ES2880709T3 - Acidos nucleicos que codifican anticuerpos humanos contra Sialyl-Lewis A - Google Patents

Acidos nucleicos que codifican anticuerpos humanos contra Sialyl-Lewis A Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a Sialyl-Lewisa e induce la actividad de ADCC o CDC, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en el que dicho dominio de VH y dicho dominio de VL comprenden respectivamente una secuencia de aminoácidos de los residuos 20- 142 de SEQ ID NO: 2 y residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos que codifican anticuerpos humanos contra Sialyl-Lewis A
Antecedentes
La presente enseñanza se refiere en general a anticuerpos dirigidos contra Sialyl-Lewisa (sLea), y más específicamente a polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-sLea y los correspondientes anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos.
El carcinoma de páncreas es uno de los adenocarcinomas más agresivos y, a menudo, se asocia con un mal pronóstico. El carcinoma de páncreas se ubica como la cuarta causa principal de mortalidad por cáncer. A pesar de los avances en el cribado de diferentes carcinomas, la fiabilidad de la detección de lesiones malignas derivadas del páncreas sigue siendo escasa. La tomografía por emisión de positrones con fluorodesoxiglucasa (FDG-PET) está indicada para la detección y estadificación del cáncer de páncreas. Sin embargo, la FDG-PET es insensible para diferenciar la pancreatitis de la malignidad y sigue siendo problemática en la estadificación de pequeñas lesiones primarias (<7 mm) y metástasis hepáticas (<1 cm). Un método de cribado de diagnóstico usado para controlar el estado de los pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) incluye la detección de niveles elevados de antígeno sLea circulante en el suero. Los pacientes con > 37 U/ml de antígeno sLea circulante indican recurrencia del cáncer. Sin embargo, el desarrollo de herramientas de diagnóstico alternativas que usan tales carbohidratos específicos de tumores ha sido lento.
La administración pasiva de anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos de tumores puede eliminar las células tumorales y las metástasis tempranas durante el desarrollo del cáncer. Este tratamiento también puede tener un impacto significativo en la recurrencia del cáncer. Los anticuerpos dirigidos contra carbohidratos específicos de tumores pueden ser candidatos útiles en este tratamiento contra el cáncer. Por ejemplo, se ha demostrado que muchos anticuerpos monoclonales restringidos a tumores resultantes de la inmunización de ratones con células cancerosas humanas se dirigen contra antígenos de carbohidratos expresados en la superficie celular como glicolípidos o glicoproteínas. Se ha demostrado que los carbohidratos sLea se expresan en tumores del tracto gastrointestinal. También se ha demostrado que la expresión de sLea afecta el potencial metastásico y se correlaciona con un mayor potencial metastásico en el cáncer de colon humano y el adenocarcinoma de páncreas. Sin embargo, la química de los carbohidratos ha sido bastante desafiante y el desarrollo clínico de anticuerpos que reconocen tales carbohidratos específicos de tumores ha sido lento. Los documentos de la técnica anterior Shitara et al. 1991 (Anticancer Res. 11: 2003-2014), Girgis et al. 2011 (Int. J. Mol. Imaging 2011: 1-9), Girgis et al. 2011 (J. Surg. Res. 170: 169-178), y van Heel & Suresh 1989 (Can. Letters 48: 85-100) mencionan diversos conjugados de anticuerpos o anticuerpos marcados que se unen a sLea. Sin embargo, ninguno de estos documentos proporciona un anticuerpo y muestra que este anticuerpo es terapéuticamente activo al matar células por ADCC o CDC.
De este modo, existe la necesidad de identificar y generar anticuerpos que reconozcan específicamente los carbohidratos específicos del tumor, tales como sLea, para el tratamiento de cánceres recurrentes. Esta enseñanza satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en las enseñanzas generales que se describen a continuación en este documento y se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Sumario de la enseñanza
De acuerdo con la presente enseñanza, se proporcionan en este documento composiciones para producir anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que se unen a sLea. Las composiciones incluyen un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en este documento. El polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de ácido nucleico proporcionada en este documento, en el que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio de VH del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
En otra realización de la enseñanza, el polinucleótido aislado puede codificar un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en este documento. El polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de ácido nucleico proporcionada en este documento, en el que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio de VL del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
Las composiciones de la enseñanza también incluyen un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo se une a sLea. En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en este documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos proporcionada en este documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye tanto un dominio de VH como un dominio de VL, donde el dominio de VH y el dominio de VL incluyen respectivamente una secuencia de aminoácidos para los respectivos dominios de VH y VL de los aislados clonales proporcionados en este documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un conjugado que tiene un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en este documento que está conjugado o fusionado de forma recombinante con un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En algunos aspectos de la enseñanza, un conjugado de la enseñanza que incluye un agente detectable se puede usar en un método de detección y/o de diagnóstico la formación de tumores es un sujeto. Tales métodos pueden incluir administrar una cantidad eficaz del conjugado a un sujeto que lo necesite.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona composiciones farmacéuticas que tienen uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la enseñanza también proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la enseñanza. En otro aspecto más, la enseñanza proporciona la administración de un segundo agente terapéutico de forma concurrente o sucesiva con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena pesada variable (VH) del clon 5B1 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 5B1 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena pesada variable (VH) del clon 9H3 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 9H3 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena pesada variable (VH) del clon 5H11 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 5H11 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena pesada variable (VH) del clon 7E3 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada del dominio de la cadena ligera variable (VL) del clon 7E3 y una secuencia líder que se puede usar para la expresión recombinante. La porción superior de la figura muestra un alineamiento entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. También se identifican las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3).
La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada de un diacuerpo designado 5B1CysDb que tiene CDR1, CDR2 y CDR2 de los dominios de cadena variable pesada (VH) y variable ligera (VL) del clon 5B1. La porción superior de la figura muestra una alineación entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) para los dominios de VH y VL se identifican en negrita y subrayado. La secuencia del enlazante y la etiqueta de polihistidina (Poly His-Tag) con aminoácidos agregados también se indican mediante texto en cursiva y subrayado.
La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada de un diacuerpo designado 7E3CysDb que tiene CDR1, CDR2 y CDR2 de los dominios de cadena variable pesada (VH) y variable ligera (VL) del clon 7E3. La porción superior de la figura muestra una alineación entre la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) para los dominios de VH y VL se identifican en negrita y subrayado. La secuencia del enlazante y la etiqueta de polihistidina (Poly His-Tag) con aminoácidos agregados también se indican mediante texto en cursiva y subrayado.
La figura 11, paneles A-E, muestran la unión de anticuerpos humanos anti-sLea a células tumorales analizadas por citometría de flujo. El panel A muestra células DMS-79 teñidas con anticuerpos recombinantes (r) 5B1, 9H3, 5H11 y 7E3. Los paneles B-F muestran respectivamente células HT29, BxPC3, SW626, SK-MEL28 y Colo205-luc teñidas con 1-2 |ig/mL de r5B1 o r7E3 más IgG o anticuerpo secundario específico de IgM como se describe en el ejemplo I.
La figura 12, paneles A y B, muestran la actividad CDC de los anticuerpos r5B1 y r7E3 en comparación con 121SLE murino (IgM) en presencia de complemento humano (Hu C') medido contra las células DMS-79. Los anticuerpos de control de isotipo humano, Hu IgG (0) y Hu IgM (♦) mostraron una citotoxicidad < 4 %. En el panel A se muestra una respuesta a la dosis de anticuerpos r5Bl IgG (■), r7E3 IgM (•) y 121SLE mIgM (▲). La EC50 calculada (|ig/ml) para anticuerpos r5B1 (IgG), r7E3 (IgM) y 121SLE (mIgM) se muestra en el panel B.
La figura 13, paneles A-C, muestran la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de los anticuerpos r5B1. El panel A muestra ADCC mediada por r5B1 con PBMC humanas contra células DMS-79. Las PBMC se probaron en proporciones E:T desde 100:1 a 12.5:1 con células tumorales DMS-79 en presencia o ausencia de 2 |ig/ml de r5B1. El panel B muestra ADCC mediada por r5B1 con células NK humanas primarias contra células DMS-79. Las células NK se probaron a proporciones E:T más bajas desde 5:1 a 0.6:1 con células tumorales DMS-79 en presencia o ausencia de 2 |ig/ml de r5B1. El panel C muestra la ADCC de r5B1 a diversas concentraciones con PBMC de 2 donantes en una proporción E:T de 1:100 con células tumorales DMS-79 en presencia de las concentraciones indicadas de r5B1.
La figura 14 muestra la internalización de sLea en células BxPC3. Se cultivaron células tumorales pancreáticas BxPC3 en presencia de anticuerpos r5B1 (anti-sLea) o r1B7 (anti-GD2) complejados con Hum-ZAP, una IgG antihumana conjugada con saporina. Después de 3 días, se midió la viabilidad de las células usando un ensayo de bromuro de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y los valores de la muestra se normalizaron a los valores de cultivos no tratados.
La figura 15 muestra la actividad del anticuerpo r5B1 en un modelo de xenoinjerto usando células Colo205-luc. Los ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID) (5 por grupo) recibieron 0.5 millones de células Colo205-luc mediante inyección en la vena de la cola el día 0. Los ratones recibieron 100 |ig de r5B1 mediante inyección intraperitoneal los días 1, 7, 14 y 21 (experimento 1, Exp1) o en los días 1, 4, 7, 10, 14 y 21 (experimento 2, Exp2) para una dosis total de 600 |ig. Los animales de control (Ctrl) recibieron inyecciones simuladas de PBS.
La figura 16 muestra el efecto de r5B1 sobre tumores Colo205-luc en ratones SCID. Los ratones recibieron 100 |ig (▼), 300 |ig (■) o 1 |ig (♦) de anticuerpo r5B1 por inyección como se describe en el ejemplo I. Los animales de control (■) recibieron inyecciones simuladas de PBS.
La figura 17 muestra la formación de imágenes de fluorescencia de cinco ratones por grupo para ratones tratados con r5B1 que tenían tumores Colo205-luc en el día 0 y la semana 5. Los ratones recibieron el régimen de tratamiento representado en la figura 16 y descrito en el Ejemplo I.
La figura 18, paneles A y B, muestra la actividad antitumoral en un modelo de xenoinjerto subcutáneo terapéutico usando células DMS-79. El panel A muestra la supresión o regresión de ratones tratados con 5B 1 (5B1 solo (▲) o 5B1 cRGD (▼)) en comparación con IgG humana (IgG sola (♦) o IgG cRGD (•)) y control inyectado con PBS (■). Las flechas indican los días de inyecciones de anticuerpos o PBS. El panel B muestra imágenes representativas de ratones tratados. Las flechas indican la ausencia de cualquier tumor visual.
La figura 19, paneles A-F, muestran la unión de 5B1 a diversos tipos de tumores. El panel A es un adenocarcinoma ductal de páncreas, tumor en estadio III. El panel B es un tumor de carcinoma en estadio IIIB de colon sigmoide. El panel C es un adenocarcinoma de pulmón en estadio IB. El panel D es un adenocarcinoma mucinoso de vejiga urinaria en estadio IV. El panel E es un carcinoma metastásico de ovario de un tumor de colon. El panel F es un carcinoma metastásico de ganglio linfático, tumor en estadio IIIA.
La figura 20 muestra imágenes de proyección de intensidad máxima (MIP) de PET en serie adquiridas de 2-120 h con anticuerpo 5B1 radiomarcado con 89Zr (89Zr-5B1) administrado por vía intravenosa a ratones SCId hembra implantados subcutáneamente con tumores pancreáticos BxPC3. Las imágenes de PET-MIP demuestran una alta absorción tumoral con eliminación del trazador unido de forma no específica a las 24 horas posteriores a la inyección (h p.i.)
La figura 21 muestra resultados de biodistribución que están de acuerdo con los datos de PET de la figura 20, con una absorción tumoral observada de 84.73±12.28 % de ID/g. Debido a los pequeños pesos de los tumores, en el gráfico insertado se muestra un gráfico de la absorción tumoral expresada como % de ID frente al tiempo. El % de ID del tumor muestra una absorción tumoral significativa por parte de 89Zr-5B1 en todos los puntos de tiempo y es al menos siete veces mayor que la 89Zr-IgG inespecífica. La inhibición competitiva con 5B1 frío (200 |ig) muestra una disminución en la acumulación de tumores.
La figura 22, paneles A-C, muestran imágenes de PET-MIP de xenoinjertos de DMS79 (Panel A) y Colo205-luc (Panel B) que llevan ratones. Está indicada la delineación de imágenes PET-MIP del tumor (T), corazón (H) e hígado (L) por 89Zr-5B1. El modelo de xenoinjertos colorrectal Colo205-luc muestra un pico de acumulación de 89Zr-5B1 a las 24 h, que eventualmente disminuye mientras se exhibe un aumento en la unión no específica al hígado (Panel C).
La figura 23 muestra una inhibición y regresión dependiente de la dosis del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de células pequeñas de pulmón DMS-79 tratado con coadministración sucesiva de anticuerpo 5B1 y Taxol (Paclitaxel). Las flechas grandes en el eje X indican el tratamiento con 5B1. La coadministración de anticuerpo 5B 1 y Taxol limitó significativamente el crecimiento tumoral y dio como resultado la regresión del tumor en comparación con la IgG humana de control (HuIgG) o el anticuerpo 5B 1 y Taxol administrados individualmente. Se indican diferencias significativas con respecto al control mediante ANOVA bidireccional en p <0.01 (**) y p <0.001 (***). N=5.
La figura 24 muestra la inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de carcinoma pancreático BxPc3 tratado con coadministración sucesiva de anticuerpo 5B1 y Taxol (Paclitaxel). Las flechas grandes en el eje X indican el tratamiento con Taxol más 5B1, mientras que las flechas pequeñas indican el tratamiento con 5B1 solo. La coadministración de anticuerpo 5B1 y Taxol limitó significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los controles (PBS - Ctrl; IgG humana - HuIgG) o anticuerpo 5B1 y Taxol administrados individualmente.
La figura 25, paneles A y B, muestran imágenes representativas de ratones que fueron trasplantados ortotópicamente con xenoinjertos de tumor pancreático BxPC3-luc. Panel A: el coregistro de FDG-PET y tomografía computarizada (CT) (izquierda) y las secciones planas de FDG-PET solamente (derecha) mostraron una detección de tumor mínima del trazador con una alta absorción en tejidos altamente metabólicos (esto es, corazón, H y vejiga, B). Panel B: La imagen de PET de anticuerpo 5B1 radiomarcado con 89Zr adquirido (89Zr-5B1) del mismo ratón registrado conjuntamente con CT mostró una detección de tumor excepcional de los xenoinjertos de tumor BxPC3-luc.
Descripción detallada
Los carbohidratos expresados en la superficie de las células tumorales pueden ser dianas para la inmunoterapia pasiva. Las composiciones proporcionadas en este documento se basan, al menos en parte, en la identificación y caracterización de anticuerpos humanos que se generaron a partir de linfocitos sanguíneos de individuos inmunizados con una vacuna conjugada de hemocianina de Sialyl-Lewisa-lapa californiana (sLea-KLH). Se identificaron al menos cuatro anticuerpos con alta afinidad por sLea (5B1, 9H3, 5H11 y 7E3). Dos de estos anticuerpos se expresaron como anticuerpos recombinantes (r5B1 y r7E3) y se caracterizaron adicionalmente en modelos in vitro e in vivo. Ambos anticuerpos fueron potentes en los ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y el anticuerpo 5B1 también fue muy activo en los ensayos de citotoxicidad dependiente de anticuerpos. La eficacia in vivo de los anticuerpos se ensayó en dos modelos de xenoinjerto usando células tumorales Colo205 o células tumorales DMS-79 injertadas en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID). La relevancia de la traducción de la enseñanza proporcionada en este documento es doble: en primer lugar, el enfoque proporcionado en este documento demuestra que la respuesta de anticuerpos provocada por una vacuna sLea-KLH es útil como vacuna en sí misma. En segundo lugar, los anticuerpos más potentes que se generaron en un ensayo clínico se pueden conservar y, en última instancia, usar como agentes terapéuticos, o en la generación de terapias, para una población diana de cáncer. La alta afinidad de los anticuerpos proporcionados en este documento y sus altas funciones efectoras respaldan este potencial de traducción.
Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" pretende significar un producto polipeptídico de células B dentro de la clase de polipéptidos de inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno molecular específico y está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en el que cada par tiene una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kDa) y una cadena ligera (aproximadamente 25 kDa) y cada porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 130 o más aminoácidos y cada porción carboxi-terminal de cada cadena incluye una región constante (Véase Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Edition, W.H. Freeman and Company, New York). En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno molecular específico que se puede unir por un anticuerpo de la enseñanza incluye el carbohidrato diana sLea.
El término "humano" cuando se usa en referencia a un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene una región variable humana y/o una región constante humana o una porción de la misma correspondiente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana están descritas por Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242. Un anticuerpo humano, en el contexto de la presente enseñanza, puede incluir un anticuerpo que se une a sLea y está codificado por una secuencia de ácido nucleico que es una variante somática de origen natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana. En el ejemplo I se proporcionan métodos de ejemplo para producir anticuerpos humanos, pero se puede usar cualquier método bien conocido para los expertos en la técnica.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es el producto de un clon o hibridoma de una sola célula o una población de células derivadas de una sola célula. También se pretende que un anticuerpo monoclonal se refiera a un anticuerpo producido por métodos recombinantes a partir de genes de inmunoglobulina que codifican cadenas pesadas y ligeras para producir una única especie de inmunoglobulina molecular. Las secuencias de aminoácidos para los anticuerpos dentro de una preparación de anticuerpos monoclonales son sustancialmente homogéneas y la actividad de unión de los anticuerpos dentro de dicha preparación exhibe sustancialmente la misma actividad de unión al antígeno. Por el contrario, los anticuerpos policlonales se obtienen de diferentes células B dentro de una población, que son una combinación de moléculas de inmunoglobulina que se unen a un antígeno específico. Cada inmunoglobulina de los anticuerpos policlonales se puede unir a un epítopo diferente del mismo antígeno. Los métodos para producir tanto anticuerpos monoclonales como anticuerpos policlonales son bien conocidos en la técnica (Harlow and Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Borrebaeck (ed.), Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Co., Publishers, New York, pp. 103-120 (1991)).
Como se usa en este documento, el término "fragmento funcional" cuando se usa en referencia a un anticuerpo pretende referirse a una porción del anticuerpo que incluye polipéptidos de cadena pesada o ligera que retiene parte o toda la actividad de unión como el anticuerpo del cual se derivó el fragmento. Tales fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, un Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, Fv monocatenario (scFv), diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo y minicuerpo. Otros fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada o ligera, polipéptidos de región variable o polipéptidos CDR o porciones de los mismos siempre que tales fragmentos funcionales retengan la actividad de unión. Tales fragmentos de unión de anticuerpos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plückthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990).
El término "cadena pesada" cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 50-70 kDa, en la que la porción amino-terminal incluye una región variable de aproximadamente 120 a 130 o más aminoácidos y una porción carboxi-terminal que incluye una región constante. La región constante puede ser una de cinco tipos distintos, denominadas alfa (a ), delta (8), épsilon (e), gamma (y) y mu (|i ), en base a la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena pesada. Las distintas cadenas pesadas difieren en tamaño: a , 8 y y contienen aproximadamente 450 aminoácidos, mientras que |i y e contienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cuando se combinan con una cadena ligera, estos tipos distintos de cadenas pesadas dan lugar a cinco clases bien conocidas de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas cuatro subclases de IgG, a saber, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Una cadena pesada puede ser una cadena pesada humana.
El término "cadena ligera" cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a una cadena polipeptídica de aproximadamente 25 kDa, en la que la porción amino-terminal incluye una región variable de aproximadamente 100 a aproximadamente 110 o más aminoácidos y una porción carboxi-terminal que incluye una región constante. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 aminoácidos. Hay dos tipos distintos, denominados kappa ( k ) de lambda (X) en base a la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera son bien conocidas en la técnica. Una cadena ligera puede ser una cadena ligera humana.
El término "dominio variable" o "región variable" se refiere a una porción de las cadenas ligeras o pesadas de un anticuerpo que generalmente se encuentra en el extremo amino terminal de la cadena ligera o pesada y tiene una longitud de aproximadamente 120 a 130 aminoácidos en la cadena pesada y aproximadamente de 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre diferentes anticuerpos. La variabilidad en la secuencia se concentra en las CDR, mientras que las porciones menos variables del dominio variable se denominan regiones marco (FR). Las CDR de las cadenas ligera y pesada son las principales responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. La numeración de las posiciones de aminoácidos usadas en este documento se realiza de acuerdo con el índice de la UE, como Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. Una región variable puede ser una región variable humana.
Una CDR se refiere a una de las tres regiones hipervariables (H1, H2 o H3) dentro de la región sin marco del marco de la hoja p de VH de inmunoglobulina (Ig o anticuerpo), o una de las tres regiones hipervariables (L1, L2 o L3) dentro de la región sin marco del marco de la hoja p de VL del anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, las CDR son secuencias de regiones variables intercaladas dentro de las secuencias de la región marco. Las regiones CDR son bien conocidas para los expertos en la técnica y han sido definidas, por ejemplo, por Kabat como las regiones de mayor hipervariabilidad dentro de los dominios de la variable de anticuerpo (V) (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Las secuencias de la región CDR también han sido definidas estructuralmente por Chothia como aquellos residuos que no forman parte de la estructura de la hoja p conservada y, de este modo, son capaces de adaptar diferentes conformaciones (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Ambas terminologías están bien reconocidas en la técnica. Las posiciones de las CDR dentro de un dominio variable de anticuerpo canónico se han determinado mediante la comparación de numerosas estructuras (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Debido a que el número de residuos dentro de una región hipervariable varía en diferentes anticuerpos, los residuos adicionales en relación con las posiciones canónicas se numeran convencionalmente con a, b, c, etc., junto al número de residuos en el esquema de numeración de dominios variables canónicos (Al-Lazikani et al., supra (1997)). Tal nomenclatura es igualmente bien conocida para los expertos en la técnica.
Por ejemplo, las CDR definidas según las designaciones Kabat (hipervariable) o Chothia (estructural) se exponen en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1: Definiciones de CDR
Kabat1 Chothia2 Ubicación del bucle
CDR de V h 1 31-35 26-32 enlace B y hebras C
CDR de V h 2 50-65 53-55 enlace C' y hebras C
CDR de V h 3 95-102 96-101 enlace F y hebras G
CDR de V l 1 24-34 26-32 enlace B y hebras C
CDR de V l 2 50-56 50-52 enlace C' y hebras C
CDR de V l 3 89-97 91-96 enlace F y hebras G
1 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., Supra
2 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., Supra
También se pueden incorporar una o más CDR en una molécula de forma ya sea covalente o no covalente para convertirla en una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir covalentemente las CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una a un antígeno particular de interés.
Como se usa en este documento, el término "aislado" cuando se usa en referencia a un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido pretende significar que la molécula de referencia está libre de al menos un componente tal como se encuentra en la naturaleza. El término incluye un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido que se elimina de algunos o todos los demás componentes tal como se encuentra en su entorno natural. Los componentes del entorno natural de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos, trombocitos, plasma, proteínas, ácidos nucleicos, sales y nutrientes. Los componentes del entorno natural de un fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido incluyen, por ejemplo, membranas lipídicas, orgánulos celulares, proteínas, ácidos nucleicos, sales y nutrientes. Un anticuerpo, fragmento funcional de anticuerpo o polinucleótido de la enseñanza también puede estar libre o completamente libre de todos estos componentes o cualquier otro componente de las células a partir de las cuales se aísla o produce de forma recombinante.
Como se usa en este documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos que está codificada por genes de región constante de cadena pesada. Las cadenas pesadas de un anticuerpo o fragmento funcional determinado determinan la clase de ese anticuerpo o fragmento funcional: IgM, IgG, IgA, IgD o IgE. Cada clase puede tener cadenas ligeras k o X. El término "subclase" se refiere a las diferencias menores en las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas que diferencian las subclases. En los seres humanos hay dos subclases de IgA (subclases IgA1 e IgA2) y hay cuatro subclases de IgG (subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Tales clases y subclases son bien conocidas para los expertos en la técnica.
Los términos "se une" o "unión", como se usa en este documento, se refieren a una interacción entre moléculas para formar un complejo. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, interacciones no covalentes que incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones hidrófobas y/o interacciones de van der Waals. Un complejo también puede incluir la unión de dos o más moléculas unidas por enlaces, interacciones o fuerzas covalentes o no covalentes. La unión de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo se puede detectar usando, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima, un método proporcionado en el ejemplo I o cualquiera de un numero de métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica.
La fuerza de las interacciones no covalentes totales entre un único sitio de unión al antígeno en un anticuerpo o fragmento funcional y un único epítopo de una molécula diana, tal como sLea, es la afinidad del anticuerpo o fragmento funcional por ese epítopo. La proporción de asociación (k-i) a disociación (k-1) de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo a un antígeno monovalente (fci/k-1) es la constante de asociación K, que es una medida de afinidad. El valor de K varía para diferentes complejos de anticuerpo o fragmento funcional y antígeno y depende tanto de k1 como de k-1. La constante de asociación K para un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede determinar usando cualquier método proporcionado en este documento o cualquier otro método bien conocido para los expertos en la técnica.
La afinidad en un sitio de unión no siempre refleja la verdadera fuerza de la interacción entre un anticuerpo o fragmento funcional y un antígeno. Cuando antígenos complejos que contienen múltiples determinantes antigénicos repetidos, tales como un sLea polivalente, entran en contacto con anticuerpos que contienen múltiples sitios de unión, la interacción del anticuerpo o fragmento funcional con el antígeno en un sitio aumentará la probabilidad de una reacción en un segundo sitio. La fuerza de tales interacciones múltiples entre un anticuerpo multivalente y un antígeno se llama avidez. La avidez de un anticuerpo o fragmento funcional puede ser una mejor medida de su capacidad de unión que la afinidad de sus sitios de unión individuales.
Por ejemplo, una alta avidez puede compensar la baja afinidad como a veces se encuentra para los anticuerpos IgM pentaméricos, que pueden tener una afinidad menor que la IgG, pero la alta avidez de la IgM, resultante de su multivalencia, le permite unirse al antígeno de manera eficaz.
La especificidad de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo se refiere a la capacidad de un anticuerpo individual o fragmento funcional del mismo para reaccionar con un solo antígeno. Un anticuerpo o fragmento funcional se puede considerar específico cuando puede distinguir diferencias en la estructura primaria, secundaria o terciaria de un antígeno o formas isoméricas de un antígeno.
El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. La secuencia de un polinucleótido está compuesta por cuatro bases de nucleótidos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) para timina cuando el polinucleótido es ARN. De este modo, los términos "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácido nucleico" son la representación alfabética de un polinucleótido. Un polinucleótido puede incluir un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, etiqueta EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Polinucleótido también se refiere a las moléculas tanto de cadena doble como simple. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de esta enseñanza que sea un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o previstas para formar la forma bicatenaria. Se entiende que los polinucleótidos y ácidos nucleicos aislados descritos en este documento están dirigidos a polinucleótidos y ácidos nucleicos no naturales. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos de origen no natural pueden incluir, pero no se limitan a, ADNc y moléculas sintetizadas químicamente.
El término "codificar" o equivalentes gramaticales del mismo, como se usa en referencia a polinucleótidos, se refiere a un polinucleótido en su estado nativo o cuando se manipula mediante métodos bien conocidos para los expertos en la técnica que se pueden transcribir para producir ARNm, que luego se traduce en un polipéptido y/o un fragmento del mismo. La hebra antisentido es el complemento de dicho polinucleótido, y la secuencia codificante se puede deducir de esta.
La frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que se pueda usar en el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad asociada con la expresión de sLea y/o un síntoma relacionado con la misma. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico se refiere a un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. En otras realizaciones, un agente terapéutico se refiere a un agente distinto de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Un agente terapéutico puede ser un agente que se sabe que es útil para, o se ha usado o se está usando actualmente para el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad asociada con la expresión de sLea y/o uno o más síntomas relacionados con la misma.
La frase "agente de diagnóstico" se refiere a una sustancia administrada a un sujeto que ayuda en el diagnóstico de una enfermedad. Estas sustancias se pueden usar para revelar, señalar y/o definir la localización de un proceso que causa una enfermedad. En determinadas realizaciones, un agente de diagnóstico incluye una sustancia que está conjugada con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, que cuando se administra a un sujeto o se pone en contacto con una muestra de un sujeto ayuda en el diagnóstico de cáncer o formación de tumores.
La frase "agente detectable" se refiere a una sustancia que se puede usar para determinar la existencia o presencia de una molécula deseada, tal como un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, en una muestra o sujeto. Un agente detectable puede ser una sustancia que se puede visualizar o una sustancia que de otro modo se puede determinar y/o medir (por ejemplo, mediante cuantificación).
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis. Tal suministro depende de un numero de variables que incluyen el período de tiempo durante el cual se usará la unidad de dosificación individual, la biodisponibilidad del agente, la vía de administración, etc.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento se refiere a la cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en este documento o cualquier otro agente terapéutico proporcionado en este documento) que es suficiente para reducir y/o mejorar la gravedad. y/o duración de una enfermedad dada y/o un síntoma relacionado con la misma. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico puede ser una cantidad necesaria para la reducción o mejora del avance o progresión de una enfermedad determinada, la reducción o mejora de la recurrencia, el desarrollo o la aparición de una enfermedad determinada y/o para mejorar o potenciar el efecto profiláctico o terapéutico de otra terapia (por ejemplo, una terapia distinta de la administración de un anticuerpo o fragmento funcional proporcionado en este documento).
El compuesto "Sialyl-Lewisa" (sLea), también conocido como sialyl Lea, Sialyl-Lewis A, Lewis a sialilado y CA 19.9, es un tetrasacárido con una fórmula molecular de C31H52N2O23 y una masa molar de 820.74 g/mol. La estructura de sLea puede incluir Neu5Aca 2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp y Neu5Gca 2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp. sLea se expresa ampliamente en tumores del tracto gastrointestinal y se usa como marcador tumoral en el cáncer de páncreas y colon. sLea también es un ligando conocido para la selección E, también conocida como molécula de adhesión de leucocitos endoteliales (ELAM).
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera o pesada de anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que un anticuerpo o fragmento funcional del mismo generado usando la cadena ligera o pesada del anticuerpo se une a sLea. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-142 de la SEQ ID NO: 2, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6 , residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10 y residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14. El polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de residuos de ácido nucleico 58-426 de SEQ ID NO: 1, residuos 58-426 de SEQ ID NO: 5, residuos 58-426 de SEQ ID NO: 9 o residuos 58-435 de SEQ ID NO: 13, en los que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio de VH del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
En otra realización de la enseñanza, el polinucleótido aislado puede codificar un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4, residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8 , residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12 y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16. El polinucleótido aislado de la enseñanza también puede incluir una secuencia de ácido nucleico de los residuos 58-390 de SEQ ID NO: 3, residuos 58-387 de SEQ ID NO: 7, residuos 58­ 390 de SEQ ID NO: 11 o residuos 67-390 de SEQ ID NO: 15, en el que la secuencia de ácido nucleico codifica el dominio de VL del anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
En otra realización, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera o pesada de anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, en el que la cadena pesada o ligera de anticuerpo o su fragmento funcional codificado por el polinucleótido de la enseñanza tiene una o más de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) representadas en las figuras 1-8 o enumeradas en la tabla 2. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que incluye una o más de las CDR se puede unir específicamente a sLea como se describe en este documento. La unión específica a sLea puede incluir la especificidad, afinidad y/o avidez como se proporciona en el Ejemplo I, para cualquiera de los anticuerpos proporcionados en este documento. En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo codificado por los polinucleótidos de la enseñanza puede incluir la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de uno cualquiera de los aislados clonales 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 descritos en este documento. Los métodos para evaluar la especificidad, afinidad y/o avidez de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo son bien conocidos en la técnica y se proporcionan en este documento métodos de ejemplo.
Tabla 2: CDR de aislados clonales
Residuos de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:) Residuos de aminoácidos (SEQ ID NO:)
CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 Dominio
variable
5B1 VH 133-156 (NO: 1) 208-231 (NO: 1) 346-393 (NO: 1) 55-62 (NO: 2) 70-77 (NO: 2) 116-131 (NO: 2)
5B1 VL 133-156 (NO:3) 208-216 (NO:3) 325-360 (NO:3) 45-52 (NO:4) 70-72 (NO:4) 109-120 (NO:4)
9H3 VH 133-156 (NO: 5)
Figure imgf000009_0001
5) 346-393 (NO: 45-52 (NO: 6 ) 70-77 (NO: 6 ) 116-131 (NO: 6 )
5)
9H3 VL 133-156 (NO: 7) 208-216 (NO: 7) 325-357 (NO: 45-52 (NO: 8 ) 70-72 (NO: 8 ) 109-119 (NO: 8 )
7)
5H11 VH 133-156 (NO: 9)
Figure imgf000009_0002
9) 346-393 (NO: 45-52 (NO: 70-77 (NO: 116-131 (NO:
9) 10) 10) 10)
5H11 VL 134-156 (NO: 11) 208-216 (NO: 325-360 (NO: 45-52 (NO: 70-72 (NO: 109-120 (NO:
11) 11) 12) 12) 12)
7E3 VH 133-156 (NO: 13) 208-231 (NO: 346-402 (NO: 45-52 (NO: 70-77 (NO: 116-134 (NO:
13) 13) 13) 13) 14)
7E3 VK 145-162 (NO: 15) 214-222 (NO: 331-360 (NO: 49-53 (NO: 72-74 (NO: 111-120 (NO:
15)_________ _15)___________ J 6 _________ J 6 __________ J 6 _____________ En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza incluye menos de seis CDR. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en CDR de VH1, CDR de VH2, CDR de v H3, CDR de VL1, CDR de VL2 y/o CDR de VL3. En realizaciones específicas, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye una, dos, tres, cuatro o cinco CDR seleccionadas del grupo que consiste en CDR de VH1, CDR de VH2, CDR de VH3, CDR de VL1, CDR de VL2 y/o CDR de VL3 de los aislados clonales 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 descritos en este documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional incluye un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 del aislado clonal 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3. Tales dominios de VH pueden incluir los residuos de aminoácidos 55-62, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 2, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 6, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45­ 52, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 10, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-77 y 116-134 de SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de VH puede incluir respectivamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 133-156, 208-231 y 346-393 de SEQ ID n O: 1, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 133-156, 208-231 y 346-393 de SEQ ID NO: 5, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 133-156, 208-231 y 346-393 de SEQ ID NO: 9, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de residuos 133-156, 208-231, 346-402 de SEQ ID NO: 13.
En otra realización, la enseñanza proporciona un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del aislado clonal 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3. Tal dominio de VL puede incluir los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-120 de SEQ ID NO: 4, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-119 de SEQ ID NO: 8, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-120 de SEQ ID NO: 12, o alternativamente los residuos de aminoácidos 49-53, 72-74 y 111-120 de SEQ ID NO: 16. En otro aspecto, la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de VH puede incluir respectivamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 133-156, 208-216 y 325-360 de SEQ ID NO: 3, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 133-156, 208-216 y 325-357 de SEQ ID NO: 7, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de los residuos 134-156, 208-216 y 325-360 de SEQ ID NO: 11, o alternativamente la secuencia de nucleótidos de residuos 145­ 162, 214-222 y 331-360 de SEQ ID NO: 15
En otra realización, la enseñanza proporciona una variante de los polinucleótidos proporcionados en este documento. Una variante cuando se usa en referencia a un polinucleótido incluye un polinucleótido que tiene uno o más nucleótidos modificados, tales como, pero sin limitarse a, un nucleótido metilado o un análogo de nucleótido. Adicionalmente, un polinucleótido variante puede incluir un polinucleótido que está interrumpido por componentes no nucleotídicos. Pueden impartirse modificaciones a un polinucleótido antes o después del ensamblaje del polinucleótido usando métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido se puede modificar después de la polimerización por conjugación con un componente de marcaje usando técnicas ya sea enzimáticas o químicas (por ejemplo, como se describe en Gottfried and Weinhold, 2011, Biochem. Soc. Trans., 39(2):523-628; Paredes et al., 2011, Methods, 54(2):251-259).
Los polinucleótidos se pueden obtener y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinados mediante, mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Dado que se conocen las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y ligera de 5B1, 9H3, 5H11 y 7E3 (véase, por ejemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16), secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos y las versiones modificadas de estos anticuerpos se pueden determinar usando métodos bien conocidos en la técnica, esto es, los codones de nucleótidos que se sabe que codifican aminoácidos particulares se ensamblan de tal manera que generan un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Dicho polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede ensamblar a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que, brevemente, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, fragmentos, o variantes de los mismos, hibridación y ligadura de esos oligonucleótidos, y luego amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Se puede generar un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza usando la secuencia de ácido nucleico de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de los aislados 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15). Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o el fragmento funcional se puede sintetizar químicamente u obtener de una fuente apropiada (por ejemplo, ADNc aislado de células que expresan el anticuerpo o fragmento funcional del mismo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar el anticuerpo o fragmento funcional del mismo) mediante amplificación de PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridar con los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica para la secuencia de ácido nucleico particular. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR luego se pueden clonar en vectores de clonación replicables usando cualquier método bien conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, la presente enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo se une a sLea. De acuerdo con lo anterior, en algunos aspectos, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10, y residuos 20­ 145 de SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4, residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8, residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12, y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo que se une a sLea, en el que el anticuerpo o fragmento funcional del mismo incluye un dominio de VH y un dominio de Vl , donde el dominio de Vh y el dominio de VL incluyen respectivamente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-142 de SeQ ID n O: 2 y los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4; residuos 20-142 de Se Q ID NO: 6 y residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8; residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10 y residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12; y residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14 y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, para unirse a sLea, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza tiene una o más de las CDR representadas en las figuras 1-8 o enumeradas en la tabla 2. Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que incluye una o más de las CDR, en particular CDR3, se puede unir específicamente a sLea como se describe en este documento. La unión específica a sLea puede incluir la especificidad y afinidad que se proporcionan en el ejemplo I para cualquiera de los anticuerpos proporcionados en este documento. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza puede incluir la actividad CDC y/o la actividad ADCC de cualquiera de los aislados clonales 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 descritos en este documento.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena VH que tiene la secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del aislado clonal 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3. Tales dominios de VH pueden incluir los residuos de aminoácidos 55-62, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 2, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 6, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-77 y 116-131 de SEQ ID NO: 10, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-77 y 116-134 de SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo incluye un dominio de cadena VL que tiene la secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 del aislado clonal 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3. Tal dominio de VL puede incluir los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-120 de SEQ ID NO: 4, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-119 de SEQ ID NO: 8, o alternativamente los residuos de aminoácidos 45-52, 70-72 y 109-120 de SEQ ID NO: 12, o alternativamente los residuos de aminoácidos 49-53, 72-74 y 111-120 de SEQ ID NO: 16.
En algunos aspectos de la enseñanza, el anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal. En algunos aspectos de la enseñanza, el anticuerpo aislado o fragmento funcional del mismo proporcionado en este documento es un isotipo IgG o IgM. En un aspecto adicional de la enseñanza, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es un anticuerpo de la subclase IgG1.
En algunas realizaciones, el fragmento funcional del anticuerpo de la enseñanza puede ser, pero no se limita a, Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fabc, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, minicuerpo o un anticuerpo de dominio único (sdAB). En algunos aspectos, la enseñanza proporciona un diacuerpo que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o 20. Tales diacuerpos de la enseñanza pueden estar, en algunos aspectos, codificados por un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17 o 19. Con respecto a los anticuerpos y los fragmentos funcionales de los mismos, se conocen bien en la técnica diversas formas, alteraciones y modificaciones. Los fragmentos de anticuerpos específicos de sLea de la enseñanza pueden incluir cualquiera de tales diversas formas, alteraciones y modificaciones de anticuerpos. A continuación se exponen ejemplos de tales diversas formas y términos que se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método de producción de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza. El método de la enseñanza puede incluir introducir un polinucleótido de la enseñanza en una célula huésped, cultivar la célula huésped en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para producir la cadena pesada y/o ligera codificada de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, y purificar la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o fragmento funcional.
La expresión recombinante de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza que se une a un antígeno sLea puede incluir la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo (preferiblemente, pero no necesariamente, que contiene el dominio variable de cadena pesada y/o ligera) de la enseñanza, el vector para la producción del anticuerpo o fragmento funcional se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. En este documento se describen métodos de preparación de una proteína mediante la expresión de un polinucleótido que contiene un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que codifica la secuencia de nucleótidos.
Se pueden usar métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que codifican secuencias y señales de control transcripcionales y de traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. La enseñanza, proporciona de este modo vectores replicables que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza unido operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO 86/05807 y WO 89/01036; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede ser clonado en dicho vector para la expresión de la cadena pesada completa, la cadena ligera completa o tanto la cadena pesada como la ligera completa.
El vector de expresión se puede transferir a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan luego mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza. De este modo, la enseñanza incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de la enseñanza unido operativamente a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican tanto la cadena pesada como la ligera se pueden coexpresar en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación.
Se puede usar una variedad de sistemas de vector de expresión de huésped para expresar el anticuerpo o fragmentos funcionales del mismo de la enseñanza (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,807,715). Tales sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés se pueden producir y posteriormente se purifican, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la enseñanza in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NS0, y 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus vaccinia 7.5K). En algunos aspectos, las células bacterianas tales como Escherichia coli, o las células eucariotas, especialmente para la expresión de un anticuerpo recombinante completo, se usan para la expresión de un anticuerpo recombinante o un fragmento funcional. Por ejemplo, las células de mamíferos tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el principal elemento promotor genético temprano intermedio del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; y Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la enseñanza se producen en células CHO. En una realización, la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la enseñanza que se unen a sLea está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
En sistemas bacterianos, se puede seleccionar ventajosamente un numero de vectores de expresión dependiendo del uso previsto para la molécula de anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicho anticuerpo, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), en el que la secuencia de codificación del anticuerpo se puede ligar individualmente en el vector en marco con región codificante lac Z de modo que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión 5-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a microesferas de agarosa de glutatión de matriz seguido de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de modo que el producto del gen diana clonado pueda liberarse de la unidad estructural GST.
En un sistema de insectos, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante del fragmento funcional o del anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).
En células huésped de mamíferos, se pueden usar un numero de sistemas de expresión basados en virus. En los casos donde se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de codificación del anticuerpo de interés se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar luego en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359). También se pueden usar señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Adicionalmente, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control de la traducción exógenas y codones de iniciación pueden tener una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Adicionalmente, se puede elegir una cepa de célula huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función del anticuerpo o fragmento funcional. Las diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, Bt 483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce endógenamente cualquier cadena de inmunoglobulina), células CRL7O3O y HsS78Bst.
Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen de manera estable el anticuerpo o el fragmento funcional de la enseñanza. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células manipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de manera estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Este método se puede usar ventajosamente para diseñar líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo.
Se puede usar un número de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantineguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), y los genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17) se pueden emplear en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Adicionalmente, la resistencia a antimetabolitos se puede usar como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77(6):3567-70; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); glutamina sintetasa (GS), que es una enzima responsable de la biosíntesis de glutamina usando glutamato y amoniaco (Bebbington et al., 1992, Biuotechnology 10:169); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Se pueden aplicar de forma rutinaria métodos bien conocidos en la técnica de la tecnología del ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1.
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo se pueden aumentar mediante la amplificación de un vector (para una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo es amplificable, el aumento del nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la enseñanza, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten una expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, se puede usar un solo vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos de cadena pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera se puede colocar antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; y Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197-2199). Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden incluir ADNc o ADN genómico.
Adicionalmente, los polinucleótidos que codifican las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se pueden someter a optimización de codones usando técnicas bien conocidas en la técnica para lograr la expresión optimizada de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza en una célula huésped deseada. Por ejemplo, en un método de optimización de codones, un codón nativo se sustituye por el codón más frecuente de un conjunto de genes de referencia, en el que la tasa de traducción de codones para cada aminoácido está diseñada para ser alta. Métodos de ejemplo adicionales para generar polinucleótidos de codones optimizados para la expresión de una proteína deseada, que se puede aplicar a las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, se describen en Kanaya et al., Gene, 238:143-155 (1999), Wang et al., Mol. Biol. Evol., 18(5):792-800 (2001), Patente de los Estados Unidos 5,795,737, Publicaciones de los Estados Unidos 2008/0076161 y WO 2008/000632.
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la enseñanza mediante expresión recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, Intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la proteína A y cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos funcionales de la presente enseñanza se pueden fusionar con secuencias polipeptídicas heterólogas proporcionadas en este documento o conocidas también en la técnica para facilitar la purificación. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede purificar mediante la adición recombinante de una etiqueta de poli-histidina (etiqueta His), etiqueta FLAG, etiqueta de hemaglutinina (etiqueta HA) o etiqueta myc, pero no se limitan a que están disponibles comercialmente y que usan métodos de purificación bien conocidos para los expertos en la técnica.
Un fragmento Fab se refiere a un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios de VH y CH1; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, (1989)) consiste en un dominio de VH.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o un fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.
Un anticuerpo monocatenario (scFv) se refiere a un anticuerpo en el que una región VL y VH se unen mediante un enlazante (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena polipeptídica continua en el que el enlazante es suficiente largo para permitir que la cadena de proteínas se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión al antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)). Los diacuerpos se refieren a anticuerpos bivalentes que incluyen dos cadenas polipeptídicas, en las que cada cadena polipeptídica incluye dominios de VH y VL unidos por un enlazante que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo de este modo que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993), y Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su apareamiento tendrá dos sitios de unión de antígeno idénticos. Se pueden usar cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión de antígeno diferentes. De forma similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que incluyen tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión al antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.
La presente enseñanza también proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo derivado de 5B1, 9H3, 5H11 y/o 7E3, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a sLea. Se pueden usar técnicas estándar bien conocidas para los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de la enseñanza, que incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR que da como resultado sustituciones de aminoácidos. En algunos aspectos, el derivado incluye menos de 25 sustituciones de aminoácidos, menos de 20 sustituciones de aminoácidos, menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la molécula original.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene formas modificadas de aminoácidos de origen natural, sustituciones conservadoras, aminoácidos de origen no natural, análogos de aminoácidos y miméticos siempre que el anticuerpo o fragmento funcional conserve actividad funcional como se define en este documento. En una realización, el derivado tiene sustituciones de aminoácidos conservadoras que se realizan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una sustitución de aminoácidos conservadora es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Alternativamente, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden cribar en busca de actividad biológica para identificar mutantes que retienen actividad. Después de la mutagénesis, se puede expresar el anticuerpo codificado o fragmento funcional del mismo y se puede determinar la actividad del anticuerpo o fragmento funcional.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tiene fucosilación, galactosilación y/o sialilación modificadas de un fragmento Fc contenido dentro de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza. Tales modificaciones de un fragmento de Fc pueden afectar la actividad mediada por el receptor de Fc como se describe en Peipp et al., Blood, 112(6):2390-2399 (2008). Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos creados por glicoingeniería que carecen de residuos de fucosa del núcleo de los N-glicanos de Fc exhiben una ADCC fuerte a concentraciones más bajas con una eficacia mucho mayor en comparación con sus contrapartes fucosiladas. Shields et al., J. Biol. Chem., 277(30):26733-40 (2002); Okazaki et al., J Mol Biol., 336:1239-1249 (2004); Natsume et al., J. Immunol. Methods., 306:93-103 (2005). Los métodos para modificar la fucosilación, galactosilación y/o sialilación de un anticuerpo por un fragmento funcional del mismo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enfoques de defucosilación se pueden agrupar en tres metodologías (1) conversión de la ruta de N-glicosilación de células de no mamíferos en la ruta de no fucosilación "humanizada"; (2) inactivación de la ruta de fucosilación de N-glucanos de células de mamíferos y (3) síntesis química in vitro de N-glucoproteína no fucosilada o modificación enzimática de N-glucanos a formas no fucosiladas, como se describe en Yamane-Ohnuki et al., MAbs., 1(3):230-236 (2009). Se entiende que se puede usar uno cualquiera de estos métodos o cualquier otro método que sea bien conocido en la técnica para producir un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que tenga fucosilación, galactosilación y/o sialilación modificadas.
Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la enseñanza que se unen a sLea se pueden producir mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante técnicas de expresión recombinante. La práctica de la enseñanza emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, análisis genético, ADN recombinante, química orgánica, bioquímica, PCR, síntesis y modificación de oligonucleótidos, hibridación de ácidos nucleicos y campos relacionados dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se describen en las referencias citadas en este documento y se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 y actualizaciones anuales) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Edition, Oxford University Press; Lo (ed.) (2006) Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology); Vol. 248, Humana Press, Inc.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluido el uso de hibridomas y tecnologías recombinantes, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridomas, incluidas las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: anticuerpos monoclonales and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). Un anticuerpo monoclonal no se limita a los anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. Se conocen en la técnica otros métodos de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales. En el ejemplo I de este documento se proporcionan métodos de ejemplo adicionales para producir anticuerpos monoclonales.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos que se unen a sLea se pueden generar mediante cualquier técnica bien conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la enseñanza se pueden producir mediante la escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2. Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Los fragmentos funcionales de anticuerpos de la enseñanza también se pueden generar usando diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en los métodos de presentación de fagos, los dominios de anticuerpos funcionales, tales como las regiones variables de cadena pesada y/o ligera que tienen una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR proporcionadas en este documento, se muestran en la superficie de las partículas de fagos que llevan la secuencias de polinucleótidos que los codifican. El ADN que codifica los dominios de VH y VL se recombina junto con un enlazante scFv mediante PCR y se clona en un vector fagémido. El vector se electropora en E. coli y la E. coli se infecta con fagos auxiliares. Los fagos usados en estos métodos son por lo general fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y los dominios de VH y VL se fusionan habitualmente de forma recombinante con el gen III o el gen VIII del fago. El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno particular, tal como sLea, se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o microesfera. Los ejemplos de métodos de presentación de fagos que se pueden usar para preparar los fragmentos funcionales de anticuerpos de la presente enseñanza incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134; las Publicaciones Internacionales Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, y WO97/13844; y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 y 5,969,108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, las regiones codificantes de anticuerpos del fago se pueden aislar y usar para generar anticuerpos completos, incluidos anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en este documento.
También se pueden emplear técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la Publicación PCT No. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043.
Para generar anticuerpos completos, se pueden usar cebadores de PCR que incluyen secuencias de nucleótidos VH o VL, un sitio de restricción y una secuencia flanqueante para proteger el sitio de restricción para amplificar las secuencias VH o VL en clones scFv. Usando técnicas de clonación bien conocidas para los expertos en la técnica, los dominios de VH amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante VH, por ejemplo, la región constante gamma 1 humana, y los dominios VL amplificados por PCR se pueden clonar en vectores que expresan una región constante VL, por ejemplo, regiones constantes kappa o lambda humanas. Los dominios de VH y VL también se pueden clonar en un vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se cotransfectan luego en líneas celulares para generar líneas celulares estables o transitorias que expresan anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se conjuga (conjugaciones covalentes o no covalentes) o se fusiona de forma recombinante con uno o más agentes de diagnóstico, agentes detectables o agentes terapéuticos o cualquier otra molécula deseada. El anticuerpo conjugado o fusionado recombinantemente o el fragmento funcional puede ser útil para controlar o diagnosticar el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad asociada con la expresión de sLea, tal como cáncer o formación de tumores, como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia en particular.
La detección y el diagnóstico se pueden lograr, por ejemplo, acoplando el anticuerpo o el fragmento funcional de la enseñanza a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, materiales radiactivos, tales como, pero no se limitan a, circonio (89Zr), yodo (131I, 125I, 124I, 123I y 121I), carbono (14C, 11C), azufre (35S), tritio (3H), indio (113In, 112In y 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti) ), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 15O, 13N, 64Cu, 94mTc, 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175yb, 166Ho, 86Y, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Sn; y metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, diversas enzimas, tales como, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales como, pero no se limitan a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no se limitan a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no se limitan a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no se limitan a, luciferasa, luciferina y aecuorina, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente enseñanza abarca además los usos terapéuticos de un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza conjugado (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionado de forma recombinante con uno o más agentes terapéuticos. En este contexto, por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar o fusionar de forma recombinante con un agente terapéutico, tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, o un ion metálico radiactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Un agente terapéutico puede ser un quimioterapéutico tal como, pero no se limita a, una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina y daunorrubicina (anteriormente daunomicina)); un taxano (por ejemplo, paclitaxel (Taxol) y docetaxel (Taxotere); un antimetabolito (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo y decarbazina); o un agente alquilante (por ejemplo, meciloretamina, tioepa clorambucila, melfalán, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) y cisplatino); un antibiótico (por ejemplo, actinomicina D, bleomicina, mitramicina, y antramicina (a Mc )); una molécula de auristatina (por ejemplo, auristatina PHE, briostatina 1, solastatina 10, monometil auristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF)); una hormona (por ejemplo, glucocorticoides, progestinas, andrógenos y estrógenos); una análogo de nucleósido (por ejemplo, gemcitabina), un inhibidor de la enzima reparadora del ADN (por ejemplo, etopósido y topotecán), un inhibidor de quinasa (por ejemplo, compuesto ST1571, también conocido como Gleevec o mesilato de imatinib); un agente citotóxico (por ejemplo, maitansina, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, 1-deshidrotestosterona, glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos, y los compuestos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,245,759, 6,399,633, 6,383,790, 6,335,156, 6,271,242, 6,242,196, 6,218,410, 6,218,372, 6,057,300, 6,034,053, 5,985,877, 5,958,769, 5,925,376, 5,922,844, 5,911,995, 5,872,223, 5,863,904, 5,840,745, 5,728,868, 5,648,239, 5,587,459); un inhibidor de la farnesil transferasa (por ejemplo, R115777, BMS-214662, y los descritos por, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos: 6,458,935, 6,451,812, 6,440,974, 6,436,960, 6,432,959, 6,420,387, 6,414,145, 6,410,541, 6,410,539, 6,403,581, 6,399,615, 6,387,905, 6,372,747, 6,369,034, 6,362,188, 6,342,765, 6,342,487, 6,300,501, 6,268,363, 6,265,422, 6,248,756, 6,239,140, 6,232,338, 6,228,865, 6,228,856, 6,225,322, 6,218,406, 6,211,193, 6,187,786, 6,169,096, 6,159,984, 6,143,766, 6,133,303, 6,127,366, 6.124.465, 6,124,295, 6,103,723, 6,093,737, 6,090,948, 6,080,870, 6,077,853, 6,071,935, 6,066,738, 6,063,930, 6.054.466, 6,051,582, 6,051,574, y 6,040,305); un inhibidor de la topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina, irinotecán, SN-38, topotecán, 9-aminocamptotecina, GG-211 (GI 147211), DX-8951f, IST-622, rubitecán, pirazoloacridina, XR-5000, saintopina, UCE6, UCE1022, TAN-1518A, TAN 1518B, KT6006, KT6528, ED-110, NB-506, ED-110, NB-506, fagaronina, coralyne, beta-lapachona y rebeccamicina); un aglutinante de surco menor de ADN (por ejemplo, colorante Hoescht 33342 y colorante Hoechst 33258); inhibidores de la adenosina desaminasa (por ejemplo, fosfato de fludarabina y 2-clorodesoxiadenosina); o sales, solvatos, clatratos o profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un agente terapéutico puede ser un inmunoterapéutico tal como, pero no se limitan a, cetuximab, bevacizumab, herceptina, rituximab).
Adicionalmente, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede conjugar con un agente terapéutico tal como un ion metálico radiactivo, tal como emisores alfa tal como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometales, incluidos, pero no se limitan a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm; o un quelante macrocíclico, tal como ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo o fragmento funcional mediante una molécula enlazante. Tales moléculas enlazantes se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
Adicionalmente, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede conjugar (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionarse de forma recombinante con un agente terapéutico que modifica una respuesta biológica dada. De este modo, los agentes terapéuticos no deben interpretarse como limitados a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina (por ejemplo, abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera y toxina diftérica); una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, y-interferón, a -interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-y, AIM I, AIM II, Ligando Fas y VEGF), un agente anti-angiogénico (por ejemplo, angiostatina, endostatina y un componente de la ruta de coagulación tal como factor tisular); un modificador de la respuesta biológica (por ejemplo, una citocina tal como interferón gamma, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-9, interleucina-10, interleucina-12, interleucina-15, interleucina-23, factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos, y factor estimulante de colonias de granulocitos); un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento) o un agente de coagulación (por ejemplo, calcio, vitamina K, factores tisulares, tal como, pero no se limitan a, factor de Hageman (factor XII), cininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína (PK), proteínas de coagulación-factores II (protrombina), factor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolípido y monómero de fibrina).
La presente enseñanza abarca anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (conjugaciones covalentes o no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo para generar proteínas de fusión. En algunos aspectos, dicho polipéptido puede tener aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90 o aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. En algunos aspectos, la enseñanza proporciona proteínas de fusión que tienen un fragmento funcional de un anticuerpo de la enseñanza (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio de VH, una CDR de VH, un dominio de VL o una CDR de VL) y una proteína o polipéptido heterólogo. En una realización, la proteína o polipéptido heterólogo con el que se fusiona el anticuerpo o el fragmento funcional es útil para dirigir el anticuerpo o el fragmento funcional a un tipo de célula particular, tal como una célula que expresa sLea.
Una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye cualquier anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza proporcionada en este documento conjugado (conjugaciones covalentes o no covalentes) o fusionado recombinantemente a un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En una realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un anticuerpo 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un fragmento funcional de anticuerpos 5B1, 9H3, 5H11 o 7E3 y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye un dominio de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los dominios de VH representados en los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6, residuos 20-142 de SEQ ID n O: 10, o residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14, y/o un dominio de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de los dominios VL representados en los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4, residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8, residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12, o residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión de la presente enseñanza incluye una o más CDR de Vh que tienen la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR de VH representadas en las SEQ ID NOS: 2, 6, 10 o 14, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión incluye una o más CDR de VL que tienen la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR de VL representadas en SEQ ID NOS: 4, 8, 12 o 16, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico. En otra realización, una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza incluye al menos un dominio de VH y al menos un dominio de VL representado en los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2 y los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4; residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6 y residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8; residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10 y residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12; o residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14 y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16, respectivamente, y un agente de diagnóstico, agente detectable o agente terapéutico.
Los métodos para fusionar o conjugar agentes de diagnóstico, agentes detectables o agentes terapéuticos (incluidos polipéptidos) con anticuerpos son bien conocidos, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.
243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095, 5,112,946, 7,981,695, 8,039,273, 8,142,784; las Publicaciones de los Estados Unidos 2009/0202536, 2010/0034837, 2011/0137017, 2011/0280891, 2012/0003247; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; las Publicaciones PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, and WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992; and Senter, Current Opinion in Chemical Biology, 13:235-244 (2009).
En otro aspecto, se puede unir un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico en la región de bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante la formación de un enlace disulfuro. Alternativamente, tales agentes se pueden unir al componente de anticuerpo usando un reticulante heterobifuncional, tal como 3-(2-piridilditio) propionato de N-succinilo (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Las técnicas generales para tal conjugación son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995).
Alternativamente, se puede conjugar un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico mediante una unidad estructural carbohidrato en la región Fc del anticuerpo. Los métodos para conjugar péptidos con componentes de anticuerpos a través de una unidad estructural de carbohidrato de anticuerpo son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cancer. 41:832-839 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer. 46:1101-1106 (1990); y Shih et al., la Patente de los Estados Unidos No. 5,057,313. El método general implica hacer reaccionar un componente de anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre y que está cargado con una pluralidad de péptidos. Esta reacción da como resultado un enlace de base de Schiff inicial (imina), que se puede estabilizar mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.
Sin embargo, si la región Fc está ausente, por ejemplo, si es deseable un fragmento funcional de anticuerpo como se proporciona en este documento, todavía es posible unir un agente de diagnóstico, un agente detectable o un agente terapéutico. Se puede introducir una unidad estructural de carbohidrato en la región variable de cadena ligera de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol., 154: 5919 (1995); las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,443,953 y 6,254,868. La unidad estructural de carbohidrato modificado se usa para unir el agente de diagnóstico, el agente detectable o el agente terapéutico.
El agente terapéutico conjugado o fusionado de forma recombinante con un fragmento funcional de anticuerpo de la enseñanza que se une a sLea se puede elegir para conseguir el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos deseados. Se entiende que está dentro del nivel de habilidad de un médico u otro personal médico considerar lo siguiente al decidir qué agente terapéutico conjugar o fusionar de manera recombinante con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza: la naturaleza de la enfermedad, la gravedad de la enfermedad y el estado del sujeto.
Un conjugado o anticuerpo de fusión o fragmento funcional de la enseñanza que está marcado de forma detectable como se proporciona en este documento y se une a sLea se puede usar con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o controlar una enfermedad, en el que las células que causan o están asociadas con la enfermedad expresa sLea. Por ejemplo, como se proporciona en este documento, se ha demostrado que las células cancerosas y los tumores expresan sLea, tales como, pero no se limitan a, tumores del tracto gastrointestinal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer de páncreas, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de células pequeñas de pulmón, adenocarcinoma de vejiga, cáncer de colon metastásico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario en anillo de sello y carcinoma metastásico. De acuerdo con lo anterior, la enseñanza proporciona métodos para detectar cáncer o una formación de un tumor en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un conjugado o anticuerpo de fusión o fragmento funcional de la enseñanza a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, el método de detección puede incluir además ensayar la expresión de una sLea en las células o una muestra de tejido de un sujeto usando uno o más conjugados o anticuerpos de fusión o fragmentos funcionales de la enseñanza que se unen a sLea; y comparar el nivel de sLea con un nivel de control, por ejemplo, niveles en muestras de tejido normal (por ejemplo, de un sujeto que no tiene una enfermedad, o del mismo sujeto antes de la aparición de la enfermedad), por lo que se compara un aumento en el nivel ensayado de sLea al nivel de control de la sLea es indicativo de la enfermedad. Tales métodos de diagnóstico pueden permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o un tratamiento agresivo antes de lo que sería posible de otra manera, evitando así el desarrollo o la progresión de la enfermedad.
También se puede usar un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza para analizar los niveles de antígeno sLea en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos como se proporciona en este documento o bien conocido para los expertos en la técnica (por ejemplo, véase Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; y Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar sLea incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores de ensayo de anticuerpos apropiados se conocen en la técnica e incluyen marcadores de enzimas, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In) y tecnecio (99Tc); marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, y biotina.
En un aspecto, la enseñanza proporciona la detección y el diagnóstico de enfermedades en un ser humano. En una realización, el diagnóstico incluye: a) administrar (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un sujeto una cantidad eficaz de una proteína conjugada o de fusión de la enseñanza que se une a sLea; b) esperar un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el conjugado o la proteína de fusión se concentre preferentemente en los sitios del sujeto donde se expresa sLea (y, en algunos aspectos, que el conjugado o la proteína de fusión no unida se aclare al nivel de fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el conjugado o la proteína de fusión en el sujeto, de manera que la detección del conjugado o de la proteína de fusión por encima del nivel de fondo indique que el sujeto tiene una enfermedad. El nivel de fondo se puede determinar mediante diversos métodos que incluyen comparar la cantidad de conjugado o proteína de fusión detectada con un valor estándar previamente determinado para un sistema particular.
Se entiende que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado determinarán la cantidad de unidad estructural de formación de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico y puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, en el caso de un radioisótopo conjugado con un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada normalmente variará desde aproximadamente 5 a 20 milicurios de 99Tc. El conjugado se acumulará entonces preferentemente en la ubicación de las células que expresan sLea. La formación de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments" (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de varias variables, incluido el tipo de agente detectable usado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el conjugado se concentre preferentemente en los sitios del sujeto y para que el conjugado no unido se aclare al nivel de fondo es 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días. En una realización, el control de una enfermedad se lleva a cabo repitiendo el método de diagnóstico que se proporciona en este documento, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial o más.
La presencia del conjugado o de la proteína de fusión se puede detectar en el sujeto usando métodos conocidos en la técnica para el barrido in vivo. Estos métodos dependen del tipo de agente detectable usado. Un experto en la técnica podrá determinar el método apropiado para detectar un agente detectable particular. Los métodos y dispositivos que se pueden usar en los métodos de diagnóstico de la enseñanza incluyen, pero no se limitan a, tomografía computarizada (CT), barrido de cuerpo entero tal como tomografía por emisión de posición (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y ecografía. En una realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un radioisótopo y se detecta en el sujeto usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación. En otra realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un compuesto fluorescente y se detecta en el sujeto usando un instrumento de barrido que responde a la fluorescencia. En otra realización, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un metal emisor de positrones, tal como circonio (89Zr) o cualquier otro metal emisor de positrones proporcionado en este documento o que sea bien conocido en la técnica por ser detectable mediante tomografía por emisión de positrones, y se detecta en el sujeto mediante tomografía por emisión de positrones.
En otra realización más, un anticuerpo o un fragmento de función de la enseñanza se conjuga con un marcador paramagnético y se detecta en un sujeto usando formación de imágenes por resonancia magnética (MRI).
En una realización, la enseñanza proporciona una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o un fragmento funcional de la enseñanza y un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable que se puede usar en las composiciones farmacéuticas de la enseñanza incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar conocidos en la técnica, tales como solución salina regulada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión de aceite y agua, y diversos tipos de agentes de humectación. Estas composiciones farmacéuticas se pueden preparar en formas de dosis unitarias líquidas o en cualquier otra forma de dosificación que sea suficiente para administrar el anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza al área diana del sujeto que necesita tratamiento. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de cualquier manera apropiada para el modo de administración elegido, por ejemplo, intravascular, intramuscular, subcutáneo, intraperitoneal, etc. Otros componentes opcionales, por ejemplo, estabilizantes de grado farmacéutico, soluciones reguladoras, conservantes, excipientes y similares se pueden seleccionar fácilmente por un experto en la técnica. La preparación de una composición farmacéutica, teniendo debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro del nivel del experto en la técnica.
Las formulaciones farmacéuticas que contienen uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza proporcionada en este documento se pueden preparar para el almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales, fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones reguladoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecil dimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (p Eg ).
De este modo, en algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Los métodos de la enseñanza pueden incluir administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada en este documento. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede incluir uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales proporcionados en este documento. Las enfermedades que se pueden tratar o prevenir usando los métodos de la enseñanza incluyen cáncer, formación de tumores y/o metástasis. En particular, los métodos de la enseñanza son útiles para tratar cánceres o la formación de tumores en los que las células cancerosas o el tumor expresan los carbohidratos sLea. Los ejemplos no limitantes de cánceres o tumores que se pueden tratar o prevenir usando los métodos de la enseñanza incluyen tumores del tracto gastrointestinal, por ejemplo, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer de colon metastásico, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas o adenocarcinoma de páncreas; carcinoma de células pequeñas del pulmón; adenocarcinoma de vejiga; cáncer de ovario en anillo de sello; cáncer de ovario, carcinoma metastásico; y adenocarcinoma de estómago, esófago, garganta, tracto urogenital o mama.
De acuerdo con lo anterior, en algunos aspectos, la enseñanza proporciona un método de tratamiento del cáncer o prevención de la metástasis tumoral en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o el fragmento se une a sLea e incluye un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6, residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10, y residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la enseñanza proporciona un método de tratamiento del cáncer o prevención de la metástasis tumoral en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a sLea e incluye un dominio de VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4, residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8, residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12, y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16. En otro aspecto más, la enseñanza proporciona un método de tratamiento del cáncer o prevención de la metástasis tumoral en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que tiene un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, en el que el anticuerpo o fragmento funcional se une a sLea e incluye tanto un dominio de VH como un dominio de VL, donde el dominio de VH y el dominio de VL incluyen respectivamente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2 y residuos 20­ 130 de SEQ ID NO: 4; residuos 20-142 de SEQ ID NO: 6 y residuos 20-129 de SEQ ID NO: 8; residuos 20-142 de SEQ ID NO: 10 y residuos 20-130 de SEQ ID NO: 12; y residuos 20-145 de SEQ ID NO: 14 y residuos 23-130 de SEQ ID NO: 16.
Las formulaciones, tales como las descritas en este documento, también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad particular que se esté tratando. En determinadas realizaciones, las formulaciones incluyen un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza y uno o más compuestos activos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Tales moléculas están presentes de forma apropiada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede combinar con uno o más de otros agentes terapéuticos. Tal terapia combinada se puede administrar al sujeto de forma simultánea o sucesiva.
De este modo, en algunos aspectos, la enseñanza proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica proporcionada en este documento a un sujeto que lo necesite, en el que la composición farmacéutica incluye un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza y un segundo agente terapéutico. El segundo agente terapéutico apropiado puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica como se describe en este documento. Como se proporciona en este documento en el ejemplo IV, en algunos aspectos de la enseñanza, el segundo agente terapéutico puede ser Taxol.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento contienen cantidades terapéuticamente eficaces de uno o más de los anticuerpos de la enseñanza proporcionada en este documento, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, en un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles en la prevención, tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad, tal cáncer o formación de tumores, o uno o más de los síntomas de los mismos.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza. En una realización, los anticuerpos o fragmentos funcionales se formulan en preparaciones farmacéuticas apropiadas, tales como soluciones o suspensiones estériles para administración parenteral. En una realización, los anticuerpos o fragmentos funcionales proporcionados en este documento se formulan en composiciones farmacéuticas usando técnicas y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Ed., p. 126).
Se puede incluir un anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios indeseables en el sujeto tratado. La concentración terapéuticamente eficaz se puede determinar empíricamente probando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo usando métodos de rutina y luego extrapolarlos para dosificaciones para humanos. La concentración de un anticuerpo o fragmento funcional en la composición farmacéutica dependerá de, por ejemplo, las características fisicoquímicas del anticuerpo o fragmento funcional, el programa de dosificación y la cantidad administrada, así como de otros factores bien conocidos para los expertos en la técnica.
En una realización, una dosificación terapéuticamente eficaz produce una concentración en suero de un anticuerpo o fragmento funcional desde aproximadamente 0.1 ng/mL a aproximadamente 50-100 |ig/mL. Las composiciones farmacéuticas, en otra realización, proporcionan una dosificación desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 500 mg de anticuerpo por kilogramo de peso corporal por día. Se pueden preparar formas unitarias de dosificación farmacéutica para proporcionar desde aproximadamente 0.01 mg, 0.1 mg o 1 mg a aproximadamente 30 mg, 100 mg o 500 mg, y en una realización desde aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg del anticuerpo o fragmento funcional y/o una combinación de otros ingredientes esenciales opcionales por forma unitaria de dosificación.
El anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza se puede administrar de una vez, o se puede dividir en un numero de dosis más pequeñas para administrar a intervalos de tiempo. Se entiende que la dosificación precisa y la duración del tratamiento es una función de la enfermedad que se está tratando y se puede determinar empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o por extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro. Cabe señalar que las concentraciones y los valores de dosificación también pueden variar con la gravedad de la afección que se va a aliviar. Se debe entender además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos en este documento son sólo a modo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o la práctica de las composiciones reivindicadas.
Al mezclar o añadir el anticuerpo o el fragmento funcional de la enseñanza, la mezcla resultante puede ser una solución, suspensión o similar. La forma de la mezcla resultante depende de un numero de factores, incluido el modo de administración pretendido y la solubilidad del compuesto en el portador o vehículo seleccionado. La concentración eficaz es suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad, trastorno o afección tratada y se puede determinar empíricamente.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para su administración a seres humanos y animales en formas de dosificación unitaria, tales como soluciones o suspensiones parenterales estériles que contienen cantidades apropiadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. El anticuerpo o fragmento funcional puede, en una realización, formularse y administrarse en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiple. Las formas de dosis unitarias se refieren a unidades físicamente discretas apropiadas para sujetos humanos y animales y empaquetadas individualmente como se conoce en la técnica. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada del anticuerpo o fragmento funcional de la enseñanza suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis unitarias incluyen ampollas y jeringas. Las formas de dosis unitarias se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosis unitaria idénticas empaquetadas en un único recipiente para ser administradas en forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales o botellas de pintas o galones. Por tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no están segregadas en el envase.
En una realización, uno o más anticuerpos o fragmentos funcionales de la enseñanza están en una formulación farmacéutica líquida. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo, disolviendo, dispersando o mezclando de otro modo un anticuerpo o fragmento funcional como se proporciona en este documento y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar así una solución. Si se desea, la composición farmacéutica que se va a administrar también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes reguladores del pH y similares, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato sódico de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes similares. Los métodos reales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica; por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
Los métodos para administrar una composición farmacéutica de la enseñanza son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la vía apropiada de administración de una composición farmacéutica se puede determinar fácilmente por un médico experto. Las vías de administración de ejemplo incluyen inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intradérmica o inyección subcutánea. Adicionalmente, se entiende que la formulación de la composición farmacéutica se puede ajustar fácilmente para adaptarse a la vía de administración. La enseñanza también proporciona que después de la administración de una composición farmacéutica de la enseñanza, se pueden administrar al sujeto dosis retardadas, sucesivas y/o repetidas de una o más composiciones farmacéuticas como se proporciona en este documento.
Los métodos de la enseñanza para el tratamiento de una enfermedad están destinados a incluir (1) prevenir la enfermedad, esto es, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha experimentado o muestra síntomas de la enfermedad; (2) inhibir la enfermedad, esto es, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos; o (3) aliviar la enfermedad, esto es, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. Los métodos de la enseñanza para prevenir una enfermedad están destinados a incluir la prevención de un síntoma clínico indicativo de cáncer o formación de tumores. Tal prevención incluye, por ejemplo, el mantenimiento de indicadores fisiológicos normales en un sujeto. Por lo tanto, la prevención puede incluir el tratamiento profiláctico de un sujeto para protegerlo de la aparición de metástasis tumoral.
La cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica usada en los métodos de la enseñanza variará dependiendo de la composición farmacéutica usada, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del sujeto que se va a tratar, todo lo cual está dentro de la habilidad del médico tratante. Un sujeto que se puede tratar mediante los métodos de la enseñanza incluye un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Se entiende que las modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta enseñanza también se proporcionan dentro de la definición de la enseñanza proporcionada en este documento. De acuerdo con lo anterior, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la presente enseñanza.
Ejemplo I
Los anticuerpos monoclonales humanos para sLea tienen una potente actividad antitumoral
El antígeno de carbohidrato sLea se expresa ampliamente en tumores epiteliales del tracto gastrointestinal, mama y páncreas y en cánceres de pulmón de células pequeñas. Dado que la sobreexpresión de sLea parece ser un evento clave en la invasión y metástasis de muchos tumores y da como resultado la susceptibilidad a la lisis mediada por anticuerpos, sLea es una diana molecular atractiva para la terapia tumoral. De acuerdo con lo anterior, como se describe en este documento, se generaron y caracterizaron anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos de linfocitos sanguíneos de individuos inmunizados con una vacuna sLea-KLH. Se seleccionaron varios mAb en base a ELISA y FACS, incluidos dos mAb con alta afinidad por sLea (5B1 y 7E3, afinidades de unión 0.14 y 0.04 nmol/L, respectivamente) y se caracterizaron adicionalmente. Ambos anticuerpos eran específicos para Neu5Aca 2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp y Neu5Gca 2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp según lo determinado por análisis de matriz de glucanos. La citotoxicidad dependiente del complemento contra las células DMS-79 fue mayor (EC500.1 |i g/mL frente a 1.7 |i g/mL) para r7E3 (IgM) que para r5B1 (IgG1). Adicionalmente, los anticuerpos r5B1 mostraron un alto nivel de actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos en células DMS-79 con células NK humanas o células mononucleares de sangre periférica. Para evaluar la eficacia in vivo, los anticuerpos se probaron en un modelo de xenoinjerto con células tumorales Colo205 o células tumorales DMS-79 injertadas en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID). En el modelo de xenoinjerto Colo205, el tratamiento durante los primeros 21 días con cuatro dosis de r5B1 (100 |i g por dosis) duplicó el tiempo medio de supervivencia a 207 días, y tres de cinco animales sobrevivieron con seis dosis. En el modelo de xenoinjerto DSM-79, se suprimió o retrocedió el crecimiento de tumores DMS-79 establecidos en animales tratados con anticuerpo r5B1. Sobre la base del potencial de sLea como diana para el ataque inmunológico y su afinidad, especificidad y funciones efectoras, 5B1 y 7E3 tienen utilidad clínica en el tratamiento del cáncer.
Materiales, células y anticuerpos
Las líneas celulares DMS-79 (Pettengill et al., Cancer, 45:906-18 (1980)), SW626, EL4, HT29, BxPC3, SK-MEL28, y P3 X 63Ag8.653 se adquirieron de American Type Culture Colección (ATCC). Las células Colo205-luc (Bioware ultra) se obtuvieron de Caliper Life Sciences. El mAb de control murino 121SLE (IgM) se adquirió de GeneTex. El tetrasacárido sLea (No. de Cat. S2279) se adquirió de Sigma-Aldrich. sLea-HSA (albúmina de suero humano) conjugado (No. de Cat.
07-011), sLea monovalente biotinilado (sLea-sp-biotina; No. de Cat. 02-044), sLea-PAA biotinilado polivalente (No. de Cat.
01-044), Lea-PAA marcado con biotina (No. de Cat. 01-035) y sLex-PAA-biotina (No. de Cat. 01-045) se adquirieron de GlycoTech. En la presentación polivalente, el tetrasacárido se incorpora a una matriz de poliacrilamida (PAA), creando así un polímero multivalente de 30 kDa con aproximadamente uno de cada cinco grupos amida de la cadena del polímero N-sustituido con biotina en una proporción de 4:1 y aproximadamente un contenido de 20 % de carbohidratos. Otros glicoconjugados de HSA o BSA usados en este estudio se prepararon internamente usando sLea pentenil glicósido como se describe. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother, 58:1397-405 (2009). GD3, fucosil-GM1, GM2 y GM3 se adquirieron de Matreya, y GD2 se adquirió de Advanced ImmunoChemical.
Generación de hibridomas productores de mAb anti-sLea
Se obtuvieron muestras de sangre de 3 pacientes en un ensayo en curso con vacuna conjugada sLea-KLH en pacientes con cáncer de mama iniciado en MSKCC bajo un protocolo iRb e IND aprobado por MSKCC y FDA. Se seleccionaron muestras de sangre de 2 pacientes después de 3 o 4 vacunaciones, que mostraron títulos de anticuerpos de 1/160 y 1/320, respectivamente, contra sLea. Estos sueros (y mAb 19.9 murino) reaccionan bien con líneas celulares positivas a sLea en ensayos FACS y median CDC potentes. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother, 58:1397-405 (2009). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de aproximadamente 80 a 90 mL de sangre mediante centrifugación en gradiente en Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich).
Se cultivaron PBMC en medio RPMI-1640 complementado con L-glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, vitamina, penicilina/estreptomicina, FBS al 10 % (Omega Scientific), 10 ng/mL de IL-21 (Biosource) y 1 |ig/mL de mAb anti-CD40 (sobrenadante de hibridoma G28-5; ATCC). Las células se fusionaron mediante electrofusión con células de mieloma p 3 X 63Ag8.653.
ELISA de sLea
Para el ELISA de sLea, las placas se recubrieron con 1 |ig/mL de conjugado sLea-HSA, sLea biotinilado monovalente o con sLea-PAA biotinilado polivalente capturado en placas recubiertas con neutr-avidina. Se usaron como controles pocillos sin recubrir (PBS) y pocillos recubiertos con HSA. Los anticuerpos unidos se detectaron inicialmente con anti-IgA anti­ humana de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) G M (Jackson ImmunoResearch), y los pocillos positivos se sondaron posteriormente con anticuerpos secundarios específicos de IgG-Fcor IgM para determinar los isotipos.
Análisis de especificidad de carbohidratos
La reactividad cruzada contra los antígenos estrechamente relacionados, Lea y sLex, se evaluó mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) y se confirmó mediante ELISA usando Lea-PAA marcado con biotina y biotina-sLex-PAA. La unión a los gangliósidos g D2, GD3, fucosil-GM1, GM2 y GM3 se ensayó mediante ELISA. Se usó un ELISA de competición para evaluar la especificidad de los mAb contra varias otras unidades estructurales de carbohidratos relacionados. En resumen, se recubrieron las placas con 2 |ig/mL de conjugado sLea-HSA, seguido de bloqueo con BSA al 3 % en PBS. A continuación, se mezclaron por separado 30 |iL de diferentes unidades estructurales de carbohidratos (40 |ig/mL en PBS preparado a partir de soluciones madre de 1 mg/mL) ya sea conjugado o no con HSA o BSA con 30 |iL de anticuerpo de prueba y se incubó a temperatura ambiente en una placa de muestra. Después de 30 minutos, se transfirieron 50 |iL de la mezcla a la placa de ensayo recubierta y se incubaron durante 1 hora, seguido de incubación con IgA antihumana de cabra marcada con HRP+ G M, lavado y detección colorimétrica del anticuerpo unido usando un espectrofluorómetro Versamax (todas las etapas se llevaron a cabo a temperatura ambiente). Las unidades estructurales de carbohidratos probados incluyeron globo H, Lewis Y, Lewis X, sialil-Thomson-nouveaux (sTn), sTn agrupado, Thomson Friedenreich (TF), mucina Tighe Leb/LeY, mucina submaxilar porcina (PSM) y sLea tetrasacárido y conjugado sLea-HSA. Para determinar la especificidad fina de los anticuerpos, el grupo Consortium for Functional Glycomics Core H realizó un análisis de matriz de glucanos. Los anticuerpos 5B1 y 7E3 se probaron a 10 |ig/mL usando la versión 4.1 de la matriz impresa que consiste en 465 glucanos en réplicas de 6.
Clonación de ADNc de inmunoglobulina y expresión de anticuerpos recombinantes
La región variable del ADNc de cadena pesada y ligera de mAb humano se recuperó mediante RT-PCR de la línea celular de hibridoma individual y se subclonó en el vector de expresión de la cadena pesada de IgG1 o IgM o de la cadena ligera de IgK o IgL como se describió anteriormente. Sawada-Hirai et al., J. Immune Based Ther. Vaccines, 2:5 (2004). El vector de expresión de la cadena pesada o de la cadena ligera de Ig se sometió a doble digestión con Not I y Sal I, y luego se ligaron ambos fragmentos para formar un vector de expresión de doble gen. Se transfectaron células CHO en placas de 6 pocillos con el vector de expresión de doble gen usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 24 horas, las células transfectadas se transfirieron a una placa de 10 cm con medio de selección [DMEM complementado con FBS dializado al 10 % (Invitrogen), 50 |imol/L de L-metionina sulfoximina (MSX), complemento de GS (Sigma-Aldrich) y penicilina/estreptomicina (Omega Scientific)]. Dos semanas más tarde, se aislaron y expandieron transfectantes resistentes a MSX. Se seleccionaron clones de alta producción de anticuerpos anti-sLea midiendo los niveles de anticuerpos en los sobrenadantes en un ensayo ELISA específico de sLea y se expandieron para la producción de mAb a gran escala.
Purificación de mAb humano
Los anticuerpos se purificaron usando el sistema Ákta Explorer (GE Healthcare) que ejecuta el software Unicorn 5.0. En resumen, se cultivaron clones estables de 5B1 o 7E3 en medio de cultivo sin suero en un biorreactor Wave, y el sobrenadante recolectado se clarificó mediante centrifugación y filtración y se almacenó refrigerado hasta su uso. Los anticuerpos IgG humanos se purificaron en columnas de proteína A de tamaño apropiado usando 10 mmol/L de PBS y 150 mmol/L de solución reguladora de ejecución de NaCl. Los anticuerpos IgM humanos se purificaron en una columna de hidroxiapatita y la IgM se eluyó con un gradiente de fosfato de 500 mmol/L. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron mediante OD280 usando un E1% de 1.4 y 1.18 para IgG e IgM, respectivamente, para calcular la concentración. La pureza de cada preparación se evaluó mediante análisis SDS-PAGE (1-5 |ig por carril) en condiciones reductoras, y la pureza fue superior al 90 % en base a la suma de cadenas pesadas y ligeras.
Citometría de flujo
Las líneas de células tumorales positivas o negativas a sLea (0.5 x 106 células por condición) se lavaron en PBS/FBS al 2 % (PBSF). A continuación, se agregó mAb humano de prueba o de control (1-2 |ig/mL en medio completo) y se incubó en hielo durante 30 minutos. Gilewski et al., Clin Cancer Res, 6:1693-701 (2000); Gilewski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:3270-5 (2001). Después de lavar en PBSF, las células se incubaron con Alexa-488 IgG anti-humana-Fcy o IgM anti­ humana-^ (Invitrogen) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces en PBSF y se analizaron mediante citometría de flujo usando el sistema Guava Personal Cell Analysis-96 (PCA-96) System (Millipore). Las células Colo205-luc se incubaron con 2 |ig/mL de anticuerpo primario, seguido de tinción con anticuerpos secundarios de SouthernBiotech, y se analizaron en un instrumento Becton Dickinson FACS Advantage IV usando el software FlowJo 7.2.4.
Determinación de afinidad
Las constantes de afinidad se determinaron usando el principio de SPR con un Biacore 3000 (GE Healthcare). Se acoplaron sLea univalente marcada con biotina (No. de Cat. 02-044) o sLea-PAA-biotin polivalente (No. de Cat. 01-044) a celdas de flujo separadas de un chip biosensor SPA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una celda de flujo bloqueada con HSA y medio de cultivo que contenía biotina libre como celda de referencia. Los parámetros cinéticos de unión se determinaron a partir de varias concentraciones conocidas de anticuerpo diluido en solución reguladora HBS-EP (HEPES 10 mmol/L, pH 7.4, NaCl 150 mmol/L, EDTA 3.4 mmol/L, surfactante P20 al 0.005 %) usando la celda de flujo recubierta con sLea-PAA-biotin. El software de ajuste de curvas proporcionado por el instrumento Biacore se usó para generar estimaciones de las tasas de asociación y disociación a partir de las cuales se calculan las afinidades.
Ensayo de CDC
Se usaron líneas celulares positivas y negativas al antígeno sLea para un ensayo de citotoxicidad de 90 minutos (Guava PCA-96 Cell-Toxicity kit; Millipore; No. de Cat. 4500-0200) usando complemento humano (Quidel; No. de Cat. A113) y mAb humanos purificados en diversas diluciones (0.1-25 |ig/mL) o con mAb de control positivo como se describió anteriormente (Ragupathi et al. Clin Cancer Res 2003, 9:5214; Ragupathi et al. Int J Cancer 2000, 85:659; Dickler et al. Cancer Res 1999, 5:2773). En resumen, se pintaron 2.5 x 106 células diana con éster succinimílico de diacetato de carboxifluoresceína (CSFE) para producir células diana fluorescentes de color verde/amarillo. Las células pintadas (1 x 105/50 |iL de muestra) se incubaron durante 40 minutos con 100 |iL de anticuerpos en hielo. A continuación, se agregaron 50 |iL de complemento humano diluido 1:2 en medio completo (RPMI-1640, FCS al 10 %) o medio solo para triplicar las muestras y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. De este modo, la dilución final del complemento en el ensayo fue 1:8. Las células que murieron durante este tiempo de incubación se marcaron agregando el colorante impermeable a la membrana 7-aminoactinomicina D (7-AAD), y las muestras se analizaron mediante inmunofluorescencia de dos colores usando el módulo de software Guava CellToxicity. Las muestras de control que recibieron NP40 se usaron para determinar la muerte máxima y las muestras que recibieron el complemento solo sirvieron como valor de referencia. El porcentaje de células muertas se determinó mediante un control apropiado y se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: % de muerte=[(% muestra - % complemento solo)/(% NP40 - % complemento solo)] x 100.
Ensayo de citotoxicidad mediado por células dependiente de anticuerpos
Las células efectoras de PBMC se aislaron mediante centrifugación de densidad Ficoll-Hypaque a partir de muestras de sangre obtenidas según un protocolo aprobado por IRB MSKCC. Las células diana se incubaron a 5 x 106 células/mL en medio de crecimiento completo con 15 |iL de solución de calceína-AM al 0.1 % (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a 37 °C, en presencia de CO2 al 5 %. Las células se lavaron dos veces con 15 mL de PBS-EDTA al 0.02 % y se volvieron a suspender en 1 mL de medio de crecimiento completo. Se sembraron en placa cincuenta microlitros (10,000 células) de células diana marcadas en una placa de 96 pocillos en presencia o ausencia de anticuerpos a las concentraciones descritas en la figura 13, y se incubaron con 50 |iL de células mononucleares de sangre periférica recién aisladas (células efectoras, en una proporción E/T de 100:1) de acuerdo con lo anterior. Después de 2 horas de incubación, la placa se centrifugó a 300 x g durante 10 minutos, y se transfirieron 75 |iL de sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano. La fluorescencia en el sobrenadante se midió a una excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm en Fluoroskan Ascent (Thermo Scientific). Se determinó la liberación espontánea a partir de células diana en medio RPMI-1640 con FBS al 30 % sin células efectoras y se determinó la liberación máxima a partir de células diana en medio RPMI-1640 con FBS al 30 % y Triton X-100 al 6 % sin células efectoras. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como [(recuentos en la muestra - liberación espontánea)/(recuentos máximos - liberación espontánea)] x 100.
Ensayo de internalización de mAb
La internalización del anticuerpo 5B 1 se evaluó midiendo la actividad citotóxica de r5B 1 y el complejo conjugado secundario Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems) contra células BxPC3 que expresan sLea, que se sembraron en placas de 96 pocillos (2,000 células/90 |iL/pocillo) y se incubó durante la noche por duplicado. Se incubaron diversas concentraciones del anticuerpo 5B1 con conjugados secundarios de Hum-ZAP a RT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se agregaron a las células 10 |iL/pocillo de r5B1 y complejo Hum-ZAP y se incubaron durante 3 días. Se agregaron veinticinco microlitros de solución de bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (Sigma-Aldrich) (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo y se incubaron a 37 °C. Después de 2 horas de incubación, se agregaron 100 |iL/pocillo de solución de solubilización (SDS al 20%/50 % N, N-dimetilformamida) a cada pocillo y se incubó durante otras 16 horas a 37 °C. El OD se midió a 570/690 nm, y los valores obtenidos con medio solo se usaron para la sustracción del fondo de la placa. Se usaron ocho cultivos paralelos sin anticuerpo para normalizar los valores de la muestra (muestra/media sin tratar x 100).
Modelo de trasplante de xenoinjerto
Se adquirieron ratones hembra CB17 SCID (5-8 semanas de edad) de Taconic. Para el modelo de xenoinjerto Colo205, se inyectaron células Colo205-luc (0.5 x 106) en 0.1 mL de medio de crecimiento completo a través de la vena de la cola el día 0 usando una jeringa de insulina BD con aguja 28G (Becton Dickinson & Co). Para el primer estudio, se inyectaron cien microgramos de mAb 5B 1 por vía intraperitoneal los días 1, 7, 14 y 21 (experimento 1) o los días 1, 4, 7, 10, 14 y 21 (experimento 2). Para el segundo estudio, se inyectaron 100 |ig, 300 |ig o 1 mg de mAb 5B1 por vía intraperitoneal el día 4 después de la inyección de células tumorales, luego dos veces por semana durante las dos primeras semanas y una vez por semana durante las siguientes 7 semanas. Se controló el desarrollo de tumores en los ratones. Para el modelo de xenoinjerto DMS-79, se inyectaron células DMS-79 (1 x 106) por vía subcutánea en ratones hembra CB17 SCID, y los ratones comenzaron el tratamiento el día 19 después de que la longitud del tumor alcanzara 5 mm (~ 20 mm2). A continuación, los animales se trataron con anticuerpos IgG o 5B1 humanos administrados mediante inyección intraperitoneal a 200 |ig por dosis, más cRGD mediante inyección intravenosa para aumentar la permeabilidad vascular inicialmente a 80 |ig, luego 5 días a la semana, 40 |ig por dosis hasta el día 37.
Todos los procedimientos se realizaron bajo un protocolo aprobado por the Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee. Las curvas de supervivencia Kaplan-Meier se generaron usando GraphPad Prism 5.1 (GraphPad Software) y se analizaron usando la prueba de rango logarítmico de Mantel-Haenszel.
Resultados
Identificación de anticuerpos monoclonales humanos mediante ELISA y generación de anticuerpos recombinantes
Se usaron muestras de sangre de 3 pacientes vacunados para los esfuerzos de generación de hibridomas y se detectaron muchos pocillos positivos en los ensayos ELISA específicos de antígeno (Tabla 3). Se usó un cribado extenso para eliminar los anticuerpos que mostraban una unión inferior o inespecífica. Inicialmente, se seleccionaron, expandieron y subclonaron ocho células de hibridoma que expresan anticuerpos humanos (1 IgM y 7 IgG) con fuerte reactividad contra sLea para su caracterización adicional. Dos anticuerpos (9H1 y 9H3) mostraron una fuerte unión a los conjugados sLea-HSA pero no a las placas recubiertas con sLea-PAA. Tres anticuerpos (5B1, 5H11 y 7E3) mostraron una fuerte unión a conjugados de sLea-HSA y sLea monovalentes y polivalentes cuando se midieron mediante ensayos ELISA (Tabla 4).
Tabla 3: Unión de sobrenadantes de hibridoma candidatos que contienen anticuerpos monoclonales IgG o IgM al conjugado sLea-acetilfenilendiamina (APD)-albúmina de suero humano (HSA) (sLea-HuSA).
OD (490 nm)*
Sobrenadante Isotipo HuSA sLea-HuSA PBS EF41-5B1 G 0.000 2.240 0.020 EF41-5H11 G 0.020 2.180 -0.010 EF41-6F7 G 0.010 0.480 -0.010 EF41-9H1 G 0.010 0.730 -0.020 EF41-9H3 G 0.010 1.100 -0.020 EF41-9A10 G 0.010 2.140 -0.010 EF41-10C1 G 0.000 0.040 -0.020 EF40-3C4 G 0.000 0.500 0.000 EF40-10H3 G 0.000 0.130 0.000 EF41-7E3 M -0.020 2.130 0.010 EF41-9A7 M 2.700 2.540 2.610 EF40-5B7 M 0.070 0.070 0.080 * Se resta el blanco de control de isotipo. HuSA indica control de albúmina de suero humano. PBS indica control de solución salina regulada con fosfato.___________________________________________________________________
Tabla 4: Unión de los anticuerpos seleccionados a sLea presentados como forma univalente (mono-) sLea, multivalente (poli)sLea o sLea-HSA.
Sobrenadante PBS NAV OD (490 nm) NAV+ mono- NAV+ poly-sLea SLeA-HSA* sLea
EF41-5B1(G) 0.050 0.050 0.900 2.280 1.740 EF41-5H11(G) 0.040 0.050 1.280 2.130 1.900 EF41-6F7(G) 0.050 0.050 0.050 0.080 0.100 EF41-9H1(G) 0.050 0.050 0.050 0.060 0.300 EF41-9H3 (G) 0.050 0.050 0.050 0.050 0.750 EF41-9A10 (G) 0.040 0.040 0.170 0.870 1.330 EF40-3C4 (G) 0.040 0.050 0.040 0.050 0.070 EF41-7E3 (M) 0.050 0.050 0.970 0.920 1.310
HuSA indica control de albúmina de suero humano. PBS indica control de solución salina regulada con fosfato. NAV indica control de avidina neutral.
Las regiones variables de cadena pesada y ligera de 4 anticuerpos seleccionados se recuperaron mediante RT-PCR y se clonaron en nuestros vectores de expresión IgG1 o IgM de longitud completa. El análisis de secuencia molecular usando IMGT/V-Quest (Brochet et al., Nucleic Acids Res., 36:W503-8 (2008)) reveló que los 3 anticuerpos IgG seleccionados 5B1 (IgGA,), 9H3 (IgG/7), y 5H11 (IgG/7) se derivaron de la misma familia VH y todos usaron cadenas ligeras lambda. Estos anticuerpos IgG1 mostraron diferentes secuencias de CDR con 16, 5 o 3 mutaciones que se desvían de la línea germinal, respectivamente (Figuras 1-6; Tabla 5). El anticuerpo IgM (7E3) usa la cadena ligera kappa y tiene 6 mutaciones de cadena pesada (Figuras 7-8; Tabla 5). El aumento de mutaciones en 5B1 es indicativo de maduración por afinidad. Se produjeron anticuerpos recombinantes en líneas celulares CHO en un sistema de biorreactor de ondas y se purificaron usando cromatografía de proteína A o hidroxiapatita para IgG e IgM, respectivamente. Los anticuerpos recombinantes purificados retuvieron las propiedades de los anticuerpos originales derivados del hibridoma con respecto a la unión y especificidad de ELISA.
Tabla 5: Clasificación de ADNc de anticuerpos anti-sLea humanos seleccionados derivados de donantes de sangre vacunados.
Figure imgf000026_0001
Análisis de la unión de células tumorales
La unión a la superficie celular es crucial para la actividad citotóxica y, por lo tanto, se probó a continuación. La citometría de flujo mostró una fuerte unión de los anticuerpos recombinantes 5B1, 9H3, 5H11 y 7E3 a las células DMS-79, una línea celular en suspensión de cáncer de pulmón de células pequeñas (Figura 11A). La unión de r5B1 y r7E3 también se confirmó en células de cáncer de colon HT29 (figura 11B), células de cáncer de páncreas BxPC3 (figura 11C), células de cáncer de ovario SW626 (figura 11D) y células de cáncer de colon Colo205-luc (figura 11F). Estos anticuerpos no lograron unirse a células de melanoma SK-MEL28 negativas a sLea (negativas a SLE121) (Figura 11E) o células de linfoma de ratón EL4 (datos no mostrados).
Medidas de afinidad
La afinidad/avidez relativa de la unión a sLea se probó mediante SPR usando un chip biosensor recubierto de estreptavidina para capturar sLea-PPA biotinilado. Como se muestra en la tabla 6, r5B1 y r7E3 se unen rápidamente a sLea-PPA y muestran una tasa de desactivación significativamente más lenta en comparación con 121SLE, un anticuerpo IgM murino anti-sLea disponible comercialmente que se usó para comparación. La afinidad de 5B1 se midió a 0.14 nmol/L, y la afinidad/avidez aparente de 7E3 fue aproximadamente 4 veces mayor (Tabla 6). La determinación de la afinidad de 9H3 se vio obstaculizada porque los anticuerpos de 9H3 (nativos y recombinantes) no se unieron al chip biosensor recubierto de sLea-PAA.
Tabla 6: Determinación de parámetros cinéticos de anticuerpos anti-sLea por SPR.
mAb Afinidad, nmol/L Kd, mol/L
Figure imgf000027_0001
Asociación ka, 1/mol/L s) Disociación kd, 1/s Isotipo
r5B1 0.14 1.4 x 10-10 7.0 x 109 1.1 x 106 1.6 x 10-4 IgG 1A.
r7E3 0.04 3.6 x 10-11 2.8 x 1010 8.8 x 105 3.2 x 10-5 IgM/K
121SLE 0.35 3.5 x 10-10 2.8 x 109 2.7 x 106 9.4 x 10-4 m-IgM
Análisis de especificidad
Los ensayos preliminares para sondear la especificidad de los carbohidratos mostraron que 5B1, 9H3 y 7E3 no se unían a los antígenos sLeX, Lea o LeY estrechamente relacionados o los gangliósidos GD2, GD3, fucosil-GM1, GM2 y GM3 medidos por ELISA. o SPR. El análisis adicional de la unión de 7E3, 5B1 y 121SLE a sLea-PAA-biotina o sLea-sp-biotina capturada en un chip de avidina Biacore mostró que los tres anticuerpos se unían a la forma polivalente de sLea, mientras que se encontró que 7E3 y 5B1 se unían a la forma monovalente. La unión de 5B1 a sLea-PAA también fue inhibida por el tetrasacárido sLea de una manera dependiente de la dosis en una serie de análisis de concentración de Biacore (datos no mostrados). Estos resultados son consistentes con observaciones previas de que se encontró que los sueros con altos títulos de anticuerpos anti-sLea eran específicos para sLea, es decir, no reactivos con los gangliósidos GM2, GD2, GD3, fucosil GM1 o los glicolípidos neutros globo H y Ley por ELISA. Ragupathi et al., Cancer Immunol Immunother 58:1397-405 (2009). En un ensayo de competición con 9 unidades estructurales de carbohidratos relacionados distintos en diversas presentaciones (por ejemplo, como ceramida o conjugado con BSA o HSA), solo el tetrasacárido sLea y el conjugado sLea-HSA pudieron inhibir la unión al conjugado sLea-HSA (Tabla 7).
Tabla 7: Unión a sLeA-PAA-HSA en presencia de diversos glicoconjugados relacionados.
Antígenos
Figure imgf000027_0002
Sialyl Tn-HSA 1.866 1.981 1.882 1 2.218 2.259
GloboH-ceramida 1.866 1 1.906
Figure imgf000027_0003
2.098 2.201
sTn(c)-HSA (directo) 1.896
Figure imgf000027_0004
1.947
Figure imgf000027_0005
2.131 2.136
sTn-M2-HSA (mono) 1.937
Figure imgf000027_0006
1.843
Figure imgf000027_0007
2.040 2.066
LeX-gal-cer 1.893
Figure imgf000027_0008
1.791
Figure imgf000027_0009
2.173 2.175
dPSM 1.897 1 1.757 1 2.218 2.110 Tn-mono alil M2-HSA 1.837 1.905 2.041 1.991 2.083 2.107 Tighe Leb/LeY mucina 1.808 1 1.951 1.964 2.106 2.065
LeX-PAA 1.830 1.873 2.053 2.036 2.099 2.108
LeY-ceramida 1.824 1.821 1.940 1.980 2.143 2.085
Lewis Y ceramida 1.833 1.844 1.941 1.874 2.090 2.111
Tn(c)-HSA 1.881 1.711 1.893 1.917 2.146 2.030
T-serina-BSA 1.809 1.830 2.128 2.089 2.137 2.039
TF(c) HSA 1.874 1.909 2.031 2.032 2.119 2.094
Tn LY-BSA 1.901 1.863 1.944 1.959 2.084 2.118
NPrGBMP-HSA 1.892 1.797 1.944 1.964 2.090 2.111
sLeA - HSA 1.329 1.298 1.373 1.266 1.542 1.621
sLeA tetrasacárido 0.371 0.312 0.797 0.814 2.114 2.041
Ninguno 1.809 1.809 1.993 1.993 2.096 2.096
Blanco 0.101 0.093 0.093 0.092 0.108 0.100
Para examinar la especificidad de carbohidratos con más detalle, los anticuerpos 5B 1 y 7E3 también se probaron mediante análisis de matriz de glucanos realizado por el grupo the Consortium for Functional Glycomics Core H. Ambos anticuerpos se probaron a 10 pg/mL en matrices impresas que consisten en 465 glucanos en 6 réplicas. Los resultados confirmaron la alta especificidad de ambos anticuerpos con reconocimiento selectivo del tetrasacárido sLea, Neu5Aca 2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp y Neu5Gca2-3Galp1-3(Fuca 1-4)GlcNAcp y ausencia virtual de unión a antígenos estrechamente relacionados que estaban presentes en la matriz, incluidos sLex, Lea, Lexy Ley. Los resultados se resumen en la tabla 8, que muestra las 5 principales estructuras de glucanos de 465 que fueron reconocidas por los respectivos anticuerpos.
Tabla 8: Análisis de la especificidad de carbohidratos mediante cribado de matriz de glucanos.
Figure imgf000028_0001
Actividad de CDC
Para evaluar la actividad funcional de 5B1 y 7E3, se probó la actividad citotóxica con células DMS-79 en presencia de suero humano como fuente de complemento. Ambos anticuerpos mostraron en algunos ensayos una actividad de muerte cercana al 100 % a 10 |ig/mL, mientras que un anticuerpo de control con diferente especificidad (1B7, mAb anti-GD2 IgG1) no tuvo efecto a las mismas concentraciones (datos no mostrados). La actividad de CDC depende de la concentración, y 7E3 fue significativamente más activo que 5B1 en este ensayo (Figura 12), lo que se esperaba ya que se sabe que los anticuerpos IgM son más efectivos en los ensayos de citotoxicidad mediada por complemento. La EC50 (50 % de citotoxicidad) fue 1.7 |ig/mL para 5B1 y 0.1 |ig/mL para 7E3, lo que se traduce en una potencia aproximadamente 85 veces mayor para 7E3 en base molar (Figura 12).
Actividad de ADCC
Aunque 7E3 es significativamente más potente en el ensayo de CDC, se sabe que los anticuerpos IgG tienen actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), que se cree que es importante para la destrucción de tumores in vivo. Se midieron altos niveles de citotoxicidad usando anticuerpo 5B1 con células diana PBMC humanas y DMS-79 en diversas proporciones E:T (Figura 13A). Se observaron niveles similares de citotoxicidad a proporciones E:T más bajas con células NK primarias (Figura 13B). Un experimento de respuesta a la dosis con PBMC de 2 donantes medidos en una proporción E/T de 100:1 mostró una eficacia similar, y se alcanzó una citotoxicidad superior al 85 % a concentraciones de 0.5 |ig/mL o más de 5B1 (Figura 13C). La citotoxicidad mediada por 5B1 requiere receptores FcyRIII ya que puede bloquearse con anticuerpos anti-CD16 3G8. También se midieron altos niveles de citotoxicidad usando anticuerpo 5B1 con PBMC humanas contra células Colo205-luc en una proporción E:T de 100:1. La actividad de ADCC lograda con 1 |ig/mL de anticuerpos 5B1 fue superior a la actividad observada con anticuerpos frente a GM2, fucosil-GM1, globo H o ácido polisiálico. Como se esperaba, 7E3 y 121SLE murino (ambos son IgM) fueron inactivos en este ensayo.
Ensayo de internalización de 5B1
Previamente se demostró que los conjugados de anticuerpos dirigidos al antígeno "estrechamente relacionado con" Lewis Y se internalizan rápidamente y son muy eficaces en modelos animales. Hellstrom et al., Cancer Res 50:2183-90 (1990); Trail et al., Science 261:212-5 (1993). Para examinar si sLea está internalizada, se incubó la línea celular pancreática, BxPC3 con 5B1, y luego se agregó Hum-ZAP, un IgG anti-humano conjugado con la proteína saporina de inactivación de ribosomas. Kohls et al., Biotechniques 28:162-5 (2000). Las células que internalizan el complejo que contiene saporina mueren, mientras que la saporina no internalizada deja las células ilesas. Como se muestra en la figura 14, las células BxPC3 se destruyen eficazmente en presencia de dosis crecientes de 5B1, mientras que la presencia de un anticuerpo IgG1 de isotipo coincidente dirigido contra GD2, que no se expresa en estas células, no destruye las células.
Actividad en modelo animal de xenoinjerto para metástasis
Para evaluar la actividad de 5B1 in vivo, los anticuerpos se probaron en dos modelos de xenoinjerto usando ya sea células tumorales Colo205-luc o células tumorales DMS-79 en ratones SCID. Para el modelo de xenoinjerto que usa células tumorales Colo205-luc, se inyectaron a cinco ratones por grupo con 0.5 x 106 células en la vena de la cola el día 0, y se verificó la inyección exitosa de las células obteniendo imágenes de los animales usando el sistema de imágenes in vivo IVIS 200. (Caliper Life Sciences). Un día después, los animales se trataron con anticuerpos 5B1 mediante inyección intraperitoneal o simulada de PBS. En el experimento 1, se administraron 100 |ig de 5B1 los días 1, 7, 14 y 21 (dosis total de 400 |ig), y en el experimento 2 los animales recibieron 100 |ig de 5B1 los días 1, 4, 7, 10, 14 y 21 (dosis total de 600 |ig). La mediana del promedio de supervivencia de los animales no tratados fue de 102 días en los 2 experimentos y todos los animales no tratados murieron en 155 días (Figura 15). El tratamiento de los animales mejoró significativamente la supervivencia: la supervivencia media se duplicó a 207 días en el grupo que recibió 4 dosis de 5B1 y 2 de 5 animales sobrevivieron hasta la finalización del experimento después de 301 días (prueba de rango logarítmico, P=0.0499; HR=3.46). La proporción de supervivientes aumentó aún más a 3 de 5 ratones cuando se administraron 6 dosis (prueba de rango logarítmico, P=0.0064; HR=6.375). El segundo experimento se terminó después de 308 días, y los animales supervivientes no revelaron tumores Colo205-luc a la sensibilidad más alta del sistema de formación de imágenes (datos no mostrados).
En un segundo estudio, ratones inyectados de forma similar con células tumorales Colo205-luc como se describió anteriormente, se trataron con dosis crecientes de anticuerpos 5B1 o 7E3 (100 |ig, 300 |ig o 1 mg). Todos los animales recibieron inicialmente una inyección interperitoneal o simulada de PBS (control) del anticuerpo 5B1 o 7E3 el día 4 después de la inyección de células tumorales, luego dos veces por semana durante las dos primeras semanas y una vez por semana durante las siguientes 7 semanas. El tratamiento retardado con diversas dosis de 5B1 mostró una protección dependiente de la dosis hasta la curación completa en ratones SCID injertados con células tumorales Colo205-luc (Figuras 16 y 17). El tratamiento con anticuerpos 7E3 no mostró mayor protección a pesar de una mayor afinidad aparente (datos no mostrados).
En un modelo de xenoinjerto que usa células DMS-79, se inyectaron subcutáneamente a cinco ratones por grupo con 1 x 106 células el día 0, y se inició el tratamiento el día 19 después de que la longitud del tumor alcanzara 5 mm (-20 mm2). A continuación, los animales se trataron con anticuerpos IgG o 5B 1 humanos administrados mediante inyección intraperitoneal a 200 |ig por dosis, más cRGD mediante inyección intravenosa inicialmente a 80 |ig, luego 5 días a la semana, 40 |ig por dosis hasta el día 37. El crecimiento de tumores DMS-79 establecidos se suprimieron o retrocedieron en animales tratados con 5B1 o una combinación de 5B1 más cRGD (Figura 18A y 18B). El tratamiento de animales con 5B1 el día del injerto con células DMS-79 en un modelo subcutáneo evitó completamente el crecimiento del tumor (datos no mostrados).
Los datos anteriores demuestran una capacidad significativa para suprimir o hacer retroceder tumores establecidos y proporcionar un beneficio de supervivencia usando el tratamiento con anticuerpo 5B1.
Ejemplo II
Detección y diagnóstico por inmuno-PET de cáncer de páncreas y otros adenocarcinomas positivos para sLea usando el anticuerpo monoclonal radiomarcado 5B1
Los adenocarcinomas son una de las principales causas de muerte por cáncer. La detección del cáncer de páncreas sigue siendo especialmente difícil y el diagnóstico a menudo se realiza en un estadio tardío. Los enfoques para la detección temprana de cánceres de páncreas primarios y metastásicos podrían tener un impacto clínico significativo. En la práctica clínica, se controlan los niveles elevados de antígeno sLea para identificar una sospecha de malignidad oculta en pacientes con cáncer de páncreas. Como se describe en este documento, se investigó el potencial de una nueva sonda de formación de imágenes de inmunoPET dirigida a sLea en modelos preclínicos de cáncer de páncreas y otros adenocarcinomas positivos a sLea. El anticuerpo monoclonal humano anti-sLea 5B1 mostró tinción positiva en adenocarcinomas humanos que se sabe son positivos para sLea pero no en neoplasias malignas negativas para sLea o en la mayoría de los tejidos normales. El 5B1 radiomarcado con 89Zr (89Zr-5B1) mostró un marcado alto (> 80 %) y rendimientos de purificación (> 95 %). Se investigaron las imágenes con 89Zr-5B1 en xenoinjertos de cáncer de páncreas subcutáneo, ortotópico y metastásico en ratones SCID hembras. Las imágenes de PET adquiridas y los estudios de biodistribución demostraron una especificidad y localización excepcionales de 89Zr-5B1 para los xenoinjertos de BxPC3 que sobreexpresan sLea con una unión no específica mínima a los tejidos sanos. Un análisis adicional en modelos de xenoinjerto subcutáneo de cáncer de pulmón de células pequeñas y colon dio como resultado una excelente delineación del tumor por 89Zr-5B1 también. De acuerdo con lo anterior, estos resultados muestran que 89Zr-5B1 se puede usar como una sonda molecular para la detección temprana de neoplasias que expresan sLea en la clínica.
Líneas celulares y cultivo de tejidos
Todas las manipulaciones de cultivos de tejidos se realizaron siguiendo técnicas estériles. Las células de cáncer de pulmón de células pequeñas DMS79 y BxPC3 se obtuvieron the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células de cáncer colorrectal Colo205-luc (Bioware Ultra) se adquirieron de Caliper Life Sciences (CLS, Hopkinton, MA). Todas las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones de ATCC y CLS a 37 °C con atmósfera humidificada con CO2 al 5 %.
Evaluación in vitro de los niveles de expresión de sLea mediante FACS
La citometría de flujo con las líneas de células cancerosas cultivadas indicadas se realizó como se describe en este documento en el ejemplo I. En resumen, se lavaron suspensiones de células individuales de 1x106 células tumorales en cultivo por tubo en PBS con suero bovino fetal (FBS) al 3 %. A continuación, se agregaron anticuerpos monoclonales humanos r5B1 (IgG contra sLea) a 20 ug/mL por tubo y se incubaron en hielo durante 30 min. Después de lavar en PBS con FBS al 3 %, se agregaron 20 |il de anti-IgG humana de cabra diluida 1:25 marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) y la mezcla se incubó durante otros 30 minutos en hielo. Después de un lavado final, la población positiva y la intensidad de fluorescencia media de las células teñidas se diferenciaron usando barrido FACS (Becton & Dickinson, San Jose, CA). Se usaron células teñidas solo con IgG antihumana de cabra marcadas con isotiocianato de fluoresceína para establecer el resultado de FACScan al 1 % como fondo para comparar con el porcentaje de células positivas teñidas con mAb primario.
Preparación de anticuerpos marcados con 89Zr
Se prepararon y purificaron anticuerpos 5B 1 recombinantes como se describe en este documento. Los anticuerpos 5B 1 y una IgG humana inespecífica se funcionalizaron con p-isotiocianatobencil-desferrioxamina (DFO-Bz-NCS, Macrocyclics, Inc., Dallas, TX) con una proporción mAb: DFO-Bz-NCS de 1:4. Por ejemplo, a 300 |iL de 5B1 (1.23 mg en PBS, pH ~ 9), se agregó un volumen de 7.2 |iL de DFO-Bz-NCS (4.25 mM en DMSO). La reacción se incubó a 37 °C durante 1-1.5 h. Los anticuerpos funcionalizados se purificaron mediante una columna de desalación PD10 (GE Healthcare) o un filtro centrífugo de 10 kDa (Amicon).
Se produjo Zr-89 mediante bombardeo con haz de protones de hoja de itrio y se aisló con alta pureza como oxalato de Zr-89 en MSKCC de acuerdo con el procedimiento previamente establecido. Holland et al., Nuclear Medicine and Biology 36:729-39 (2009). El marcaje de los anticuerpos se realizó mediante métodos descritos por Holland et al., Journal of Nuclear Medicine official publication, Society of Nuclear Medicine 51:1293-300 (2010). En general, el oxalato de Zr-89 se neutralizó a pH 7.0-7.2 con Na2CO31 M. Luego se agregaron los anticuerpos DFO. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. La purificación posterior se llevó a cabo usando una columna de desalación PD10 con solución salina al 0.9 %.
Experimentos in vitro
Se investigó la estabilidad de 89Zr-5B1 in vitro en solución salina al 0.9 % y en albúmina de suero bovino al 1 % durante 5 días a 37 °C. Los cambios en la pureza radioquímica se controlaron en t=0-5 días mediante radio iTLC con DTPA 50 mM como fase móvil. Se realizaron ensayos de inmunorreactividad in vitro de acuerdo con el protocolo descrito por Lindmo et al., Journal of Immunological Methods 72:77-89 (1984), para demostrar la integridad de los anticuerpos radiomarcados con Zr-89.
Modelos animales
Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices establecidas por the Institutional Animal Care and Use Committee. Se indujeron tumores en las patas traseras a ratones hembra CB17SC-F SCID (Jackson Laboratories, 6-8 semanas, 20-22 g) o ratones atímicos desnudos (nu/nu). Todas las líneas celulares se inocularon por vía subcutánea en 200 |iL de medio:solución de Matrigel (BD Biosciences) 1:1 y se cultivaron hasta un volumen tumoral máximo de 250 mm3 antes de su uso.
Estudios de biodistribución
Se realizaron estudios de biodistribución en varias cohortes de ratones que llevaban xenoinjertos de pulmón de células pequeñas DMS79, páncreas BxPC3 y colorrectal Colo205-luc separados (n=3-5). Se administraron Zr-89 mAb (10-20 |iCi, 1-2 |ig) en 100 |iL de solución salina al 0.9 % por vía intravenosa en la vena lateral. Se coinyectó mAb no marcado adicional (10-50 |ig) junto con el trazador. Se realizó un estudio de bloqueo con 250 |ig de exceso de mAb sin marcar para abordar la especificidad del anticuerpo frente a sLea en una cohorte de ratones. Después de cada punto de tiempo (t=24, 48, 120 h p.i.), los ratones fueron sacrificados por asfixia con CO2. La sangre se extrajo inmediatamente mediante punción cardíaca mientras se extraía el tumor junto con los órganos elegidos. Se midió el peso húmedo de cada tejido y se contó la radiactividad unida a cada órgano usando un contador gamma Wizard22480 (Perkin Elmer). El porcentaje de absorción de trazador expresado como % de dosis inyectada por gramo (% de ID/g) se calculó como la actividad unida al tejido por peso de órgano por disminución de la dosis inyectada real corregida al tiempo del recuento.
Inmuno-PET de pequeños animales
Los experimentos de formación de imágenes se realizaron con un escáner microPET Focus 120 o R4 (Concorde Microsystems). A los ratones (n=3-5) se les administraron anticuerpos marcados con Zr-89 (200-300 |iCi, 15-25 |ig) en formulaciones de solución salina al 0.9 % de 100-200 |iL mediante inyecciones en la vena lateral de la cola. Las adquisiciones de PET de cuerpo entero se registraron en ratones a las 24-96 h p.i. mientras estaba anestesiado con isofluorano al 1.5-2.0 % (Baxter Healthcare) en oxígeno. Las imágenes se analizaron usando el software ASIPro VM™ (Concorde Microsystems). Se dibujaron y representaron las regiones de interés (ROI) en función del tiempo.
Inmunohistoquímica
Se preparó 5B1 biotinilado incubando un exceso molar de 20x Sulfo-NHS-LC-biotin (Thermo Scientific/Pierce No. de Cat.
21327) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La biotina libre se eliminó con columnas de centrifugación de desalado Zebra™ (Thermo Scientific/Pierce, No. de Cat. 89889) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos se intercambiaron con solución reguladora por PBS que contenía azida sódica al 0.01 % a una concentración de 1.1 mg/ml. La unión a las células DMS79 fue confirmada por FACS y fue comparable al anticuerpo 5B1 original.
Se determinaron las condiciones de tinción inmunohistoquímica preliminares usando células Colo205 como control positivo y células SK-MEL28 como control negativo. Se prepararon pellas celulares, se fijaron con formalina y se incrustaron en parafina. Los portaobjetos se incubaron con 5B1 biotinilado diluido en suero humano normal al 10 % (v/v) en PBS (Jackson ImmunoResearch Labs; No. de Cat. 009-000-121). La tinción se realizó mediante automatización de Ventana (Discovery XT platform-Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, AZ) con el método estándar de inmunoperoxidasa de estreptavidina-biotina y el sistema de detección DAB como método de tinción. La recuperación de antígeno se llevó a cabo usando calor y la solución de acondicionamiento CC1 de Ventana. El monoclonal de ratón CA 19.9 (clon 116-NS-19-9) de Signet (Covance) dio resultados comparables en el estudio piloto. Las células Colo205 son fuertemente positivas con 5B1 biotinilado usado a 10 |ig/mL mientras que las células SKMEL28 fueron completamente negativas. Las micromatrices de tejido Histo-Array™ se adquirieron de Imgenex (San Diego, CA). Se usaron los siguientes portaobjetos que contenían núcleos de biopsia de tumor, así como algunos núcleos de tejido normal: IMH-327 (cánceres comunes, 59 muestras), IMH-359 (colorrectal: metástasis de cáncer normal; 59 muestras) e IMH-324 (cáncer metastásico en ovario). Los núcleos de tejido tumoral pancreático estaban presentes en IMH-327.
sLea concentración en suero in vivo
Se desangraron ratones que llevaban xenoinjertos de Colo205, BxPC3 y DMS79 para ensayos de antígeno sLea. Un grupo de ratones sin tumor sirvió como control. Los niveles de sLea en el suero de ratones se midieron usando el kit ST AIA-PACK CA19.9 (No. de Cat. 025271, TOSOH Bioscience Inc, South San Francisco, CA). El principio del ensayo se basa en el ensayo métrico inmunoenzimático de dos sitios. El análisis se realizó como se describe en el manual de instrucciones del fabricante. La densidad óptica de las placas de inmunoensayo se midió mediante un analizador de inmunoensayo automatizado TOSOH AIA2000 (TOSOH Bioscience, Inc, San Francisco, CA).
Análisis estadístico
Los valores de los datos se expresaron como la media ± SD a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó usando el software GraphPad Prism versión 5.03 usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Dunnett. Un valor de p <0.05 se considera estadísticamente significativo.
Resultados
La especificidad de unión de 5B1 se probó mediante la tinción de micromatrices de tejidos normales y malignos seleccionados. La reactividad de 5B1 se restringió a neoplasias y tejidos normales ocasionales que se sabía previamente que sobreexpresan sLea (Figura 19; Tabla 9). La mayoría de los tejidos normales fueron completamente negativos (Tabla 9). Por el contrario, se encontró una tinción positiva fuerte en 21/34 adenocarcinomas de colon (62 %), 33/57 metástasis de adenocarcinoma en el ovario (58 %) y 7/9 cánceres ductales pancreáticos (66 %) en diversos estadios (Tabla 10). Como se muestra en la figura 19, la reactividad típica era una tinción citoplásmica difusa con algunas células tumorales que mostraban claramente una tinción distinta de la membrana celular. Adicionalmente, también se encontró que algunos cánceres de ovario en anillo de sello y algunos cánceres de pulmón y mama eran muy positivos. Por el contrario, solo 4/43 muestras de cáncer de próstata y 0/51 casos de GIST fueron positivos (datos no mostrados).
Tabla 9: Estudio de la unión de 5B1 a tejidos normales
Tejido normal Tinción
Cerebro negativo
Mama positivo
Colon positivo
Riñón negativo
Hígado negativo
Pulmón negativo
Ganglio li negativo
Músculo negativo
Páncreas positivo
Placenta negativo
Piel negativo
Bazo negativo
Estómag
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negativo
Tabla 10: Tinción de adenocarcinomas ductales pancreáticos con 5B1.
IHC SR1 Estadio Edad Sexo Histología
neg II 71 M moderadamente diferenciado pos++ III 68 M moderadamente diferenciado neg III 64 F moderadamente diferenciado pos++ III 46 M moderadamente diferenciado pos++ III 54 M moderadamente diferenciado pos++ III 40 M moderadamente diferenciado pos+/- IVA 66 M moderadamente diferenciado pos++ IVA 45 M moderadamente diferenciado tejido pobre IVA 64 F moderadamente diferenciado pos++ IVA 69 M pobremente diferenciado
La alta especificidad de la inmunotinción de 5B1 para tejidos cancerosos que expresan sLea fue la base para su uso este mAb como sonda de PET. La modificación de 5B1 con el análogo de bencil-isotiocianato de deferoxamina (DFO-Bz-NCS) se realizó en una proporción de 4:1 (quelato: mAb) con posterior purificación mediante filtración centrífuga usando solución salina como solución reguladora de lavado. Se realizó un radiomarcado fácil con Zr-89 a temperatura ambiente después del ajuste del pH a 7.0-7.2. Es necesario un intervalo de pH más estrecho, cercano al neutro, para lograr rendimientos óptimos de radiomarcaje de > 80 %. El Zr-89 libre no unido se eliminó mediante la columna de desalación PD10. La concentración del producto se realizó usando un filtro centrífugo (MWCO: 10 kDa). Se estableció una actividad específica relativamente alta de 12.1 ± 1.1 mCi/mg. Se aseguraron purezas radioquímicas de más del 95 % antes de su uso. Los ensayos de inmunorreactividad mostraron retención de actividad para sLea (72.4 ± 1.1 %, n=3). La estabilidad en la albúmina de suero bovino a 37 °C se mantuvo en > 95 % durante 5 días (datos no mostrados). En solución salina, la desmetalación se observó tan pronto como a las 24 h (> 85 % complejado) con aproximadamente > 75 % radiometal unido después de 120 h a 37 °C.
Se llevaron a cabo estudios de biodistribución y formación de imágenes de PET en animales pequeños usando ratones SCID hembra implantados subcutáneamente con xenoinjertos de cáncer de páncreas BxPC3 en la pata trasera izquierda. Las imágenes de PET obtenidas confirmaron una delineación sustancial del sLea asociado al tumor por 89Zr-5B1. A partir de las proyecciones de intensidad máxima (MIP) de la figura 20, los xenoinjertos de BxPC3 (n=3) mostraron una acumulación excepcional del radiotrazador administrado por vía intravenosa. Las regiones de interés (ROI) extraídas en el tumor a partir de las imágenes de PET mostraron una absorción de 5.0±0.4 % de ID/g (2 h), 16.2±2.5 % de ID/g (24 h), 23.8±4.7 % de ID/g (48 h), 36.8±6.1 % de ID/g (96 h) y 49.5±7.7 % de ID/g (120 h). La acumulación de sangre y la actividad normal de unión al tejido parecieron aclararse después de 24 h p.i. Los resultados de los experimentos de biodistribución son consistentes con los datos de PET. Se observó una alta localización tumoral de 89Zr-5B1 a las 24 h (84.7±12.3 % DI/g, n=4); la absorción aumentada se mostró adicionalmente a las 120 h p.i. (114.1±23.1 % de ID/g, n=4) (Figura 21). La absorción tumoral supera el 100 % debido al pequeño peso (62.4±0.03 mg). El % de ID a las 24 h p.i. se encontró que era diez veces mayor que el de la IgG no específica en puntos de tiempo similares (Figura 21 Recuadro). La inhibición competitiva con 250 |ig de 5B1 no radiomarcado a las 24 h p.i. bloqueó la acumulación de trazador que define la especificidad de la absorción. Se observó una unión mínima del 89Zr-5B1 al páncreas normal y al resto de los tejidos normales recolectados, proporcionando un alto contraste de tumor a tejido en todos los puntos de tiempo.
Después de los resultados anteriores, se ensayó 89Zr-5B1 en un modelo de tumor de páncreas ortotópico BxPC3. Los modelos ortotópicos son clínicamente relevantes y ofrecen una prueba clínicamente aceptada de la eficacia de la sonda PET. Después de la inoculación en el páncreas, el crecimiento del tumor se controló semanalmente mediante formación de imágenes ópticas bioluminiscentes. Se realizaron experimentos con imágenes de PET una vez que los tumores fueron palpables. Se realizó una comparación de las propiedades de delineación del tumor de la sonda entre FDG-PET y 89Zr-5B1 (Figura 25). La tomografía computarizada (CT) junto con la PET proporcionó una visualización potenciada de la región anatómica de interés.
Para evaluar 89Zr-5B1 como sonda de PET en otros adenocarcinomas que expresan sLea, se ensayó 89Zr-5B1 en modelos de cáncer de pulmón y colon. Se realizaron experimentos con animales pequeños usando células de cáncer de pulmón de células pequeñas DMS79 y células de cáncer de colon Colo205-luc inyectadas por vía subcutánea en la pata trasera derecha de ratones SCID hembra. Las imágenes de PET MIP se adquirieron después de 24-120 h p.i. de 200-300 |iCi (16-25 |ig) inyectados por vía intravenosa. Se demostró una absorción tumoral heterogénea de DMS79 con 38.15±2.12 % de ID/g tan pronto como a las 24 h p.i con excelente señal contra el fondo (Figura 22A). Un aumento en la acumulación de tumor trazador resultó después de 48 h p.i. (44.60±6.47 % de ID/g) con retención a 120 h p.i. (41.97±12.23 % de ID/g). El 89Zr-5B1 unido no específico se eliminó rápidamente de los tejidos normales con una absorción de fondo mínima o nula a las 48 h p.i. Adicionalmente, se observó delineación del tumor en los xenoinjertos Colo205-luc como se muestra en la figura 22B a las 24-120 h p.i. Las ROI mostraron acumulación de tumor con 10.5±0.76, 23.5±2.7, 24.8±4.0, 18.4±4.7, 16.5±2.3 % de ID/g a 2, 24, 48, 96 y 120 h respectivamente. Se produjo un aumento observable de la acumulación hepática con el tiempo con la consiguiente disminución de la absorción tumoral como se muestra en las regiones de interés extraídas de las imágenes de PET (Figura 22C). Los datos generados a partir de los estudios de biodistribución se correlacionan bien con los resultados de PET observados (datos no mostrados).
Se cuantificó el nivel de sLea en suero de ratón a medida que progresaban los tumores. Se llevó a cabo la exanguinación de ratones SCID que llevaban xenoinjertos Colo205, DMS79 y BxPC3 con un grupo no portador de tumor que sirvió como control. Los valores de sLea mostraron niveles elevados de sLea en ratones expuestos a Colo205 en comparación con los ratones implantados pancreáticos BxPC3 y DSM79 (Tabla 11).
Tabla 11: Valores en suero de sLea de ratones que portan xenoinjertos de tumor colorrectal (Colo205), páncreas (BxPC3) y pulmón de células pequeñas (DMS79) en comparación con el control.
Tipo de tumor Animal # Volumen del tumor, mm3 sLea, U/ml
Colo205-luc M1 269.5 3227
M2 257.3 2957
M3 281.3 1318
BxPC3 M1 232.38 N.D.
M2 320.00 N.D.
M3 220.50 N.D.
DMS79 M1 288.0 N.D.
M2 245.0 N.D.
M3 232.4 N.D.
Control M1 - 3
Figure imgf000034_0001
N.D.=No detectado.
Estos resultados demuestran que un anticuerpo anti-sLea radiomarcado (89Zr-5B1) es específico para la detección y el diagnóstico de adenocarcinoma pancreático y otros adenocarcinomas positivos para sLea. 89Zr-5B1 se produjo con excelentes rendimientos y pureza, junto con una alta actividad específica e inmunorreactividad retenida. La evaluación de 89Zr-5B1 en modelos de tumores de páncreas subcutáneos, ortotópicos y metastásicos proporcionó una excelente delineación y diagnóstico de tumores. La evaluación preclínica de este radiotrazador en animales pequeños portadores de tumores de pulmón de células pequeñas y de colon demostró la utilidad universal de este trazador para las neoplasias que expresan sLea.
Ejemplo III
Los diacuerpos anti-sLea se unen a diversas líneas celulares cancerosas
Se generaron dos diacuerpos usando los dominios de VH y VL de los aislados clonales 5B1 y 7E3 descritos en este documento, denominados 5B 1CysDb y 7E3CysDb, respectivamente (Figuras 9 y 10). Ambos diacuerpos contenían una región enlazante de cinco aminoácidos entre los dominios VL y VH. También se incluyó una etiqueta de polihistidina en el C-terminal, que se usó para purificación y detección, para ambos diacuerpos.
La unión de 5B1CysDb y 7E3CysDb a tres líneas celulares cancerosas: (1) células DMS-79, una línea celular en suspensión de cáncer de pulmón de células pequeñas; (2) células Capan-2, células de adenocarcinoma pancreático; y (3) células BxPC3, células de cáncer de páncreas, se evaluó incubando 0.25 millones de células en 0.2 ml con 10 pg/mL de 5B1CysDb o 7E3CysDb, respectivamente. Las combinaciones de células y diacuerpos se incubaron durante 40 minutos en hielo en Pb S/FBS al 2 %.
Después del lavado, las células se incubaron durante 40 minutos con 0.2 ml de anticuerpo anti-His marcado con ALEXA-488 diluido 1:1000 (Life Technology, No. de Cat. A21215). Después de un segundo lavado, las células se analizaron con un citómetro de flujo Guava. Tanto 5B1CysDb como 7E3CysDb demostraron una unión significativa a las células DMS-79, Capan-2 y BxPC3 (Tabla 12).
Tabla 12: Unión de 5B 1CysDb y 7E3CysDb a líneas celulares
5B1CysDb 7E3CysDb
Línea celular Porcentaje (+) MFI Porcentaje (+) MFI
DMS-79 98.1 113.0 93.8 124.6
Capan-2 63.8 98.5 65.9 235.3
BxPC3 51.3 39.9 50.2 49.7
MFI - intensidad fluorescente media
Ejemplo IV
La administración de 5B1 y Taxol inhibe el crecimiento tumoral
Se evaluó la actividad antitumoral de la coadministración de un anticuerpo anti-sLea (5B1) y el agente quimioterapéutico Taxol (Paclitaxel) en modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas y cáncer de pulmón de células pequeñas. Como se describió anteriormente en este documento, se inyectaron 1 millón de células BxPc3 (células tumorales pancreáticos) o 5 millones de células DMS-79 (células de cáncer de pulmón de células pequeñas) en el flanco trasero de ratones hembra CB17 SCID de 6 semanas de edad (día 0; N=5). Se dejó que los tumores DMS79 crecieran durante 21 días hasta que el tamaño medio del tumor fue 193±64 mm3. Se administró IgG humana o 5B 1 (0.5 o 1 mg) por vía intraperitoneal dos veces por semana (a partir del día 21), y se administró Taxol (0.2 mg/dosis) por vía intravenosa los días 23, 30, 37 y 44. En el modelo de xenoinjerto de DMS-79, la coadministración de anticuerpo 5B 1 y Taxol limitó significativamente el crecimiento tumoral y dio como resultado una regresión del tumor en comparación con IgG humana de control o anticuerpo 5B 1 y Taxol administrados individualmente (Figura 23).
En el modelo de xenoinjerto de BxPc3, los tumores se hicieron crecer durante 14 días, en los que alcanzaron un promedio de 126±30 mm3. Se administró Taxol por vía intravenosa los días 14, 21, 28 y 34 (semanalmente) y se administró 5B1 dos veces por semana a partir del día 14. La coadministración de anticuerpo 5B1 y Taxol limitó significativamente el

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que se une a Sialyl-Lewisa e induce la actividad de ADCC o CDC, comprendiendo dicho anticuerpo un dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL), en el que dicho dominio de VH y dicho dominio de VL comprenden respectivamente una secuencia de aminoácidos de los residuos 20­ 142 de SEQ ID NO: 2 y residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4.
2. Un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que dicha cadena pesada de anticuerpo comprende un dominio de cadena pesada variable (VH) que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 20-142 de SEQ ID NO: 2; y un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que dicha cadena ligera de anticuerpo comprende un dominio de cadena ligera variable (VL) que tiene una secuencia de aminoácidos de los residuos 20-130 de SEQ ID NO: 4, en el que el anticuerpo comprende dicha cadena pesada de anticuerpo y dicha cadena ligera de anticuerpo se une a Sialyl-Lewisa e induce la actividad de ADCC o CDC.
3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de aminoácidos del dominio de VH está codificada por la secuencia de ácido nucleico de los residuos 58-426 de SEQ ID NO: 1.
4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de aminoácidos del dominio de VL está codificada por la secuencia de ácido nucleico de los residuos 58-390 de SEQ ID NO: 3.
5. Anticuerpo aislado según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano, preferiblemente un isotipo IgG o IgM, en el que dicho anticuerpo IgG es preferiblemente una subclase IgG1.
6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 o 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.
7. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 o 5 y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite.
8. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 7, en la que dicha enfermedad es cáncer o una formación de tumor, en la que las células de dicho cáncer o dicho tumor expresan sLea; o en la que dicho cáncer o tumor se selecciona del grupo que consiste en un tumor del tracto gastrointestinal, cáncer de colon, adenocarcinoma colorrectal, cáncer de colon metastásico, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, adenocarcinoma de páncreas, carcinoma de células pequeñas del pulmón, adenocarcinoma de vejiga, cáncer de ovario en anillo de sello, cáncer de ovario, carcinoma metastásico, adenocarcinoma de estómago, adenocarcinoma de esófago, adenocarcinoma de garganta, adenocarcinoma del tracto urogenital, y adenocarcinoma de mama.
9. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 7, en la que dicha composición farmacéutica está adaptada para administrar concurrente o sucesivamente un segundo agente terapéutico, preferiblemente dicho segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o un agente inmunoterapéutico.
10. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 9, en la que el segundo agente terapéutico es un Taxol.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201515094D0 (en) 2015-08-25 2015-10-07 Univ Nottingham Sialyl-di-lewis a as expressed on glycoproteins but not glycolipids as a functional cancer target and antibodies thereto
WO2018011353A1 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Bioarctic Ab Brain delivery protein
UA126388C2 (uk) 2016-11-18 2022-09-28 Астеллас Фарма Інк. Fab-фрагмент антитіла до muc1 людини
CA3045466A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-pd-l1 antibodies for immuno-pet imaging
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
WO2018232349A1 (en) * 2017-06-15 2018-12-20 Development Center For Biotechnology Antibody-drug conjugates containing anti-globo h antibodies and uses thereof
TWI795415B (zh) * 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
JP7304846B2 (ja) 2017-07-24 2023-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ８抗体およびその使用
PT110526B (pt) 2018-01-26 2021-02-04 Univ Nova De Lisboa Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais
KR102115236B1 (ko) * 2018-01-29 2020-05-27 (주)에스엠티바이오 췌장 또는 담관계암 치료를 위한 키메라 항원 수용체
CN113056286A (zh) * 2018-09-10 2021-06-29 冷泉港实验室 用于治疗胰腺炎的方法
CN113454115A (zh) * 2018-10-19 2021-09-28 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向唾液酸化路易斯a的嵌合抗原受体及其用途
EP4065605A4 (en) * 2019-11-26 2023-07-12 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. ANTIBODIES AGAINST CARBOHYDRATE ANTIGENS
CN114605550B (zh) * 2020-12-08 2023-09-22 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒
WO2022153298A1 (en) * 2021-01-12 2022-07-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to cancer glycosylation and uses thereof
EP4314077A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 BioNTech SE Combination therapy with an anti-ca19-9 antibody and folfirinox in the treatment of cancer

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA128362A (en) 1910-07-25 1910-09-27 Victor Herbert Gregory Furnace for drawing glass
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
WO1990002809A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
ATE145428T1 (de) 1990-12-14 1996-12-15 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6271242B1 (en) 1992-02-10 2001-08-07 Bristol-Myers Squibb Co. Method for treating cancer using a tyrosine protein kinase inhibitor
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH0630786A (ja) * 1992-07-14 1994-02-08 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd バイスペシフィック抗体
AU691820B2 (en) 1993-07-15 1998-05-28 Cancer Research Campaign Technology Limited Prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5925376C1 (en) 1994-01-10 2001-03-20 Madalene C Y Heng Method for treating psoriasis using selected phosphorylase kinase inhibitor and additional compounds
ATE243745T1 (de) 1994-01-31 2003-07-15 Univ Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
MX9700764A (es) 1994-07-29 1997-05-31 Smithkline Beecham Plc Compuestos novedosos.
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
US5795737A (en) 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins
DK1323346T3 (da) 1995-01-17 2006-10-30 Brigham & Womens Hospital Receptorspecifik transport af immunogener gennem epitelet
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9515975D0 (en) 1995-08-04 1995-10-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
US5863904A (en) 1995-09-26 1999-01-26 The University Of Michigan Methods for treating cancers and restenosis with P21
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US6127366A (en) 1995-11-22 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
ATE321757T1 (de) 1995-12-08 2006-04-15 Janssen Pharmaceutica Nv (imidazol-5-yl)methyl-2-chinolinonderivate als farnesyl protein transferase inhibitoren
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5958769A (en) 1996-01-18 1999-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
WO1997027854A1 (en) 1996-01-30 1997-08-07 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU703203B2 (en) 1996-01-30 1999-03-18 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
CA2249320C (en) 1996-03-20 2008-12-23 Immunomedics, Inc. Glycosylated humanized b-cell specific antibodies
US5883105A (en) 1996-04-03 1999-03-16 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5891889A (en) 1996-04-03 1999-04-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6080870A (en) 1996-04-03 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Biaryl substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6063930A (en) 1996-04-03 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6300501B1 (en) 1996-05-22 2001-10-09 Warner-Lambert Company Histidine-(N-benzyl glycinamide) inhibitors of protein farnesyl transferase
US5648239A (en) 1996-06-21 1997-07-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human camp-dependent protein kinase inhibitor homolog
BR9709974A (pt) 1996-06-27 1999-08-10 Pfizer Derivados de 2-(2-oxo-etidileno)-imidazolidin-4-ona e seu uso como inibidores da transferase da proteina de farnesila
EP0956865B2 (en) 1996-08-12 2010-08-18 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation MEDICINES COMPRISING Rho KINASE INHIBITOR
US6040305A (en) 1996-09-13 2000-03-21 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US5945429A (en) 1996-09-13 1999-08-31 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6030982A (en) 1996-09-13 2000-02-29 Schering Corporationm Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6013662A (en) 1996-12-30 2000-01-11 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US6093737A (en) 1996-12-30 2000-07-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5939439A (en) 1996-12-30 1999-08-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
WO1998032741A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Zeneca Limited Inhibitors of farnesyl protein transferase
ZA981080B (en) 1997-02-11 1998-08-12 Warner Lambert Co Bicyclic inhibitors of protein farnesyl transferase
US6180415B1 (en) 1997-02-20 2001-01-30 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
AU6542898A (en) * 1997-03-05 1998-09-22 John Wayne Cancer Institute Sialyl lewis antigens as targets for immunotherapy
TW591030B (en) 1997-03-10 2004-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl transferase inhibiting 1,8-annelated quinolinone derivatives substituted with N- or C-linked imidazoles
US6211193B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6239140B1 (en) 1997-06-17 2001-05-29 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6051582A (en) 1997-06-17 2000-04-18 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6228865B1 (en) 1997-06-17 2001-05-08 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6159984A (en) 1997-06-17 2000-12-12 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6225322B1 (en) 1997-06-17 2001-05-01 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
AU737092B2 (en) 1997-08-15 2001-08-09 Cephalon, Inc. Combination of tyrosine kinase inhibitor and chemical castration to treat prostate cancer
US6103723A (en) 1997-10-17 2000-08-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1025088T3 (da) 1997-10-22 2001-11-12 Astrazeneca Ab Imidazolderivater og deres anvendelse som farnesylproteintransferaseinhibitorer
JP2001520222A (ja) 1997-10-22 2001-10-30 ゼネカ・リミテッド イミダゾール誘導体およびファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビターとしてのそれらの使用
US6124465A (en) 1997-11-25 2000-09-26 Rhone-Poulenc S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
PL340729A1 (en) 1997-11-28 2001-02-26 Lg Chemical Ltd Imidazolic derivatives exhibiting inhibitive activity in respect to pharnesil transferase and method of obtaining them
US6054466A (en) 1997-12-04 2000-04-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6242196B1 (en) 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
US6335156B1 (en) 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
DE69904302T2 (de) 1998-02-02 2003-08-14 Lg Chemical Ltd Farnesyltransferase-inhibitoren mit piperidinstruktur und verfahren zu ihrer herstellung
DE69914893T2 (de) 1998-04-27 2004-07-22 Warner-Lambert Co. Llc Glycinamidederivate mit funktionalisierter alkyl- und alkenylseitenkette als inhibitoren der farnesyltransferase
EA003510B1 (ru) 1998-07-06 2003-06-26 Янссен Фармацевтика Н.В. Ингибиторы фарнезилпротеинтрансферазы, применяемые для лечения артропатий
US6034053A (en) 1998-07-13 2000-03-07 Wayne Hughes Institute EGF-isoflavone conjugates for the prevention of restenosis
US6787638B1 (en) * 1998-12-02 2004-09-07 Applied Molecular Evolution, Inc. Tumor specific human monoclonal antibodies and methods of use
US6372747B1 (en) 1998-12-18 2002-04-16 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6362188B1 (en) 1998-12-18 2002-03-26 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
FR2787327B1 (fr) 1998-12-21 2003-01-17 Aventis Pharma Sa Compositions contenant des inhibiteurs de farnesyle transferase
US6432959B1 (en) 1998-12-23 2002-08-13 Schering Corporation Inhibitors of farnesyl-protein transferase
AU779008C (en) 1999-01-11 2005-06-30 Princeton University High affinity inhibitors for target validation and uses thereof
US6399633B1 (en) 1999-02-01 2002-06-04 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6143766A (en) 1999-04-16 2000-11-07 Warner-Lambert Company Benzopyranone and quinolone inhibitors of ras farnesyl transferase
US6458935B1 (en) 1999-06-23 2002-10-01 Merck & Co., Inc. Radiolabeled farnesyl-protein transferase inhibitors
US6403581B1 (en) 2000-01-19 2002-06-11 American Cyanamid Company Method of inhibition of farnesyl-protein transferase using substituted benz (cd) indol-2-imine and-amine derivatives
CA2480504A1 (en) 2002-04-01 2003-10-16 Evelina Angov Method of designing synthetic nucleic acid sequences for optimal protein expression in a host cell
SG10201701737XA (en) 2003-11-06 2017-04-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
HUE035853T2 (en) 2005-07-18 2018-05-28 Seattle Genetics Inc Beta-glucuronide-linker-drug conjugates
JP5250850B2 (ja) 2006-06-29 2013-07-31 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 改善されたポリペプチド発現を達成する方法
JP5382692B2 (ja) 2006-07-10 2014-01-08 学校法人藤田学園 抗体の分類法、抗原の同定法、抗体又は抗体セットの取得法、抗体パネルの作成法、並びに抗体又は抗体セット及びその用途
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
CA2698374C (en) * 2007-09-07 2018-04-03 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
CA2727915C (en) 2008-07-15 2016-04-26 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
US8192738B2 (en) * 2008-09-19 2012-06-05 Medimmune, Llc Targeted antibodies directed to DLL4
EP2396034A4 (en) * 2009-02-10 2012-11-21 Shenogen Pharma Group Ltd ANTIBODIES AND METHODS FOR TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH A STROGEN RECEPTOR
AU2011280893C1 (en) * 2010-07-22 2016-02-04 The Regents Of The University Of California Anti-tumor antigen antibodies and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023026538A (ja) 2023-02-24
JP2024050966A (ja) 2024-04-10
JP2023165831A (ja) 2023-11-17
EP3041507B1 (en) 2021-06-30
WO2015053871A8 (en) 2016-03-31
HK1226295A1 (zh) 2017-09-29
JP2016534735A (ja) 2016-11-10
EP3041507A4 (en) 2017-07-12
KR20160054501A (ko) 2016-05-16
CN105764526B (zh) 2020-12-15
AU2014332442B2 (en) 2019-12-19
IL244297A0 (en) 2016-04-21
AU2022209226A1 (en) 2022-08-18
JP7299405B2 (ja) 2023-06-27
EP3906945A2 (en) 2021-11-10
HRP20211129T1 (hr) 2021-10-15
CA3090644A1 (en) 2015-04-16
CY1124435T1 (el) 2022-07-22
PL3041507T3 (pl) 2021-11-15
PT3041507T (pt) 2021-07-26
RU2699289C2 (ru) 2019-09-04
US20200247900A1 (en) 2020-08-06
US20170015756A1 (en) 2017-01-19
US20150056134A1 (en) 2015-02-26
ZA201601354B (en) 2020-08-26
WO2015053871A4 (en) 2015-07-30
EP3041507A2 (en) 2016-07-13
CA3090644C (en) 2023-02-07
WO2015053871A3 (en) 2015-06-11
CA2922478C (en) 2020-09-29
KR102362630B1 (ko) 2022-02-15
SI3041507T1 (sl) 2021-11-30
KR20220025183A (ko) 2022-03-03
EP3906945A3 (en) 2022-03-16
IL244297B (en) 2020-09-30
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