones variables intercaladas dentro de las secuencias de la región marco. Las regiones CDR son bien conocidas por los expertos en la técnica y han sido definidas, por ejemplo, por Kabat como las regiones de mayor hipervariabilidad dentro de los dominios de la variable de anticuerpo (V) (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Las secuencias de la región CDR también han sido definidas estructuralmente por Chothia como aquellos residuos que no forman parte del marco conservado de la hoja p y, por lo tanto, son capaces de adaptar diferentes conformaciones (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Ambas terminologías están bien reconocidas en la técnica. Las posiciones de las CDR dentro de un dominio variable de anticuerpo canónico se han determinado mediante la comparación de numerosas estructuras (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Debido a que el número de residuos dentro de una región hipervariable varía en diferentes anticuerpos, los residuos adicionales en relación con las posiciones canónicas se numeran convencionalmente con a, b, c y así sucesivamente junto al número de residuos en el esquema de numeración de dominios variables canónicos (Al-Lazikani et al., supra (1997)). Esta nomenclatura es igualmente bien conocida por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, las CDR definidas según las designaciones Kabat (hipervariable) o Chothia (estructural) se exponen en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Definiciones de CDR
Kabati Chothia2 Ubicación de bucle
Vh CDRi 3i-35 26-32 une cadenas B y C
Vh CDR2 50-65 53-55 une cadenas C' y C’
Vh CDR3 95-i02 96 -i0 i une cadenas F y G
Vl CDRi 24-34 26-32 une cadenas B y C
VlCDR2 50-56 50-52 une cadenas C' y C’
Vl CDR3 89-97 9i-96 une cadenas F y G
1 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., supra
2 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., supra
También se pueden incorporar una o más CDR en una molécula en forma covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir covalentemente las CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar las c Dr en forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una a un antígeno particular de interés.
Como se usa en el presente documento, el término “aislado” cuando se usa en referencia a un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido pretende significar que la molécula de referencia está libre de al menos un componente tal como se encuentra en la naturaleza. El término incluye un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido que se elimina de algunos o todos los demás componentes tal como se encuentra en su entorno natural. Los componentes del entorno natural de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, trombocitos, plasma, proteínas, ácidos nucleicos, sales y nutrientes. Los componentes del entorno natural de un fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido incluyen, por ejemplo, membranas lipídicas, orgánulos celulares, proteínas, ácidos nucleicos, sales y nutrientes. Un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido de la enseñanza también puede estar libre o completamente libre de todos estos componentes o cualquier otro componente de las células a partir de las cuales se aísla o produce en forma recombinante.
Como se usa en el presente documento, “ isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos que está codificada por genes de región constante de cadena pesada. Las cadenas pesadas de un determinado anticuerpo o fragmento funcional determinan la clase de ese anticuerpo o fragmento funcional: IgM, IgG, IgA, IgD o IgE. Cada clase puede tener cadenas ligeras k o A. El término “subclase” se refiere a las diferencias menores en las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas que diferencian las subclases. En los seres humanos hay dos subclases de IgA (subclases IgA1 e IgA2) y hay cuatro subclases de IgG (subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Tales clases y subclases son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Las expresiones “se une” o “unión”, como se usan en el presente documento, se refieren a una interacción entre moléculas para formar un complejo. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, interacciones no covalentes que incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas y/o interacciones de van der Waals. Un complejo también puede incluir la unión de dos o más moléculas unidas por enlaces, interacciones o fuerzas covalentes o no covalentes. La unión de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo puede detectarse usando, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima, un método proporcionado en el Ejemplo I o cualquiera de varios métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La fuerza de las interacciones no covalentes totales entre un único sitio de unión al antígeno en un anticuerpo o fragmento funcional y un solo epítopo de una molécula diana, como GD2, es la afinidad del anticuerpo o fragmento funcional por ese epítopo. La relación de asociación (ki) a disociación (k-i) de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo a un antígeno monovalente (ki/k-i) es la constante de asociación K, que es una medida de afinidad. El valor de K varía para diferentes complejos de anticuerpo o fragmento funcional y antígeno y depende tanto de ki como de k-i. La constante de asociación K para un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza puede determinarse usando cualquier método proporcionado en el presente documento o cualquier otro método bien conocido por los expertos en la técnica.
La afinidad en un sitio de unión no siempre refleja la verdadera fuerza de la interacción entre un anticuerpo o fragmento funcional y un antígeno. Cuando antígenos complejos que contienen múltiples determinantes antigénicos repetidos, como un GD2 polivalente, entran en contacto con anticuerpos que contienen múltiples sitios de unión, la interacción del anticuerpo o fragmento funcional con el antígeno en un sitio aumentará la probabilidad de una reacción en un segundo sitio. La fuerza de tales interacciones múltiples entre un anticuerpo multivalente y un antígeno se llama avidez.
La avidez de un anticuerpo o fragmento funcional puede ser una mejor medida de su capacidad de unión que la afinidad de sus sitios de unión individuales. Por ejemplo, una alta avidez puede compensar una baja afinidad como a veces se encuentra con los anticuerpos IgM pentaméricos, que pueden tener una afinidad menor que la IgG, pero la alta avidez de la IgM, que resulta de su multivalencia, le permite unirse al antígeno de manera efectiva.
La especificidad de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo se refiere a la capacidad de un anticuerpo individual o fragmento funcional del mismo para reaccionar con un solo antígeno. Un anticuerpo o fragmento funcional puede considerarse específico cuando puede distinguir diferencias en la estructura primaria, secundaria o terciaria de un antígeno o formas isoméricas de un antígeno. El anticuerpo puede tener reactividad cruzada si el epítopo de unión está presente en otros antígenos.
El término “polinucleótido” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. La secuencia de un polinucleótido está compuesta por cuatro bases de nucleótidos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) para timina cuando el polinucleótido es ARN. Por lo tanto, las expresiones “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de ácido nucleico” son la representación alfabética de un polinucleótido. Un polinucleótido puede incluir un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, marca EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Polinucleótido también se refiere a moléculas de cadena doble y simple. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de esta enseñanza que sea un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o previstas para formar la forma bicatenaria. Se entiende que los polinucleótidos y ácidos nucleicos aislados descritos en el presente documento están dirigidos a polinucleótidos y ácidos nucleicos no naturales. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos de origen no natural pueden incluir, pero sin limitación, ADNc y moléculas sintetizadas químicamente.
El término “codificar” o equivalentes gramaticales del mismo, como se usa en referencia a polinucleótidos, se refiere a un polinucleótido en su estado nativo o cuando se manipula mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica que se pueden transcribir para producir ARNm, que luego se traduce en un polipéptido y/o un fragmento del mismo. La hebra antisentido es el complemento de tal polinucleótido, y la secuencia codificante puede deducirse de ella.
La frase “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que pueda usarse en el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad asociada con la expresión de GD2 y/o un síntoma relacionado con la misma. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. En otras realizaciones, un agente terapéutico se refiere a un agente distinto de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Un agente terapéutico puede ser un agente que se sabe que es útil para el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad asociada con la expresión de GD2 y/o uno o más síntomas relacionados con ella, o se ha utilizado o se está utilizando actualmente.
La frase “agente de diagnóstico” se refiere a una sustancia administrada a un sujeto que ayuda en el diagnóstico de una enfermedad. Estas sustancias se pueden usar para revelar, señalar y/o definir la localización de un proceso que causa una enfermedad. En determinadas realizaciones, un agente de diagnóstico incluye una sustancia que está conjugada con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, que cuando se administra a un sujeto o se pone en contacto con una muestra de un sujeto ayuda en el diagnóstico de cáncer o formación de tumores.
La frase “agente detectable” se refiere a una sustancia que puede usarse para determinar la existencia o la presencia de una molécula deseada, tal como un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, en una muestra o sujeto. Un agente detectable puede ser una sustancia que se puede visualizar o una sustancia que de otro modo se puede determinar y/o medir (por ejemplo, mediante cuantificación).
Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Puede administrarse una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Tal suministro depende de una serie de variables que incluyen el período de tiempo durante el cual se utilizará la unidad de dosificación individual, la biodisponibilidad del agente, la vía de administración, etc.
La frase “cantidad terapéuticamente eficaz” como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en el presente documento o cualquier otro agente terapéutico proporcionado en el presente documento) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad y/o duración de una enfermedad dada y/o un síntoma relacionado con la misma. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico puede ser una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o progresión de una enfermedad determinada, la reducción o mejora de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad determinada y/o para mejorar o potenciar el efecto profiláctico o terapéutico de otra terapia (por ejemplo, una terapia distinta de la administración de un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en el presente documento).
El compuesto GD2, también conocido como gangliósido GD2, gangliósido GD2 y gangliósido G2, es un disialogangliósido con una fórmula molecular de C74H134N4O32 y una masa molar de 1591,86 g/mol. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos ácidos que se encuentran en la superficie exterior de la mayoría de las membranas celulares. Pueden ser dianas para anticuerpos monoclonales (mAb) debido a la alta densidad de antígenos, la falta de modulación, la relativa homogeneidad en muchos tumores y la posibilidad de regulación positiva por parte de las citoquinas. Muchos tumores tienen una composición y estructura de glicolípidos anormales. Se ha encontrado GD2 en un amplio espectro de tumores humanos, incluidos los de origen neuroectodérmico o epitelial, prácticamente todos los melanomas y aproximadamente el 50% de las muestras tumorales de osteosarcoma y sarcoma de tejidos blandos.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera o pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, en el que la cadena ligera o pesada de anticuerpo o su fragmento funcional codificado por el polinucleótido de la enseñanza tiene una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) representadas en las Fig. 1-21 o enumeradas en la Tabla 2. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que incluye una o más de las CDR se puede unir específicamente a GD2 como se describe en el presente documento. La unión específica a GD2 puede incluir la especificidad, afinidad y/o avidez como se proporciona en el Ejemplo I para cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo codificado por los polinucleótidos de la enseñanza puede incluir la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de cualquiera de los aislados clonales 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2 descritos en el presente documento. Los métodos para evaluar la especificidad, afinidad y/o avidez de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo son bien conocidos en la técnica y se proporcionan aquí métodos de ejemplo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza incluye menos de seis CDR. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3. En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3 de los aislados clonales 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2 descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada de anticuerpo o el fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, en las que la secuencia de aminoácidos de VH CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 40; la secuencia de aminoácidos de VH CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 40; y la secuencia de aminoácidos de VH CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada de anticuerpo o el fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos de VH CDR1 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 1; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 5; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 9; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 13; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 17; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 21; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 25; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 29; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 33; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 35; los residuos 76-99 de la SEQ ID NO: 39; la secuencia de aminoácidos de VH CDR2 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 1; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 5; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 9; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 13; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 17; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 21; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 25; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 29; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 33; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 35; los residuos 151-174 de la SEQ ID NO: 39; y la secuencia de aminoácidos de VH CDR3 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 1; los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 5; los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 9; los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 13; los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 17; los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 21; los residuos 289­ 327 de la SEQ ID NO: 25; los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 29; los residuos 289-330 de la SEQ ID NO: 33; los residuos 289-330 de la SEQ ID NO: 35; los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, en el que la cadena pesada o fragmento funcional del anticuerpo incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 del aislado clonal 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio VH tiene las secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97­ 109 de la SEQ iD NO: 6; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID n O: 10; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio VH tiene las secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 codificadas por secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 1; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 5; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-324 de la Se Q ID NO: 9; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 13; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 17; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-324 de la s Eq ID NO: 21 ; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-327 de la Se Q ID NO: 25; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-327 de la SEQ ID NO: 29; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-330 de la SeQ ID NO: 33; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-330 de la SEQ ID NO: 35; los residuos 76-99, los residuos 151-174 y los residuos 289-324 de la SEQ ID NO: 39.
En otra realización, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada del anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40.
En otra realización más, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena pesada del anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde la secuencia de aminoácidos del dominio VH está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde la VL CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 42; la VL CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 50-52 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 42, y la VL CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 95­ 103 de la SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera del anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos de VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde la VL CDR1 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 79-111 de la SEQ ID NO: 3; los residuos 79-111 de la SEQ ID NO: 7; los residuos 79­ 114 de la SEQ ID NO: 11; los residuos 79-114 de la SEQ ID NO: 15; los residuos 79-114 de la SEQ ID NO: 19; los residuos 79-114 de la SEQ ID NO: 23; los residuos 79-111 de la SEQ ID NO: 27; los residuos 79-111 de la SEQ ID NO: 31; los residuos 79-96 de la SEQ ID NO: 37; y los residuos 79-114 de la SEQ ID NO: 41; la VL CDR2 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 163-171 de la SEQ ID NO: 3; 163-171 de la SEQ ID NO: 7; 166-174 de la SEQ ID NO: 11; 166-174 de la SEQ ID NO: 15; 166-174 de la SEQ ID NO: 19; 166-174 de la SEQ ID NO: 23; 163-171 de la SEQ ID NO: 27; 163-171 de la SEQ ID NO: 31; 148-156 de la SEQ ID NO: 37; y 166-174 de la SEQ ID NO: 41; y la VL CDR3 está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 3; los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 7; los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 11; los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 15; los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 19; los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 23; los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 27; los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 31; los residuos 265-291 de la SEQ ID NO: 37; los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, en donde la cadena ligera o fragmento funcional del anticuerpo incluye un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y Vl CDR3 del aislado clonal 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ iD NO: 20; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27­ 37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32, los residuos 50-52 y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ iD NO: 42.
En otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 codificadas por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en los residuos 79-111, los residuos 163-171 y los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 3; los residuos 79-111, los residuos 163-171 y los residuos 280-306 de la Se Q ID NO: 7; los residuos 79-114, los residuos 166-174 y los residuos 283-309 de la Se Q ID NO: 11; los residuos 79-114, los residuos 166-174 y los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 15; los residuos 79-114, los residuos 166-174 y los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 19; los residuos 79-114, los residuos 166-174 y los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 23; los residuos 79-111, los residuos 163-171 y los residuos 280-306 de la Se Q ID NO: 27; los residuos 79-111, los residuos 163-171 y los residuos 280-306 de la SEQ ID NO: 31; los residuos 79-96, los residuos 148-156 y los residuos 265-291 de la SEQ ID NO: 37; los residuos 79-114, los residuos 166-174 y los residuos 283-309 de la SEQ ID NO: 41.
En otra realización, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No : 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42.
En otra realización más, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo o un fragmento funcional de la misma, incluyendo la cadena ligera de anticuerpo o fragmento funcional de la misma un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde la secuencia de aminoácidos del dominio VL está codificada por la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 41.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo que se une a GD2. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo tiene una o más de las CDR representadas en las Fig. 1-21 o enumeradas en la Tabla 2. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que incluye una o más de las CDR, en particular CDR3, puede unirse específicamente a GD2 como se describe en el presente documento. La unión específica a GD2 puede incluir la especificidad y la afinidad como se describe en el Ejemplo I para cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza puede incluir la actividad de CDC y/o la actividad de ADCC de cualquiera de los aislados clonales 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2 descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en donde el anticuerpo se une a GD2. En consecuencia, en algunos aspectos, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio tiene las secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos de VH CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 40; la secuencia de aminoácidos de VH CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 40; y la secuencia de aminoácidos de VH CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En algunos otros aspectos, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio VH tiene las secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33, residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97­ 108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97­ 110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En otros aspectos más, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde la VL CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 42; la VL CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 50-52 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 42, y la VL CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42.
En algunos aspectos, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95­ 103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32, los residuos 50-52 y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95­ 103 de la SEQ ID NO: 42.
En algunos otros aspectos, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la Se Q ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40; y el VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42.
En algunas otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VH y el dominio VL incluyen, respectivamente, las secuencias de aminoácidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42.
Tabla 2: CDR de aislados clonales
Domino Residuos de ácido nucleico Secuencia de aminoácidos
variable
(SEQ ID NO:) (SEQ ID NO:)
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
1B7 VH 76-99 151-174 289-327 26-33 51-58 97-109
(NO: 1) (NO: 1) (NO: 1) (NO: 2) (NO: 2) (NO: 2)
1B7 VL 79-111 163-171 280-306 27-37 55-57 94-102
(NO: 3) (NO: 3) (NO: 3) (NO: 4) (NO: 4) (NO: 4)
2H12 VH 76-99 151-174 289-327 26-33 51-58 97-109
(NO: 5) (NO: 5) (NO: 5) (NO: 6) (NO: 6) (NO: 6)
2H12 VL 79-111 163-171 280-306 27-37 55-57 94-102
(NO: 7) (NO: 7) (NO: 7) (NO: 8) (NO: 8) (NO: 8)
1G2VH 76-99 151-174 289-324 26-33 51-58 97-108
(NO: 9) (NO: 9) (NO: 9) (NO: 10) (NO: 10) (NO: 10)
1G2 VL 79-114 166-174 283-309 27-38 56-58 95-103
(NO: 11) (NO: 11) (NO: 11). (NO: 12) (NO: 12) (NO: 12)
1E9 VH 76-99 151-174 289-324 26-33 51-58 97-108
(NO: 13) (NO: 13) (NO: 13) (NO: 14) (NO: 14) (NO: 14)
1E9 VL 79-114 166-174 283-309 27-38 56-58 95-103
(NO: 15) (NO: 15) (NO: 15) (NO: 16) (NO: 16) (NO: 16)
1H3 VH 76-99 151-174 289-324 26-33 51-58 97-108
(NO: 17) (NO: 17) (NO: 17) (NO: 18) (NO: 18) (NO: 18)
1H3 VL 79-114 166-174 283-309 27-38 56-58 95-103
(NO: 19) (NO: 19) (NO: 19) (NO: 20) (NO: 20) (NO: 20)
2F5 VH 76-99 151-174 289-324 26-33 51-58 97-108
(NO: 21) (NO: 21) (NO: 21) (NO: 22) (NO: 22) (NO: 22)
2F5 VL 79-114 166-174 283-309 27-38 56-58 95-103
(NO: 23) (NO: 23) (NO: 23) (NO: 24) (NO: 24) (NO: 24)
2F7 VH 76-99 151-174 289-327 26-33 51-58 97-109
(NO: 25) (NO: 25) (NO: 25) (NO: 26) (NO: 26) (NO: 26)
2F7 VL 79-111 163-171 280-306 27-37 55-57 94-102
(NO: 27) (NO: 27) (NO: 27) (NO: 28) (NO: 28) (NO: 28)
2E12 VH 76-99 151-174 289-327 26-33 51-58 97-109
(NO: 29) (NO: 29) (NO: 29) (NO: 30) (NO: 30) (NO: 30)
2E12 VL 79-111 163-171 280-306 27-37 55-57 94-102
(NO: 31) (NO: 31) (NO: 31) (NO: 32) (NO: 32) (NO: 32)
31F9 VH 76-99 151-174 289-330 26-33 51-58 97-110
(NO: 33) (NO: 33) (NO: 33) (NO: 34) (NO: 34) (NO: 34)
31F9V2 VH 76-99 151-174 289-330 26-33 51-58 97-110
(NO: 35) (NO: 35) (NO: 35) (NO: 36) (NO: 36) (NO: 36)
31F9 VL 79-96 148-156 265-291 27-32 50-52 89-97
(NO: 37) (NO: 37) (NO: 37) (NO: 38) (NO: 38) (NO: 38)
32E2 VH 76-99 151-174 289-324 26-33 51-58 97-108
(NO: 39) (NO: 39) (NO: 39) (NO: 40) (NO: 40) (NO: 40)
32E2 VL 79-114 166-174 283-309 27-38 56-58 95-103
(NO: 41) (NO: 41) (NO: 41) (NO: 42) (NO: 42) (NO: 42)
En otra realización, la enseñanza proporciona una variante de los polinucleótidos proporcionados en el presente documento. Una variante cuando se usa en referencia a un polinucleótido incluye un polinucleótido que tiene uno o más nucleótidos modificados, tales como, pero sin limitación, un nucleótido metilado o un análogo de nucleótido. Además, un polinucleótido variante puede incluir un polinucleótido que está interrumpido por componentes no nucleotídicos. Pueden impartirse modificaciones a un polinucleótido antes o después del ensamblaje del polinucleótido usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido puede modificarse después de la polimerización por conjugación con un componente de marcaje usando técnicas enzimáticas o químicas (por ejemplo, tal como se describe en Gottfried y Weinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39(2):523-628; Paredes et al., 2011, Methods, 54(2): 251-259).
Los polinucleótidos pueden obtenerse y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Dado que las secuencias de aminoácidos de los dominios de cadena pesada y ligera variables de 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 y 32E2 son conocidas (ver, por ejemplo, las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42), las secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos y las versiones modificadas de estos anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, es decir, los codones de nucleótidos de los que se sabe que codifican aminoácidos particulares se ensamblan de tal manera que se genere un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Dicho polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, fragmentos o variantes de los mismos, fusión y ligación de esos oligonucleótidos, y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Se puede generar un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza usando la secuencia de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de los aislados 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2 (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 y 41). Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento funcional se puede sintetizar químicamente u obtener de una fuente adecuada (por ejemplo, ADNc aislado de células que expresan el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridar a los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia de ácido nucleico particular. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden luego clonarse en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la técnica.
En algunos aspectos de la enseñanza, el anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos de la enseñanza, el anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo proporcionado en el presente documento es un isotipo IgG o IgM. En un aspecto adicional de la enseñanza, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo de la subclase IgG1.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un método de producción de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza. El método de la enseñanza puede incluir introducir un polinucleótido de la enseñanza en una célula huésped, cultivar la célula huésped en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para producir la cadena pesada y/o ligera codificada de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza y purificar la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o fragmento funcional. En otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona una célula recombinante que tiene un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional de la enseñanza. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo tiene el dominio de cadena pesada variable y el dominio de cadena ligera variable de los anticuerpos designados 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2.
La expresión recombinante de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza que se une a un antígeno GD2 puede incluir la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo (preferible, pero no necesariamente, que contiene el dominio variable de cadena pesada y/o ligera) de la enseñanza, el vector para la producción del anticuerpo o fragmento funcional se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. En el presente documento, se describen métodos para preparar una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que codifica la secuencia de nucleótidos.
Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que codifican secuencias y señales de control de la transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. La enseñanza, por lo tanto, proporciona vectores replicables que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza unido operativamente a un promotor. Dichos vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales Nros. WO 86/05807 y WO 89/01036; y la patente U.S. N° 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo puede ser clonado en un vector de este tipo para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o tanto la cadena pesada como la ligera completas.
El vector de expresión se puede transferir a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza. Por lo tanto, la enseñanza incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza unido operativamente a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones para la expresión de anticuerpos bicatenarios, los vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera pueden coexpresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión de huésped para expresar el anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo de la enseñanza (ver, por ejemplo, la patente U.S. N° 5.807.715). Dichos sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden expresar, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, una molécula de anticuerpo de la enseñanza in situ. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NS0 y 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus vaccinia 7.5K). En algunos aspectos, las células bacterianas como Escherichia coli, o las células eucariotas, especialmente para la expresión de un anticuerpo recombinante completo, se utilizan para la expresión de un anticuerpo recombinante o un fragmento funcional. Por ejemplo, las células de mamíferos como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector como el principal elemento de promotor genético temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz de anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la enseñanza se producen en células CHO. En una realización, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la enseñanza que se unen a GD2 está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente diversos vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicho anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), en el que la secuencia codificante del anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con región codificante de lac Z de modo que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de agarosa de glutatión de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de modo que el producto del gen diana clonado pueda liberarse del resto GST.
En un sistema de insectos, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como vector para expresar genes extraños. El virus crece en las células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del fragmento funcional o del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).
En células huésped de mamíferos, se pueden utilizar varios sistemas de expresión a base de virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de codificación del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse luego en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (por ejemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359). También pueden usarse señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de iniciación pueden tener una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (ver, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
Además, se puede elegir una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función del anticuerpo o fragmento funcional. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccional de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamíferos incluyen, pero sin limitación, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente cualquier cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O y HsS78Bst.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen de manera estable el anticuerpo o el fragmento funcional de la enseñanza. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células manipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo.
Se pueden usar varios sistemas de selección que incluyen, pero sin limitación, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA 48:202), y los genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede utilizar como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (6):3567-70; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); glutamina sintetasa (GS), que es una enzima responsable de la biosíntesis de glutamina usando glutamato y amoníaco (Bebbington et al., 1992, Biuotechnology 10:169); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926­ 932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Se pueden aplicar en forma rutinaria métodos bien conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante la amplificación de vectores (para una revisión, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la enseñanza, en donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un solo vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera puede colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199). Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden incluir ADNc o ADN genómico.
Además, los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza pueden someterse a optimización de codones usando técnicas bien conocidas en la técnica para lograr la expresión optimizada de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza en una célula huésped deseada. Por ejemplo, en un método de optimización de codones, un codón nativo se sustituye por el codón más frecuente de un conjunto de genes de referencia, en el que la tasa de traducción de codones para cada aminoácido está diseñada para ser alta. Métodos de ejemplo adicionales para generar polinucleótidos de codones optimizados para la expresión de una proteína deseada, que se puede aplicar a las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, se describen en Kanaya et al., Gene, 238:143-155 (1999), Wang et al., Mol. Biol. Evol., 18(5):792-800 (2001), patente U.S. 5.795.737, publicación U.S. 2008/0076161 y WO 2008/000632.
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la enseñanza mediante expresión recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente enseñanza pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas proporcionadas en el presente documento o conocidas en la técnica para facilitar la purificación. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede purificar mediante la adición recombinante de una marca de poli-histidina (marca His), marca de FLAG, marca de hemaglutinina (marca de HA) o marca de myc, entre otras, que están disponibles en comercios y utilizando métodos de purificación bien conocidos por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, el fragmento funcional de anticuerpo de la enseñanza puede ser, pero sin limitación, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fabc, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, minicuerpo o un anticuerpo de dominio único (sdAB). Con respecto a los anticuerpos y sus fragmentos funcionales, se conocen bien en la técnica diversas formas, alteraciones y modificaciones. Los fragmentos de anticuerpos específicos de GD2 de la enseñanza pueden incluir cualquiera de dichas diversas formas, alteraciones y modificaciones de anticuerpos. A continuación, se exponen ejemplos de las diversas formas y términos que se conocen en la técnica.
Un fragmento Fab se refiere a un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341: 544-546, (1989)) consiste en un dominio VH.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.
Un anticuerpo monocatenario (scFv) se refiere a un anticuerpo en el que una región VL y VH se unen mediante un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena polipeptídica continua en la que el enlazador es suficientemente largo para permitir que la cadena de proteínas se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión al antígeno monovalente (ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-83 (1988)). Los diacuerpos se refieren a anticuerpos bivalentes que incluyen dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica incluye dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (ver, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993), y Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión de antígenos idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión de antígeno diferentes. De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que incluyen tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión con el antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.
La presente enseñanza también proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo derivado de 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 y 32E2, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a GD2. Se pueden usar técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que da como resultado sustituciones de aminoácidos. En algunos aspectos, el derivado incluye menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la molécula original.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene formas modificadas de aminoácidos naturales, sustituciones conservadoras, aminoácidos no naturales, análogos de aminoácidos y miméticos, siempre que el anticuerpo o fragmento funcional retenga la actividad funcional como se define en el presente documento. En una realización, el derivado tiene sustituciones de aminoácidos conservadoras que se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una sustitución conservadora de aminoácidos es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica, se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De modo alternativo, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden seleccionarse en busca de actividad biológica para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, se puede expresar el anticuerpo codificado o fragmento funcional del mismo y se puede determinar la actividad del anticuerpo o fragmento funcional.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene fucosilación, galactosilación y/o sialilación modificadas de un fragmento Fc contenido dentro de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Tales modificaciones de un fragmento de Fc pueden afectar la actividad mediada por el receptor de Fc como se describe en Peipp et al., Blood, 112 (6): 2390-2399 (2008). Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos creados por glicoingeniería que carecen de residuos de fucosa del núcleo de los N-glicanos Fc exhiben una fuerte ADCC a concentraciones más bajas con una eficacia mucho mayor en comparación con sus contrapartes fucosiladas. Shields et al., J. Biol. Chem., 277(30):26733-40 (2002); Okazaki et al., J Mol Biol., 336:1239-1249 (2004); Natsume et al., J. Immunol. Methods., 306:93-103 (2005). Los métodos para modificar la fucosilación, galactosilación y/o sialilación de un anticuerpo por un fragmento funcional del mismo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enfoques de defucosilación se pueden agrupar en tres metodologías (1) conversión de la vía de N-glicosilación de células de no mamíferos en la vía de no fucosilación “humanizada”; (2) inactivación de la vía de fucosilación de N-glucanos de células de mamíferos y (3) síntesis química in vitro de N-glucoproteína no fucosilada o modificación enzimática de N-glucanos a formas no fucosiladas, como se describe en Yamane-Ohnuki et al., MAbs., 1(3):230-236 (2009). Se entiende que se puede usar cualquiera de estos métodos o cualquier otro método que sea bien conocido en la técnica para producir un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tenga fucosilación, galactosilación y/o sialilación modificadas.
Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la enseñanza que se unen a GD2 pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante. La práctica de la enseñanza emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro de la técnica. Estas técnicas se describen en las referencias citadas en el presente documento y se explican completamente en la literatura. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press; Lo (ed.) (2006) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology); Vol. 248, Humana Press, Inc.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluido el uso de hibridomas y tecnologías recombinantes, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridomas, incluidas las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). Un anticuerpo monoclonal no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. En la técnica se conocen otros métodos de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales. En el Ejemplo I de este documento, se proporcionan métodos de ejemplo adicionales para producir anticuerpos monoclonales.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos que se unen a GD2 pueden generarse mediante cualquier técnica bien conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la enseñanza se pueden producir mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos de la enseñanza también se pueden generar usando diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en los métodos de presentación de fagos, los dominios de anticuerpos funcionales, tales como las regiones variables de cadena pesada y/o ligera que tienen una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR proporcionadas en el presente documento, se muestran en la superficie de las partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. El ADN que codifica los dominios VH y VL se recombina junto con un enlazador scFv mediante PCR y se clona en un vector fagémido. El vector se electropora en E. coli y la E. coli se infecta con fagos auxiliares. Los fagos utilizados en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y los dominios VH y VL se fusionan habitualmente en forma recombinante con el gen III o el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular, tal como GD2, puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. Los ejemplos de métodos de presentación de fagos que pueden usarse para preparar los fragmentos funcionales de anticuerpos de la presente enseñanza incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; solicitud PCT N° PCT/GB91/01134; publicaciones internacionales números WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 y WO97/13844; y patentes U.S. Nros. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727, 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describió en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluidos anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
También se pueden emplear técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT N° WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043.
Para generar anticuerpos completos, se pueden usar cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos VH
o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las
secuencias VH o VL en clones scFv. Utilizando técnicas de clonación bien conocidas por los expertos en la técnica,
los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresan una región constante VH, por
ejemplo, la región constante gamma 1 humana, y los dominios VL amplificados por PCR pueden clonarse en vectores
que expresan una región constante VL, por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios VH
y VL también se pueden clonar en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de
conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan luego en líneas celulares
para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG,
usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se conjuga (conjugaciones covalentes
o no covalentes) o se fusiona en forma recombinante con uno o más agentes de diagnóstico, agentes detectables o
agentes terapéuticos o cualquier otra molécula deseada. El anticuerpo o fragmento funcional conjugado o fusionado
recombinantemente puede ser útil para monitorear o diagnosticar el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una
enfermedad asociada con la expresión de GD2, como cáncer o formación de tumores, como parte de un procedimiento
de pruebas clínicas, como determinar la eficacia de una terapia particular.
En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza se conjuga con un agente
detectable. La detección y el diagnóstico se pueden lograr, por ejemplo, acoplando el anticuerpo o el fragmento
funcional de la enseñanza a sustancias detectables que incluyen, pero sin limitación, materiales radiactivos, tales
como, pero sin limitación, circonio (89Zr), yodo (131I, 125I, 124I, 123I y 121I,), carbono (14C, 11C), azufre (35S), tritio (3H), indio
(115In, 113In, 112In y 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón
(133Xe), flúor (18F), 15O, 13N, 64Cu, 94mTc, 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 86Y, 90Y, 47Sc, 186Re, 18BRe,
142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117S positrones usando diversas tomografías por emisión de positrones, diversas enzimas, tales como, pero sin limitación,
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales
como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero sin
limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína,
cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero sin limitación, luminol; materiales
bioluminiscentes, tales como, pero sin limitación, luciferasa, luciferina y aequorina, e iones metálicos paramagnéticos
no radiactivos.
La presente enseñanza abarca, además, los usos terapéuticos de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza
conjugado (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionado en forma recombinante con uno o más agentes
terapéuticos. En este contexto, por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse o fusionarse en forma recombinante con
un agente terapéutico, como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, o un ión metálico radiactivo,
por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las
células. Un agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico tales como, pero sin limitación, una antraciclina
(por ejemplo, doxorrubicina y daunorrubicina (anteriormente daunomicina)); un taxano (por ejemplo, paclitaxel (Taxol)
y docetaxel (Taxotere); un antimetabolito (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo y descarbazina); o un agente alquilante (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán,
carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C,
cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) y cisplatino); un antibiótico (por ejemplo, actomicina, bleomicina, mitramicina y
antramicina (AMC)); una molécula de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1, solastatina 10, monometil
auristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF)); una hormona (por ejemplo, glucocorticoides, progestinas,
andrógenos y estrógenos); un análogo de nucleósido (por ejemplo, gemcitabina), un inhibidor de la enzima reparadora
del ADN (por ejemplo, etopósido y topotecán), un inhibidor de quinasa (por ejemplo, compuesto ST1571, también
conocido como Gleevec o mesilato de imatinib); un agente citotóxico (por ejemplo, maitansina, paclitaxel, citocalasina
B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina,
doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, 1-deshidrotestosterona,
glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos, y
aquellos compuestos descritos en las patentes U.S. números 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242,
6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.811.90,
5.925.376, 5.922.844, 5.811.905); un inhibidor de la farnesil transferasa (por ejemplo, R115777, BMS-214662, y los
descritos, por ejemplo, por las patentes U.S. números: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959,
6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188,
6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856,
6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465,
6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466,
6.051.582, 6.051.574 y 6.040.305); un inhibidor de la topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina, irinotecán, SN-38,
topotecán, 9-aminocamptotecina, GG-211 (GI 147211), DX-8951f, iSt -622, rubitecán, pirazoloacridina, XR-5000,
saintopina, UCE6, UCE1022, TAN-1518A, TAN 1518B, KT6006, KT6528, ED-110, NB-506, ED-110, NB-506,
fagaronina, coralina, beta-lapachona y rebeccamicina); un aglutinante de surco menor de ADN (por ejemplo, colorante
Hoechst 33342 y colorante Hoechst 33258); inhibidores de la adenosina desaminasa (por ejemplo, fosfato de
fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina); o sales, solvatos, clatratos o profármacos farmacéuticamente aceptables de
los mismos. Un agente terapéutico puede ser un inmunoterapéutico tales como, pero sin limitación, cetuximab, bevacizumab, heceptina, rituximab).
Además, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede conjugar con un agente terapéutico como un ión metálico radiactivo, como emisores alfa como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos, incluidos, pero sin limitación, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131S; o un quelante macrocíclico, como ácido 1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano-N,N',N”,N'”-tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo o fragmento funcional a través de una molécula enlazadora. Tales moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
Además, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza puede conjugarse (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionarse de manera recombinante con un agente terapéutico que modifica una respuesta biológica dada. Por lo tanto, los agentes terapéuticos no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina (por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera y toxina diftérica); una proteína como el factor de necrosis tumoral, el interferón y, el interferón a, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-y, AIM I, AIM II, ligando Fas y VEGF), un agente antiangiogénico (por ejemplo, angiostatina, endostatina y un componente de la vía de coagulación tal como factor tisular); un modificador de la respuesta biológica (por ejemplo, una citoquina como interferón gamma, interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-5, interleuquina-6, interleuquina-7, interleuquina-9, interleuquina-10, interleuquina-12, interleuquina-15, interleuquina-23, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos y factor estimulante de colonias de granulocitos); un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento) o un agente de coagulación (por ejemplo, calcio, vitamina K, factores tisulares tales como, pero sin limitación, factor de Hageman (factor XII), cininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína (PK), proteínas-factores de coagulación II (protrombina), factor V, XII a, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolípido y monómero de fibrina).
La presente enseñanza abarca anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza fusionados en forma recombinante o conjugados químicamente (conjugaciones covalentes o no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo para generar proteínas de fusión. En algunos aspectos, tal polipéptido puede tener aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, la enseñanza proporciona proteínas de fusión que tienen un fragmento funcional de un anticuerpo de la enseñanza (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una VH CDR, un dominio VL o una VL CDR) y una proteína o polipéptido heterólogo. En una realización, la proteína o polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo o el fragmento funcional es útil para dirigir el anticuerpo o el fragmento funcional a un tipo de célula particular, tal como una célula que expresa GD2.
Una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye cualquier anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza proporcionada aquí conjugado (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionado en forma recombinante a un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En una realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un anticuerpo 1B7, 2H12, 1G2, 1E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2 y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un fragmento funcional de anticuerpos 1B7, 2H12, 1G2, 1 E9, 1H3, 2F5, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 o 32E2, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunas realizaciones, una proteína conjugada o de fusión de la presente enseñanza incluye una o más VH CDR que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDR representadas en las SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36 o 40 y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión incluye una o más VL CDR que tienen la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VL CDR representadas en SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38 o 42 y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunos aspectos, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VH, teniendo el dominio VH las secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos VH CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 40; la secuencia de aminoácidos de VH CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 40; y la secuencia de aminoácidos de VH CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 97­ 110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunos otros aspectos, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VH, teniendo el dominio VH secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33, los residuos 51­ 58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID No : 10; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ iD NO: 18; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97­ 108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En otros aspectos más, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VH, teniendo el dominio VH una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunas realizaciones, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VL, teniendo el dominio VL las secuencias de aminoácidos Vl CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde la VL CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 42; la VL CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 50-52 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 42, y la VL CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En otras realizaciones, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VL, teniendo el dominio VL secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ iD NO: 24; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27­ 37, residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32, los residuos 50-52 y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunos otros aspectos, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VL, teniendo el dominio VL una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunas realizaciones, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VH y un dominio VL, en donde el dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40; y el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4; s Eq ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
En algunas otras realizaciones, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio VH y un dominio VL, en donde el dominio VH y el dominio VL tienen, respectivamente, una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
Los métodos para fusionar o conjugar agentes de diagnóstico, agentes detectables o agentes terapéuticos (incluidos polipéptidos) con anticuerpos son bien conocidos, ver, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; patentes U.S. Nros. 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.723.125, 5.783.181, 5.908.626, 5.844.095, 5.112.946, 7.981.695, 8.039.273, 8.142.784; publicaciones U.S. 2009/0202536, 2010/0034837, 2011/0137017, 2011/0280891,2012/0003247; EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 y WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Trauneckeret al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992; y Senter, Current Opinion in Chemical Biology, 13:235-244 (2009).
En otro aspecto, se puede unir un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico en la región de bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante la formación de un enlace disulfuro. Alternativamente, tales agentes pueden unirse al componente de anticuerpo usando un reticulante heterobifuncional, tal como 3- (2-piridilditio)propionato de N-succinilo (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Las técnicas generales para tal conjugación son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Wong, CHe M iSTRY OF PROTEIN CONJu Ga TION A n D CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods”, en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pp. 187-230 (Wiley-Liss, Inc.
1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide- Derived Antibodies”, en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pp. 60-84 (Cambridge University Press 1995).
Alternativamente, se puede conjugar un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico mediante un resto carbohidrato en la región Fc del anticuerpo. Los métodos para conjugar péptidos con componentes de anticuerpos a través de un resto carbohidrato de anticuerpo son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cancer. 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer. 46:1101-1106 (1990); y Shih et al., patente U.S. N° 5.057.313. El método general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que está cargado con una pluralidad de péptidos. Esta reacción da como resultado un enlace de base de Schiff (imina) inicial, que puede estabilizarse mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.
Sin embargo, si la región Fc está ausente, por ejemplo, si es deseable un fragmento funcional de anticuerpo como se proporciona en el presente documento, todavía es posible unir un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico. Puede introducirse un resto carbohidrato en la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo. Ver, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol., 154:5919 (1995); patentes U.S. Nros. 5.443.953 y 6.254.868. El resto carbohidrato modificado se usa para unir el agente de diagnóstico, el agente detectable o el agente terapéutico.
El agente terapéutico conjugado o fusionado en forma recombinante con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza que se une a GD2 puede elegirse para lograr el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos deseados. Se entiende que está dentro del nivel de pericia de un médico u otro personal médico considerar lo siguiente al decidir qué agente terapéutico conjugar o fusionar de manera recombinante con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la condición del sujeto.
Un conjugado o anticuerpo de fusión o fragmento funcional de la enseñanza que está marcado en forma detectable como se proporciona en el presente documento y se une a GD2 puede usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o controlar una enfermedad, en la que las células que causan o están asociadas con GD2 que expresa la enfermedad. Por ejemplo, como se proporciona en el presente documento, se ha demostrado que las células cancerosas y los tumores expresan g D2 tales como, pero sin limitación, neuroblastoma, osteosarcomas y otros subconjuntos de sarcomas, melanomas, gliomas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama y células madre de cáncer de mama, meduloblastoma y astrocitoma. Otros tipos de sarcomas incluyen, pero sin limitación, sarcoma de tejido blando, condrosarcoma, liposarcoma y leiomiosarcoma. Los sarcomas de tejido blando incluyen, pero sin limitación, sarcoma aveolar de partes blandas, angiosarcoma, sarcoma epitelioide, condrosarcoma extraesquelético, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, tumor del estroma gastrointestinal, liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma.
Por consiguiente, la enseñanza proporciona métodos para detectar cáncer o la formación de un tumor en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un conjugado o anticuerpo de fusión o fragmento funcional de la enseñanza a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el método de detección puede incluir, además, ensayar la expresión de GD2 en las células o una muestra de tejido de un sujeto usando uno o más conjugados o anticuerpos de fusión o fragmentos funcionales de la enseñanza que se unen a GD2; y comparar el nivel de GD2 con un nivel de control, por ejemplo, niveles en muestras de tejido normal (por ejemplo, de un sujeto que no tiene una enfermedad, o del mismo sujeto antes del inicio de la enfermedad), por lo que un aumento en el nivel ensayado de GD2 en comparación con el nivel de control de GD2 es indicativo de la enfermedad. Dichos métodos de diagnóstico pueden permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamientos agresivos antes de lo que sería posible de otra manera, evitando así el desarrollo o la progresión de la enfermedad.
También se puede usar un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza para analizar los niveles de antígeno GD2 en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos como se proporciona en el presente documento o bien como se conoce por los expertos en la técnica (por ejemplo, ver Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.
101: 976-985; y Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Otros métodos a base de anticuerpos útiles para detectar GD2 incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados se conocen en la técnica e incluyen marcadores de enzimas, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
En un aspecto, la enseñanza proporciona la detección y el diagnóstico de enfermedades en un ser humano. En una realización, el diagnóstico incluye: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de un conjugado o proteína de fusión de la enseñanza que se une a GD2; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el conjugado o la proteína de fusión se concentre preferiblemente en los sitios del sujeto donde se expresa GD2 (y, en algunos aspectos, para que el conjugado o la proteína de fusión no unida se aclare al nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo; yd) detectar el conjugado o la proteína de fusión en el sujeto, de manera que la detección del conjugado o de la proteína de fusión por encima del nivel de fondo indique que el sujeto tiene una enfermedad. El nivel de fondo se puede determinar mediante varios métodos que incluyen comparar la cantidad de proteína de fusión o conjugada detectada con un valor estándar previamente determinado para un sistema particular.
Se entiende que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de resto de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico y puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, en el caso de un radioisótopo conjugado con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada de modo normal variará de aproximadamente 5 a 20 milicurios de 99Tc. El conjugado se acumulará entonces preferiblemente en la ubicación de las células que expresan GD2. La formación de imágenes de tumores in vivo se describe en S. W. Burchiel et al., “ Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments” (capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de varias variables, incluido el tipo de agente detectable utilizado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el conjugado se concentre preferiblemente en los sitios del sujeto y para que el conjugado no unido se aclare al nivel de fondo es 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días. En una realización, la monitorización de una enfermedad se lleva a cabo repitiendo el método de diagnóstico como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial o más.
La presencia del conjugado o de la proteína de fusión se puede detectar en el sujeto usando métodos conocidos en la técnica para la exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo de agente detectable utilizado. Un experto en la técnica podrá determinar el método apropiado para detectar un agente detectable particular. Los métodos y dispositivos que se pueden utilizar en los métodos de diagnóstico de la enseñanza incluyen, pero sin limitación, tomografía computada (TC), exploración de cuerpo entero como tomografía por emisión de posición (PET), imagen por resonancia magnética (MRI) y ecografía. En una realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un radioisótopo y se detecta en el sujeto usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación. En otra realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un compuesto fluorescente y se detecta en el sujeto usando un instrumento de exploración que responde a la fluorescencia. En otra realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un metal emisor de positrones, como circonio (89Zr) o cualquier otro metal emisor de positrones proporcionado en el presente documento o que sea bien conocido en la técnica como detectable mediante tomografía por emisión de positrones, y se detecta en el sujeto mediante tomografía por emisión de positrones. En otra realización más, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un marcador paramagnético y se detecta en un sujeto usando formación de imágenes por resonancia magnética (IRM).
En una realización, la enseñanza proporciona una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o un fragmento funcional de la enseñanza y un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable que puede usarse en las composiciones farmacéuticas de la enseñanza incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar conocidos en la técnica, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión de aceite y agua, y varios tipos de agentes humectantes. Estas composiciones farmacéuticas se pueden preparar en formas de dosis unitarias líquidas o en cualquier otra forma de dosificación que sea suficiente para administrar el anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza al área diana del sujeto que necesita tratamiento. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de cualquier manera apropiada para el modo de administración elegido, por ejemplo, intravascular, intramuscular, subcutáneo, intraperitoneal, etc. Otros componentes opcionales, por ejemplo, estabilizadores de grado farmacéutico, tampones, conservantes, excipientes y similares pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la técnica. La preparación de una composición farmacéutica, teniendo debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la pericia del experto en la técnica.
Las formulaciones farmacéuticas que contienen uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza proporcionados en el presente documento se pueden preparar para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetil bencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Los métodos de la enseñanza pueden incluir administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales proporcionados en el presente documento. Las enfermedades que se pueden tratar o prevenir usando los métodos de la enseñanza incluyen cáncer, formación de tumores y/o metástasis. En particular, los métodos de la enseñanza son útiles para tratar cánceres o la formación de tumores en los que las células cancerosas o el tumor expresan GD2. Los ejemplos no limitantes de cánceres o tumores que se pueden tratar o prevenir usando los métodos de la enseñanza incluyen neuroblastoma, osteosarcomas y otros subconjuntos de sarcomas, melanomas, gliomas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, meduloblastoma y astrocitoma. Otros tipos de sarcomas incluyen, pero sin limitación, sarcoma de tejido blando, condrosarcoma, liposarcoma y leiomiosarcoma. Los sarcomas de tejido blando incluyen, pero sin limitación, sarcoma aveolar de partes blandas, angiosarcoma, sarcoma epitelioide, condrosarcoma extraesquelético, osteosarcoma extraesquelético, fibrosarcoma, tumor del estroma gastrointestinal, liposarcoma, tumor maligno de la vaina del nervio periférico, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma. También se sabe que las células madre del cáncer de mama expresan GD2. Battulal VL et al., Ganglioside GD2 identifies breast cancer stem cells and promotes tumorigenesis. J CLIN INVEST. 122(6):2066-2078 (2012).
Por consiguiente, en algunos aspectos, la enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento se une a GD2 y tiene un dominio de cadena pesada variable (VH), en donde el dominio tiene secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos VH CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 26-33 de la SEQ. ID NO: 2; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 26-33 de la SEQ ID NO: 40; la secuencia de aminoácidos de VH CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 51-58 de la SEQ ID NO: 40; y la secuencia de aminoácidos de VH CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 97­ 108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 36; y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En algunos otros aspectos, la enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a GD2 y tiene un dominio de cadena pesada variable (VH), teniendo el dominio VH secuencias de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ iD NO: 6; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 10; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 14; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97­ 108 de la SEQ ID NO: 18; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 22; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 30; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34; los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-110 de la SEQ iD NO: 36; y los residuos 26-33, los residuos 51-58 y los residuos 97-108 de la SEQ ID NO: 40.
En otros aspectos más, la enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a GD2 y tiene un dominio de cadena pesada variable (VH), teniendo el dominio VH una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a GD2 y tiene un dominio de cadena ligera variable (VL), teniendo el dominio VL las secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde la VL CDR1 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27­ 38 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38 de la SEQ ID NO: 42; la VL CDR2 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 55­ 57 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 55-57 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 50-52 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 56-58 de la SEQ ID NO: 42, y la VL CDR3 se selecciona del grupo que consiste en los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 95­ 103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 20; los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42.
En algunos aspectos, la presente enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a GD2 y tiene un dominio de cadena ligera variable (VL), teniendo el dominio VL secuencias de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 4; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 8; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 12; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 16; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ iD NO: 20; los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 24; los residuos 27­ 37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 28; los residuos 27-37, los residuos 55-57 y los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 32; los residuos 27-32, los residuos 50-52 y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y los residuos 27-38, los residuos 56-58 y los residuos 95-103 de la SEQ iD NO: 42.
En algunos otros aspectos, la presente enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento se une a GD2 y tiene un dominio de cadena ligera variable (VL), teniendo el dominio VL una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 40; y el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 42.
En algunas otras realizaciones, la presente enseñanza proporciona un método para tratar el cáncer o la formación de un tumor en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, incluyendo el anticuerpo o fragmento funcional del mismo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en donde el dominio VH y el dominio VL tienen, respectivamente, una secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 42.
Las formulaciones, como las descritas en el presente documento, también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad particular que se esté tratando. En determinadas realizaciones, las formulaciones incluyen un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza y uno o más compuestos activos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Tales moléculas están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede combinar con uno o más de otros agentes terapéuticos. Tal terapia combinada se puede administrar al sujeto de forma simultánea o sucesiva.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento a un sujeto que lo necesita, en el que la composición farmacéutica incluye un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico apropiado puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica como se describe en el presente documento. En un aspecto, el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o un agente inmunoterapéutico.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento contienen cantidades terapéuticamente eficaces de uno o más de los anticuerpos de la enseñanza proporcionada en el presente documento, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas son útiles en la prevención, el tratamiento, el manejo o la mejora de una enfermedad, como el cáncer o la formación de un tumor, o uno o más de sus síntomas.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza. En una realización, los anticuerpos o fragmentos funcionales se formulan en preparaciones farmacéuticas adecuadas, tales como soluciones o suspensiones estériles para administración parenteral. En una realización, los anticuerpos o fragmentos funcionales proporcionados en el presente documento se formulan en composiciones farmacéuticas usando técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms. 4th. Ed., p. 126).
Se puede incluir un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el sujeto tratado. La concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente probando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo usando métodos de rutina y luego extrapolarlos para dosis para humanos. La concentración de un anticuerpo o fragmento funcional en la composición farmacéutica dependerá, por ejemplo, de las características fisicoquímicas del anticuerpo o fragmento funcional, el programa de dosificación y la cantidad administrada, así como de otros factores bien conocidos por los expertos en la técnica.
En una realización, una dosis terapéuticamente eficaz produce una concentración sérica de un anticuerpo o fragmento funcional de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50-100 pg/ml. Las composiciones farmacéuticas, en otra realización, proporcionan una dosis de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 500 mg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal por día. Se pueden preparar formas unitarias de dosificación farmacéutica para proporcionar desde aproximadamente 0,01 mg, 0,1 mg o 1 mg hasta aproximadamente 30 mg, 100 mg o 500 mg, y en una realización de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg del anticuerpo o fragmento funcional y/o una combinación de otros ingredientes esenciales opcionales por forma de unidad de dosificación.
El anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede administrar de una vez, o se puede dividir en varias dosis más pequeñas para administrar a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que se está tratando y se puede determinar empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la afección por aliviar. Debe entenderse, además, que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos en el presente documento son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las composiciones reivindicadas.
Tras mezclar o añadir el anticuerpo o el fragmento funcional de la enseñanza, la mezcla resultante puede ser una solución, suspensión o similar. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluido el modo de administración pretendido y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección tratada y puede determinarse empíricamente.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para la administración a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria, tales como soluciones o suspensiones parenterales estériles que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una realización, el anticuerpo o fragmento funcional puede formularse y administrarse en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Las formas de dosis unitarias se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empaquetadas individualmente como se conoce en la técnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas. Las formas de dosis unitarias se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosis unitaria idénticas empaquetadas en un único recipiente para ser administradas en forma de dosis unitaria segregada. Ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales o botellas de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no están segregadas en el envase.
En una realización, uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza están en una formulación farmacéutica líquida. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o mezclando un anticuerpo o fragmento funcional como se proporciona en el presente documento y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador tales como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar, de ese modo, una solución. Si se desea, la composición farmacéutica a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes similares. Los métodos reales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos o serán evidentes para los expertos en esta técnica; por ejemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
Los métodos para administrar una composición farmacéutica de la enseñanza son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la vía apropiada de administración de una composición farmacéutica puede ser determinada fácilmente por un médico experto. Las vías de administración de ejemplo incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intradérmica o inyección subcutánea. Además, se entiende que la formulación de la composición farmacéutica se puede ajustar fácilmente para adaptarse a la vía de administración. La enseñanza también prevé que, después de la administración de una composición farmacéutica de la enseñanza, se puedan administrar al sujeto dosis retardadas, sucesivas y/o repetidas de una o más composiciones farmacéuticas como se proporciona en el presente documento.
Los métodos de la enseñanza para el tratamiento de una enfermedad están destinados a incluir (1) prevenir la enfermedad, es decir, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha experimentado o mostrar síntomas de la enfermedad; (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. Los métodos de la enseñanza para prevenir una enfermedad están destinados a incluir la prevención de un síntoma clínico indicativo de cáncer o formación de tumores. Tal prevención incluye, por ejemplo, el mantenimiento de indicadores fisiológicos normales en un sujeto. Por lo tanto, la prevención puede incluir el tratamiento profiláctico de un sujeto para protegerlo de la aparición de metástasis tumoral.
La cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica utilizada en los métodos de la enseñanza variará dependiendo de la composición farmacéutica utilizada, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto por tratar, todo lo cual está dentro de la pericia del médico tratante. Un sujeto que puede tratarse mediante los métodos de la enseñanza incluye un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Se entiende que las modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta enseñanza también se proporcionan dentro de la definición de la enseñanza suministrada en el presente documento. Por consiguiente, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la presente enseñanza.
Ejemplo I
Los anticuerpos monoclonales humanos contra GD2 tienen una potente actividad antitumoral
El disialogangliósido GD2 se ha encontrado en un amplio espectro de tumores humanos, que incluyen neuroblastoma, osteosarcomas y otros subconjuntos de sarcomas, melanomas, gliomas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, meduloblastoma y astrocitoma. También se sabe que las células madre del cáncer de mama expresan GD2. Battulal VL et al., Gangliósido GD2 identifica las células madre del cáncer de mama y promueve la tumorigénesis. J Clin Invest. 122 (6): 2066-2078 (2012). Los gangliósidos son dianas ideales para los anticuerpos monoclonales (mAb) debido a la alta densidad de antígenos, la falta de modulación, la homogeneidad relativa en muchos tumores y la posibilidad de regulación positiva por parte de las citoquinas. Por consiguiente, como se describe en el presente documento, se generaron anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos contra GD2. Se seleccionaron varios mAb basándose en ELISA y FACS y se caracterizaron adicionalmente. De los anticuerpos probados, 1B7, 2H12, 2F7, 2E12 y 31F9V2 mostraron altos niveles de citotoxicidad dependiente del complemento en algunas líneas de células cancerosas; 1B7, 31F9, 31F9V2 y 2F7 mostraron altos niveles de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos en algunas líneas de células cancerosas; y la actividad antitumoral también se confirmó en modelos in vivo. En base al potencial de GD2 como un objetivo para el ataque inmunológico y su afinidad, especificidad y funciones efectoras, mAb anti-GD2 tienen utilidad clínica en el tratamiento del cáncer.
Materiales, células y anticuerpos
Antígenos: GD2-PAA-biotina (cat # 0832-BP), GM2-PAA-biotina (cat # 0835-BP) y GD3-PAA-biotina (cat # 0898-BP) se adquirieron de Lectinity (Moscú, Rusia). Tn-PAA-biotina (cat # 01-010), sTn-PAA-biotina (cat # 01-059), TF-PAA-biotina (cat # 01-023) y sLeA-PAA-biotina (cat # 01-044) se adquirieron de Glycotech (Gaithersburg, Md ). GD2-ceramida, GM2-ceramida, GD3-ceramida, Fucosil-GM1-ceramida y Globo-H-biotina se obtuvieron de MSKCC (Nueva York, NY). El péptido-biotina MUC1 (N° de cat. 353951) se adquirió de American Peptide Company (Sunnyvale, CA). La GM3-ceramida (cat # 1503) se adquirió de Matreya (Pleasant Gap, PA). Los antígenos de ceramida se disolvieron en metanol y todos los demás se resuspendieron en PBS a 1 mg/ml.
Líneas celulares: las líneas celulares H524, Lan1-luc, BxPC3, SK-MEL19, ST88, LS141, SaOS2 se obtuvieron de MSKCC (Nueva York, NY). Capan2 (ATCC, HTB-80), DMS79 (ATCC, CRL-2049), Jurkat (ATCC, TIB-152), SK-MEL28 (ATCC, HTB72), HT29, (HTB-38) y MCF7 (ATCC, HTB22) se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). TC-71 (AAC516) se adquirió en Leibniz Institute DSMZ (Braunschweig, Alemania).
Generación de hibridomas productores de mAb anti-GD2 y líneas celulares linfoblastoides (LCL): se obtuvieron muestras de sangre de pacientes en ensayos con vacuna conjugada GD2-/GD3-KLH en pacientes con melonama y vacuna trivalente GD2-/GD3-/GM2-KLH en pacientes con sarcoma. El ensayo de fase I de melanoma se realizó en MSKCC, mientras que el ensayo de sarcoma fue un estudio de fase II ciego y multicéntrico. Todas las muestras se obtuvieron según el protocolo iRb e IND respectivo institucional y aprobado por la FDA. Se aislaron células B humanas de aproximadamente 80-90 ml de sangre mediante el cóctel de enriquecimiento de células B humanas RosetteSep (cat # 15024, StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá) usando centrifugación en gradiente en Histopaque-1077 (cat # 10771, Sigma, St Louis, MO). Las células B se cultivaron en medio RPMI-1640 (cat # 10-040-CV, Mediatech, Manassas, VA) suplementado con L-Glutamina (cat # 25030081, Life Technologies, Carlsbad, CA), aminoácidos no esenciales (cat. # NE-01), piruvato de sodio (cat # SP-90), vitamina (cat # ME-30), penicilina/estreptomicina (PS-20), 10% de FBS (cat # FB-01) de Omega Scientific, Tarzana, CA, y una mezcla de estimulantes y citoquinas. De cinco a siete días después, las células se fusionaron mediante electrofusión con células de mieloma P3X63Ag8.653 (N° de cat. PTA-8434, ATCC, Manassas, VA). Se generaron LCL infectando la célula B con EBV (sobrenadante de cultivo B95-8) en presencia de IL2 y R848 o PS2006. Los hibridomas y LCL que producen anti-GD2 se identificaron usando un ELISA específico de GD2.
ELISA: Para los antígenos biotinilados: 50 p/pocillo de NeutrAvidin (cat # 31000, Thermo Scientific, Rockford, IL) se revistió en la placa ELISA (cat # 655061, Greiner Bio-One, Monroe, NC) a 4 pg/ml y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. La placa se bloqueó con albúmina de suero humano al 1,25% (HuSA) (cat # HA25S, Monobind, Lake Forest, CA) durante 2 horas a t A o 4 °C, O/N. Después de lavar la placa con Tween/PBS al 0,05% (PBS-T al 0,05%) dos veces, se añadieron 50 pl/pocillo de antígeno biotinilado (concentración final a 2 pg/ml en PBS) o PBS y se incubó a TA durante 30 min o 4 °C, O/N. La placa se lavó dos veces con PBS-T y se incubó con 100 pl/pocillo de mAb purificados diluidos en HuSA al 1,25% a 2 pg/ml durante 1 hora a TA. Después de lavar la placa con PBS-T al 0,05% tres veces 100 pl/pocillo de anticuerpo secundario, se añadió IgG o IgM antihumana conjugada con fosfatasa alcalina (dilución 1:3000 en HuSA al 1,25%, cat # 075-1002 y cat # 075-1003, respectivamente, Kp L, Gaithersburg, Maryland) y se incubó a TA durante 1 hora. La placa se lavó cuatro veces con PBS-T al 0,05%. Se añadieron cien pl/pocillo de sustrato pNPP (N° de cat. PI34045, Thermo Scientific, Rockford, IL) y se incubaron a TA durante 1 hora y la reacción se detuvo con 25 pl/pocillo de NaOH 2N.
Para los antígenos de ceramida: 50 pl/pocillo de antígeno de ceramida (concentración final a 5 pg/ml en EtOH) o EtOH se revistió en la placa de 96 pocillos (cat # 269620, Thermo Scientific, Rockford, IL) y se incubó a TA durante 2 horas. La placa se lavó una vez con PBS y se bloqueó con HuSA al 2,5% a TA durante 2 horas o 4 °C, O/N. La placa se lavó una vez con PBS y se incubó con 100 pl/pocillo de mAb purificados diluidos en HuSA al 1,25% a 2 pg/ml durante 1 hora a TA. La placa se lavó dos veces con PBS antes de añadir el segundo anticuerpo como se describió anteriormente. La placa se lavó tres veces con PBS-T al 0,025% antes de añadir el sustrato.
FACS: Las células se resuspendieron en 200 pl/tubo de PBS/BSA al 1% (N° de cat. A3059, Sigma, St. Louis, MO) a 0,25 x 106 células/ml. Se añadió mAb purificado al tubo a 2 mg/ml para IgG o 5 mg/ml para IgM y se incubó durante 40 min a 4 °C. Después de lavar con PBS/BSA al 1% una vez, se añadieron 200 pl de anticuerpo conjugado con fluoróforo, Alexa488-anti-IgG humana (cat # H10120, Life Technologies, Carlsbad, CA) o Alexa488-anti-IgM humana (cat # A21215, Life Technologies, Carlsbad, CA) al tubo y se incubó durante 40 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con PBS/BSA al 1% y se analizaron con el software Guava ExpressPro utilizando el sistema Guava Personal Cell Analysis-96 (PCA-96) (Millipore, Billerica, MA).
Determinación de la afinidad: las constantes de afinidad se determinaron usando el principio de resonancia de plasma superficial (SPR) con un BiaCore 3000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se obtuvo GD2-poliacrilamida (GD2-PAAbiotina) marcada con biotina sintetizada personalizada de Lectinity Holdings Inc (Moscú, Rusia) y se acopló a un chip biosensor recubierto de estreptavidina (SA; Cat # BR100398) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una celda de flujo bloqueada con HSA y medio de cultivo que contenía biotina libre se usó como celda de referencia. Los parámetros cinéticos de unión se determinaron a partir de varias concentraciones conocidas de anticuerpo diluido en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,005%) usando la celda de flujo recubierta con GD2-PAA-biotina. Se utilizó el software de ajuste de curvas proporcionado por el instrumento BiaCore para calcular las tasas de asociación y disociación.
Ensayo CDC: Las células se lavaron con PBS dos veces, se resuspendieron en 1 ml de PBS a 106 células/ml/tubo y se incubaron con 12,5 pl/tubo de Calceína AM (1 mg/ml en DMSO) (cat # C3100MP, Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 °C durante 30 min. Las células marcadas se lavaron con medio que contenía FBS al 10% (medio completo) (cat # FB-12, Omega Scientific, Tarzana, CA) dos veces y se resuspendieron en 1 ml de medio completo. Las células marcadas (50 pl/pocillo) se incubaron con 100 pl de pocillo de mAb diluido en medio completo durante 15 min a 4 °C. Se añadieron a los pocillos 50 pl/pocillo de complementos humanos (cat # IPLA-CSER, Innovative Research, Novi, MI) diluidos en medio completo y se incubaron a 37 °C durante 90 min. La dilución final apropiada para el complemento humano fue predeterminada para cada línea celular (entre 1:5 y 1:16). Después de una centrifugación a 1600 rpm durante 8 min, el sobrenadante (100 pl/pocillo) se transfirió a una nueva placa de fluorescencia de 96 pocillos (N° de cat. 7605, Thermo Scientific, Rockford, IL). Cada muestra se evaluó por triplicado. Las muestras de control que reciben NP40 se utilizan para determinar la muerte máxima y las muestras que reciben el complemento solo sirven como línea de base. El porcentaje de células muertas se determina mediante unidades fluorescentes relativas y se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: % muertas = (% de muestra - % de complemento solo)/(% de NP40 - % de complemento solo)*100.
Ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos: El kit básico de bioensayo ADCC Reporter (N° de cat. G7010) se adquirió de Promega (Madison, WI) y el ensayo se realizó de acuerdo con el manual de instrucciones. Brevemente, las células efectoras (Jurkat del kit básico) y las células diana que expresan el antígeno GD2 se lavaron y resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía suero de IgG bovino bajo al 10% (kit básico) a 3 x 106 células/ml y 0,5 x 106 células/ml, respectivamente. Las células diana (12.500 células/25 pl/pocillo) se incubaron con 25 pl/pocillo de mAb anti-GD2 (concentración final a 5 pg/ml) o solo medio, y las células efectoras (75.000/25 pl/pocillo) durante 17 horas a 37 °C. Se añadieron 100 ml/pocillo de sustrato de ensayo de luciferasa Bio-Glo (kit de núcleo) y se incubó durante 10 min. La unidad de luz relativa (RLU) se midió mediante un luminómetro Synergy 2 (BioTek, Winooski, VT). Las células efectoras y los pocillos de solo medio sirvieron como RLU de línea de base. Cada muestra se analiza por triplicado.
Ensayo de internalización: se evaluó la internalización de anticuerpos anti-GD2 midiendo la actividad citotóxica del complejo mAb y conjugado secundario Hum-ZAP (cat # IT22, Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) contra líneas celulares que expresan GD2, H524 y Lan1-luc. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (2000 células/90 pl/pocillo) y se incubaron durante la noche por duplicado. El anticuerpo anti-GD2 se incubó con conjugados secundarios de Hum-ZAP a TA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se añadieron a las células 10 pl/pocillo de mAb y complejo Hum-ZAP y se incubaron durante 3 días. La concentración final del mAb fue de 10 pg/ml. El ensayo se realizó por triplicado. Se añadieron 25 pl de solución de bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (N° de cat. M5655, Sigma, St Louis, MO) (5 mg/ml en PBS) a cada pocillo y se incubó a 37 °C. Después de 2 horas de incubación, se añadieron 100 pl/pocillo de solución de solubilización (SDS al 20%/N,N-dimetilformamida al 50%, N° de cat. D4551, Sigam, St Louis, MO) a cada pocillo y se incubaron durante otras 4 horas a 37 °C. La DO se midió a 570/690 nm y los valores obtenidos con medio solo se utilizaron para la sustracción del fondo de la placa. Se utilizaron tres cultivos paralelos sin anticuerpo para normalizar los valores de la muestra (muestra/media sin tratar*100).
Ensayo de internalización usando una sonda fluorescente intracelular sensible al pH: Se conjugaron fragmentos F(ab')2 de IgG antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch, N° de cat. 109-006-006) con colorante reactivo de pHAb amina (Promega, N° de cat. G9841) según el protocolo del fabricante. pHAb es un tinte sensor de pH que muestra fluorescencia solo a pH ácido, que se encuentra cuando las células absorben los anticuerpos en sus lisosomas. En resumen, anticuerpo primario (1B7, 31F9, 5A7G3 o sin mAb como control de reactivo) a 6 pg/ml (200 pl/tubo) y anti-IgG humana F(ab')2-pHAb a 4,5 pg/ml (200 pl/tubo) se incubaron a TA durante 20 min. Las células H524 o TC-71 se resuspendieron en RPMI1640 FBS al 10% Glutamina medio P/S a 1,5 x 106 células/ml. Se añadieron doscientos pl de células a la mezcla de anticuerpo primario más secundario y se incubaron durante 40 min a 4 °C. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 0,5 ml de medio de cultivo, se distribuyeron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C, 5% de CO2. Se tomaron muestras a 1 hora, 2 horas, 4 horas y 24 horas para el análisis de citometría de flujo utilizando el software Guava Express Pro para determinar el porcentaje de células positivas.
Modelo de trasplante de xenoinjerto: se obtuvieron células SaOS2 de osteosarcoma de ATCC (Cat # HTB-85; Manassas, VA) y se compraron ratones CB17 SCID hembra (5-8 semanas de edad) de Taconic (Germantown, NY). Se inyectaron células SaOS2 (1 x 106) en 0,1 ml de medio de crecimiento completo a través de la vena de la cola el día 0 usando una jeringa de insulina BD con aguja 28G (BD, Franklin Lakes, NJ) en 10 animales por grupo. Se inyectaron 200 mg de mAb (1B7 o 31F9) por vía intraperitoneal los días 1, 4, 8, 11, 14, 21 y 28 después de la inyección de células tumorales. La supervivencia se controló diariamente y se generaron curvas de supervivencia de KaplanMeier usando GraphPad Prism 6.05 (GraphPad Software, San Diego, CA).
Se obtuvieron células TC-71 de sarcoma de Ewing de Leibniz-Institute DSMZ GmbH (Braunschweig, Alemania) y se cultivaron como se recomienda. Se inyectaron células TC-71 (0,1 x 106) en 0,1 ml de matriz de membrana base BD Matrigel™ (Becton Dickinson Bioscience) por vía subcutánea en el flanco trasero derecho de ratones hembra CB17 SCID (5-8 semanas de edad) el día 0, 5 ratones por grupo. Se inyectaron 200 |jg de mAb (1B7 o 31F9) por vía intraperitoneal los días 1, 4, 8, 11, 14, 21 y 28 después de la inyección de células tumorales. Los animales del grupo de control recibieron inyecciones simuladas con PBS. Se controló el crecimiento tumoral de los ratones dos veces por semana y se midió el tamaño del tumor con un calibre. El volumen del tumor (mm3) se calculó como largo*ancho*ancho*0,5.
Todos los procedimientos se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee.
Clonación de ADNc de inmunoglobina y expresión de anticuerpos recombinantes: se recuperó la región variable de ADNc de cadena pesada y ligera de mAb humano mediante RT-PCR de la línea celular de hibridoma individual o LCL y se subclonó en el vector de expresión de cadena pesada de IgG1 o IgM, o de cadena ligera de IgK o IgL como se describió anteriormente. Sawada-Hirai, R., et al. Human antianthrax protective antigen neutralizing monoclonal antibodies derived from donors vaccinated with anthrax vaccine adsorbed. J IMMUNE BASED THER VACCINES 2(1): 5 (2004). El vector de expresión de cadena pesada o cadena ligera de Ig se digirió doblemente con Not I y Sal I, y luego se ligaron ambos fragmentos para formar un vector de expresión génica dual. Se transfectaron células CHO en placas de 6 pocillos con el vector de expresión génica dual usando Lipofectamine 2000 (N° de cat. 11668019, Life Technologies, Carlsbad, CA). Después de 24 horas, las células transfectadas se transfirieron a una placa de 10 cm con medio de selección [DMEM suplementado con FBS dializado al 10% (cat # 26400044, Life Technologies, Carlsbad, CA), L-metionina sulfoximina 50 mM (MSX, cat # M5379, Sigma, St Louis, MO), suplemento de GS (cat # 58762C, Sigma, St Louis, MO) y penicilina/estreptomicina (cat # PS-20, Omega Scientific, Tarzana, CA)]. Dos semanas más tarde, se aislaron y expandieron transfectantes resistentes a MSX. Se seleccionaron clones de alta producción de anticuerpos anti-GD2 midiendo los niveles de anticuerpos en los sobrenadantes en un ensayo ELISA específico de GD2 y se expandieron para producciones de mAb en gran escala.
Resultados
Generación de anticuerpos recombinantes: Las regiones variables de cadena pesada y ligera de 11 anticuerpos seleccionados se recuperaron mediante RT-PCR y se clonaron en vectores de expresión de cadena pesada de IgG o IgM de longitud completa, o IgK o IgL de cadena ligera. El análisis de secuencia molecular usando IMGT/V-Quest (Brochet et al., Nucleic Acids Res., 36: W503-8 (2008)) reveló que los nueve anticuerpos anti-GD2 humanos seleccionados se derivaron de tres familias de VH diferentes y todos usaron cadenas kappa ligeras. Estos anticuerpos IgG mostraron diferentes secuencias de CDR con 5, 7, 8, 9, 10 o 20 mutaciones que se desvían de la línea germinal, respectivamente (Figuras 1-14, 17-21; Tabla 3). El anticuerpo IgM (2E12) también utiliza la cadena kappa ligera y tiene 3 mutaciones de cadena pesada (Figuras 15-16; Tabla 3). Los anticuerpos recombinantes se produjeron en líneas celulares CHO en un sistema de biorreactor de ondas y se purificaron usando proteína A o cromatografía de hidroxiapatita para IgG e IgM, respectivamente. Los anticuerpos recombinantes purificados retuvieron las propiedades de los anticuerpos originales derivados del hibridoma con respecto a la unión y especificidad de ELISA.
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Especificidad de unión: en los ensayos ELISA específicos de antígeno, siete anticuerpos humanos anti-GD2 (1B7, 2H12, 1G2, 2F7, 2E12, 31F9 y 32E2) mostraron una fuerte reactividad contra el conjugado de GD2-PAA, pero no contra GD3-PAA, Globo-H, MUC1, Tn-PAA, sTn-PAA, TF-PAA o SleA-PAA. Tres anticuerpos (1B7, 2H12 y 2F7) también mostraron actividad cruzada con los conjugados de GM2-PAA. De manera similar, los siete anticuerpos también demostraron una fuerte reactividad con el conjugado de GD2-ceramida (GD2-cer), pero no con el conjugado de GD3-ceramida (GD3-cer), el conjugado de F-GM1-ceramida (F-GM1-cer) o conjugado de GM3-ceramida (GM3-cer).
Tabla 4: Unión de anticuerpos anti-GD2 medida por ELISA
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Especificidad de unión por ELISA a 2 pg/ml; * IgM
Análisis de la unión a células tumorales: la unión a la superficie celular es crucial para la actividad citotóxica y, por lo tanto, se probó a continuación para los anticuerpos anti-GD2 1B7, 2H12, 1G2, 2f 7, 2E12, 31F9 y 32E2. La citometría de flujo mostró una fuerte unión de los siete anticuerpos a H524, una línea celular de cáncer de células pequeñas, a Lan1-Luc, una línea celular de neuroblastoma, a Hs527T, una línea celular de cáncer de mama y a TC7l y SaOS2, dos líneas celulares de sarcoma. También se detectó unión positiva entre algunos de los siete anticuerpos y otras líneas de células cancerosas, incluidas células de cáncer de páncreas, células de leucemia de células T aguda, células de melanoma y otras células de sarcoma (Tabla 5).
Tabla 5: Unión de mAbs anti-GD2 a diferentes líneas celulares
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* IgM, 2 |jg/ml
Medidas de afinidad: La afinidad/avidez relativa de la unión a GD2 se probó mediante SPR usando un chip biosensor recubierto de estreptavidina para capturar GD2-PAA biotinilado (Tabla 6).
Tabla 6: Parámetros cinéticos para mAbs anti-GD2
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Actividad de CDC: para evaluar la actividad funcional de 1B7, 2H12, 1G2, 2F7, 2E12, 31F9, 31F9V2 y 32E2, probamos su actividad citotóxica con cuatro células diferentes (H524, Lan1-Luc, Jurkat y TC-71) en presencia de suero humano como fuente de complemento. 1B7 mostró una actividad destructora cercana al 100% a l0 jg/m l en tres de las cuatro células analizadas. 2H12, 2F7, 31F9V2 y 32E2 mostraron niveles significativos de actividad CDC hacia algunas líneas celulares. 2E12, un anticuerpo IgM, mostró cerca del 100% de actividad destructora a 5 jg/m l para H524, Lan1-Luc y TC-71, lo que se esperaba porque se sabía que los anticuerpos IgM eran más efectivos en los ensayos de citotoxicidad mediada por el complemento.
Tabla 7: Citotoxicidad dependiente del complemento
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Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos: aunque 2E12 fue más potente en el ensayo de CDC, se sabía que los anticuerpos IgG tenían actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), que es importante para la destrucción de tumores in vivo. Se probaron seis anticuerpos IgG anti-GD2 (1B7, 31F9, 31F9V2, 1G2, 2F7 y 32E2) con cinco líneas celulares diferentes (SaOS2, H524, Hs578T, TC71). El tratamiento con medio solo se utilizó como control. Se midieron altos niveles de citotoxicidad usando anticuerpos 1B7, 31F9,

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a GD2, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende una combinación de dominio variable de cadena pesada (VH) y dominio variable de cadena ligera (VL) seleccionados de las siguientes combinaciones (i) a (viii):
(i) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 2, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la Se Q ID NO: 4;
(ii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 6; y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la Se Q ID NO: 8;
(iii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la Se Q ID NO: 10, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-38, los residuos 56-58, y los residuos 95-103 de la Se Q ID NO: 12;
(iv) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-109 de la SEQ ID NO: 26, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la Se Q ID NO: 28;
(v) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la Se Q ID NO: 30, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-37, los residuos 55-57, y los residuos 94-102 de la Se Q ID NO: 32;
(vi) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-110 de la SEQ ID NO: 34, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-32, los residuos 50-52, y los residuos 89-97 de la s Eq ID NO: 38;
(vii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-110 de la Se Q ID NO: 36, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-32, los residuos 50-52, y los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38; y
(viii) el dominio VH que comprende VH CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 26-33, los residuos 51-58, y los residuos 97-108 de la Se Q ID NO: 40, y el dominio VL que comprende VL CDR1, CDR2 y CDR3 de acuerdo con los residuos 27-38, los residuos 56-58, y los residuos 95-103 de la SEQ ID NO: 42.
2. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo se selecciona del grupo que consiste en:
(i) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 2 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 4;
(ii) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 6 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 8;
(iii) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 10 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 12;
(iv) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 26 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 28;
(v) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 30 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 32;
(vi) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 34 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 38;
(vii) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 36 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 38; y
(viii) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende el dominio VH de la SEQ ID NO: 40 y un dominio VL de la SEQ ID NO: 42.
3. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.
4. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho fragmento funcional de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo y un minicuerpo.
5. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho anticuerpo es un isótopo de IgG o IgM.
7. El anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha IgG es una IgG1 de subclase 1.
8. Un conjugado que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 conjugado o fusionado en forma recombinante con un agente de diagnóstico, o un agente detectable o un agente terapéutico.
9. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en un método de detección de un tumor en un sujeto que lo necesita, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo se conjuga o fusiona en forma recombinante con un agente detectable.
10. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo está conjugado o fusionado en forma recombinante con un agente terapéutico.
11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 10, y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso como medicamento.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde las células de dicho cáncer expresan GD2.
14. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en neuroblastoma, osteosarcomas y otros subconjuntos de sarcomas, melanomas, gliomas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de mama, meduloblastoma y astrocitoma.
15. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde dicho tratamiento comprende administrar concurrente o sucesivamente un segundo agente terapéutico.
16. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicho segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o un agente inmunoterapéutico.
17. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
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