ES2579805T3 - Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína - Google Patents

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Abstract

Un proceso para producir un anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína, que comprende uno o más aminoácidos cisteína libres que tienen un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0 y una secuencia en la cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 5 34, 37, 38 y 42: NSLRCEDTAV (SEQ ID NO:10) LVTVCSASTKGPS (SEQ ID NO:11) LVTVSSCSTKGPS (SEQ ID NO:13) LVTVSSACTKGPS (SEQ ID NO:14) HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR (SEQ ID NO:31) YKCKVCNKALP (SEQ ID NO:34) KGFYPCDIAVE (SEQ ID NO:37) PPVLDCDGSFF (SEQ ID NO:38) GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL (SEQ ID NO:42) donde la cisteína en las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42 es el aminoácido cisteína libre o una secuencia en la cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27: SLSASCGDRVT (SEQ ID NO:17) EIKRTCAAPSV (SEQ ID NO:19) TCAAPCVFIFPP (SEQ ID NO:20) FIFPPCDEQLK (SEQ ID NO:21) DEQLKCGTASV (SEQ ID NO:22) WKVDNCLQSGN (SEQ ID NO:24) ALQSGCSQESV (SEQ ID NO:25) GLSSPCTKSFN (SEQ ID NO:27) donde la cisteína en las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27 es el aminoácido cisteína libre; en donde el proceso comprende sustituir uno o más residuos de aminoácidos de un anticuerpo parental con el residuo de aminoácido cisteína libre, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antígeno y el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína se une selectivamente al mismo antígeno que el anticuerpo parental; y en donde el anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos y conjugados modificados por ingenierla genetica con cistelna Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a procesos para producir anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna, conjugados de anticuerpo-farmaco formados entre un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna y un resto de farmaco, a composiciones farmaceuticas y usos medicos de los conjugados anticuerpo- farmaco y a metodos de cribado de anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna para detectar la reactividad del tiol.
Antecedentes de la invencion
La terapia con anticuerpos se ha establecido para el tratamiento dirigido de pacientes con cancer, afecciones inmunologicas y angiogenicas. En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico del cancer y la terapia con anticuerpos, los investigadores han buscado identificar polipeptidos transmembrana o de otro modo asociados a tumores que se expresan especlficamente en la superficie de las celulas cancerosas en comparacion con una celula o celulas normales, no cancerosas. La identificacion de dichos polipeptidos antlgenos de la superficie celular asociados a tumores, es decir, antlgenos asociados a tumores (TAA), ha dado lugar a la capacidad de dirigirse especlficamente a las celulas cancerosas para la destruccion a traves de terapias basadas en anticuerpos.
El uso de conjugados anticuerpo-farmaco (ADC), es decir, inmunoconjugados para la administracion local de agentes citotoxicos o citostaticos, es decir, farmacos para eliminar o inhibir celulas tumorales en el tratamiento del cancer (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4975278) permite teoricamente la administracion dirigida del resto de farmaco a los tumores y la acumulacion intracelular en los mismos, donde la administracion sistemica de estos farmacos no conjugados puede dar lugar a niveles inaceptables de toxicidad para las celulas normales, ademas de para las celulas del tumor que se pretende eliminar (Baldwin et al (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al (ed.s), pp. 475-506). Con ello se busca la eficacia maxima con un mlnimo de toxicidad. Los esfuerzos para disenar y perfeccionar los ADC se han centrado en la selectividad de los anticuerpos monoclonales (mAb), as! como en las propiedades de union a farmacos y de liberacion de farmacos (Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549). En estas estrategias se ha descrito la utilidad tanto de los anticuerpos policlonales como de los anticuerpos monoclonales (Rowland et al (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Los farmacos utilizados en estos metodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al (1986) supra). Las toxinas utilizadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina de la difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de molecula pequena, tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) J. of the NaL Cancer Inst. 92( 19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342). Las toxinas pueden llevar a cabo sus efectos citostaticos y citotoxicos mediante mecanismos que incluyen la union a tubulina, union a ADN o la inhibicion de la topoisomerasa. Algunos farmacos citotoxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptores de protelnas.
Un conjugado anticuerpo-radioisotopo ha sido aprobado. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) esta compuesto de un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antlgeno CD20 que se encuentra sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos y el radioisotopo 111In o 90Y que esta unido por un enlace tiourea al quelante (Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336- 42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. OncoL 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN® tiene actividad contra el linfoma no Hodgkin (LNH) de linfocitos B, la administracion tiene como resultados citopenias intensas y prolongadas en la mayorla de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtutzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto por un anticuerpo anti-CD33 hu unido a caliqueamicina, se aprobo en 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda mediante inyeccion (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; patentes US-4970198; US-5079233; US-5585089; US-5606040; US- 5693762; US-5739116; US-5767285; US-5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto del anticuerpo anti-huC242 unido a traves de un enlace disulfuro SPP al resto de farmaco maitansinoide, Dm1 (Xie et al (2004) J. of Pharm. and Exp. Ther. 308(3): 1073-82), ha avanzado a la fase II de ensayos cllnicos para el tratamiento de canceres que expresan CanAg, tales como el cancer de colon, pancreatico, gastrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo-farmaco compuesto por el anticuerpo monoclonal anti-antlgeno de membrana especlfico de la prostata (PSMA) ligado al resto de farmaco maitansinoide, DM1, se encuentra en desarrollo para el potencial tratamiento de los tumores de prostata.
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Los peptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), analogos sinteticos de dolastatina (documento WO 02/088172), se han conjugado con: (i) anticuerpos monoclonales quimericos cBR96 (especificos de Lewis Y en carcinomas); (ii) cAC10 que es especifico de CD30 en tumores hematologicos (Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-65); documento US 2004/0018194; (iii) anticuerpos anti-CD20, tales como rituxan (WO 04/032828) para el tratamiento de los canceres que expresan el CD20 y afecciones inmunitarias; (iv) anticuerpos anti-EphB2R 2H9 y anti-IL-8 para el tratamiento de cancer colorrectal (Mao et al (2004) Cancer Research 64(3):781- 788); (v) anticuerpo E-selectina (Bhaskar et al (2003) Cancer Res. 63:6387-6394) y (vi) otros anticuerpos anti-CD30 (documento WO 03/043583). Las variantes de auristatina E se divulgan en los documentos US 5767237 y US 6124431. La monometil auristatina E conjugada con anticuerpos monoclonales se divulga en Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Numero 623 Resumen, presentado 28 de 2004. Los analogos de auristatina MMAE y MMAF se han conjugado con diversos anticuerpos (documento WO 2005/081711).
Los medios convencionales de union, es decir, la union a traves de enlaces covalentes, de un resto de farmaco a un anticuerpo conduce generalmente a una mezcla heterogenea de moleculas en las que los restos de farmaco estan asociados a un numero de sitios en el anticuerpo. Por ejemplo, normalmente los farmacos citotoxicos se han conjugado a anticuerpos a traves de los a menudo numerosos residuos de lisina de un anticuerpo, generando una mezcla heterogenea de conjugado anticuerpo-farmaco. Dependiendo de las condiciones de reaccion, la mezcla heterogenea contiene generalmente una distribucion de anticuerpos con de 0 a aproximadamente 8, o mas, restos de farmaco adjunto. Ademas, dentro de cada subgrupo de conjugados con una relacion particular entre numero entero de restos de farmaco y anticuerpo, es una mezcla potencialmente heterogenea en la que el resto de farmaco esta unido a varios sitios en el anticuerpo. Los metodos analiticos y de preparacion son inadecuados para separar y caracterizar las moleculas de especies de conjugado anticuerpo-farmaco dentro de la mezcla heterogenea resultante de una reaccion de conjugacion. Los anticuerpos son biomoleculas grandes, complejas y estructuralmente diversas, a menudo con muchos grupos funcionales reactivos. Sus reactividades con reactivos enlazadores e intermedios farmaco-enlazador dependen de factores tales como el pH, la concentracion, la concentracion de sal y los co- disolventes. Ademas, el proceso de conjugacion multietapa puede ser no reproducible debido a las dificultades en el control de las condiciones de reaccion y la caracterizacion de los reactivos y productos intermedios.
Los tioles de la cisteina son reactivos a pH neutro, a diferencia de la mayoria de las aminas, que estan protonadas y son menos nucleofilas a un pH cercano a 7. Ya que los grupos tiol libres (RSH, sulfhidrilo) son relativamente reactivos, las proteinas con residuos de cisteina a menudo existen en su forma oxidada como oligomeros unidos por disulfuro o tienen grupos disulfuro internos formando puentes. Las proteinas extracelulares en general no tienen tioles libres (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres, en la pagina 55). La cantidad de tiol libre en una proteina se puede estimar mediante el ensayo de Ellman estandar. La inmunoglobulina M es un ejemplo de un pentamero unido por disulfuro, mientras que la inmunoglobulina G es un ejemplo de una proteina con puentes disulfuro internos que las subunidades entre si. En las proteinas, tales como esta, la reduccion de los enlaces disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) o selenol (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-156) es necesaria para generar el reactivo tiol libre. Este enfoque puede tener como resultado la perdida de la estructura terciaria de los anticuerpos y la especificidad de union al antigeno.
Los grupos tiol de la cisteina de los anticuerpos son generalmente mas reactivos, es decir, mas nucleofilos, hacia los reactivos de conjugacion electrofilos que los grupos amina o hidroxilo de los anticuerpos. Los residuos de cisteina se han introducido en proteinas por tecnicas de ingenieria genetica para formar enlaces covalentes con ligandos o para formar nuevos enlaces disulfuro intramoleculares (Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; documento US 6248564). Sin embargo, el diseno de los grupos tiol de la cisteina mediante la mutacion de los diversos residuos de aminoacidos de una proteina en aminoacidos de cisteina es potencialmente problematico, particularmente en el caso de los residuos no emparejados (Cis libre) o en los que son relativamente accesibles para la reaccion u oxidacion. En las soluciones concentradas de la proteina, ya sea en el periplasma de E. coli, los sobrenadantes de cultivo, o en la proteina parcialmente o totalmente purificada, los residuos de Cis no emparejados en la superficie de la proteina pueden unirse y oxidarse para formar disulfuros intermoleculares y, por lo tanto, dimeros o multimeros de las proteinas. La formation de un dimero de disulfuro hace que la nueva Cis no sea reactiva para la conjugacion con un farmaco, ligando u otro marcador. Por otra parte, si la proteina oxidativamente forma un enlace disulfuro intramolecular entre la Cis de nuevo diseno y un residuo de Cis existente, ambos grupos de Cis no estan disponibles para la participation sitio activo y las interacciones en el sitio activo. Ademas, la proteina puede volverse inactiva o no especifica, por un mal plegamiento o la perdida de estructura terciaria (Zhang et al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9).
El documento WO 2004/050849 se refiere a inmunotoxinas y su uso en el tratamiento de tumores.
El documento WO 03/049704 se refiere a anticuerpos para tratar el cancer.
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El documento WO 03/060080 se refiere a los dominios variables de la inmunoglobulina canina, anticuerpos caninizados y metodos para su fabricacion y su uso.
El documento WO 94/06474 se refiere a un anticuerpo para el tratamiento contra Helicobacter pylori.
Shopes B., 1993, Molecular Immunology, Elmsford, NY, US, 30(6): 603-609 se refiere a una IgG humana disenada por ingenierla genetica con una flexibilidad limitada que inicia completamente la citolisis a traves del complemento.
Hafner F. T. et al, 2000, Analytical Chemistry, 72(23): 5779-5786, se refiere a un inmunoensayo no competitivo de pequenos analitos a nivel femtomolar por electroforesis capilar con sonda de afinidad y su uso en el analisis directo de la digoxina usando un inmunorreactivo scFv marcado de manera uniforme.
Renard M. et al, 2003, Journal of Molecular Biology, Londres, GB, 326(1): 167-175, se refiere a la derivacion de restricciones topologicas de datos funcionales para el diseno de inmunosensores fluorescentes sin reactivos.
Corneillie T. M. et al, 2004, Bioconjugate Chemistry, 15(6):1389-1391 se refiere a un anticuerpo monoclonal 2D12.5 mutante para G54C que tiene una mayor afinidad por los complejos de metales debilmente electrofilos.
Trail P. A. et al, 2003, Cancer Immunology, Immunotherapy: CII, 52(5): 328-337, se refiere a inmunoconjugados de anticuerpos monoclonales con farmaco para el tratamiento especlfico de cancer.
Schelte P. et al, 2000, Bioconjugate Chemistry, ACS, Washington, DC, US, 11(1): 118-123, se refiere a la reactividad diferencial de las funciones de maleimida y bromoacetilo con tioles y su aplicacion a la preparation de construcciones de diepltopos liposomales.
Lyons A. et al., 1990, Protein Engineering, Oxford University Press, Surrey, GB, 3(8):703-709, se refiere a la union especlfica del sitio a anticuerpos recombinantes a traves de la introduction de residuos de cistelna.
Wright S. K. et al, 1998, Analytical Biochemsitry, 265(1):8-14, se refiere a una evaluation de los metodos para la cuantificacion de las cistelnas en las protelnas.
Sumario
En consecuencia, en una realization, la presente invention proporciona un proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna que comprende uno o mas aminoacidos de cistelna libres que tiene un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0 y una secuencia en la cadena pesada seleccionada de las SEC ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42:
NSLRCEDTAV (SEQ ID NO:10)
LVTVCSASTKGPS (SEQ ID NO:11)
LVTVSSCSTKGPS (SEQ ID NO:13)
LVTVSSACTKGPS (SEQ ID NO:14)
HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR (SEQ ID NO:31)
YKCKVCNKALP (SEQ ID NO:34)
KGFYPCDIAVE (SEQ ID NO:37)
PPVLDCDGSFF (SEQ ID NO:38)
GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL (SEQ ID NO:42)
donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42 es el aminoacido cistelna libre; o una secuencia en la cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27:
SLSASCGDRVT (SEQ ID NO:17)
EIKRTCAAPSV (SEQ ID NO:19)
TCAAPCVFIFPP (SEQ ID NO:20)
FIFPPCDEQLK (SEQ ID NO:21)
DEQLKCGTASV (SEQ ID NO:22)
WKVDNCLQSGN (SEQ ID NO:24)
ALQSGCSQESV (SEQ ID NO:25)
GLSSPCTKSFN (SEQ ID NO:27)
donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27 es el aminoacido cistelna libre; en el que el proceso comprende sustituir uno o mas residuos de aminoacidos de un anticuerpo parental con el residuo de aminoacido cistelna libre, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antlgeno y el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se une selectivamente al mismo antlgeno que el anticuerpo parental; y en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna es un anticuerpo humano, quimerico o humanizado.
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El anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna puede ser mas reactivo que el anticuerpo parental con el reactivo que reacciona con el tiol.
Los residuos de aminoacidos cistelna libres pueden estar situados en las cadenas pesadas o ligeras, o en los dominios constantes o variables. Los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab, tambien se puede manipular con uno o mas aminoacidos de cistelna en sustitucion de los aminoacidos del fragmento de anticuerpo, para formar fragmentos de anticuerpos modificados con cistelna.
El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna puede comprender:
(i) mutagenizar una secuencia de acido nucleico que codifica el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna;
(ii) expresar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna; y
(iii) aislar y purificar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna.
El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna puede comprender expresar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna en una partlcula viral seleccionada de un fago o una partlcula de fagemido.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de cribado de anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna en cuanto a la reactividad del tiol que comprende:
(a) introducir uno o mas aminoacidos de cistelna en un anticuerpo parental con el fin de generar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna;
(b) hacer reaccionar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna con un reactivo de afinidad reactivo con tiol para generar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad, en el que el reactivo de afinidad reactivo con tiol comprende un resto de biotina y
(c) medir la union del anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad a un medio de captura, donde el medio de captura comprende estreptavidina.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco que comprende un anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna que comprende un aminoacido cistelna libre que tiene un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0; y un resto de farmaco (D) seleccionado de un maitansinoide, una auristatina, una dolastatina y una caliqueamicina, en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna esta unido a traves de uno o mas aminoacidos de cistelna libres mediante un resto enlazador (L) con D; teniendo el compuesto la Formula I:
Ab-(L-D)p I
donde p es 1, 2, 3, o 4; y en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se prepara por un proceso que comprende sustituir uno o mas residuos de aminoacidos de un anticuerpo parental con el uno o mas aminoacidos cistelna libres, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antlgeno y el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se une selectivamente al mismo antlgeno que el anticuerpo parental, en el que el compuesto conjugado anticuerpo-farmaco comprende:
una o mas secuencias de la cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42:
NSLRCEDTAV (SEQ ID NO:10)
LVTVCSASTKGPS (SEQ ID NO:11)
LVTVSSCSTKGPS (SEQ ID NO:13)
LVTVSSACTKGPS (SEQ ID NO:14) HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR (SEQ ID NO:31) YKCKVCNKALP (SEQ ID NO:34)
KGFYPCDIAVE (SEQ ID NO:37)
PPVLDCDGSFF (SEQ ID NO:38) GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL (SEQ ID NO:42)
donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 10, 11,13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42 es el aminoacido cistelna libre; o una o mas secuencias de la cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27:
SLSASCGDRVT (SEQ ID NO:17)
EIKRTCAAPSV (SEQ ID NO:19)
TCAAPCVFIFPP (SEQ ID NO:20)
FIFPPCDEQLK (SEQ ID NO:21)
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WKVDNCLQSGN (SEQ ID NO:24)
ALQSGCSQESV (SEQ ID NO:25)
GLSSPCTKSFN (SEQ ID NO:27)
donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27 es el aminoacido cistelna libre y en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna es un ser anticuerpo humano, quimerico o humanizado.
Ejemplos de restos de farmaco incluyen DM1, MMAE y MMAF.
El conjugado anticuerpo-farmaco de Formula I puede comprender ademas una secuencia de peptido de union a albumina (ABP); teniendo la composicion la Formula la:
ABP-Ab-(L-D)p Ia
Otro aspecto de la invencion es una composicion que comprende un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna o un conjugado anticuerpo-farmaco modificado por ingenierla genetica con cistelna y un vehlculo o diluyente fisiologicamente o farmaceuticamente aceptable. Esta composicion para uso terapeutico es esteril y se puede liofilizar.
Otro aspecto de la invencion incluye los usos medicos de los conjugados anticuerpo-farmaco y las composiciones divulgadas en la presente memoria. Las composiciones farmaceuticas incluyen combinaciones de compuestos de Formula I y uno o mas agentes quimioterapeuticos.
En algunos aspectos, la presente invencion incluye usos medicos de los conjugados anticuerpo-farmaco para el tratamiento del cancer, por ejemplo donde cuando el cancer se caracteriza por la sobreexpresion de un receptor ErbB mediante el uso de un conjugado anticuerpo-farmaco de un anticuerpo anti-ErbB.
Como alternativa o adicionalmente, la presente invencion incluye usos medicos de los conjugados de la presente invencion para el tratamiento del cancer, por ejemplo, por inhibicion del crecimiento de celulas tumorales que sobreexpresan un receptor del factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en el receptor de HER2 y el receptor de EGF que comprende administrar a un paciente un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco que se une especlficamente a dicho receptor del factor de crecimiento y un agente quimioterapeutico en el que dicho conjugado anticuerpo-farmaco y dicho Como alternativa o adicionalmente, la presente invencion incluye usos medicos de los conjugados de la presente invencion para el tratamiento del cancer en un paciente humano, por ejemplo, un paciente humano susceptible de padecer o diagnosticado con una afeccion caracterizada por la sobreexpresion del receptor ErbB2, que comprende administrar una cantidad eficaz de una combinacion de un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco y un agente quimioterapeutico.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A muestra una representacion tridimensional del fragmento de anticuerpo hu4D5Fabv7 derivada de las coordenadas de la cristalografla de rayos X. Las posiciones de la estructura de los ejemplos de residuos de Cis modificados por ingenierla genetica de las cadenas pesada y ligera se numeran (de acuerdo con un sistema de numeracion secuencial).
La Figura 1B muestra un esquema de numeracion secuencial (fila superior), comenzando en el extremo N- terminal en comparacion con el esquema de numeracion de Kabat (fila inferior) para 4D5v7fabH. Las inserciones de la numeracion de Kabat se indican por a, b, c.
Las figuras 2A y 2B muestran las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de hu4D5Fabv8 y de las variantes de fago (TioFab) con Cis mutante de hu4D5Fabv8: (A) fago no biotinilado- hu4D5Fabv8 y (B) fago biotinilado-hu4D5Fabv8 (B) mediante el ensayo PHESELECTOR de interacciones con BSA (barra blanca), HER2 (barra rayada) o estreptavidina (barra solida).
Las Figuras 3A y 3B muestran las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de hu4D5Fabv8 (izquierda) y las variantes (TioFab) con Cis mutante de hu4D5Fabv8: (A) fago no biotinilado- hu4D5Fabv8 y (B) fago biotinilado-hu4D5Fabv8 mediante el ensayo PHESELECTOR para las interacciones con: BSA (barra blanca), HER2 (barra rayada) y estreptavidina (barra rellena). Las variantes de la cadena ligera estan en el lado izquierdo y las variantes de la cadena pesada estan en el lado derecho. Reactividad del tiol = DO450 nm para la union de estreptavidina + DO450 nm para la union a HER2 (anticuerpo).
La Figura 4A muestra los valores de accesibilidad de superficie fraccionarias de residuos de hu4D5Fabv8 de tipo silvestre. Los sitios de las cadenas ligeras estan en el lado izquierdo y los sitios de las cadenas pesadas estan en el lado derecho.
La Figura 4B muestra las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de las variantes hu4D5Fabv8 biotinilado (izquierda) y mutante hu4D5Fabv8 Cis (TioFab) para las interacciones con HER2 (dla 2), estreptavidina (SA) (dla 2), HER2 (dla 4) y SA (dla 4). Las variantes Phage-hu4D5Fabv8 Cis se aislaron y se almacenaron a 4 °C. La conjugacion con biotina se llevo a cabo el dla 2 dlas o el dla 4 seguido de los analisis PHESELECTOR para controlar su interaccion con Her2 y estreptavidina como se describe en el Ejemplo 2 y
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probar la estabilidad de los grupos tiol reactivos en las variantes TioFab manipuladas.
La Figura 5 muestra las mediciones con la deteccion de la absorbancia a 450 nm del conjugado biotina- maleimida-hu4D5Fabv8 (A121C) y el hu4D5Fabv8 de tipo silvestre no biotinilado para la union a estreptavidina y HER2. Cada Fab se ensayo a 2 ng y 20 ng.
La Figura 6 muestra el analisis de ELISA con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de ABP-hu4DSFabv8 biotinilado de tipo silvestre (wt) y los mutantes con cistelna de ABP-hu4D5Fabv8, V110C y A121C, para la union con albumina de conejo, estreptavidina (SA) y HER2.
La Figura 7 muestra el analisis ELISA con deteccion de la absorbancia a 450 nm de mutantes con cistelna ABP- hu4D5Fabv8 biotinilado (variantes TioFab): (de izquierda a derecha) variantes con una unica Cis ABP-V110C, ABP-A121C y variantes con doble Cis ABP-V110C-A88C y ABP -V110C-A121C para la union con albumina de conejo, HER2 y estreptavidina (SA) y probando con Fab-HRP o SA-HRP.
La Figura 8 muestra la union del fago TioFab biotinilado y un anticuerpo anti-fago HRP a HER2 (arriba) y estreptavidina (abajo).
La Figura 9 muestra un ejemplo de representacion de una union de un conjugado ABP-protelna de fusion farmaco-TioFab que se une al antlgeno del receptor HER2. ABP = protelna de union a la albumina.
La Figura 10 muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas SK-BR-3 tratadas con -•-trastuzumab; -▲- trastuzumab-SMCC-DM1 y -♦- mutante con cistelna hu4D5Fabv8 - (A121C)-BMPEO-DM1.
La Figura 11 muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas SK-BR-3 tratadas con: trastuzumab -o- ; -•-trastuzumab-SMCC-DM1; y -□- mutante con cistelna hu4D5Fabv8 (V110C) -BMPEO-DM1.
La Figura 12 muestra el cambio medio del volumen del tumor con el tiempo en ratones desnudos atlmicos con aloinjertos de tumor mamario MMTV-HER2 Fo5, administrados en dla 0 con: 'S’ Vehlculo (tampon); -■- ABP- mutante con cistelna hu4D5Fabv8 (cadena ligera V110C)-DM1; y -•- ABP-mutante con cistelna hu4D5Fabv8 (cadena pesada de A121C)-DM1.
La Figura 13A muestra una representacion animada de la union del anticuerpo biotinilado a HER2 inmovilizado con la union del anticuerpo secundario marcado con HRP para la deteccion de la absorbancia.
La Figura 13B muestra las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de variantes de tio- trastuzumab conjugados con biotina-maleimida y trastuzumab de tipo silvestre no biotinilado en la union a HER2 inmovilizado. De izquierda a derecha: V110C (una Cis), A121C (una Cis). V110C1A121C (Cis dobles) y trastuzumab. Cada variante tio IgG y trastuzumab se probo a 1,10 y 100 ng.
La figura 14A muestra una representacion animada de la union del anticuerpo biotinilado a HER2 inmovilizado con la union de biotina a anti-IgG-HRP para la deteccion de absorbancia.
La Figura 14B muestra las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de las de variantes tio-trastuzumab conjugadas con biotina-maleimida biotina y trastuzumab de tipo silvestre no biotinilado en la union a estreptavidina inmovilizada. De izquierda a derecha V110C (una Cis), A121C (una Cis), V110C/A121C (Cis dobles) y trastuzumab. Cada variante de tio IgG y trastuzumab se probo a 1,10, y 100 ng.
La Figura 15 muestra el proceso general para preparar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna (TioMab) expresado a partir del cultivo de celulas para la conjugacion.
La Figura 16 muestra el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante no reductor (arriba) y reductor (abajo) de las variantes Fc TioMab 2H9 (de izquierda a derecha, carriles 1-9): A339C; S337C; S324C; A287C; V284C; V282C; V279C; V273C, y 2H9 de tipo silvestre despues de la purificacion sobre Protelna A inmovilizada El carril de la derecha es una escalera de marcador de tamano, que indica que las protelnas intactas son alrededor de 150 kDa, los fragmentos de cadena pesada de 50 kDa y los fragmentos de cadena ligera de 25 kDa.
La Figura 17A muestra el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante no reductor (izquierda) y reductor (+ DTT) (derecha) de las variantes TioMab 2H) (de izquierda a derecha, carriles 1-4): L- V15C; S179C; S375C; S400C, despues de la purificacion sobre Protelna A inmovilizada
La Figura 17B muestra el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante no reductor (izquierda) y reductor (+ DTT) (derecha) de las variantes TioMab 2H9 y 3A5 TioMab despues de la purificacion sobre Protelna A inmovilizada
La Figura 18 muestra el analisis de transferencia Western de variantes Tio-IgG biotiniladas. Las variantes TioMab 2H9 y 3A5 se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante reducida, las protelnas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La presencia de anticuerpo y biotina conjugada se probaron con anti-IgG-HRP (arriba) y estreptavidina-HRP (abajo), respectivamente. Carril 1: 3A5 H-A121C. Carril 2: 3A5 L- V110C. Carril 3: 2H9H-A121C. Carril 4: 2H9 L-V110C. Carril 5: 2H9 tipo silvestre.
La Figura 19 muestra el analisis de ELISA para la union de las variantes 2H9 biotiniladas a estreptavidina probando con anti-IgG-HRP y midiendo la absorbancia a 450 nm (diagrama de barras superior). El diagrama esquematico inferior representa el diseno experimental utilizado en el analisis ELISA.
La Figura 20 muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas SK-BR-3 tratadas con: -•- trastuzumab; -A-trastuzumab-SMCC-DM1 con una carga de farmaco de 3,4 DM1/Ab; y -♦- tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 con una carga de farmaco de 1,6 DM1/Ab.
La Figura 21A muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas HT 1080EphB2 tratadas con: -O- anti-EphB2R 2H9 parental; y -0-tio 2H9 (A121C) BMPEO-DM1.
La Figura 21B muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas BT 474 tratadas con: -O- anti- EphB2R 2H9 parental; y -□- tio 2H9 (A121C) BMPEO-DM1.
La Figura 22 muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas PC3/neo tratadas con: -♦- 3A5 anti
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MUC16-SMCC-DM1; y -■- tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1.
La Figura 23 muestra un ensayo de proliferation celular in vitro de celulas PC3/MUC16 tratadas con: -♦- 3A5 anti MUC16-SMCC-DM1; y - ■- tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1.
La Figura 24 muestra un ensayo de proliferacion celular in vitro de celulas OVCAR-3 tratadas con: -♦- 3A5 anti MUC16-SMCC-DM1; y -■- tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1.
La Figura 25 muestra el cambio de volumen medio del tumor de mas de 21 dias en ratones desnudos atimicos con aloinjertos de tumor mamario MMTV-HER2 Fo5, despues de una sola dosis en el Dia 0 con: 'S’ vehiculo (tampon); -•- trastuzumab-SMCC-DM1 10 mg/kg, con una carga de farmaco de 3,4 DM1/Ab; -■- tio trastuzumab (A121C)-SMCC-DM1 21 mg/kg, con una carga de farmaco de 1,6 DM1/Ab; y -□- tio trastuzumab (A121C)-SMCC- DM1 10 mg/kg, con una carga de farmaco de 1,6 DM1/Ab.
Descripcion detallada de las realizaciones ilustrativas
Ahora se hara referencia en detalle a ciertas realizaciones de la invention, ejemplos de las cuales se ilustran en las estructuras y formulas que se acompanan. Aunque la invencion se describira junto con las realizaciones enumeradas, se entendera que no se pretende limitar la invencion a esas realizaciones. Por el contrario, la invencion pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invencion como se define por las reivindicaciones.
Un experto en la tecnica reconocera muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, que se podrlan utilizar en la practica de la presente invencion. La presente invencion no esta en modo alguno limitada a los metodos y materiales descritos.
A menos que se defina lo contrario, los terminos tecnicos y cientlficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto ordinario en la tecnica a la que pertenece esta invencion y son consistentes con: Singleton et al (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; and Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York.
DEFINICIONES
A menos que se indique lo contrario, los siguientes terminos y frases como se utilizan en la presente memoria estan destinados a tener los siguientes significados:
Cuando se utilizan nombres comerciales en la presente memoria, los solicitantes pretenden incluir de forma independiente la formulation con el nombre comercial del producto, el medicamento generico y el principio(s) farmaceutico activo del nombre comercial del producto.
El termino "anticuerpo" en la presente memoria se usa en el sentido mas amplio y abarca especlficamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dlmeros, multlmeros, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quimericos o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una protelna generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y unirse a un antlgeno especlfico. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York). Un antlgeno diana en general, tiene numerosos sitios de union, tambien llamados epltopos, reconocidos por las CDR en varios anticuerpos. Cada anticuerpo que se une especlficamente a un epltopo diferente tiene una estructura diferente. Por lo tanto, un antlgeno puede tener mas de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molecula de inmunoglobulina de longitud completa o una portion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molecula que contiene un sitio de union al antlgeno que se une inmunoespeclficamente a un antlgeno de una diana de interes o parte de la misma, incluyendo tales dianas, pero sin limitarse, a celulas cancerosas o celulas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados a una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina divulgada en la presente memoria puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molecula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas se pueden derivar de cualquier especie. En un aspecto, sin embargo, la inmunoglobulina es de origen humano, murino, o de origen de conejo.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porcion de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region de union al antlgeno o variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; minicuerpos (Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323), fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos anti-idiotlpicos (anti-Id), CDR (region determinante de la complementariedad) y fragmentos de union a epltopo de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespeclficamente a los antlgenos de celulas cancerosas, antlgenos virales o antlgenos microbianos, moleculas de anticuerpo de cadena unica y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
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El termino "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especlficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Ademas, al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epltopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antlgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en el sentido de que se pueden sintetizar de forma no contaminada por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo como el obtenido de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la production del anticuerpo mediante cualquier metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invention pueden producirse por el metodo del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al (1975) Nature 256: 495, o pueden prepararse por metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo: US 4816567; US 5807715). Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las tecnicas descritas en Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597; por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales de la presente invencion incluyen especlficamente anticuerpos "quimericos" en los que una portion de la cadena pesada y/o ligera es identica con, u homologa, a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es identica con, u homologa, a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada (documento US 4816567; y Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855). Los anticuerpos quimericos de interes en la presente memoria incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de union a antlgeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.) y las secuencias de la region constante humana.
Un "anticuerpo intacto" en la presente memoria es aquel que comprende los dominios VL y VH, as! como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y los dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia humana nativa) o variante de secuencia de aminoacidos de la misma. El anticuerpo intacto puede tener una o mas "funciones efectoras" que se refieren a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region constante Fc (una region FC de una secuencia nativa o region Fc variante de una secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la union a Clq; citotoxicidad dependiente del complemento; union al receptor Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis y en la regulation negativa de los receptores de la superficie celular, tales como el receptor de linfocitos B y BCR.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos de inmunoglobulina intactas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse en otras "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 5, £, y y p, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Las formas de Ig incluyen modificaciones en bisagra o formas sin bisagra (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; documento US 2005/0048572; documento US 2004/0229310).
Un "receptor ErbB" es una protelna tirosina quinasa receptor que pertenece a la familia de receptores ErbB, cuyos miembros son mediadores importantes del crecimiento, la diferenciacion y la supervivencia celular. La familia de receptores ErbB incluye cuatro miembros distintos incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tiro2). Un panel de anticuerpos anti-ErbB2 se ha caracterizado usando la llnea celular del tumor de mama humano SKBR3 (Hudziak et al (1989) Mol. Cell. Biol 9(3):1165-72. La inhibition maxima se obtuvo con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibio la proliferation celular en un 56 %. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferation celular en menor grado en este ensayo. Se encontro tambien que el anticuerpo 4D5 sensibilizaba a las llneas celulares de tumor de mama que sobreexpresan ErbB2 a los efectos citotoxicos del TNF-a (documento US 5677171). Los anticuerpos anti-ErbB2 discutidos en Hudziak et al. se caracterizan adicionalmente en Fendly et al (1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3)59A; Sarup et al (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11(3): 117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 545301-5309; Sliwkowski et aL (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. BioL Chem. 266:14300-5;
D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; and Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394.
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El receptor ErbB generalmente comprendera un dominio extracelular, que puede unirse a un ligando de ErbB; un dominio transmembrana lipofilo; un dominio tirosina quinasa intracelular conservado y un dominio de serialization carboxilo terminal que alberga varios residuos de tirosina que pueden ser fosforilados. El receptor ErbB puede ser un receptor ErbB de "secuencia nativa" o una "variante de la secuencia de aminoacidos" de la misma. Preferiblemente, el receptor ErbB es un receptor ErbB humano de secuencia nativa. Por consiguiente, un "miembro de la familia de receptores ErbB" es EGFR (ErbB 1), ErbB2, ErbB3, ErbB4 o cualquier otro receptor ErbB actualmente conocido o que se identifiquen en el futuro.
Los terminos "ErbBI", "receptor del factor de crecimiento epidermico", "EGFR" y "HER1" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a EGFR como se divulga, por ejemplo, en Carpenter et al (1987) Ann. Rev. Biochem, 56:881-914, incluyendo formas mutantes de origen natural mutante del mismo (por ejemplo, un mutante de deletion del EGFR como en Humphrey et al (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 87:4207-4211). El termino erbB1 se refiere al gen que codifica el producto protelna EGFR. Se describen anticuerpos contra HER1, por ejemplo, en Murthy et al (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252:549-560 y en el documento WO 9525167.
El termino "ERRP" y las expresiones "protelna relacionada con el receptor EGF" y "protelna relacionada con el receptor del factor de crecimiento epidermico" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a ERRP como se divulga, por ejemplo, en los documentos US 6399743 y Publication US N.° 2003/0096373.
Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se usan indistintamente en la presente memoria y se refieren a la protelna HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:6497-6501 y Yamamoto et al (1986) Nature, 319:230-234 (Genebank numero de acceso X03363). El termino "erbB2" se refiere al gen que codifica ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185neu de rata. El ErbB2 preferido es ErbB2 humano de secuencia nativa.
"ErbB3" y "HER3" se refieren al polipeptido receptor como se divulga, por ejemplo, en las Patentes US-5183884 y US-5480968, as! como Kraus et al (1989) Proc. Nat Acad. Sci. (USA) 86:9193-9197. Los anticuerpos contra ErbB3 se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes US-5183884, US-5480968 y en el documento WO 97/35885.
Los terminos "ErbB4" y "HER4" en la presente memoria se refieren al polipeptido receptor como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea EP 599.274; Plowman et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 17461750; y Plowman et al (1993) Nature 366:473-475, incluyendo isoformas de los mismos, por ejemplo, como se divulga en el documento WO 99/19488. Anticuerpos contra HER4, se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/18444.
Los anticuerpos frente a receptores ErbB estan comercializados en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EE.UU.
El termino "variante de la secuencia de aminoacidos" se refiere a polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos que difieren en cierta medida de un polipeptido de secuencia nativa. Generalmente, las variantes de la secuencia de aminoacidos poseeran al menos aproximadamente 70 % de identidad de secuencia con al menos un dominio de union al receptor de un ligando de ErbB nativo o con por lo menos un dominio de union al ligando de un receptor ErbB nativo, y preferiblemente, seran al menos aproximadamente 80 %, mas preferiblemente, al menos aproximadamente 90 % homologas de la secuencia con tal receptor o dominios de union al ligando. Las variantes de la secuencia de aminoacidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos nativa. Los aminoacidos se designan por los nombres convencionales, codigos de una letra y de tres letras.
"Identidad de secuencia" se define como el porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de aminoacidos que son identicos despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el maximo porcentaje de identidad de secuencia. Metodos y programas de ordenador para la alineacion son bien conocidos en la tecnica. Uno de estos programas de ordenador es "Align 2", propiedad de Genentech, Inc., que se presento con la documentation del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington, DC 20559, el 10 de diciembre de 1991.
"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" y "CCDA" se refieren a una reaction mediada por celulas en la que celulas citotoxicas no especlficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citollticos naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) reconocen el anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente causan la lisis de la celula diana. Las celulas primarias que intervienen en la ADCC, los linfocitos, NK, expresan FcyRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, (1991) "Annu. Rev. Immunol." 9:457-92. Para evaluar la actividad de ADCC de una molecula de interes, se puede realizar un ensayo de ADCC, in vitro, tal como el descrito en las patentes US 5500362 y US 5821337. Celulas efectoras utiles para tales ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citollticos naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo
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animal tal como el divulgado en Clynes et al (1998) Proc. NAT. ACAD. SCL (USA) 95:652-656.
Las "celulas efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o mas receptores de la region constante (FcR) y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las celulas expresan al menos FcyRIII y realizan la funcion efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citolfticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos; prefiriendose los PBMC y los linfocitos NK. Las celulas efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de la sangre o PBMC como se describe en la presente memoria.
Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la region constante Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa del FcR humano. Ademas, un FcR preferido es uno que se une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRiIB (un "receptor inhibidor", que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmaticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo activador de inmunorreceptor con residuos de tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo inhibidor de inmunorreceptor con residuos de tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmico. (Leer revision en M. en Daeron, "Annu. Rev. Immunol." 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, "Annu. Rev. Immunol", 9:457-92 (1991); Capel et al (1994) Immunomethods 4:25-34; y de Haas et al (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41. Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan abarcados por el termino "FcR" en la presente memoria. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim et al (1994) J. Immunol 24: 249).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molecula para lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activacion del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma un complejo con un antlgeno cognado. Para evaluar la activacion del complemento, se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y otros, J. Immunol Methods, 202:163 (1996).
"Los anticuerpos nativos" son normalmente glicoprotelnas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varla entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada y ligera tienen tambien un extremo un dominio variable (Vh) seguido de un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.
El termino "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular por su antlgeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuracion de hoja p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union al antlgeno de los anticuerpos (ver Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antlgeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participacion del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
La expresion "region hipervariable" cuando se usa en la presente memoria se refiere a los residuos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union a antlgeno. La region hipervariable comprende generalmente residuos de aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al supra) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 5355 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901917). La "region marco" o residuos "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la region hipervariable tal como se definen aqul.
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La digestion con papalna de los anticuerpos produce dos fragmentos de union al antlgeno identicos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un unico sitio de union al antlgeno y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union al antlgeno y todavla es capaz de reticularse con el antlgeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mlnimo que contiene un sitio completo de reconocimiento del antlgeno y el sitio de union al antlgeno. Esta region consiste en un dlmero de una cadena pesada y una cadena ligera de dominio variable en estrecha asociacion no covalente. Es en esta configuracion en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union al antlgeno en la superficie del dlmero Vh-Vl. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union al antlgeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables especlficas para un antlgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antlgeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de union.
El fragmento Fab tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal de la cadena pesada del dominio CH1 incluyendo una o mas cistelnas de la region bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designacion en la presente memoria para Fab' en el que el residuo(s) cistelna de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cistelnas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos qulmicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominadas kappa (k) y lambda (A), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena unica" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl dominios del anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptldica. Preferiblemente, el polipeptido Fv comprende ademas un polipeptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la union al antlgeno. Para una revision de scFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269315 (1994). Los fragmentos scFv del anticuerpo anti-ErbB2 se describen en el documento WO 93/16185 y en las patentes US-5571894 y US-5587458.
El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos con dos sitios de union al antlgeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena polipeptldica (VH - VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union al antlgeno. Los diacuerpos se describen mas detalladamente en, por ejemplo, los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. La humanizacion es un metodo para transferir la informacion de union al antlgeno murino a un aceptor de anticuerpo humano no inmunogenico y ha dado lugar a muchos farmacos terapeuticamente utiles. El metodo de humanizacion comienza generalmente mediante la transferencia de las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) murinas en una estructura de anticuerpo (Jones et al, (1986) Nature 321:522-525). Estos anticuerpos injertados con CDR generalmente no conservan su afinidad original para la union al antlgeno, y de hecho, la afinidad esta a menudo severamente deterioradas. Ademas de las CDR, para mantener la adecuada conformacion de la CDR tambien deben incorporarse residuos del marco de anticuerpos no humanos seleccionados (Chothia et al (1989) Nature 342: 877). La transferencia de residuos estructurales de raton clave al aceptor humano con el fin de apoyar la conformacion estructural de las CDR injertadas se ha demostrado que restaura la union al antlgeno y la afinidad (Riechmann et al (1992) J. Mol. Biol. 224,487-499; Foote y Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; y Presta et al (2001) Thromb. Haemost 85:379-389). En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una region hipervariable de una especia no humana (anticuerpo donante), tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la region marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aun mas el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region
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constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease el documento US 6407213; Jones et al (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al (1988) Nature 332:323-329; y Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.
Un "aminoacido con cistelna libre" se refiere a un residuo de aminoacido cistelna que ha sido introducido por ingenierla genetica en un anticuerpo parental, tiene un grupo funcional tiol (-SH), y no esta emparejado como un puente disulfuro intramolecular o intermolecular.
La expresion "valor de reactividad del tiol" es una caracterizacion cuantitativa de la reactividad de los aminoacidos con cistelna libre. El valor de reactividad del tiol es el porcentaje de un aminoacido con cistelna libre en un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna que reacciona con un reactivo que reacciona con tiol y se convierte en un valor maximo de 1. Por ejemplo, un aminoacido con cistelna libre en un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna que reacciona con un rendimiento del 100 % con un reactivo que reacciona con tiol, tal como un reactivo de biotina-maleimida, para formar un anticuerpo marcado con biotina tiene un valor de reactividad del tiol de 1,0. Otro aminoacido cistelna introducido por ingenierla genetica en el mismo o diferente anticuerpo parental que reacciona con un rendimiento del 80 % con un reactivo que reacciona con tiol tiene un valor de reactividad del tiol de 0,8. Otro aminoacido cistelna introducido por ingenierla genetica en el mismo o diferente anticuerpo parental que no reacciona totalmente con un reactivo que reacciona con tiol tiene un valor de reactividad del tiol de 0. La determinacion del valor de reactividad del tiol de una cistelna en particular puede llevarse a cabo mediante el ensayo ELISA, espectroscopla de masas, cromatografla de llquidos, autorradiografla u otras pruebas anallticas cuantitativas.
Un "anticuerpo parental" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos en la que uno o mas residuos de aminoacidos se sustituyen por uno o mas residuos de cistelna. El anticuerpo parental puede comprender una secuencia nativa o de tipo silvestre. El anticuerpo parental puede tener modificaciones de la secuencia de aminoacidos preexistentes (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones) en relacion con otras formas nativas, de tipo silvestre o modificadas de un anticuerpo. Un anticuerpo parental puede ser dirigido contra un antlgeno diana de interes, por ejemplo, un polipeptido biologicamente importante. Tambien se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antlgenos no polipeptldicos (tales como antlgenos glicollpidos asociados a tumor; vease el documento US 5091178).
Ejemplos de anticuerpos parentales incluyen anticuerpos que tienen afinidad y selectividad por los receptores de la superficie celular y transmembrana y antlgenos asociados a tumores (TAA).
Otros ejemplos de anticuerpos parentales incluyen los seleccionados de, y sin limitacion, anticuerpo anti-receptor de estrogenos, anticuerpo anti-receptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-catepsina D, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-e-cadherina, anticuerpo anti-CA125 y anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo, anti-CAI9-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-glicoprotelna P, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo anti-protelna del retinoblastoma, anticuerpo anti-oncoproetlna ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CD11c, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti- LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti- CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti-citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentina, anticuerpo anti-protelnas del VPH, anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa, anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo anti-antlgeno especlfico de la prostata, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo anti-antlgeno-tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratina y anticuerpo anti-antlgeno Tn.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirlan con los usos diagnosticos o terapeuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificara (1) hasta mas del 95 % en peso de anticuerpo segun se determina por el metodo de Lowry, y mas preferiblemente mas de 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tincion de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de celulas recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estara presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
Un anticuerpo "que se une" a una diana molecular o a un antlgeno de interes, por ejemplo, el antlgeno ErbB2, es uno capaz de unirse a ese antlgeno con suficiente afinidad de tal forma que el anticuerpo sea util en dirigirse a una celula que expresa el antlgeno. Cuando el anticuerpo es uno que se une a ErbB2, por lo general, se unen
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preferentemente ErbB2 frente a otros receptores ErbB y puede ser uno que no experimente una reaccion cruzada significativa con otras protelnas tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En tales realizaciones, el grado de union del anticuerpo a estas protelnas no ErbB2 (por ejemplo, union de la superficie celular a un receptor endogeno) sera menor que 10 %, determinado mediante el analisis de separation celular por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA). A veces, el anticuerpo anti-ErbB2 no sufrira una reaccion cruzada significativa con la protelna neu de rata, por ejemplo, como se describe en Schecter et al. (1984) Nature 312:513 y Drebin et al (1984) Nature 312:545-548.
Dianas moleculares para anticuerpos abarcados por la presente invention incluyen protelnas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitarse a: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a) y CD79p (CD79b); (ii) miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor EGF, HER2, HER3 o HER4; (iii) moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Macl, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y av/p3 integrina, incluyendo o bien las subunidades alfa o beta de la misma (por ejemplo anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti- CD11b); (iv) factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antlgenos de grupos sangulneos; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor mpl, CTLA-4; protelna C, BR3, c-met, factor tisular, p7 etc; y (v) antlgenos asociados a tumores de la superficie celular y transmembrana (TAA).
A menos que se indique lo contrario, la expresion "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos union al antlgeno de, o derivados de este, el anticuerpo murino 4D5 (ATCC CRL 10463). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser un anticuerpo monoclonal murino 4D5 o una variante del mismo, tal como un 4D5 humanizado. Ejemplos de anticuerpos 4D5 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (trastuzumab, HERCEPTIN®) como en la patente US-5821337.
Los terminos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapeutico como a las medidas profilacticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) un cambio o trastorno fisiologico indeseado, tal como el desarrollo o diseminacion del cancer. Para los fines de esta invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los slntomas, la disminucion del grado de la enfermedad, la estabilizacion (es decir, no empeoramiento) de la enfermedad, el retraso o ralentizacion de la progresion de la enfermedad, la mejora o paliacion del estado de enfermedad y la remision (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Los que estan en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno o afeccion, as! como los propensos a tener la afeccion o trastorno o aquellos en los que se va a prevenir la afeccion o trastorno.
El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un farmaco eficaz para tratar una enfermedad o afeccion en un mamlfero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la infiltration de celulas cancerosas en organos perifericos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la metastasis tumoral; inhibir, en cierta medida, el crecimiento del tumor y/o aliviar en cierta medida uno o mas de los slntomas asociados al cancer. En la medida en que el farmaco puede prevenir el crecimiento y/o destruir las celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico. Para la terapia del cancer, la eficacia puede medirse, por ejemplo, por la evaluation del tiempo hasta la progresion de la enfermedad (TTP) y/o la determination de la tasa de respuesta (RR).
El termino "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistemica (es decir, niveles en sangre/plasma) de una cantidad dada de farmaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un termino absoluto que indica la medicion tanto del ritmo (velocidad) como de la cantidad total (extension) del farmaco que alcanza la circulation general de una forma farmaceutica administrada.
Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren o describen la condition fisiologica en mamlferos que se caracteriza generalmente por un crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o mas celulas cancerosas. Ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Mas ejemplos particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas (por ejemplo, cancer de celulas escamosas epiteliales), cancer de pulmon incluyendo cancer de pulmon microcltico, cancer de pulmon no microcltico ("CPNM"), adenocarcinoma del pulmon y carcinoma escamoso del pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o cancer de estomago incluyendo cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hlgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandulas salivares, cancer de rinon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma de pene, ademas de cancer de cabeza y cuello.
Un "cancer que expresa ErbB" es aquel que comprende celulas que tienen la protelna ErbB presente en su superficie celular. Un "cancer que expresa ErbB2" es aquel que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de celulas del mismo, de tal manera que un anticuerpo anti-ErbB2 se puede unir al mismo y tener un efecto terapeutico con respecto al cancer.
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Un cancer que "sobreexpresa" un receptor antigenico es aquel que tiene niveles significativamente mas altos del receptor, tales como ErbB2, en la superficie celular del mismo, en comparacion con una celula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresion puede estar causada por la amplificacion genica o por el aumento de la transcripcion o la traduccion. La sobreexpresion del receptor se puede determinar en un ensayo de diagnostico o pronostico mediante la evaluacion de los niveles incrementados de la protelna del receptor presente en la superficie de una celula (por ejemplo, mediante un ensayo de inmunohistoqulmica; IHC). Como alternativa o adicionalmente, se pueden medir los niveles de acido nucleico que codifica el receptor en la celula, por ejemplo, mediante tecnicas de hibridacion in situ fluorescente (FISH; ver el documento WO 98/45479), la transferencia Southern o la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR en tiempo real cuantitativa (RT-PCR).
Los tumores que sobreexpresan ErbB2 (HER2) son calificados por las puntuaciones de inmunohistoqulmica que corresponden al numero de copias de moleculas HER2 expresadas por celula y pueden determinarse bioqulmicamente: 0=0-10.000 copias/celula, 1+ = al menos aproximadamente 200.000 copias/celula, 2+ = al menos aproximadamente 500.000 copias /celula, 3+ = aproximadamente 1-2 x 106 copias/celula. La sobreexpresion de HER2 en el nivel 3+, que conduce a la activacion independiente de ligando de la tirosina quinasa (Hudziak et al (1987) Proc. Natl Acad Sci. USA, 84: 7159-7163), se produce en aproximadamente el 30 % de los canceres de mama, y en estos pacientes, la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global se ven disminuidos (Slamon et al (1989) Science, 244:707-712; Slamon et al (1987) Science, 235:177-182).
La expresion "agente citotoxico" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la funcion de las celulas y/o causa la destruction de las celulas. El termino pretende incluir isotopos radioactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos y toxinas, tales como toxinas de molecula pequena o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo los analogos sinteticos y derivados de las mismas.
Una "enfermedad autoinmunitaria" en la presente memoria es una enfermedad o afeccion que surge de y va dirigida contra los propios tejidos u organos de un individuo o un co-segregado o manifestation de las mismas o un trastorno resultante de las mismas. En muchas de estas afecciones autoinmunitarias e inflamatorias, puede existir una serie de marcadores cllnicos y de laboratorio, incluyendo, pero sin limitarse a, hipergammaglobulinemia, niveles altos de autoanticuerpos, depositos de complejos antlgeno-anticuerpo en los tejidos, beneficio de los tratamientos con corticosteroides o inmunosupresores y agregados de celulas linfoides en los tejidos afectados. Sin limitarse a ninguna teorla en cuanto a la enfermedad autoinmunitaria media por linfocitos B, se cree que los linfocitos B demuestran un efecto patogenico en enfermedades autoinmunitarias humanas a traves de una multitud de vlas mecanicas, incluyendo la production de autoanticuerpos, la formation del complejo inmunitarios, la activacion de celulas dendrlticas y linfocitos T, la slntesis de citoquinas, la liberation directa de quimiocinas y la provision de un nido para la neo-linfogenesis ectopica. Cada una de estas vlas puede participar en diferentes grados en la patologla de las enfermedades autoinmunitarias. Una enfermedad autoinmunitaria puede ser una enfermedad especlfica de un organo (es decir, la respuesta inmunitaria se dirige especlficamente contra un sistema de organos tales como el sistema endocrino, el sistema hematopoyetico, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinales y el hlgado, el sistema renal, el tiroides, las orejas, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistemica que puede afectar a multiples sistemas organicos (por ejemplo, lupus eritematoso sistemico (LES), artritis reumatoide, polimiositis, etc.).
El termino "citostatico" se refiere al efecto de limitar la funcion de las celulas, tales como limitar el crecimiento celular o la proliferation de las celulas.
Un "agente quimioterapeutico" es un compuesto qulmico util en el tratamiento del cancer. Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen Erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE®, Millenium Pharm.), fulvestrant (FASLODEX®, Astrazeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), letrozol (FEMaRa®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), oxaliplatino (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5- fluorouracilo), leucovorina, rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (GSK572016, GlaxoSmithKline), lonafarnib (ScH 66336), sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.) y gefitinib (IRESSA®, Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida y CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo, tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos enedina (por ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I y caliqueamicina omegaI1 (Angew Chem Intl. Ed. Engl. (1994)33: 183-186); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bifosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; as! como el cromoforo neocarzinostatina y cromoforos relacionados, cromoforos de antibioticos enedina),
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aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenergicos anti tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; recuperador de acido folico tal como acido frollnico; aceglatona; glucosido aldofosfamida; acido aminolevullnico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; acido podofillnico; 2- etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2°- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulacion de nanopartlculas manipuladas con albumina de paclitaxel sin Cremophor ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina GEMZAR®; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Tambien incluidos en esta definicion de "agente quimioterapeutico" son: (i) agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre tumores tales como anti-estrogenos y moduladores selectivos de receptores estrogenicos (SERM), incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON. (ii) inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FIMERA® y anastrozol ARIMIDEX®; (iii) antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; as! como troxacitabina (un 1,3-dioxolano nucleosido analogo de citosina); (iv) inhibidores de la aromatasa; (v) inhibidores de la protelna quinasa; (vi) inhibidores de la quinasa de llpidos; (vii) oligonucleotidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresion de genes en las vlas de senalizacion implicadas en la proliferacion de celulas aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Ralf y H-Ras; (viii) ribozimas tales como un inhibidor de la expresion de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresion de HER2; (ix) las vacunas tales como vacunas de terapia genica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rII- 2; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; (x) agentes anti-angiogenicos, tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); y (xi) sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En la presente memoria, la expresion "farmaco dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapeutico que se une a EGFR y, opcionalmente, inhibe la activacion de EGFR. Ejemplos de tales agentes incluyen anticuerpos y moleculas pequenas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vease, el documento US 4943533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o cetuximab; ERBITUX®) y 225 reconformado humano (H225) (vease el documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen al EGFR mutante tipo II (patente US5.212.290); anticuerpos humanizados y quimericos que se unen a EGFR, como se describe en el documentoUS 5891996 y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, como ABX-EGF (vease el documento WO 98/50433, Abgenix). El anticuerpo anti-EGFR se puede conjugar con un agente citotoxico, generando as! un inmunoconjugado (vease, por ejemplo, el documento EP 659,439A2, Merck Patent GmbH). Ejemplos de moleculas pequenas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), Erlotinib HCl (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).
Los inhibidores de la protelna quinasa incluyen inhibidores de la tirosina quinasa que inhiben en cierta medida la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa, como un receptor ErbB. Ejemplos de tales inhibidores incluyen los farmacos dirigidos a EGFR citados en el parrafo precedente, as! como quinazolinas, tales como PD 153035.4-(3- cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, como CGP 59326. CGP 60261 y CGP 62706 y pirazolopirimidinas, 4- (fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contienen restos nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moleculas
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antisentido (por ejemplo, aquellas que se unen al acido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (documento US 5804396); trifostinas (documento US 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inhibidores de pan-ErbB, tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (Gleevec; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); o como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patentes: WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca) y WO 96/33980 (Zeneca).
Un "agente anti-angiogenico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere con, hasta cierto punto, el desarrollo de los vasos sangulneos. El factor anti-angiogenico puede, por ejemplo, ser una molecula pequena o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento implicado en la promocion de la angiogenesis. El factor anti-angiogenico preferido en la presente memoria es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
El termino "citocina" es un termino generico para las protelnas liberadas por una poblacion de celulas que actuan sobre otra celula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptldicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoprotelnas, tales como hormona estimulante del follculo (FSH), hormona estimulante del tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral-a y p; sustancia inhibidora de Muller; peptido asociado a la gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-p; factor de crecimiento de plaquetas, factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como el interferon a, p, y y; factores estimulantes de las colonias (CSF) tales como CSF de macrofagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrofagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL- 1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12; un factor de necrosis tumoral como TNF-a o TNF-p y otros factores de polipeptidos que incluyen LIF y el ligando kit (KL). Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino citocina incluye protelnas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El termino "profarmaco" tal como se utiliza en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxica para las celulas tumorales en comparacion con el farmaco original y es capaz de ser enzimaticamente o hidrollticamente activada o convertida en la forma parental mas activa. Vease, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt et al (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profarmacos de esta invencion incluyen, pero no se limitan a, profarmacos que contienen fosfato, profarmacos que contienen tiofosfato, profarmacos que contienen sulfato, profarmacos que contienen peptidos, profarmacos modificados con D- aminoacidos, profarmacos glicosilados, profarmacos que contienen p-lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos, profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5- fluorocitosina y otros profarmacos 5-fluorouridina que pueden convertirse en el farmaco libre citotoxico mas activo. Ejemplos de farmacos citotoxicos que pueden derivarse en una forma profarmaco para su uso en esta invencion incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapeuticos descritos anteriormente.
Un "liposoma" es una veslcula pequena compuesta de varios tipos de llpidos, fosfollpidos y/o tensioactivo que es util para la administracion de un farmaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 divulgados en la presente memoria y, opcionalmente, un agente quimioterapeutico) a un mamlfero. Los componentes del liposoma se disponen comunmente en una formacion de bicapa, similar a la disposicion de los llpidos de las membranas biologicas.
El termino "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapeuticos, que contienen information sobre las indicaciones, uso, dosis, administracion, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de tales productos terapeuticos.
"Expresion en fagos" es una tecnica por la cual los polipeptidos variantes se expresan como protelnas de fusion con una protelna de la cubierta en la superficie del fago, por ejemplo, fagos filamentosos, partlculas. Una utilidad de la expresion en fagos radica en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de protelnas aleatorias se pueden clasificar rapidamente y de manera eficiente en cuanto a aquellas secuencias que se unen a una molecula diana con alta afinidad. La expresion de las bibliotecas de peptidos y protelnas en fagos se ha utilizado para el cribado de millones de polipeptidos para detectar aquellos que tienen propiedades de union especlficas. Para la expresion de peptidos pequenos al azar y protelnas pequenas se han usado metodos de expresion en fago polivalentes, generalmente a traves de fusiones con cualquiera de pIII o pVIII del fago filamentoso (Wells y Lowman, (1992) Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 355-362, y las referencias citadas en el mismo). En la expresion de fagos monovalente, una biblioteca de protelna o peptido se fusiona con una protelna de la envoltura del fago o una portion del mismo y se
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expresa a bajos niveles en presencia de la protelna de tipo silvestre. Los efectos de la avidez se reducen con respecto al fago polivalente de modo que la clasificacion se hace sobre la base de la afinidad del ligando intrlnseco y se usan vectores fagemidos, que simplifican las manipulaciones de ADN. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzmology, 3:205-0216 (1991). La expresion en fagos incluye tecnicas para la produccion de moleculas similares a anticuerpos (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, p627-628; Lee et al).
Un "fagemido" es un vector de plasmido que tiene un origen de replication bacteriano, por ejemplo, Co1E1 y una copia de una region intergenica de un bacteriofago. El fagemido puede usarse en cualquier bacteriofago conocido, incluyendo bacteriofago filamentoso y bacteriofago lambdoide. El plasmido tambien contendra generalmente un marcador seleccionable para la resistencia a los antibioticos. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores pueden propagarse como plasmidos. Cuando se proporcionan celulas que albergan estos vectores con todos los genes necesarios para la produccion de partlculas de fago, el modo de replicacion del plasmido cambia a la replicacion de clrculo rodante para generar copias de una cadena del ADN del plasmido y las partlculas de fago para envoltura. El fagemido puede formar partlculas de fago infecciosas o no infecciosas. Este termino incluye fagemidos que contienen un gen de protelna de la envoltura del fago o un fragmento de la misma unido a un gen polipeptido heterologo como una fusion de genes de tal manera que el polipeptido heterologo se expresa en la superficie de la partlcula del fago.
"Enlazador", "unidad enlazadora" o "enlace" se refiere a un resto qulmico que comprende un enlace covalente o una cadena de atomos que une covalentemente un anticuerpo con un resto de farmaco. En diversas realizaciones, un enlazador se especifica como L. Los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un alquildiilo, un arileno, un heteroarileno, restos tales como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades repetitivas de alquiloxi (por ejemplo, polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino, Jeffamine™) y ester de diacido y amidas, incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida.
El termino "marcador" se refiere a cualquier resto que puede unirse covalentemente a un anticuerpo y que funciona para: (i) proporcionar una senal detectable; (ii) interactuar con una segunda etiqueta para modificar la senal detectable proporcionada por la primera o segunda etiqueta, por ejemplo, FRET (transferencia de energla de resonancia de fluorescencia); (iii) estabilizar las interacciones o aumentar la afinidad de union, con el antlgeno o ligando; (iv) afectar a la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforetica o permeabilidad celular, por carga, hidrofobicidad, forma u otros parametros flsicos o (v) proporcionar un resto de captura, para modular la afinidad de ligando, union al anticuerpo/antlgeno o complejacion ionica.
Las definiciones estereoqulmicas y convenciones utilizadas en la presente memoria generalmente siguen lo descrito en S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York y Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Muchos compuestos organicos existen en formas opticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada en un plano. En la description de un compuesto opticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se utilizan para denotar la configuration absoluta de la molecula alrededor de su centro(s) quiral. Los prefijos d y l o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotation de la luz polarizada en un plano por el compuesto, significando (- ) o 1 que el compuesto es levogiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrogiro. Para una estructura qulmica dada, estos estereoisomeros son identicos, excepto que son imagenes especulares uno del otro. Un estereoisomero especlfico tambien puede ser referido como un enantiomero y una mezcla de tales isomeros a menudo se denomina mezcla enantiomerica. Una mezcla 50:50 de enantiomeros se denomina mezcla racemica o un racemato, la cual puede ocurrir cuando no ha habido una estereoseleccion o estereoespecificidad en una reaction qulmica o proceso. Los terminos "mezcla racemica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiomericas, carentes de actividad optica.
La expresion "sal farmaceuticamente aceptable", como se usa en la presente memoria, se refiere a sales organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables de un ADC. Ejemplos de sales incluyen, pero no se limitan, a sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato acido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato acido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluensulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmaceuticamente aceptable puede implicar la inclusion de otra molecula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraion. El contraion puede ser cualquier resto organico o inorganico que estabiliza la carga en el compuesto original. Ademas, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener mas de un atomo cargado en su estructura. Los casos en los que multiples atomos cargados son parte de la sal farmaceuticamente aceptable pueden tener multiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener uno o mas atomos cargados y/o uno o mas contraiones.
"Solvato farmaceuticamente aceptable" se refiere a una asociacion de una o mas moleculas de disolvente y un ADC. Ejemplos de disolventes que forman solvatos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, acido acetico y etanolamina.
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Las siguientes abreviaturas se usan en la presente memoria y tienen las definiciones indicadas: BME es beta- mercaptoetanol, Boc es N-(t-butoxicarbonil), cit es citrulina (acido 2-amino-5-ureido pentanoico), dap es dolaprolna, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es N,N-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleucina, DMA es dimetilacetamida, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es etilenglicol dimetil eter (o 1,2- dimetoxietano), DMF es N,N-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfoxido, doe es dolafenina, dov es N,N- dimetilvalina, DTNB es 5,5'-ditiobis (acido 2-nitrobenzoico), DTPA es acido dietilentriaminopentaacetico, DTT es ditiotreitol, EDCI es clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-1-etoxicarbonil -1,2- dihidroquinolina, ES-MS es espectrometrla de masas de electronebulizacion, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N- (9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol, HPLC es cromatografla llquida de alto rendimiento, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4-anisildifenilmetil (o 4-metoxitritil), nor es (1S, 2R)-(+)-norefedrina, PAB es p-aminobencilcarbamoil, PBS es solucion salina tamponada con fosfato (pH 7), PEG es polietilenglicol, Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6-maleimidocaprollo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo-fris-pirrolidino, SEC es cromatografla de exclusion por tamano, Su es succinimida, TFA es acido trifluoroacetico, TLC es cromatografla en capa fina. UV es ultravioleta, y val es valina.
ANTICUERPOS MANIPULADOS CON CISTEINA
Los compuestos de la divulgacion incluyen anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna donde uno o mas aminoacidos de un anticuerpo de tipo silvestre o anticuerpo parental se sustituyen con un aminoacido cistelna. Cualquier forma de anticuerpo puede ser modificado por ingenierla genetica de este modo, es decir, mutado. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo Fab parental puede ser disenado para formar un Fab modificado por ingenierla genetica con cistelna, referido aqul como "TioFab". De manera similar, un anticuerpo monoclonal parental puede ser disenado para formar un "TioMab". Debe tenerse en cuenta que la mutacion de sitio unico produce un unico residuo de cistelna modificado por ingenierla genetica en un TioFab, mientras que una mutacion de sitio unico produce dos residuos cistelna modificados por ingenierla genetica en un TioMab, debido a la naturaleza dimerica de los anticuerpos IgG. Los mutantes con residuos de cistelna (Cis) ("modificados por ingenierla genetica") se evaluan en cuanto a la reactividad de los grupos tiol de la cistelna. El valor de la reactividad tiol es un termino relativo, numerico en el intervalo de 0 a 1,0 y se puede medir por cualquier anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna. Los valores de la reactividad del tiol de los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna de la divulgacion estan en los intervalos de 0,6 a 1,0; 0,7 a 1,0; o 0,8 a 1,0.
Los metodos de diseno, seleccion y preparation de la invention permiten anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna que son reactivos con funcionalidad electrofila. Estos metodos permiten otros compuestos conjugados de anticuerpos tales como compuestos conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) con moleculas del farmaco en sitios designados, disenados selectivos. Los residuos de cistelna reactivos en la superficie de un anticuerpo permiten conjugar especlficamente un resto de farmaco a traves de un grupo reactivo tiol tal como maleimida o haloacetilo. La reactividad nucleofila de la funcionalidad tiol de un residuo de Cis frente a un grupo maleimida es aproximadamente 1000 veces mayor en comparacion con cualquier otra funcionalidad de aminoacidos en una protelna, tal como un grupo amino de residuos de lisina o el grupo amino N-terminal. La funcionalidad tiol especlfica en reactivos yodoacetilo y maleimida puede reaccionar con grupos amina, pero a pH mas alto (> 9,0) y se requieren tiempos de reaction mas largos (Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach. Academic Press, Londres).
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna de la divulgacion conservan preferentemente la capacidad de union de sus anticuerpos homologos parentales de tipo silvestre. Por lo tanto, los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna son capaces de unirse, preferiblemente especlficamente, a los antlgenos. Tales antlgenos incluyen, por ejemplo, antlgenos asociados a tumores (TAA), protelnas receptoras de la superficie celular y otras moleculas de la superficie celular, protelnas transmembrana, protelnas de serialization, factores de regulation de supervivencia celular, factores de regulation de proliferation celular, moleculas asociadas a (por ejemplo, moleculas conocidas o que se sospecha que contribuyen funcionalmente) el desarrollo o la diferenciacion de tejidos, linfocinas, citocinas, moleculas implicadas en la regulacion del ciclo celular, moleculas que participan en la vasculogenesis y moleculas asociadas (por ejemplo, moleculas conocidas o que se sospecha que contribuyen funcionalmente) a la angiogenesis. El antlgeno asociado a un tumor puede ser un factor de diferenciacion de cluster (es decir, una protelna CD). Un antlgeno al cual se puede unir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categorlas mencionadas anteriormente, en el que el otro subconjunto(s) de dicha categorla comprende otras moleculas/antlgenos que tienen una caracterlstica distinta (con respecto al antlgeno de interes).
El anticuerpo parental puede ser tambien un anticuerpo humanizado seleccionado de huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (Trastuzumab, HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 del documento US 5821337, 520C9 humanizado (WO 93/21319) y anticuerpos humanizados 2C4 como se describe en la presente memoria.
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Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna de la divulgacion pueden unirse especlficamente y eficazmente al sitio con un reactivo que reacciona con tiol. El reactivo que reacciona con tiol puede ser un reactivo enlazador multifuncional, es decir, un reactivo marcador de afinidad (por ejemplo un reactivo enlazador de biotina), un marcador de deteccion (por ejemplo, un reactivo fluoroforo), un reactivo de inmovilizacion de la fase solida (por ejemplo SEPHAROSE™, poliestireno o vidrio), o un intermedio farmaco-enlazador. Un ejemplo de un reactivo que reacciona con tiol es N-etilmaleimida (NEM). En un ejemplo de realizacion, la reaccion de un TioFab con un reactivo enlazador de biotina proporciona un TioFab biotinilado mediante el cual se puede detectar y medir la presencia y la reactividad del residuo de cistelna modificado por ingenierla genetica. La reaccion de un TioFab con un reactivo enlazador multifuncional proporciona un TioFab con un enlazador funcionalizado que puede reaccionar adicionalmente con un reactivo que es un resto de farmaco u otro marcador. La reaccion de un TioFab con un intermedio enlazador de un farmaco proporciona un conjugado TioFab-farmaco.
Ejemplos de metodos descritos aqul pueden aplicarse en general a la identificacion y produccion de anticuerpos, y mas en general, a otras protelnas a traves de la aplicacion de las etapas de diseno y cribado descritas en este documento.
Este enfoque se puede aplicar a la conjugacion de otros agentes reactivos con tiol en los que el grupo reactivo es, por ejemplo, una maleimida, una yodoacetamida, un disulfuro de piridilo u otra pareja de conjugacion de tiol reactiva (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671). La pareja puede ser un agente citotoxico (por ejemplo, una toxina tal como la doxorrubicina o la toxina pertussis), un fluoroforo tal como un colorante fluorescente como fluorescelna o rodamina, un agente quelante para la formacion de imagenes o metal radioterapeutico, un marcador de peptidilo o no peptidilo o etiqueta de deteccion, o un agente modificador del aclaramiento, tal como diversos isomeros de polietilenglicol, un peptido que se une a un tercer componente u otro hidrato de carbono o agente lipofilo.
Los sitios identificados en el fragmento de anticuerpo de ejemplo, hu4D5Fabv8 de la presente invencion estan principalmente en el dominio constante de un anticuerpo, que esta bien conservado a traves de todas las especies de anticuerpos. Estos sitios deben ser ampliamente aplicables a otros anticuerpos, sin mas necesidad de diseno estructural o del conocimiento de las estructuras de anticuerpos especlficos y sin interferencias en las propiedades de union al antlgeno inherentes a los dominios variables de union al anticuerpo.
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna que pueden ser utiles en el tratamiento del cancer incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra los receptores de superficie celular y antlgenos asociados a tumores (TAA). Tales anticuerpos pueden ser utilizados como anticuerpos desnudos (sin conjugar a un resto de farmaco o de marcador) o como conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de Formula I. Los antlgenos asociados a tumores son conocidos en la tecnica, y pueden prepararse para su uso en la generacion de anticuerpos usando metodos e informacion que son bien conocidos en la tecnica. En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y la terapia del cancer, los investigadores han intentado identificar polipeptidos transmembrana o de otro modo asociados a tumores que se expresan especlficamente en la superficie de uno o mas tipos particulares de celulas cancerosas en comparacion con una o mas celulas no cancerosas normales. A menudo, dichos polipeptidos asociados a tumores se expresan mas abundantemente en la superficie de las celulas cancerosas en comparacion con la superficie de las celulas no cancerosas. La identificacion de dichos polipeptidos antlgenos de la superficie celular asociados a tumores ha dado lugar a la capacidad de dirigirse especlficamente a las celulas cancerosas para la destruccion a traves de terapias basadas en anticuerpos.
Ejemplos de TAA incluyen, pero no se limitan a, TAA (1)-(36) enumerados a continuation. Por conveniencia, se enumera a continuacion la informacion relativa a estos antlgenos, todos los cuales son conocidos en la tecnica e incluye nombres, nombres alternativos, numeros de acceso GenBank y de referencia(s) primaria(s), siguiendo las convenciones de identificacion de secuencias de acidos nucleicos y de protelnas del Centro Nacional de Informacion sobre Biotecnologla (NCBI). Las secuencias de acidos nucleicos y protelnas que corresponden a TAA (1)-(36) estan disponibles en bases de datos publicas tales como GenBank. Los antlgenos asociados a tumores dirigidos por anticuerpos incluyen todas las secuencias de aminoacidos variantes e isoformas que poseen al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con respecto a las secuencias identificadas en las referencias citadas, o que presentan sustancialmente las mismas propiedades biologicas o caracterlsticas como un TAA que tiene una secuencia que se encuentra en las referencias citadas. Por ejemplo, un TAA que tiene una secuencia variante en general es capaz de unirse especlficamente a un anticuerpo que se une especlficamente al TAA con la secuencia correspondiente en la lista.
ANTIGENOS ASOCIADOS A TUMORES (1)-(36)
(1) BMPR1B (receptor de la protelna morfogenetica osea tipo 1B, N.° de acceso de Genbank. NM_001203) ten
Dijke,P., et al Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997));
WO2004063362 (Reivindicacion 2); WO2003042661 (Reivindicacion 12); US2003134790-A1 (Pagina 38-39);
WO2002102235 (Reivindicacion 13; Pagina 296); WO2003055443 (Pagina 91-92); WO200299122 (Ejemplo 2;
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Pagina 528-530); WO2003029421 (Reivindicacion 6); WO2003024392 (Reivindicacion 2; Fig 112);
WO200298358 (Reivindicacion 1; Pagina 183); WO200254940 (Pagina 100-101); WO200259377(Pagina 349350); WO200230268 (Reivindicacion 27; Pagina 376); WO200148204 (Ejemplo; Fig 4) NP_001194 receptor de la protelna morfogenetica osea tipo 1B /pid=NP_001194.1-Referencias cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, N.° de acceso de Genbank. NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267- 11273); WO2004048938 (Ejemplo 2); WO2004032842 (Ejemplo IV); WO2003042661 (Reivindicacion 12); WO2063016475 (Reivindicacion 1); WO200278524 (Ejemplo 2);
WO200299074 (Reivindicacion 19; Pagina 127-129); WO200286443 (Reivindicacion 27; Paginas 222, 393); WO2003003906 (Reivindicacion 10; Pagina 293); WO200264798 (Reivindicacion 33; Pagina 93-95); WO200014228.(Reivindicacion 5; Pagina 133-136); US2003224454 (Fig 3); WO2003025138 (Reivindicacion 12; Pagina 150);
NP_003477 familia de vehlculos de soluto 7 (vehlculo de aminoacidos cationicos, sistema y+), miembro 5 /pid=NP_003477.3 - Homo sapiens Referencias cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923;
NM_003486_1
(3) STEAP1 (antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata, N.° de acceso de Genbank. NM_012449) Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO004065577 (Reivindicacion 6); WO2004027049 (Fig 1L); EP1394274 (Ejemplo 11); WO2004016225 (Reivindicacion 2); WO2003042661 (Reivindicacion 12); US2003157089 (Ejemplo 5); US2003185830 (Ejemplo 5); US2003064397 (Fig 2); WO200289747 (Ejemplo 5; Pagina 618-619); WO2003022995 (Ejemplo 9; Fig 13A, Example 53; Pagina 173, Example 2; Fig 2a);
NP_036581 antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata Referencias cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, N.° de acceso de Genbank. AF361486) J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004045553 (Reivindicacion 14); WO200292836 (Reivindicacion 6; Fig 12); WO200283866 (Reivindicacion 15; Pagina 116-121); US2003124140 (Ejemplo 16); Referencias cruzadas: GI:34501467; AAK741203; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, N.° de acceso de Genbank. NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93 (1):136-140 (1996), J. BioL Chem. 270 (37):21984- 21990 (1995)); WO2003101283 (Reivindicacion 14); (WO2002102235 (Reivindicacion 13; Pagina 287-288); WO2002101075 (Reivindicacion 4; Pagina 308-309); WO200271928 (Pagina 320-321); WO9410312 (Pagina 5257); Referencias cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de vehlculos de soluto 34 (fosfato sodico), miembro 2, vehlculo de fosfato dependiente de sodio tipo II 3b, N.° de acceso de Genbank. NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); WO2004022778 (Reivindicacion 2); EP1394274 (Ejemplo 11);
WO2002102235 (Reivindicacion 13; Pagina 326); EP875569 (Reivindicacion 1; Pagina 17-19); WO200157188 (Reivindicacion 20; Pagina 329); WO2004032842 (Ejemplo IV); WO200175177 (Reivindicacion 24; Pagina 139140); Referencias cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmatico corto, (semaforina) 5B, N.° de acceso de Genbank. AB040878) Nagase T., et al (2000) DNA Res. 7 (2):143-150); WO2004000997 (Reivindicacion 1); WO2003003984 (Reivindicacion 1); WO200206339 (Reivindicacion 1; Pagina 50); WO200188133 (Reivindicacion 1; Pagina 41-43, 48-58); WO2003054152 (Reivindicacion 20); WO2003101400 (Reivindicacion 11);
Acceso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737;
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gen RIKEN cDNA 2700050C12, N.° de acceso de Genbank. AY358628); Ross et al (2002) Cancer Res. 62:2546-2553;
US2003129192 (Reivindicacion 2); US2004044180 (Reivindicacion 12); US2004044179 (Reivindicacion 11); US2003096961 (Reivindicacion 11); US2003232056 (Ejemplo 5); WO2003105758 (Reivindicacion 12); US2003206918 (Ejemplo 5); EP1347046 (Reivindicacion 1); WO2003025148 (Reivindicacion 20);
Referencias cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR (receptor de endotelina tipo B, N.° de acceso de Genbank. AY275463);
Nakamuta M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 178,248-255, 1991; Arai H., et al Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem. Biophys. Res. Commun.178, 656-663,1991;
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Elshourbagy N.A., et al J. Biol. Chem. 268, 3873-3879,1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, si- 84, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.8.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997; Verheij JB., et al Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur. J. Hum. Genet. 5.180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79,1257-1266,1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum. Mol. Genet. 5:351-354,1996; Amiel J., et al Hum. Mol. Genet 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat. Genet. 12, 445-447,1996; Svensson PJ., et al Hum. Genet. 103,145148,1998; Fuchs 8., et al Mol. Med. 7,115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum. Genet. 111,198-206; WO004045516 (Reivindicacion 1); WO2004048938 (Ejemplo 2); W02004040000 (Reivindicacion 151); W02003087768 (Reivindicacion 1); W0200301647 (Reivindicacion 1); W02003016475 (Reivindicacion 1); W0200261087 (Fig 1); W0200301649 (Fig 6); W02003025138 (Reivindicacion 12; Pagina 144); W0200198351 (Reivindicacion 1; Pagina 124-125); EP522868 (Reivindicacion 8; Fig 2); W0200177172 (Reivindicacion 1; Pagina 297-299); U82003109676; U86518404 (Fig 3); U85773223 (Reivindicacion la; Col 31-34);
W0004001004;
(10) M8G783 (RNF124, protelna hipotetica FLJ20315, N.° de acceso de Genbank. NM_017763); W02003104275 (Reivindicacion 1); W02004046342 (Ejemplo 2); W02003042661 (Reivindicacion 12); W02003083074 (Reivindicacion 14; Pagina 61); W02003018621 (Reivindicacion 1); W02003024392 (Reivindicacion 2; Fig 93); W0200166689 (Ejemplo 6);
(11) 8TEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, 8TAMP1, 8TEAP2, 8TMP, gen asociado al cancer de prostata 1, protelna asociada al cancer de prostata 1, antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata 2, protelna de la prostata de seis dominios transmembrana, N.° de acceso de Genbank. AF455138)
Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); W02003087306; U82003064397 (Reivindicacion 1; Fig 1); W0200272596 (Reivindicacion 13; Pagina 54-55); W0200172962 (Reivindicacion 1; Fig 4B); W02003104270 (Reivindicacion 11); W02003104270 (Reivindicacion 16); U82004005598 (Reivindicacion 22); W02003042661 (Reivindicacion 12); U82003060612 (Reivindicacion 12; Fig 10); W0200226822 (Reivindicacion 23; Fig 2); W0200216429 (Reivindicacion 12; Fig 10);
Referencias cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal cationico de potencial de receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4, N.° de acceso de Genbank. NM_017636)
Xu, X.Z, et al Proc. Natl. Acad. 8ci. U.8.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); U82003143557 (Reivindicacion 4); W0200040614 (Reivindicacion 14; Pagina 100-103); W0200210382 (Reivindicacion 1; Fig 9A); W02003042661 (Reivindicacion 12); W0200230268 (Reivindicacion 27; Pagina 391); U82003219806 (Reivindicacion 4); W0200162794 (Reivindicacion 14; Fig 1A- D);
Referencias cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPT0 (CR, CR1, CRGF, CRIPT0, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, N.° de acceso de Genbank. NP_003203 o NM_003212)
Ciccodicola, A., et al EMB0 J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 43):555-565 (1991)); U82003224411 (Reivindicacion 1); W02003083041 (Ejemplo 1); W02003034984 (Reivindicacion 12); W0200288170 (Reivindicacion 2; Pagina 52-53); W02003024392 (Reivindicacion 2; Fig 58); W0200216413 (Reivindicacion 1; Pagina 94-95, 105); W0200222808 (Reivindicacion 2; Fig 1); U85854399 (Ejemplo 2; Col 1718); U85792616 (Fig 2); Referencias cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein Barr) o Hs.73792 N.° de acceso de Genbank. M26004)
Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp. Med. 167,1047-1066,1988; Moore M., et al Proc. Natl. Acad. 8ci. U.8.A. 84,9194-9198,1987; Barel M., et al Mol. Immunol. 35,1025-1031,1998; Weis JJ., et al Proc. Natl. Acad. 8ci. U.8.A. 83, 5639-5643, 1986; 8inha 8.K., et al (1993) J. Immunol.150, 53115320; W02004045520 (Ejemplo 4);
U82004005538 (Ejemplo 1); W02003062401 (Reivindicacion 9); W02004045520 (Ejemplo 4);
W09102536 (Fig 9.1.-9.9); W02004020595 (Reivindicacion 1);
Acceso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (inmunoglobulina beta asociada), B29, N.° de acceso de Genbank. NM_000626 o 11038674)
Proc. Natl. Acad. 8ci. U.8.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur.J. Immunol. 22 (6):1621-1625); W02004016225 (Reivindicacion 2, Fig 140); W02003087768. U82004101874 (Reivindicacion 1. pagina 102); W02003062401 (Reivindicacion 9); W0200278524 (Ejemplo 2); U82002150573 (Reivindicacion 5, pagina 15); U85644033; W02003048202 (Reivindicacion 1, paginas 306 y 309); W0 99/558658, U86534482 (Reivindicacion 13, Fig 17A/B); W0200055351 (Reivindicacion 11, paginas 1145-1146); Referencias cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
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(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (protelna 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C, N.° de acceso de Genbank. NM_030764, AY358130)
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, MJ., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO2004016225 (Reivindicacion 2); WO2003077836; WO200138490 (Reivindicacion 5; Fig 18D-1-18D-2); WO2003097803 (Reivindicacion 12); WO2003089624 (Reivindicacion 25);
Referencias cruzadas: MIM:606509; NP_1103912; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, N.° de acceso de Genbank. M11730)
Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234,1986; Semba K., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns JJ., et al J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429;
WO2004048938 (Ejemplo 2); WO2004027049 (Fig 1I); WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (Reivindicacion 9); WO2003016475 (Reivindicacion 1); US2003118592; WO2003008537 (Reivindicacion 1); WO2003055439 (Reivindicacion 29; Fig 1A-B); WO2003025228 (Reivindicacion 37; Fig 5C); WO200222636 (Ejemplo 13; Pagina 95-107); WO200212341 (Reivindicacion 68; Fig 7); WO200213847 (Pagina 71-74); WO200214503 (Pagina 114-117); WO200153463 (Reivindicacion 2; Pagina 41-46); WO200141787 (Pagina 15); WO200044899 (Reivindicacion 52; Fig 7); WO200020579 (Reivindicacion 3; Fig 2); US5869445.(Reivindicacion 3; Col 31-38); WO9630514 (Reivindicacion 2; Pagina 56-61); EP1439393 (Reivindicacion 7); WO2004043361 (Reivindicacion 7);
WO2004022709; WO200100244 (Ejemplo 3; Fig 4);
Acceso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1.
(18) NCA (CEACAM6, N.° de acceso de Genbank. M18728);
Barnett T., et al Genomics 3,59-66,1988; Tawaragi Y., et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899-16903,2002; WO2004063709;
EP1439393 (Reivindicacion 7); WO2004044178 (Ejemplo 4); WO2004031238; WO2003042661 (Reivindicacion 12);
WO200278524 (Ejemplo 2); WO200286443 (Reivindicacion 27; Pagina 427); WO200260317 (Reivindicacion 2); Acceso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
(19) MDP (DPEP1, N.° de acceso de Genbank. BC017023)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); WO2003016475 (Reivindicacion 1);
WO200264798 (Reivindicacion 33; Pagina 85-87); JP05003790 (Fig 6-8); WO9946284 (Fig 9);
Referencias cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Ra (IL20Ra, ZCYTOR7, N.° de acceso de Genbank. AF184971);
Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol. 167, 3545-3549. 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; EP1394274 (Ejemplo 11); US2004005320 (Ejemplo 5); WO2003029262 (Pagina 7475); WO2003002717 (Reivindicacion 2; Pagina 63); WO200222153 (Pagina 45-47); US2002042366 (Pagina 2021); WO200146261 (Pagina 57-59); WO200146232 (Pagina 63-65); WO9837193 (Reivindicacion 1; Pagina 5559);
Acceso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, N.° de acceso de Genbank. AF229053) Gary S.C.. et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003;
Strausberg RL., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003186372 (Reivindicacion 11); US2003186373 (Reivindicacion 11); US2003119131 (Reivindicacion 1; Fig 52); US2003119122 (Reivindicacion 1; Fig 52); US2003119126 (Reivindicacion 1); US2003119121 (Reivindicacion 1; Fig 52); US2003119129 (Reivindicacion 1); US2003119130 (Reivindicacion 1); US2003119128 (Reivindicacion 1; Fig 52); US2003119125 (Reivindicacion 1); WO2003016475 (Reivindicacion 1); WO200202634 (Reivindicacion 1);
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5. N.° de acceso de Genbank. NM_04442) Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); WO2003042661 (Reivindicacion 12);
WO200053216 (Reivindicacion 1; Pagina 41); WO2004065576 (Reivindicacion 1); WO2004020583
(Reivindicacion 9); WO2003004529 (Pagina 128-132); WO200053216 (Reivindicacion 1; Pagina 42);
Referencias cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; No_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, N.° de acceso de Genbank. AX092328)
US20040101899 (Reivindicacion 2); WO2003104399 (Reivindicacion 11); WO2004000221 (Fig 3);
US2003165504 (Reivindicacion 1); US2003124140 (Ejemplo 2); US2003065143 (Fig 60); WO2002102235 (Reivindicacion 13; Pagina 299);
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US2003091580 (Ejemplo 2); WO200210187 (Reivindicacion 6; Fig 10); WO200194641 (Reivindicacion 12; Fig 7b);
WO200202624 (Reivindicacion 13; Fig 1A-1B); US2002034749 (Reivindicacion 54; Pagina 45-46);
WO200206317 (Ejemplo 2;
Pagina 320-321, Reivindicacion 34; Pagina 321-322); WO200271928 (Pagina 468-469); WO200202587 (Ejemplo 1; Fig 1); WO200140269 (Ejemplo 3; Paginas 190-192); WO200036107 (Ejemplo 2; Pagina 205-207); WO2004053079 (Reivindicacion 12); WO2003004989 (Reivindicacion 1); WO200271928 (Pagina 233-234, 452453); WO 0116318;
(24) PSCA (Precursor del antlgeno de las celulas madre prostaticas, N.° de acceso de Genbank. AJ297436) Reiter RE., et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95,1735-1740,1998; Gu Z, et al Oncogene 19, 1288-1296,2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004022709,
EP1394274 (Ejemplo 11); US2004018553 (Reivindicacion 17); WO2003008537 (Reivindicacion 1); WO200281646 (Reivindicacion 1; Pagina 164); WO2003003906 (Reivindicacion 10; Pagina 288): WO200140309 (Ejemplo 1; Fig 17); US2001055751 (Ejemplo 1; Fig 1b); WO200032752 (Reivindicacion 18; Fig 1); WO9851805 (Reivindicacion 17; Pagina 97); WO9851824 (Reivindicacion 10; Pagina 94); WO9840403 (Reivindicacion 2; Fig 1B);
Acceso: 043653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
(25) GEDA (N.° de acceso de Genbank. AY260763);
protelna de tipo companero de fusion de la HMGIC de lipoma AAP14954 /pid=AAP14954.1 - Especie Homo sapiens: Homo sapiens (humano)
WO2003054152 (Reivindicacion 20); WO2003000842 (Reivindicacion 1); WO2003023013 (Ejemplo 3, Reivindicacion 20); US2003194704 (Reivindicacion 45);
Referencias cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (receptor del factor de activacion de linfocitos B, receptor BLyS 3, BR3, N.° de acceso de Genbank. AF116456); receptor de BAFF/pid=NP_443177.1 - Homo sapiens Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004058309; WO2004011611;
WO2003045422 (Ejemplo; Pagina 32-33); WO2003014294 (Reivindicacion 35; Fig 6B); WO2003035846 (Reivindicacion 70; Pagina 615-616); WO200294852 (Col 136-137); WO200238766 (Reivindicacion 3; Pagina 133); WO200224909 (Ejemplo 3; Fig 3);
Referencias cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, N.° de acceso de Genbank. AK026467);
Wilson et al (1991) J. Exp. Med. 173:137-146; WO2003072036 (Reivindicacion 1; Fig 1);
Referencias cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa asociada, una protelna especlfica de linfocitos B que interacciona covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moleculas de IgM, transduce una senal implicada en la diferenciacion de linfocitos B), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gene Chromosome: 19q13.2, N.° de acceso de Genbank. NP_001774.10)
WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (Reivindicacion 9); US2002150573 (Reivindicacion 4, paginas 13-14);
WO9958658 (Reivindicacion 13, Fig 16); WO9207574 (Fig 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1 ):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464;
(29) CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la protelna G que se activa por la quimiocina CXCL13, interviene en la migracion de linfocitos y en la defensa humoral, desempena un papel en la infeccion por VIH-2 y quizas en el desarrollo del SIDA, linfoma, mieloma y leucemia); 372 aa, pI: 854 MW: 41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: 11q23.3, N.° de acceso de Genbank. NP_001707.1)
WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (Ejemplo 2); US6555339 (Ejemplo 2); WO200261087 (Fig 1); WO200157188 (Reivindicacion 20, pagina 269); WO200172830 (paginas 12-13); WO200022129 (Ejemplo 1, paginas 152-153, Ejemplo 2, paginas 254-256); WO9928468 (Reivindicacion 1, pagina 38); US5440021 (Ejemplo 2, col 49-52); WO9428931 (Paginas 56-58); WO9217497 (Reivindicacion 7, Fig 5); Dobner et al (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem. J. 309:773-779;
(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molecula MHC de clase II (antlgeno Ia) que une los peptidos y los presenta a los linfocitos T CD4+); 273 aa, pI: 656 MW: 30820 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, N.° de acceso de Genbank. NP_002111.1)
Tonnelle et al (1985) eMbOJ. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue
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Antigens 59:512-519; WO9958658 (Reivindicacion 13, Fig 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119;
(31) P2X5 (canal ionico activado por ligando del receptor purinergico P2X 5, canal ionico activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmision sinaptica y la neurogenesis, cuya deficiencia puede contribuir a la fisiopatologla de la inestabilidad idiopatica del detrusor); 422 aa), pi: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17p13.3, N.° de acceso de Genbank. NP_002552.2)
Le et al (1997) FEBS Lett. 418(1-2):195-199; WO2004047749; WO2003072035 (Reivindicacion 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; WO200222660 (Reivindicacion 20); WO2003093444 (Reivindicacion 1); WO2003087768 (Reivindicacion 1); WO2003029277 (Pagina 82);
(32) CD72 (antlgeno de diferenciacion de linfocitos B CD72, Lyb-2) SECUENCIA DE PROTEINAS COMPLETA Full maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pi: 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 9p13.3, N.° de acceso de Genbank. NP_001773.1)
WO2004042346 (Reivindicacion 65); WO2003026493 (Paginas 51-52, 57-58); WO200075655 (Paginas 105106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903;
(33) LY64 (antlgeno linfocitario 64 (RP105), protelna de membrana tipo I de la familia de protelnas con repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activacion de linfocitos B y la apoptosis, la perdida de funcion esta asociada a una mayor actividad en pacientes con lupus eritematoso sistemico); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: [P] Gene Chromosome: 5q12, N.° de acceso de Genbank. NP_005573.1)
US2002193567; WO9707198 (Reivindicacion 11, paginas 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003083047; WO9744452 (Reivindicacion 8, paginas 57-61); WO200012130 (Paginas 24-26);
(34) FcRH1 (protelna de tipo receptor Fc 1, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene los dominios similares a Ig tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciacion de linfocitos B); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21-1q22, N.° de acceso de Genbank. NP_443170.1) WO2003077836; WO200138490 (Reivindicacion 6, Fig 18E-1-18-E-2); Davis et al (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003089624 (Reivindicacion 8); EP1347046 (Reivindicacion 1); WO2003089624 (Reivindicacion 7);
(35) IRTA2 (receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas asociado a la translocacion, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de los linfocitos B y la linfomagenesis; en algunas neoplasias de linfocitos B se produce alteracion de la regulacion del gen mediante translocacion); 977 aa, pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [p] Gene Chromosome: Iq21, N.° de acceso de Genbank. Humano:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Raton:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1 WO2003024392 (Reivindicacion 2, Fig 97); Nakayama et al (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124-127; WO2003077836; WO200138490 (Reivindicacion 3, Fig 18B-1-18B-2);
(36) TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con Familia EGF/heregulina de los factores de crecimiento y folistatina); 374 aa, Acceso NCBI: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; N.° de acceso de Genbank. AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436
WO2004074320 (SEQ ID NO 810); JP2004113151 (SEQ ID NOS 2,4, 8); WO2003042661 (SEQ ID NO 580); WO2003009814 (SEQ ID NO 411); EP1295944 (Paginas 69-70); WO200230268 (Pagina 329); WO200190304 (SEQ ID NO 2706); US2004249130; US2004022727; WO2004063355; US2004197325; US2003232350; US2004005563; US2003124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res. 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer. Oct 15;94(2):178-84.
El anticuerpo parental tambien puede ser una protelna de fusion que comprende una secuencia de peptido de union a albumina (ABP) (Dennis et al. (2002). "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Los anticuerpos de la invention incluyen protelnas de fusion con secuencias de ABP ensenadas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277: 3503535043 en las Tablas III y IV, pagina 35038; (ii) US 20040001827 en [0076] SEQ ID NOS: 9-22 y (iii) WO 01/45746 en las paginas 12-13, SEQ ID NOS: z1-z14.
MUTAGENESIS
El ADN que codifica una variante de una secuencia de aminoacidos del polipeptido de partida se prepara por varios metodos conocidos en la tecnica. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, la preparation por mutagenesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleotidos), mutagenesis por PCR y mutagenesis de cassette de un ADN
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preparado anteriormente que codifica el polipeptido. Las variantes de anticuerpos recombinantes pueden ser construidas tambien mediante manipulacion de fragmentos de restriccion o mediante PCR de extension por solapamiento con los oligonucleotidos sinteticos. Los cebadores mutagenicos codifican la sustitucion(s) del codon de cistelna. Se pueden emplear tecnicas de mutagenesis estandar para generar ADN que codifica tales anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna mutantes. Los detalles generales pueden encontrarse en Sambrook et al Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; y Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, N. Y., 1993.
La mutagenesis dirigida es un metodo para preparar variantes de sustitucion, es decir, protelnas mutantes. Esta tecnica es bien conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, Carter (1985) et al Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443; Ho et al (1989) Gen (Amst.) 77:51-59; y Kunkel et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 488). En resumen, en la realizacion de la mutagenesis dirigida al sitio de ADN, el ADN de partida se altera hibridando primero un oligonucleotido que codifica la mutacion deseada con una sola hebra de tal ADN de partida. Despues de la hibridacion, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra entera, usando el oligonucleotido hibridado como cebador, y utilizando la cadena sencilla del ADN de partida como molde. Asl, el oligonucleotido que codifica la mutacion deseada se incorpora en el ADN de doble cadena resultante. La mutagenesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo dentro del gen que expresa la protelna que se mutageniza en un plasmido de expresion y el plasmido resultante puede ser secuenciado para confirmar la introduccion de las mutaciones de sustitucion de cistelna deseadas (Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252-20260). Los protocolos y formato de mutagenesis dirigida al sitio incluyen los que estan disponibles comercialmente, por ejemplo QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA).
La mutagenesis por PCR tambien es adecuada para hacer variantes de secuencia de aminoacidos del polipeptido de partida. Ver Higuchi, (1990) en PCR Protocols, pp.177-183, Academic Press; Ito et al (1991) Gen 102: 67-70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5: 126-132; y Vallette et al (1989) Nuc. Acids Res. 17: 723-733. En resumen, cuando se utilizan pequenas cantidades de ADN molde como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la region correspondiente en un ADN molde se pueden utilizar para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN especlfico que difiere de la secuencia molde solo en las posiciones donde los cebadores difieren del molde.
Otro metodo para preparar variantes, la mutagenesis de casete, se basa en la tecnica descrita por Wells et al (1985) Gene 34: 315-323. El material de partida es el plasmido (u otro vector) que comprende el aDn del polipeptido de partida a mutar. Se identifican el codon o codones en el ADN de partida a mutar. Debe haber un sitio de endonucleasa de restriccion unico en cada lado del sitio(s) de mutacion identificado. Si no existen tales sitios de restriccion, pueden generarse usando el metodo de mutagenesis mediada por oligonucleotidos descrito anteriormente para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN del polipeptido de partida. El ADN del plasmido se corta en estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleotido de doble cadena que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restriccion pero que contiene la mutacion(es) deseada usando tecnicas estandar, en el que las dos hebras del oligonucleotido se sintetizan por separado y luego se hibridan juntas utilizando tecnicas estandar. Este oligonucleotido de doble cadena se conoce como el cassette. Este casete esta disenado para tener extremos 5' y 3' que son compatibles con los extremos del plasmido linearizado, de modo que pueda ligarse directamente al plasmido. Este plasmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada. El aDn mutante que contiene las sustituciones de cistelna codificadas puede ser confirmado mediante secuenciacion de ADN.
Las mutaciones individuales tambien son generadas por mutagenesis dirigida de oligonucleotidos utilizando ADN plasmldico de doble hebra como molde mediante mutagenesis basada en PCR (Sambrook y Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; Zoller et al (1983) Methods Enzymol. 100:468-500; Zoller, MJ. y Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487-6500).
En la presente invention, se uso hu4D5Fabv8 expresado en el fago M13 (Gerstner et al (2002) "Sequence Plasticity In The Antigen-Binding Site Of A Therapeutic Anti-HER2 Antibody", J Mol. 321: 851-62) para los experimentos como un sistema modelo. Las mutaciones de cistelna se introdujeron en las construcciones hu4D5Fabv8-fago, hu4D5Fabv8 y ABP-hu4D5Fabv8. Las preparaciones de hu4D5-TioFab-fago se llevaron a cabo utilizando el metodo de precipitation con polietilenglicol (PEG) como se describio anteriormente (Lowman, Henry B. (1998) Methods in Molecular Biology (Totowa, New Jersey) 87 (Combinatorial Peptide Library Protocols) 249- 264).
Los oligonucleotidos se preparan por el metodo de slntesis de fosforamidita (US 4415732; US 4458066; Beaucage, S. and Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223-2311). El metodo de la fosforamidita implica ademas la adicion clclica de unidades monomericas de nucleotido con un resto 3' fosforamidita reactivo a una cadena de oligonucleotido en crecimiento en un soporte solido compuesto de vidrio de poro controlado o de poliestireno altamente reticulado y lo mas comunmente en la direction 3' a 5' en la cual el nucleosido 3' terminal esta unido al soporte solido en el principio de la slntesis (US 5047524; US 5262530). El metodo se practica generalmente usando sintetizadores disponibles comercialmente automatizados (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los oligonucleotidos pueden marcarse qulmicamente con restos no
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isotopicos para la deteccion, captura, estabilizacion u otros fines (Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) en PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, pp. 39-54; Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671; Keller, G. and Manak, M. en DNA Probes Second Edition (1993), Stockton Press, New York, pp. 121-23).
ENSAYO PHESELECTOR
El ensayo PHESELECTOR (ELISA de fagos para la seleccion de tioles reactivos) permite la deteccion de grupos cistelna reactivos en anticuerpos en un formato de ELISA de fagos. El proceso de recubrimiento de la protelna (por ejemplo anticuerpo) de interes en las superficies del pocillo, seguido de la incubacion con las partlculas de fago y, a continuacion el anticuerpo secundario marcado con HRP con deteccion de absorbancia se detalla en el Ejemplo 2. Las protelnas mutantes expresadas en el fago se pueden seleccionar de una manera rapida, robusta y con alto rendimiento. Se pueden producir bibliotecas de anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna y someterse a seleccion de union utilizando el mismo enfoque para identificar sitios adecuadamente reactivos de incorporacion de Cis libre de bibliotecas de fagos de protelnas aleatorias de anticuerpos u otras protelnas. Esta tecnica incluye hacer la reaccion de las protelnas mutantes de cistelna que se expresan en fagos con un reactivo de afinidad o grupo informador que tambien es reactivo con tiol. La Figura 8 ilustra el Ensayo PHESELECTOR mediante una representacion esquematica que representa la union de Fab o TioFab a HER2 (arriba) y TioFab biotinilado a estreptavidina (abajo).
EXPRESION Y PURIFICACION DE PROTEINAS
El ADN que codifica los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna se alsla facilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ej., usando sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especlficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podrla colocarse en vectores de expresion, que luego son transfectados en celulas hospedadoras, tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o de otras celulas hospedadoras de mamlfero, tales como celulas de mieloma (US 5807715; US 2005/0048572; Us 2004/0229310) que de otro modo no producen la protelna del anticuerpo, para obtener la slntesis de anticuerpos monoclonales en las celulas hospedadoras recombinantes. Los rendimientos de los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna hu4D5Fabv8 fueron similares a hu4D5Fabv8 de tipo silvestre. Los artlculos de revision sobre la expresion recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 y Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151-188.
Despues del diseno y seleccion, los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna, por ejemplo, TioFabs, con residuos de Cis no emparejados altamente reactivos, se pueden producir por: (i) expresion en una celula bacteriana, por ejemplo, sistema de E. coli o un sistema de cultivo de celulas de mamlfero (WO 01/00245), por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino (CHO) y (ii) purificacion utilizando tecnicas de purificacion de protelnas comunes (Lowman et al (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982-10988).
Los TioFabs se expresaron despues de la induccion en 34B8, una cepa de E. coli no supresora (Baca et al (1997) Journal of Biological Chemistry 272(16):10678-84). Vease el ejemplo 3a. El sedimento celular cosechado se resuspendio en PBS (solucion salina tamponada con fosfato), la lisis total de celulas se llevo a cabo mediante el paso a traves de un microfluidizador y los TioFabs se purificaron por cromatografla de afinidad con protelna G SEPHAROSE™ (Amersham). Los TioFabs se conjugaron con biotina-PEO-maleimida como se ha descrito anteriormente y los TioFabs biotinilados se purificaron adicionalmente por cromatografla de filtracion en gel Superdex-200™ (Amersham), que elimino la biotina libre-PEO-maleimida y la fraccion oligomerica de TioFabs.
anAlisis DE ESPECTROSCOPIA DE MASAS
Se empleo el analisis de cromatografla llquida de ionizacion por electronebulizacion y espectrometrla de masas (LC- ESI-MS) para la determinacion del peso molecular exacto de Fab conjugado con biotina (Cole, R.B. Electro Spray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation And Applications. (1997) Wiley, New York). La secuencia de aminoacidos del peptido hu4D5Fabv8 (A121C) biotinilado se determino por digestion trlptica seguida por analisis de LC-ESI-MS en tandem (Tabla 4, Ejemplo 3b).
El fragmento de anticuerpo Fab hu4D5Fabv8 contiene aproximadamente 445 residuos de aminoacidos, incluyendo 10 residuos de Cis (cinco en la cadena ligera y cinco en la cadena pesada). La estructura de alta resolucion del fragmento variable 4D5 humanizado (Fv4D5) se ha establecido, ver: Eigenbrot et al "X-Ray Structures Of The Antigen-Binding Domains From Three Variants Of Humanized Anti-P185her2 Antibody 4D5 And Comparison With Molecular Modeling" (1993) J Mol Biol. 229:969-995). Todos los residuos de Cis estan presentes en forma de enlaces disulfuro, por lo tanto, estos residuos no tienen ningun grupo tiol reactivo para conjugar con el farmaco- maleimida (a no ser tratados con un agente reductor). Por lo tanto, el residuo Cis recien modificado por ingenierla genetica, puede permanecer sin emparejar y es capaz de reaccionar con, es decir, conjugarse con un reactivo enlazador electrofilo o intermedio farmaco-enlazador, tal como un farmaco-maleimida. La figura 1A muestra una
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representacion tridimensional del fragmento de anticuerpo hu4D5Fabv8 derivado por las coordenadas de cristal de rayos X. Las posiciones de estructura de los residuos de Cis modificados por ingenieria genetica de las cadenas pesada y ligera se numeran de acuerdo con un sistema de numeracion secuencial. Este sistema de numeracion secuencial se correlaciona con el sistema de numeracion de Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Servicio de Salud Publica, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) para la variante 4d5v7fabH de trastuzumab de acuerdo con la Figura 1B que muestra el esquema de numeracion secuencial (fila superior), comenzando en el extremo N-terminal, se diferencia del esquema de numeracion de Kabat (fila inferior) mediante inserciones senaladas por a, b, c. Usando el sistema de numeracion de Kabat, la secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos o mas aminoacidos adicionales correspondientes a un acortamiento de, o insercion en, un Fr o CDR del dominio variable. Los sitios variantes de la cadena pesada modificados por ingenieria genetica con cisteina se identifican por la numeracion secuencial y los esquemas de numeracion de Kabat en la siguiente tabla:
Variantes de cadena pesada 4D5Fab
Numeracion secuencial Numeracion de Kabat
A40C
Ala-40 Ala-40
A88C
Ala-88 Ala-84
S119C
Ser-119 Ser-112
S120C
Ser-120 Ser-113
A121C
Ala-121 Ala-114
S122C
Ser-122 Ser-115
A175C
Ala-175 Ala-168
Los Fabs mutantes de Cis-fagemido M13 (Figuras 3A y 3B) pueden seleccionarse rapidamente en comparacion con las proteinas Fab. La union del fagemido-TioFab al antigeno y a la estreptavidina se puede ensayar mediante el recubrimiento de HER2 y estreptavidina, respectivamente, en placas de ELISA seguido de ensayo con anti-Fab-HRP (peroxidasa de rabano picante) como se describe en el Ejemplo 2 y se representa en la Figura 8. Este metodo permitio el control simultaneo del efecto sobre la union al antigeno y la reactividad del grupo tiol por el residuo de Cis modificado por ingenieria genetica/molecula de biotina conjugada. Ademas, el metodo puede ser aplicado para detectar los grupos tiol reactivos de cualquier proteina expresada en el fago M13. Los fagemido-TioFabs conjugados o no conjugados se purifican mediante precipitacion con PEG simple.
El fragmento de union a antigeno de 4D5 humanizado (hu4D5Fab) se expresa bien en E. coli y se ha expresado en un bacteriofago (Garrard et al (1993) Gene 128: 103-109). El fragmento de anticuerpo Fab hu4D5Fabv8 se expreso en el fago M13 como un sistema modelo en el ensayo basado en ELISA para investigar la reactividad del tiol. La Figura 8 es una representacion grafica del ensayo PHESELECTOR, que representa la union de un fago TioFab biotinilado y un anticuerpo anti-fago-HRP a HER2 (arriba) y estreptavidina (abajo). Se seleccionaron inicialmente cinco residuos de aminoacidos (L-Ala43, H-Ala40, H-Ser119, Ala121 y H-H-Ser122) a partir de informacion de la estructura cristalina como remotos respecto a la superficie de union al antigeno (Eigenbrot et al (1993) J Mol Biol. 229: 969-995). La estructura cristalina de rayos X de la base de datos de proteinas se designa como 1FVC. Los residuos de Cis fueron disenados en estas posiciones por mutagenesis dirigida al sitio. Las preparaciones TioFab- fago se aislaron y se hicieron reaccionar con el reactivo de biotinilacion.
Las variantes conjugadas y no conjugadas con biotina se ensayaron para HER2 y la union a estreptavidina utilizando un ensayo PHESELECTOR basado en ELISA (Figura 8, Ejemplo 2) con un anticuerpo anti-fago conjugado con HRP (peroxidasa de rabano picante). La interaccion de fago-hu4D5Fabv8 no biotinilado (Figura 2A) y fago-hu4D5Fabv8 bitoinilado (Figura 2B) con BSA (barra en blanco), HER2 (barra gris) o estreptavidina (barra rellena) se controlo a traves de un anticuerpo anti-M13-peroxidasa de rabano picante (HRP) mediante el desarrollo de una reaccion de HRP estandar y midiendo la absorbancia a 450 nm. La absorbancia producida por la rotacion de un sustrato colorimetrico se midio a 450 nm. La reactividad de TioFab con HER2 mide la union al antigeno. La reactividad de TioFab con estreptavidina mide el grado de biotinilacion. La reactividad de TioFab con BSA es un control negativo para la interaccion no especifica. Como se ve en la Figura 2A, todas las variantes TioFab-fago tienen una union similar a HER2 en comparacion con la del 4D5Fabv8-fago de tipo silvestre. Ademas, la conjugacion con biotina no interfirio en la union de TioFab a HER2 (Figura 2B).
Sorprendentemente e inesperadamente, las muestras TioFabs-fago mostraron niveles variables de actividad de union a estreptavidina. De todos los fagos TioFabs ensayados, el anticuerpo modificado por ingenieria genetica con cisteina A121C exhibio la reactividad del tiol maxima. Aunque hu4D5Fabv8-fago de tipo silvestre se incubo con las mismas cantidades de biotina-maleimida, estos fagos tenian poca union a estreptavidina, lo que indica que los residuos de cisteina preexistentes (que participan en formation de enlaces disulfuro) de hu4D5Fabv8 y de las proteinas de la cubierta del fago M13 no interferian con la conjugacion especifica del sitio de biotina-maleimida. Estos resultados demuestran que el ensayo ELISA de fagos se puede utilizar con exito para seleccionar grupos tiol reactivos en la superficie de Fab.
El ensayo PHESELECTOR permite cribar grupos tiol reactivos en anticuerpos. Un ejemplo es la identification de la variante A121C por este metodo. La molecula Fab entera puede buscarse eficazmente para identificar mas variantes
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de tioFab con grupos tiol reactivos. Un parametro, la accesibilidad superficial fraccionada, se empleo para identificar y cuantificar la accesibilidad de disolvente a los residuos de aminoacidos en un polipeptido. La accesibilidad superficial puede expresarse como el area superficial (A2) que puede ponerse en contacto por una molecula de disolvente, por ejemplo, agua. El espacio de agua ocupado es aproximadamente como una esfera de 1,4 A de radio. El software esta libremente disponible o susceptible a licencia (Secretary to CCP4, Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 4AD, United Kingdom, Fax: (+44) 1925 603825, o por internet:

www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html) como la Suite CCP4 de programas de cristalografla que emplean algoritmos para calcular la accesibilidad superficial de cada aminoacido de una protelna con coordenadas derivadas de cristalografla de rayos X (The CCp4 Suite: Programs for Protein Crystallography" (1994) Acta. Cryst. D50:760-763). Dos ejemplos de modulos de software ejemplo que realizan los calculos de accesibilidad superficial son "AREAIMOL" y "SURFACE", basados en los algoritmos de B. Lee y F.M. Richards (1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400. AREAIMOL defines la superficie accesible al disolvente de una protelna en el sitio del centro de una esfera de sonda (que representa una molecula de disolvente) ya que rueda sobre la superficie de van der Waals de la protelna. AREAIMOL calcula el area superficial accesible al disolvente generando puntos de superficie sobre una esfera extensa alrededor de cada atomo (a una distancia del centro del atomo igual a la suma del radio del atomo y la sonda) y eliminando aquellos que se encuentran dentro de esferas equivalentes asociadas a atomos vecinos. AREAIMOL encuentra el area accesible al disolvente de atomos en un archivo de coordenadas PDB y resume el area accesible por residuo, por cadena y para la molecula completa. Areas accesibles (o diferencias de areas) para atomos individuales pueden escribirse a un archivo de salida pseudo-PDB. AREAIMOL supone un unico radio para cada elemento y solo reconoce un numero limitado de elementos diferentes. A los tipos de atomos desconocidos (es decir, los que no estan en la base de datos interna de AREAIMOL) se les asignara el radio por defecto de 1,8 A. La lista de atomos reconocidos es:
Atomo Numero atomico
C
6
N
7
O
8
Mg
12
S
16
P
15
Cl
17
Co
27
Radio de van der Waals (A)
1,80 1,65 1,60 1,60 1,85 1,90
1,80
1,80
AREAIMOL y SURFACE informan accesibilidades absolutas, es decir, el numero de Angstroms (A) cuadrados. La accesibilidad superficial fraccionada se calcula por referencia a un estado patron relevante para un aminoacido dentro de un polipeptido. El estado de referencia es el tripeptido Gly-X-Gly en la que X es el aminoacido de interes, y el estado de referencia deberla ser una conformacion 'extendida', es decir, como aquellas en cadenas beta. La conformacion extendida maximiza la accesibilidad de X. Un area accesible calculada se divide entre el area accesible en un estado de referencia del tripeptido Gly-X-Gly e informa el cociente, que es la accesibilidad fraccionada. El porcentaje de accesibilidad es la accesibilidad fraccionada multiplicada por 100.
Otro algoritmo a modo de ejemplo para calcular la accesibilidad superficial se basa en el modulo SOLV del programa xsae (Broger, C., F. Hoffman-LaRoche, Basilea) que calcula la accesibilidad fraccionada de un residuo de aminoacido con respecto a una esfera de agua basada en las coordenadas de rayos X del polipeptido.
La accesibilidad superficial fraccionada para cada aminoacido en hu4D5Fabv7 se calculo usando la informacion de la estructura cristalina (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229: 969-995). Los valores de accesibilidad superficial fraccionada para los aminoacidos de la cadena ligera y la cadena pesada de hu4D5Fabv7 se muestran en orden descendente en la Tabla 1.
Tabla 1.
hu4D5Fabv7-cadena ligera
SER
A 202 frac acc= 101,236 ASP A 151 frac acc= 41,586
GLY
A 41 frac acc= 90,775 SER A 12 frac acc= 40,633
GLY
A 157 frac acc= 88,186 ASN A 210 frac acc= 40,158
ASP
A 1 frac acc= 87,743 SER A 63 frac acc= 39,872
SER
A 156 frac acc= 83,742 ARG A 66 frac acc= 39,669
GLY
A 57 frac acc= 81,611 PRO A 8 frac acc= 39,297
SER
A 168 frac acc= 79,680 SER A 65 frac acc= 39,219
SER
A 56 frac acc= 79,181 SER A 77 frac acc= 38,820
LYS
A 169 frac acc= 77,591 THR A 180 frac acc= 38,296
SER
A 60 frac acc= 75,291 ASP A 185 frac acc= 38,234
THR
A 109 frac acc= 74,603 THR A 31 frac acc= 38,106
CYS
A 214 frac acc= 72,021 THR A 94 frac acc= 37,452
LYS
A 126 frac acc= 71,002 THR A 93 frac acc= 37,213
SER
A 67 frac acc= 66,694 THR A 197 frac acc= 36,709
ARG
A 18 frac acc= 66,126 SER A 182 frac acc= 36,424
ASN
A 152 frac acc= 65,415 GLY A 128 frac acc= 35,779
SER
A 127 frac acc= 65,345 LYS A 207 frac acc= 35,638
LYS
A 190 frac acc= 65,189 ASP A 17 frac acc= 35,413
LYS
A 145 frac acc= 63,342 GLY A 200 frac acc= 35,274
GLN
A 199 frac acc= 62,470 GLU A 165 frac acc= 35,067
GLU
A 143 frac acc= 61,681 ALA A 112 frac acc= 34,912
GLN
A 3 frac acc= 59,976 GLN A 79 frac acc= 34,601
LYS
A 188 frac acc= 59,680 VAL A 191 frac acc= 33,935
ARG
A 24 frac acc= 59,458 SER A 208 frac acc= 33,525
PHB
A 53 frac acc= 58,705 LYS A 39 frac acc= 33,446
SER
A 9 frac acc= 58,446 GLU A 123 frac acc= 32,486
GLN
A 27 frac acc= 57,247 THR A 69 frac acc= 32,276
ALA
A 153 frac acc= 56,538 SER A 76 frac acc= 32,108
SER
A 203 frac acc= 55,864 HIS A 189 frac acc= 31,984
LYS
A 42 frac acc= 54,730 ARG A 108 frac acc= 31,915
GLY
A 16 frac acc= 54,612 ASN A 158 frac acc= 31,447
LYS
A 45 frac acc= 54,464 VAL A 205 frac acc= 31,305
PRO
A 204 frac acc= 53,172 SER A 14 frac acc= 31,094
GLU
A 213 frac acc= 53,084 GLN A 155 frac acc= 30,630
ALA
A 184 frac acc= 52,556 GLU A 187 frac acc= 30,328
VAL
A 15 frac acc= 52,460 ARG A 211 frac acc= 30,027
SER
A 7 frac acc= 51,936 LYS A 183 frac acc= 29,751
LEU
A 154 frac acc= 51,525 ASN A 138 frac acc= 29,306
GLN
A 100 frac acc= 51,195 ASP A 170 frac acc= 29,041
SER
A 10 frac acc= 49,907 SER A 159 frac acc= 27,705
THR
A 5 frac acc= 48,879 GLN A 147 frac acc= 27,485
THR
A 206 frac acc= 48,853 THR A 22 frac acc= 27,121
ASP
A 28 frac acc= 48,758 ALA A 43 frac acc= 26,801
GLY
A 68 frac acc= 48,690 ARG A 142 frac acc= 26,447
THR
A 20 frac acc= 48,675 LEU A 54 frac acc= 25,882
ASP
A 122 frac acc= 47,359 ASP A 167 frac acc= 25,785
PRO
A 80 frac acc= 46,984 THR A 129 frac aoc= 23,880
SER
A 52 frac acc= 46,917 ALA A 144 frac acc= 23,652
SER
A 26 frac acc= 46,712 VAL A 163 frac acc= 22,261
TYR
A 92 frac acc= 46,218 PRO A 95 f rac acc= 20,607
LYS
A 107 frac acc= 45,912 ALA A 111 frac acc= 19,942
GLU
A 161 frac acc= 45,100 LYS A 103 frac acc= 18,647
VAL
A 110 frac acc= 44,844 LEU A 181 frac acc= 18,312
GLU
A 81 frac acc= 44,578 THR A 72 frac acc= 18,226
PRO
A 59 frac acc= 44,290 GLU A 195 frac acc= 18,006
ASN
A 30 frac acc= 42,721 THR A 178 frac acc= 17,499
GLN
A 160 frac acc= 42,692 THR A 85 frac acc= 17,343
SER
A 114 frac acc= 42,374 ASP A 70 frac acc= 17,194
PRO
A 40 frac acc= 41,928 LEU A 11 frac acc= 16,568
PHE
A 116 frac acc= 16,406 LEU A 125 frac acc= 2,398
THR
A 97 frac acc= 16,204 PRO A 96 frac acc= 2,387
ARG
A 61 frac acc= 16,192 LEU A 47 frac acc= 2,180
TYR
A 49 frac acc= 16,076 ALA A 51 frac acc= 1,837
SER
A 50 frac acc= 15,746 PHE A 118 frac acc= 1,779
LYS
A 149 frac acc= 15,510 PHE A 62 frac acc= 1,581
GLU
A 55 frac acc= 14,927 ALA A 25 frac acc= 1,538
LEU
A 201 frac acc= 14,012 VAL A 133 frac acc= 1,315
GLY
A 64 frac acc= 13,735 ASP A 82 frac acc= 1,141
GLY
A 212 frac acc= 13,396 LEU A 179 frac acc= 0,872
PHE
A 98 frac acc= 12,852 GLN A 124 frac acc= 0,787
THR
A 74 frac acc= 12,169 MET A 4 frac acc= 0,778
SER
A 171 frac acc= 11,536 SER A 177 frac acc= 0,693
PRO
A 141 frac acc= 11,073 SER A 131 frac acc= 0,693
PHE
A 83 frac acc= 10,871 LEU A 135 frac acc= 0,654
THR
A 164 frac acc= 10,325 PHE A 71 frac acc= 0,593
ALA
A 32 frac acc= 9,971 TRP A 35 frac acc= 0,448
HIS
A 198 frac acc= 9,958 PHE A 209 frac acc= 0,395
VAL
A 146 frac acc= 9,861 TYR A 186 frac acc= 0,259
SER
A 121 frac acc= 9,833 LEU A 78 frac acc= 0,157
ALA
A 13 frac acc= 9,615 VAL A 196 frac acc= 0,000
GLU
A 105 frac acc= 9,416 VAL A 132 frac acc= 0,000
SER
A 162 frac acc= 9,304 VAL A 104 frac acc= 0,000
ILE
A 117 frac acc= 8,780 VAL A 33 frac acc= 0,000
HIS
A 91 frac acc= 8,557 VAL A 29 frac acc= 0,000
ALA
A 193 frac acc= 8,547 TYR A 192 frac acc= 0,000
GLN
A 37 frac acc= 8,442 TYR A 86 frac acc= 0,000
VAL
A 58 frac acc= 8,281 TYR A 36 frac acc= 0,000
PRO
A 120 frac acc= 8,095 THR A 102 frac acc= 0,000
GLN
A 38 frac acc= 6,643 SER A 174 frac acc= 0,000
PRO
A 113 frac acc= 6,594 PHE A 139 frac acc= 0,000
GLY
A 101 frac acc= 6,558 LEU A 136 frac acc= 0,000
TYR
A 140 frac acc= 5,894 LEU A 73 frac acc= 0,000
VAL
A 115 frac acc= 5,712 ILE A 75 frac acc= 0,000
TYR
A 87 frac acc= 4,539 ILE A 48 frac acc= 0,000
SER
A 176 frac acc= 4,106 ILE A 21 frac acc= 0,000
ILE
A 2 frac acc= 4,080 GLN A 90 frac acc= 0,000
ASN
A 137 frac acc= 3,906 GLN A 89 frac acc= 0,000
TRP
A 148 frac acc= 3,676 CYS A 194 frac acc= 0,000
GLY
A 99 frac acc= 3,550 CYS A 134 frac acc= 0,000
PRO
A 44 frac acc= 3,543 CYS A 88 frac acc= 0,000
LEU
A 175 frac acc= 3,488 CYS A 23 frac acc= 0,000
VAL
A 19 frac acc= 3,420 ALA A 130 frac acc= 0,000
ILE
A 106 frac acc= 3,337 ALA A 84 frac acc= 0,000
PRO
A 119 frac acc= 2,953 ALA A 34 frac acc= 0,000
LEU
A 46 frac acc= 2,887
GLN
A 6 frac acc= 2,860
TYR
A 173 frac acc= 2,825
VAL
A 150 frac acc= 2,525
GLN
A 166 frac acc= 2,525
THR
A 172 frac acc= 2,436
hu4D5Fabv7-cadena pesada
SER
B 179 frac acc= 99,479 PRO B 14 frac acc= 45,729
GLY
B 42 frac acc= 95,850 THR B 54 frac acc= 45,503
GLU
B 1 frac acc= 87,276 THR B 200 frac acc= 45,369
GLY
B 66 frac acc= 84,541 LEU B 177 frac acc= 45,337
ASP
B 102 frac acc= 83,794 GLY B 8 frac acc= 44,898
SER
B 75 frac acc= 80,567 SER B 7 frac acc= 43,530
GLY
B 140 frac acc= 80,344 THR B 69 frac acc= 43,503
ASN
B 211 frac acc= 79,588 PRO B 220 frac acc= 43,378
GLY
B 197 frac acc= 78,676 LYS B 208 frac acc= 43,138
ASP
B 62 frac acc= 77,716 LYS B 30 frac acc= 42,380
GLY
B 103 frac acc= 77,176 ALA B 23 frac acc= 41,952
SER
B 163 frac acc= 76,664 GLU B 46 frac acc= 41,430
SER
B 139 frac acc= 74,946 SER B 25 frac acc= 41,323
LYS
B 213 frac acc= 74,442 ARG B 87 frac acc= 41,282
ALA
B 165 frac acc= 74,339 LYS B 124 frac acc= 40,888
THR
B 167 frac acc= 73,934 ASN B 28 frac acc= 40,529
SER
B 122 frac acc= 72,870 GLN B 3 frac acc= 39,824
SER
B 194 frac acc= 71,959 THR B 123 frac acc= 39,306
PRO
B 41 frac acc= 71,540 SER B 63 frac acc= 38,867
THR
B 198 frac acc= 68,668 GLY B 56 frac acc= 38,582
SER
B 222 frac acc= 68,128 GLY B 169 frac acc= 38,469
LYS
B 43 frac acc= 67,782 THR B 172 frac acc= 38,421
GLY
B 26 frac acc= 67,782 PRO B 209 frac acc= 38,309
THR
B 138 frac acc= 65,826 GLY B 101 frac acc= 38,040
ASP
B 31 frac acc= 64,222 TYR B 109 frac acc= 36,829
GLY
B 15 frac acc= 64,172 LYS B 221 frac acc= 36,520
SER
B 168 frac acc= 62,100 GLY B 44 frac acc= 35,147
SER
B 120 frac acc= 61,332 GLY B 181 frac acc= 34,735
LYS
B 76 frac acc= 61,092 THR B 58 frac acc= 34,457
GLY
B 141 frac acc= 59,419 GLY B 9 frac acc= 34,254
SER
B 137 frac acc= 59,179 VAL B 5 frac acc= 34,198
TYR
B 57 frac acc= 58,916 ALA B 121 frac acc= 33,049
GLU
B 89 frac acc= 58,483 SER B 127 frac acc= 32,390
SER
B 180 frac acc= 56,289 GLY B 10 frac acc= 32,230
LYS
B 65 frac acc= 55,044 SER B 71 frac acc= 30,659
ASP
B 215 frac acc= 54,656 ASP B 73 frac acc= 30,245
GLN
B 13 frac acc= 53,719 LEU B 115 frac acc= 29,867
GLN
B 112 frac acc= 53,215 LEU B 11 frac acc= 29,825
TYR
B 105 frac acc= 51,940 ASN B 84 frac acc= 29,765
ALA
B 88 frac acc= 51,602 SER B 210 frac acc= 28,656
GLY
B 164 frac acc= 50,259 GLU B 155 frac acc= 28,162
PRO
B 192 frac acc= 49,826 SER B 160 frac acc= 26,526
THR
B 158 frac acc= 49,694 CYS B 223 frac acc= 26,270
THR
B 142 frac acc= 48,896 GLY B 16 frac acc= 26,158
ASN
B 55 frac acc= 48,344 ILE B 202 frac acc= 26,068
LYS
B 136 frac acc= 48,312 GLN B 82 frac acc= 25,836
ARG
B 19 frac acc= 48,082 SER B 193 frac acc= 25,550
PRO
B 156 frac acc= 47,366 ASN B 77 frac acc= 25,418
PRO
B 174 frac acc= 47,157 ARG B 59 frac acc= 25,301
LYS
B 217 frac acc= 47,102 VAL B 93 frac acc= 25,254
GLN
B 199 frac acc= 46,650 THR B 74 frac acc= 24,902
SER
B 17 frac acc= 45,980 GLU B 219 frac acc= 24,778
SER
B 85 frac acc= 45,824 ASN B 206 frac acc= 24,647
VAL
B 170 frac acc= 24,549 PRO B 154 frac acc= 6,767
TYR
B 52 frac acc= 24,298 PRO B 133 frac acc= 6,767
ALA
B 175 frac acc= 23,804 TRP B 99 frac acc= 6,502
LYS
B 216 frac acc= 23,277 THR B 32 frac acc= 6,291
VAL
B 214 frac acc= 23,150 LEU B 45 frac acc= 4,649
GLY
B 125 frac acc= 22,802 VAL B 128 frac acc= 4,515
ASN
B 162 frac acc= 22,245 ILE B 51 frac acc= 4,307
ALA
B 72 frac acc= 22,166 SER B 186 frac acc= 4,084
ALA
B 40 frac acc= 21,974 PHE B 173 frac acc= 3,969
LEU
B 18 frac acc= 20,273 ARG B 38 frac acc= 3,734
THR
B 212 frac acc= 20,170 TRP B 47 frac acc= 3,561
LEU
B 182 frac acc= 19,619 VAL B 118 frac acc= 3,409
TYR
B 33 frac acc= 19,398 ALA B 24 frac acc= 3,376
THR
B 190 frac acc= 19,365 TYR B 95 frac acc= 3,242
VAL
B 176 frac acc= 18,941 GLU B 6 frac acc= 3,216
SER
B 21 frac acc= 18,929 ALA B 144 frac acc= 3,167
SER
B 119 frac acc= 18,877 ILE B 70 frac acc= 1,958
THR
B 91 frac acc= 18,237 GLY B 111 frac acc= 1,868
ASP
B 151 frac acc= 17,849 LEU B 4 frac acc= 1,808
THR
B 114 frac acc= 17,601 TYR B 201 frac acc= 1,758
SER
B 134 frac acc= 17,571 LEU B 148 frac acc= 1,744
LEU
B 196 frac acc= 17,090 PHE B 68 frac acc= 1,708
TYR
B 60 frac acc= 16,575 VAL B 188 frac acc= 1,315
TYR
B 183 frac acc= 15,968 CYS B 22 frac acc= 0,935
VAL
B 2 frac acc= 15,901 TRP B 161 frac acc= 0,876
PRO
B 130 frac acc= 15,342 LEU B 131 frac acc= 0,654
LEU
B 166 frac acc= 15,268 VAL B 205 frac acc= 0,495
GLY
B 100 frac acc= 15,003 ALA B 92 frac acc= 0,356
PHE
B 27 frac acc= 14,383 ALA B 79 frac acc= 0,356
ASN
B 204 frac acc= 13,873 VAL B 64 frac acc= 0,263
PHE
B 104 frac acc= 13,836 ILE B 29 frac acc= 0,227
TYR
B 80 frac acc= 13,490 VAL B 218 frac acc= 0,000
VAL
B 159 frac acc= 12,782 VAL B 189 frac acc= 0,000
ARG
B 67 frac acc= 12,362 VAL B 149 frac acc= 0,000
GLN
B 178 frac acc= 12,131 VAL B 116 frac acc= 0,000
HIS
B 171 frac acc= 11,412 VAL B 48 frac acc= 0,000
SER
B 184 frac acc= 11,255 VAL B 37 frac acc= 0,000
ARG
B 98 frac acc= 11,115 TYR B 152 frac acc= 0,000
PRO
B 53 frac acc= 11,071 TYR B 94 frac acc= 0,000
GLN
B 39 frac acc= 11,037 TRP B 36 frac acc= 0,000
SER
B 195 frac acc= 10,909 SER B 187 frac acc= 0,000
ASP
B 108 frac acc= 10,525 SER B 97 frac acc= 0,000
LEU
B 185 frac acc= 10,464 MET B 107 frac acc= 0,000
GLY
B 113 frac acc= 10,406 MET B 83 frac acc= 0,000
THR
B 78 frac acc= 10,213 LEU B 145 frac acc= 0,000
THR
B 117 frac acc= 9,990 LEU B 86 frac acc= 0,000
LYS
B 150 frac acc= 9,447 LEU B 81 frac acc= 0,000
VAL
B 157 frac acc= 9,323 LEU B 20 frac acc= 0,000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
VAL
B 12 frac acc= 9,207 ILE B 34 frac acc= 0,000
TRP
B 110 frac acc= 9,069 HIS B 207 frac acc= 0,000
ALA
B 143 frac acc= 8,903 HIS B 35 frac acc= 0,000
SER
B 135 frac acc= 8,897 GLY B 146 frac acc= 0,000
PHE
B 129 frac acc= 8,895 CYS B 203 frac acc= 0,000
ARG
B 50 frac acc= 8,639 CYS B 147 frac acc= 0,000
ALA
B 61 frac acc= 8,547 CYS B 96 frac acc= 0,000
ALA
B 132 frac acc= 7,882 ASP B 90 frac acc= 0,000
VAL
B 191 frac acc= 7,366 ALA B 106 frac acc= 0,000
PRO
B 126 frac acc= 7,258 ALA B 49 frac acc= 0,0000
PHE
B 153 frac acc= 6,918
Se aplicaron los siguientes dos criterios para identificar los residuos de hu4D5Fabv8 que pueden ser disenados para sustituir con residuos de Cis:
1. Los residuos de aminoacidos que estan completamente enterrados se eliminan, es decir, menos de 10 % de accesibilidad superficial fraccionada. La Tabla 1 muestra que hay 134 residuos (cadena ligera) y 151 (cadena pesada) de hu4D5Fabv8 que son mas del 10 % accesibles (accesibilidad superficial fraccionada). Los diez primeros residuos accesibles Ser, Ala y Val fueron seleccionados debido a su estrecha similitud estructural con Cis con respecto a otros aminoacidos, introduciendo solo las limitaciones estructurales mlnimas en el anticuerpo mediante las nuevas manipulaciones con Cis. Tambien se pueden cribar otros sitios de sustitucion de cistelna y pueden ser utiles para la conjugacion.
2. Los residuos se clasifican en funcion de su papel en las interacciones funcionales y estructurales de Fab. Se seleccionaron los residuos que no estan involucrados en las interacciones con el antlgeno y distantes de los enlaces disulfuro existentes. Los residuos de Cis recien modificados por ingenierla genetica deben ser distintos de, y no interferir con, la union al antlgeno ni desemparejar con cistelnas implicadas en la formacion de enlaces disulfuro.
Los siguientes residuos de hu4D5Fabv8 poselan los criterios anteriores y se seleccionaron para ser reemplazado con Cis: L-V15,LA43, L-V110, L-A144, L-S168, H-A88, H-A121, H-S122, H-A175 y H-S179 (mostrado en la Figura 1).
La reactividad del tiol puede ser generalizada a cualquier anticuerpo en el que la sustitucion de aminoacidos con aminoacidos cistelna reactivos pueda hacerse dentro de los intervalos en la cadena ligera seleccionados de: L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-115; L-139 a L-149; L-163 a L-173; y dentro de los intervalos en la cadena pesada seleccionados de: H-35 a H-45; H-83 a H-93; H-114 a H-127 y H-170 a H-184 y en la region Fc dentro de los intervalos seleccionados de H-268 a H-291; H-319 a H-344; H-370 a H-380 y H-395 a H-405.
La reactividad del tiol tambien puede ser generalizada a ciertos dominios de un anticuerpo, tales como el dominio constante de la cadena ligera (CL) y los dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Las sustituciones de cistelna que resulta en valores de reactividad del tiol de 0,6 y mayores se pueden hacer en los dominios constantes de cadena pesada de anticuerpos intactos, 5, £, y y p: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente, incluyendo la IgG subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. IgA e IgA2.
Es evidente a partir de los datos de la estructura cristalina que los 10 mutantes Cis seleccionados estan muy lejos del sitio de combinacion del antlgeno, tales como la interfaz con HER2 en este caso. Estos mutantes pueden ser probados experimentalmente para efectos indirectos sobre las interacciones funcionales. Las reactividades del tiol de todas las variantes Fab Cis se midieron y se calcularon como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y se presentan en la Tabla 2. Los residuos de L-V15C, L-V110C, H-A88C y H-A121C tienen grupos tiol reactivos y estables (Figuras 3A y 3B). Los mutantes V15C, V110C, A144C, S168C son variantes de Cis de la cadena ligera. Los mutantes A88C, A121C, A175C, S179C son variantes de Cis de la cadena pesada. Era sorprendente e inesperado que los sitios con alta accesibilidad superficial fraccionada no tuvieron la mas alta reactividad de tiol tal como se calcula mediante el ensayo PHESELECTOR (Tabla 2). En otras palabras, la accesibilidad superficial fraccionada (Tablas 1, 2) no se correlacionaron con la reactividad tiol (Tabla 2). De hecho, los residuos de Cis modificados por ingenierla genetica en los sitios con moderada accesibilidad superficial de 20 % a 80 % (Figura 4A, Tabla 1), o sitios parcialmente expuestos, como los residuos de Ala o Val, presentaban una reactividad del tiol mejor, es decir, > 0,6, (Figura 3B, Tabla 2) que la Cis introducida en los residuos de Ser, necesitando por lo tanto el uso del ensayo PHESELECTOR en la seleccion de sitios reactivos con tiol ya que la information de la estructura cristalina por si sola no es suficiente para seleccionar estos sitios (Figura 3B y 4a ).
Los datos de reactividad del tiol se muestran en las figuras 3A y 3B para los residuos de aminoacidos de los mutantes 4D5 TioFab Cis: (3A) fago-TioFabs no biotinilado (control) y (3B) biotinilado. Los grupos tiol reactivos en el superficie del anticuerpo/Fab se identificaron mediante un ensayo de PHESELECTOR para la interaction de fago- hu4D5Fabv8 no biotinilado (3A) y fago-hu4D5Fabv8 biotinilado (3B) con BSA (barra en blanco), HER2 (barra) o estreptavidina (barra rellena). El ensayo se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 2. Las variantes de la cadena ligera estan en el lado izquierdo y las variantes de la cadena pesada estan en el lado derecho. La union de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
los mutantes 4D5 TioFab Cis no biotinilado es baja como se esperaba, pero se mantenla una fuerte union a HER2. La relacion entre la union a estreptavidina y a HER2 de los mutantes de Cis 4D5 TioFab biotinilados da los valores de reactividad del tiol de la Tabla 2. La absorbancia de fondo a 450 nm o cantidades pequenas de union a protelna no especlficas de los mutantes de Cis 4D5 TioFab biotinilados con BSA es tambien evidente en la Figura 3B. Los valores de accesibilidad superficial fraccionada de los residuos de aminoacidos seleccionados que fueron sustituidos con un residuo de Cis se muestran en la Figura 4A. La accesibilidad superficial fraccionada se calculo a partir de la estructura hu4D5Fabv7 disponible y se muestra en la Tabla 1 (Eigenbrot et al. (1993) J Mol Biol. 229: 969-995). Los parametros conformacionales de las estructuras hu4D5Fabv7 y hu4D5Fabv8 son muy constantes y permiten la determinacion de cualquier correlacion entre los calculos de la accesibilidad superficial fraccionada de hu4D5Fabv7 y la reactividad del tiol de los mutantes de cistelna hu4D5Fabv8. La reactividad del tiol medido de los residuos de Cis del fago TioFab introducidos en los residuos parcialmente expuestos (Ala o Val) tienen mejor reactividad del tiol en comparacion con los introducidos en los residuos de Ser (Tabla 2). Se puede observar a partir de los mutantes de Cis TioFab de la Tabla 2 que hay poca o ninguna correlacion entre los valores de reactividad del tiol y la accesibilidad superficial fraccionada.
Los aminoacidos en las posiciones L-15, L-43, L-110, L-144, L-168, H-40, H-88, H-119, H-121, H-122, H-175 y H - 179 de un anticuerpo pueden generalmente ser mutados (sustituidos) con aminoacidos de cistelna libres. Intervalos dentro de los 5 residuos de aminoacidos en cada lado de estas posiciones tambien pueden ser sustituidos por aminoacidos de cistelna libre, es decir, L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-115; L-139 a L-149; L-163 a L-173; H-35 a H-45; H-83 a H-93; H-114 a H-127 y H-170 a H-184, as! como los intervalos en la region Fc seleccionada de H-268 a H-291; H-319 a H-344; H-370 a H-380 y H-395 a H-405, para producir los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna de la invencion.
Tabla 2. Reactividad del tiol de los fago-TioFabs
Construction fago-TioFab
Reactividad del tiol Accesibilidad superficial fraccionada (%) de la Tabla 1)
hu4D5Fabv8-wt
0.125 -
L-V15C
0.934 52.46
L-A43C
0.385 26.80
L-V110C
0.850 44.84
L-A144C
0.373 23.65
L-S168C
0.514 79.68
H-A40C
0.450 21.97
H-A88C
0.914 51.60
H-S119C
0.680 18.88
H-A121C
0.925 33.05
H-S122C
0.720 72.87
H-A175C
0.19 23.80
H-S179C
0.446 99.48
L = cadena ligera, H = cadena pesada, A = alanina, S = serina, V = valina, C = cistelna La reactividad del tiol se mide como la relacion entre la DO450nm para la union a estreptavidina y la DO450nm para la union a HER2 (anticuerpo) (Ejemplo 2). El valor de reactividad del tiol de 1 indica la biotinilacion completa del tiol de la cistelna.
Se seleccionaron dos variantes de Cis de la cadena ligera (L-V15C y L-V110C) y dos de la cadena pesada (H-A88C y H-A121C) para el analisis adicional, ya que estas variantes mostraban la mayor reactividad del tiol (Tabla 2).
A diferencia de la purification del fago, la preparation de Fab puede requerir 2-3 dlas, dependiendo de la escala de production. Durante este tiempo, los grupos tiol pueden perder reactividad debido a la oxidation. Para investigar la estabilidad de los grupos tiol en hu4D5Fabv8-fago, se midio la estabilidad de la reactividad del tiol de los fago- tioFabs (Figura 4B). Despues de la purificacion del TioFab-fago, en el dla 1, dla 2 y dla 4, todas las muestras fueron conjugadas con biotina-PEO-maleimida y se ensayaron con ensayo ELISA de fagos (PHESELECTOR) para determinar la union a HER2 y estreptavidina. L-V15C, L-V110C, H-A88C y H-A121C retienen cantidades significativas de reactividad del tiol en comparacion con otras variantes TioFab (Figura 4B).
ANTICUERPOS MANIPULADOS CON CISTEINA MARCADOS
Los anticuerpos de la invencion modificados por ingenierla genetica con cistelna pueden conjugarse con cualquier resto marcador que pueda unirse covalentemente al anticuerpo mediante un grupo tiol de cistelna reactivo, (Singh et al. (2002) Anal. Biochem. 304: 147-15; Harlow E. y Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2a ed. CRC Press, Boca Raton, FL). El marcador unido puede servir para: (i) proporcionar una senal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la senal detectable proporcionada por el primero o segundo marcador, por ejemplo, para dar FRET (transferencia de energla por resonancia de fluorescencia); (iii)
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estabilizar interacciones o aumentar la afinidad de union, con antlgeno o ligando; (iv) afectar la movilidad, por ejemplo, movilidad electroforetica o permeabilidad a celulas, por carga, hidrofobia, forma u otros parametros flsicos, o (v) proporcionar un resto de captura, para modular la afinidad de ligandos, union a anticuerpo/antlgeno o complejacion ionica.
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna marcados pueden ser utiles en ensayos de diagnostico, por ejemplo, para detectar la expresion de un antlgeno de interes en celulas especlficas, tejidos o suero. Para aplicaciones de diagnostico, el anticuerpo normalmente se marcara con un resto detectable. Existen numerosos marcadores que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorlas:
(a) Radioisotopos (radionuclidos), tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y,99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At o 213Bi. Los anticuerpos marcados con radioisotopos son utiles en experimentos de estudios de imagenes dirigidos a receptores. El anticuerpo puede marcarse con reactivos de ligando que se unen, quelan o complejan de otro modo un metal de radioisotopo en el que el reactivo es reactivo con el tiol de la cistelna manipulada del anticuerpo, usando las tecnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volumenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs. (1991). Los ligandos quelantes que pueden complejar un ion metalico incluyen DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Los radionuclidos pueden ser dirigidos por complejacion con los conjugados de anticuerpo-farmaco de la invencion (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146). Radioisotopos (radionuclidos), tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At o 213Bi.
Los complejos metal-quelato adecuados como marcadores de anticuerpos para los experimentos de estudios de imagen se divulgan en: los documentos US 5342606; US 5428155; US 5316757; US 5480990; US 5462725; US 5428139; US 5385893; US 5739294; US 5750660; US 5834456; Hnatowich et al (1983) J. Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al (1990) Bioconjugate Chem.1:59-65; Meares et al (1990) J. Cancer1990, Suppl. 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. NucL Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucl. Med. 21:640646; Ruegg et al (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al(1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. NucL Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20.
(b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio), tipos de fluorescelna que incluyen FITC, 5-carboxifluorescelna, 6-carboxifluorescelna; tipos de rodamina que incluyen TAMRA; dansilo; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; rojo Texas; y analogos de los mismos. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse con anticuerpos usando, por ejemplo, las tecnicas divulgadas, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, supra. Colorantes fluorescentes y reactivos marcadores fluorescentes incluyen aquellos que estan comercialmente disponibles de Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) y Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).
(c) Existen o se han divulgado diversos marcadores de enzima-sustrato (documento US 4275149) . La enzima generalmente cataliza una alteracion qulmica de un sustrato cromogenico que puede medirse usando diversas tecnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotometricamente. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Mas arriba se describen tecnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente se excita electronicamente por una reaccion qulmica y entonces puede emitir luz que puede medirse (usando, por ejemplo, un quimioluminometro) o dona energla a un aceptor fluorescente. Algunos ejemplos de marcadores enzimaticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana; documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rabano picante (HRP) , fosfatasa alcalina (AP) , p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacarido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heteroclclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa. Tecnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic Press, Nueva York, 73: 147-166.
Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) Peroxidasa de rabano picante (HRP) con peroxidasa de hidrogeno como sustrato, en el que la peroxidasa de hidrogeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'- tetrametilbencidina (TMB) ;
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogenico; y
(iii) p-galactosidasa (p-D-Gal) con un sustrato cromogenico (por ejemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidasa.
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Estan disponibles numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revision general veanse los documentos US 4275149 y US 4318980.
Un marcador puede conjugarse indirectamente con un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorlas de marcadores mencionados anteriormente con avidina o estreptavidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a estreptavidina y, por tanto, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de este modo indirecto. Como alternativa, para lograr la conjugation indirecta del marcador con la variante de polipeptido, la variante de polipeptido se conjuga con un hapteno pequeno (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con una variante de polipeptido anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti- digoxina). Por tanto, puede lograrse la conjugacion indirecta del marcador con la variante de polipeptido (Hermanson, G. (1996) en Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
La variante de polipeptido de la presente invention puede emplearse en cualquier metodo de ensayo conocido, tal como ELISA, ensayos de union competitiva, ensayos de tipo sandwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitacion (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pag. 147-158, CRC Press, Inc.).
Un marcador de detection puede ser util para localizar, visualizar y cuantificar un evento de union o reconocimiento. Los anticuerpos marcados de la invencion pueden detectar receptores de la superficie celular. Otro uso para los anticuerpos detectablemente marcados es un metodo de inmunocaptura basada en perlas que comprende conjugar una perla con un anticuerpo marcado fluorescente y detectar una senal de fluorescencia tras la union de un ligando. Las metodologlas de deteccion de la union similares utilizan el efecto de la resonancia de plasmones superficiales (SPR) para medir y detectar interacciones anticuerpo-antlgeno.
Los marcadores de deteccion tales como colorantes fluorescentes y colorantes quimioluminiscentes (Briggs et al.
(1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids" J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1: 1051-1058) proporcionan una senal detectable y generalmente son aplicables al marcado de anticuerpos, preferiblemente con las siguientes propiedades: (i) el anticuerpo marcado deberla producir una senal muy alta con bajo ruido de manera que pequenas cantidades de anticuerpos pudieran detectarse con sensibilidad tanto en ensayos sin celulas como basados en celulas; y (ii) el anticuerpo marcado deberla ser fotoestable de manera que la senal fluorescente pudiera observarse, monitorizarse y registrarse sin fotoblanqueamiento significativo. Para aplicaciones que implican la union a la superficie celular del anticuerpo marcado a membranas o superficies celulares, especialmente celulas vivas, los marcadores preferentemente (iii) tienen buena solubilidad en agua para lograr concentration de conjugado y sensibilidad de deteccion eficaces y (iv) no son toxicos para celulas vivas de manera que no alteran los procesos metabolicos normales de las celulas ni producen muerte celular prematura.
La cuantificacion directa de la intensidad de fluorescencia celular y la enumeration de eventos fluorescentemente marcados, por ejemplo, union a la superficie celular de conjugados de peptido-colorante pueden realizarse en un sistema (sistema FMAT® 8100 HTS, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza ensayos no radiactivos de mezcla y lectura, con celulas vivas o perlas (Miraglia, "Homogeneous cell- and beadbased assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4: 193204). Los usos de anticuerpos marcados tambien incluyen ensayos de union a receptor de la superficie celular, ensayos de inmunocaptura, ensayos inmunoadsorbentes ligados a fluorescencia (FLISA), escision de caspasas (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo"
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 618-23; documento US 6.372.907), apoptosis (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V" (1995) J. Immunol. Methods 184: 39-51) y ensayos de citotoxicidad. La tecnologla de ensayo de microvolumenes fluorometricos puede usarse para identificar la regulation positiva o negativa por una molecula que es dirigida a la superficie celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271: 143-51).
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna marcados de la invencion son utiles como biomarcadores y sondas para estudios de imagen por los diversos metodos y tecnicas de estudios de imagen biomedicas y moleculares tales como: (i) RMN (resonancia magnetica nuclear); (ii) MicroCT (tomografla computerizada); (iii) SPECT (tomografla computerizada por emision de foton unico); (iv) PET (tomografla de emision de positrones) Chen et al. (2004) Bioconjugate Chem. 15:41-49; (v) bioluminiscencia; (vi) fluorescencia; y (vii) ultrasonidos. La inmunoescintigrafla es un procedimiento de obtencion de imagenes en el que anticuerpos marcados con sustancias radiactivas se administran a un animal o paciente humano y se toma una imagen de sitios en el cuerpo en los que se localiza el anticuerpo (documento US 6528624). Los biomarcadores de obtencion de imagenes pueden medirse objetivamente y evaluarse como un indicador de procesos biologicos normales, procesos patogenicos o respuestas farmacologicas a una intervention terapeutica. Los biomarcadores pueden ser de varios tipos: tipo 0 son marcadores de la historia de una enfermedad y establecen una correlation longitudinal con Indices cllnicos conocidos, por ejemplo, evaluation de RMN de inflamacion sinovial en artritis reumatoide; los marcadores de tipo I capturan el efecto de una intervencion segun un mecanismo de action, aun cuando el mecanismo pueda no asociarse a un desenlace cllnico; los marcadores de tipo II sirven como criterios de valoracion indirectos en los que
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el cambio en, o senal de, el biomarcador predice un beneficio cllnico para "validar" la respuesta elegida como diana, tal como la erosion osea medida en artritis reumatoide por CT. Por tanto los biomarcadores de obtencion de imagenes pueden proporcionar informacion terapeutica farmacodinamica (PD) sobre: (i) expresion de una protelna diana, (ii) union de un agente terapeutico a la protelna diana, es decir, selectividad, y (iii) datos farmacocineticos de eliminacion y semivida. Las ventajas de los biomarcadores de obtencion de imagenes in vivo con respecto a los biomarcadores basados en laboratorio incluyen: tratamiento no invasivo, cuantificable, evaluacion del cuerpo entero, dosificacion y evaluacion repetitiva, es decir, multiples momentos temporales y efectos posiblemente transferibles de resultados precllnicos (animal pequeno) a cllnicos (ser humano). Para algunas aplicaciones, la obtencion de imagenes biologicas suplanta o minimiza el numero de experimentos en animales en estudios precllnicos.
Marcadores para obtencion de imagenes con radionuclidos incluyen radionuclidos, tales como 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 24I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, o 213Bi. El ion radionuclido metalico puede estar
complejado con un enlazador quelante tal como DOTA. Los reactivos de enlazadores tales como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA) pueden prepararse mediante la reaccion de aminobencil-DOTA con acido 4- maleimidobutlrico (Fluka) activado con cloroformiato de isopropilo (Aldrich), siguiendo el procedimiento de Axworthy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4) : 1802-1807). Los reactivos de DOTA-maleimida reaccionan con los aminoacidos de cistelna libres de los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna y proporcionan un ligando de complejacion con metal sobre el anticuerpo (Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Los reactivos de marcado de enlazadores quelantes tales como DOTA-NHS (ester de mono-N-hidroxisuccinimida de acido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico) estan comercialmente disponibles (Macrocyclics, Dallas, TX). La obtencion de imagenes diana del receptor con anticuerpos marcados con radionuclidos puede proporcionar un marcador de la activacion de la ruta por deteccion y cuantificacion de acumulacion progresiva de anticuerpos en tejido tumoral (Albert y col. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). Los radiometales conjugados pueden continuar con la degradacion intracelular tras la lisosomica.
Los metodos de marcaje de peptidos son bien conocidos. Ver Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and it, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) BioconjugateChem. 16:240-237.
Los peptidos y protelnas marcados con dos restos, un indicador fluorescente e inhibidor de la fluorescencia, en suficiente proximidad se someten a transferencia de energla por resonancia de fluorescencia (FRET). Los grupos indicadores son normalmente colorantes fluorescentes que son excitados por luz a cierta longitud de onda y transfieren energla a un grupo aceptor, o inhibidor de la fluorescencia, con el desplazamiento de Stokes apropiado para la emision a brillo maximo. Los colorantes fluorescentes incluyen moleculas con aromaticidad prolongada, tales como fluorescelna y rodamina, y sus derivados. El indicador fluorescente puede inhibirse parcialmente o significativamente por el resto inhibidor de la fluorescencia en un peptido intacto. Tras la escision del peptido por una peptidasa o proteasa puede medirse un aumento detectable en la fluorescencia (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assay of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248: 18-34).
Los anticuerpos marcados de la invencion tambien pueden usarse como agente de purificacion por afinidad. En este proceso, el anticuerpo marcado se inmoviliza sobre una fase solida tal como una resina Sephadex o papel de filtro usando metodos muy conocidos en la tecnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antlgeno que va a purificarse, y despues el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminara sustancialmente todo el material en la muestra, excepto el antlgeno que va a purificarse, que esta unido a la variante de polipeptido inmovilizada. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampon glicina, pH 5, 0, que liberara el antlgeno de la variante de polipeptido.
Los reactivos de marcado normalmente llevan funcionalidad reactiva que puede reaccionar (i) directamente con un tiol de la cistelna de un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna para formar el anticuerpo marcado, (ii) con un reactivo de enlazador para formar un producto intermedio de enlazador-marcador o (iii) con un anticuerpo de enlazador para formar el anticuerpo marcado. La funcionalidad reactiva de reactivos de marcado incluye: maleimida, haloacetilo, yodoacetamida, ester de succinimidilo (por ejemplo, NHS, N-hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloruro de sulfonilo, 2, 6-diclorotriazinilo, ester de pentafluorofenilo y fosforamidito, aunque tambien pueden usarse otro grupos funcionales.
Un ejemplo de grupo funcional reactivo es el ester de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) de un sustituyente de grupo carboxilo sustituyente de un marcador detectable, por ejemplo, biotina o un colorante fluorescente. El ester de nHs del marcador puede formarse previamente, aislarse, purificarse y/o caracterizarse, o puede formarse in situ y
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hacerse reaccionar con un grupo nucleofilo de un anticuerpo. Normalmente, la forma carboxilo del marcador se activa haciendo reaccionar con alguna combinacion de un reactivo de carbodiimida, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, o un reactivo de uronio, por ejemplo, TSTU (tetrafluoroborato de O- (N-succinimidil) N,N,N', N'-tetrametiluronio), HBTU (hexafluorofosfato de (O-benzotriazol-1-il) -N, N,N',N'- tetrametiluronio) o HATU (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il) -N,N,N',N'-tetrametiluronio), un activador, tal como 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y N-hidroxisuccinimida para dar el ester de NHS del marcador. En algunos casos, el marcador y el anticuerpo pueden acoplarse por activacion in situ del marcador y reaccion con el anticuerpo para formar el conjugado marcador-anticuerpo en una etapa. Otros reactivos activantes y de acoplamiento incluyen TBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazo-1-il)-1-1,3,3-tetrametiluronio), TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de N,N',N",N"'-tetrametiluronio), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio), EEDQ (2- etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidro-quinolina), DCC (diciclohexilcarbodiimida) ; DIPCDI (diisopropilcarbodiimida) , MSNT (1- (mesitilen-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol) y haluros arilsulfonilo, por ejemplo, cloruro de triisopropilbencenosulfonilo.
CONJUGACION DE BIOTINA-MALEIMIDA CON TIOFABS
Las propiedades de los TioFab anteriormente descritas fueron establecidas en la presencia de fago debido a que la fusion del Fab a la protelna de la cubierta del fago puede alterar potencialmente la accesibilidad o reactividad del tiol de la Cis. Por lo tanto, las construcciones de TioFab se clonaron en un vector de expresion bajo el promotor de la fosfatasa alcalina (Chang et al (1987) Gen 55: 189-196) y la expresion del TioFab se indujo mediante celulas de E. coli en crecimiento en el medio libre de fosfato. Los TioFabs se purificaron en una columna de Protelna G SEPHAROSE™ y se analizaron en geles de SDS-PAGE reductores y no reductores. Estos analisis permiten la evaluacion de si los TioFabs retuvieron su grupo tiol reactivo o si se volvieron inactivos mediante la formacion de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares. Los TioFabs L-V15C, L-V110C, H-A88C y H-A121C se expresaron y se purificaron por cromatografla en columna de Protelna G-SEPHAROSE™ (ver secciones Metodos para mas detalles). Las protelnas purificadas se analizaron en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras (con DTT) y no reductoras (sin DTT) condiciones. Se pueden utilizar otros agentes reductores tales como BME (beta- mercaptoetanol) en el gel para escindir grupos disulfuro intercatenarios. Es evidente a partir del analisis en gel de SDS-PAGE que la fraccion principal (-90 %) de TioFab esta en la forma monomerica, mientras que hu4D5Fabv8 de tipo silvestre esta esencialmente en la forma monomerica (47 kDa).
TioFab (A121C) y hu4D5Fabv8 de tipo silvestre se incubaron con exceso de 100 veces de biotina-maleimida durante 3 horas a temperatura ambiente y los Fab biotinilados se cargaron en una columna de filtracion en gel Superdex- 200™. Esta etapa de purificacion fue util en la separation de Fab monomerico de Fab oligomerico y tambien del exceso de biotina-maleimida libre (o farmaco citotoxico libre).
La Figura 5 muestra la validation de las propiedades de TioFab variantes en ausencia del contexto del fago. Las protelnas de fusion sin fago, hu4D5Fabv8 y hu4D5Fabv8-A121C (TioFab-A121C), se expresaron y se purificaron usando perlas de protelna-G agarosa seguido de incubation con un exceso de 100 veces molar de biotina- maleimida. Se comparo la union a estreptavidina y HER2 de un TioFab modificado por ingenierla genetica con Cis biotinilado y un Fab de tipo silvestre no biotinilado. El grado de conjugation de biotina (la interaction con estreptavidina) y su capacidad de union a HER2 se controlaron mediante analisis ELISA. Cada Fab se ensayo a 2 ng y 20 ng.
El A121C-TioFab biotinilado retuvo una union a HER2 comparable a la de hu4D5Fabv8 de tipo silvestre (Figura 5). El Fab de tipo silvestre y A121C-TioFab se purificaron por cromatografla en columna de filtracion en gel. Las dos muestras se ensayaron para la union a HER2 y estreptavidina mediante ELISA usando anticuerpo de cabra anti- Fab-HRP como anticuerpo secundario. Tanto el de tipo silvestre (barra en blanco) como TioFab (barra punteada) tienen una union similar a HER2 pero solo TioFab retuvo la union estreptavidina. Solo se observo un nivel de fondo de interaccion con estreptavidina con hu4D5Fabv8 de tipo silvestre no biotinilado (Figura 5). El analisis de espectro de masas (LC-ESI-MS) TioFab (A121C) biotinilado dio como resultado un pico principal con 48294.5 daltons en comparacion con hu4D5Fabv8 de tipo silvestre (47737 daltons). La diferencia de 537,5 daltons entre las dos moleculas se corresponde exactamente con una sola conjugando biotina-maleimida con el TioFab. Los resultados de la secuenciacion de protelnas por espectrometrla de masas (analisis LC-ESI-espectrometrla de masas en tandem) confirmaron ademas que la molecula de biotina conjugada estaba en el residuo Cis recien disenados (Tabla 4, Ejemplo 3).
CONJUNGACION ESPECIFICA DEL SITIO DE BIOTINA-MALEIMIDA AL PEPTIDO DE UNION A ALBUMINA (ABP)-TIOFABS S
La union de la protelna al plasma puede ser un medio eficaz para mejorar las propiedades farmacocineticas de las moleculas de vida corta. La albumina es la protelna mas abundante en el plasma. Los peptidos de union a albumina del suero (ABP) pueden alterar la farmacodinamica de protelnas de dominios activos fusionadas que incluyen alteration de la captation, penetration y difusion en el tejido. Estos parametros farmacodinamicos pueden modularse por selection especlfica de la secuencia de peptidos de union a la albumina del suero apropiada (documento US 20040001827). Una serie de peptidos de union a albumina se identificaron por cribados de
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expresion en fago (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem. 277: 35035-35043; documento WO 01/45746) . Los compuestos de la invencion incluyen secuencias de ABP ensenadas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 en las Tablas III y IV, pagina 35038; (ii) documento US 20040001827 en [0076] SEQ ID NOS: 9-22 y (iii) documento WO 01/45746 en las paginas 12-13, SEQ ID NOS: z1-z14.
Los peptidos de union a albumina (ABP)-Fab son modificados por ingenierla genetica fusionando un peptido de union a albumina con, por ejemplo, el extremo C de la cadena pesada de Fab en la relacion estequiometrica 1:1 (1 ABP/1 Fab) . Se mostro que la asociacion de estos ABP-Fab a albumina aumentaba su semivida mas de 25 veces en conejos y ratones. Por tanto, los residuos de Cis reactivos anteriormente descritos pueden introducirse en estos ABP-Fab y usarse para la conjugacion especlfica del sitio con farmacos citotoxicos, seguido de estudios en animales in vivo. La figura 9 muestra un grafico de un conjugado de una fusion peptido de union a albumina-Fab (ABP-Fab) con enlazador de farmaco.
Ejemplos de secuencias de peptidos de union a albumina a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de aminoacidos enumeradas en SEQ ID NOS: 1-5:
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:1 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:2 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO:3 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO:4 DICLPRWGCLW SEQ ID NO:5
El peptido de union a albumina (ABP) une secuencias de albumina de multiples especies (raton, rata, conejo, bovino, rhesus, babuino, y humanos) con Kd (conejo) = 0,3 pM. El peptido de union a albumina no compite con ligandos conocidos por unirse a la albumina y tiene una semivida (T1^) en conejo de 2,3 h. Las protelnas ABP-TioFab se purificaron en BSA-SEPHAROSE™ seguido de conjugacion de biotina-maleimida y la purificacion por cromatografla en columna Superdex-S200 como se describe en las secciones anteriores. Las protelnas biotiniladas purificadas fueron homogeneas y carentes de cualquier forma oligomerica (Ejemplo 4).
La Figura 6 muestra las variantes peptido de union a albumina (ABP)-TioFab. Los analisis ELISA se llevaron a cabo para ensayar la capacidad de union de ABP-hu4D5Fabv8-wt, ABP-hu4D5Fabv8-V110C y ABP-hu4D5Fabv8-A121C con albumina de conejo, estreptavidina y HER2. Los ABP-TioFab biotinilados son capaces de unirse a la albumina y HER2 con una afinidad similar a la de ABP-hu4D5Fabv8 de tipo silvestre como se confirmo por ELISA (Figura 6) y analisis de la cinetica de union BIAcore (Tabla 3). Una placa de ELISA se recubrio con albumina, HER2 y SA como se ha descrito. La union de ABP-TioFab biotinilados a la albumina, HER2 y SA se ensayaron con anti-Fab HRP. Los ABP-TioFab biotinilados eran capaces de unirse a estreptavidina en comparacion con ABP-hu4D5Fabv8 tipo silvestre control no biotinilado lo que indica que los ABP-TioFab se conjugaron con biotina-maleimida como los TioFab de una manera especlfica del sitio ya que se utilizaron los mismos mutantes Cis para ambas variantes (figura 6).
Tabla 3. Analisis de la cinetica BIAcore para la union de HER2 y albumina de conejo a ABP-hu4D5Fabv8 de tipo ________________________________silvestre biotinilado y TioFabs________________________________
Anticuerpo
kon (M-1s-1) koff (s-1) (nM)
Union a HER2
tipo silvestre
4,57 x 105 4,19 x 10-5 0,0917
V110C
4,18 x 105 4,05 x 10-5 0,097
A121C
3,91 x 105 4,15 x 10-5 0,106
Union a albumina de conejo
tipo silvestre
1,66 x 105 0,0206 124
V110C
2,43 x 165 0,0331 136
A121C
1,70 x 105 0,0238 140
ABP = peptido de union a albumina
Como alternativa, un peptido de union a albumina puede enlazarse con el anticuerpo mediante union covalente a traves de un resto enlazador.
DISENO DE ABP-TIOFAB CON DOS GRUPOS TIOL LIBRES POR FAB
Los resultados anteriores indican que las cuatro variantes (L-V15C, L-V110C, H-A88C y H-A121C) tioFab (anticuerpos Fab modificados por ingenierla genetica con cistelna) tienen grupos tiol reactivos que se pueden utilizar para la conjugacion especlfica del sitio con un reactivo marcador, reactivo enlazador o intermedio farmaco- enlazador. L-V15C puede ser expresado y purificado pero con rendimientos relativamente bajos. Sin embargo los rendimientos de expresion y purificacion de las variantes L-V110C, H-A88C y H-A121C fueron similares a los de hu4D5Fabv8. Por lo tanto estos mutantes se pueden utilizar para el analisis adicional y recombinar para obtener mas
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de un grupo tiol por Fab. Con vistas a este objetivo, se construyeron un grupo tiol en la cadena ligera y uno en la cadena pesada para obtener dos grupos tiol por molecula de Fab (L-V110C/HA88C y L-V110C/H-A121C). Estas dos variantes dobles de Cis se expresaron en un sistema de expresion de E. coli y se purificaron. Se encontro que la homogeneidad de los ABP-TioFab purificados biotinilados era similar a la de las variantes individuales de Cis.
Se investigaron los efectos del diseno y obtencion de dos residuos de Cis reactivos por Fab (Figura 7). La presencia de una segunda biotina se ensayo determinando la union de ABP-TioFab biotinilado a SA usando estreptavidina- HRP (Figura 7). Para el analisis de HER2/Fab, se revistio una placa de ELISA con HER2 y se ensayo con anti-Fab HRP. Para el analisis de SA/Fab, se revision una placa de ELISA con SA y se ensayo con anti-Fab HRP. Para el analisis de SA/SA, se revision una placa de ELISA se revistio con SA y se ensayo con SA-HRP. La Figura 7. Los analisis de ELISA para la interaction de las variantes Cis ABP-hu4D5Fabv8 biotiniladas con HER2, estreptavidina (SA), HER2/Fab, 10 SA /Fab y SA/SA indican que las interacciones fueron controlados por anti-Fab-HRP, SA-HRP, respectivamente. SA/Fab controla la presencia de biotina sola por Fab y mas de una biotina por Fab se controla por analisis de SA/SA. La union de HER2 con dobles mutantes Cis es similar a la de las variantes de Cis individuales (Figura 7). Sin embargo, el grado de biotinilacion en dobles mutantes Cis fue mayor en comparacion con una las variantes de una sola Cis debido a la existencia de mas de un grupo tiol libre por molecula de Fab (Figura 7).
MANIPUACION DE VARIANTES TIO IgG DE TRASTUZUMAB
La cistelna se introdujo en el anticuerpo monoclonal de longitud completa, trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech Inc.) en determinados residuos. Los mutantes Cis sencillos H-A88C, H-A121C y L-V110C de trastuzumab, y los mutantes dobles de cis V110C-A121C y V110C-A121C de trastuzumab se expresaron en celulas CHO (ovario de hamster chino) mediante fermentation transitoria en medios que contienen cistelna 1 mM. La secuencia de la cadena pesada mutante A88C (450 aa) es la SEQ ID NO: 6. La secuencia de la cadena pesada mutante A121C (450 aa) es la SEQ ID NO: 7. La secuencia de la cadena ligera mutante V110C (214 aa) es la SEQ ID NO: 8.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNlKD’rYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRCEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEFVTVSWNSGALTSGVHTFPAVI/QSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN S TYRWS VLTVLHQDWIiMGKEYKCKVSKKAliPAP IE KTIS KAKGQPRE PQVYTL P PSREE MTKKQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
qqgnvfscsvmhealhhhytqkslslspgk
SEQ ID NO:6
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNI kdtyihwvrqapgkglewvariyptngytry adsvxgrfti sadtskntaylqmnslrabdtavyycsrwggdgfyamdywgqgtlvtvss
CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGC-TAALGCLiVKDYFPEFVTVSWNSGALTSGVKTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEIiIiGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFHWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSHKALPAPIEKTISXAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENKYXTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD1CSRW
QQGNVFSCSVMHEALHHHYTQKSLSLSPGK
SBQ ID NO:7
I . •
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC '
SEQ ID NO:8
De acuerdo con una realization, los anticuerpos tio-trastuzumab anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna comprenden una o mas de las siguientes secuencias de cadena pesada de la region variable con un amino acido cistelna libre (SEQ ID NOS: 9-16).
Mutante
Secuencia SEQ ID NO:
A40C
WVRQCPGKGL SEQ ID NO:9
A88C
NSLRCEDTAV SEQ ID NO:10
S119C
LVTVCSASTKGPS SEQ ED NO:11
S120C
LVTVSCASTKGPS SEQ ID NO:12
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A121C
LVTVSSCSTKGPS SEQ ID NO:13
S122C
LVTVSSACTKGPS SEQ ID NO:14
A175C
HTFPCVLQSSGLYS SEQ ID NO:15
S179C
HTFPAVLQCSGLYS SEQ ID NO:16
De acuerdo con otra realizacion, los anticuerpos tio-trastuzumab modificados por ingenierla genetica con cistelna comprenden una o mas de las siguientes secuencias de la cadena ligera de la region variable con un amino acido cistelna libre (SEQ ID NOS: 17-27).
Mutante
Secuencia SEQ ID NO:
V15C
SLSASCGDRVT SEQ ID NO:17
A43C
QKPGKCPKLLI SEQ ID NO:18
V110C
EIKRTCAAPSV SEQ ID NO:19
S114C
TCAAPCVFIFPP SEQ ID NO:20
S121C
FIFPPCDEQLK SEQ ID NO:21
S127C
DEQLKCGTASV SEQ ID NO:22
A144C
FYPRECKVQWK SEQ ID NO:23
A153C
WKVDNCLQSGN SEQ ID NO:24
N158C
ALQSGCSQESV SEQ ID NO:25
S168C
VTEQDCKDSTY SEQ ID NO:26
V205C
GLSSPCTKSFN SEQ ID NO:27
Las variantes de IgG tio-trastuzumab de longitud completa resultantes se analizaron para determinar la reactividad del tiol y la actividad de union a HER2. La figura 13A muestra una representacion animada de la union del anticuerpo biotinilado a HER2 inmovilizada y al anticuerpo secundario marcado con HRP para la deteccion de absorbancia. La Figura 13B muestra las mediciones de union a HER2 inmovilizado con la deteccion de la absorbancia a 450 nm (de izquierda a derecha): trastuzumab tipo silvestre (WT) no biotinilado, variantes de tio-trastuzumab conjugadas con biotina-maleimida V110C (cis sencilla), A121C (cis sencilla) y V110C-A121C (cis dobles). Cada variante tio IgG y trastuzumab se ensayo a 1,10 y 100 ng. Las mediciones muestran que los TioMab anti-HER2 biotinilados retienen la actividad de union a HER2.
La figura 14A muestra una representacion animada de una union de un anticuerpo biotinilado a HER2 inmovilizada con la union de biotina a anti-IgG-HRP para la deteccion de la absorbancia. La Figura 14B muestra las mediciones de union con la deteccion de la absorbancia a 450 nm de variantes de tio-trastuzumab conjugado con biotina- maleimida y trastuzumab de tipo silvestre no biotinilado en la union a estreptavidina. De izquierda a derecha: V110C (cis sencilla), A121C (cis sencilla), V110C/A121C (cis doble) y trastuzumab. Cada variante de tio IgG trastuzumab y trastuzumab parental se ensayo a 1, 10 y 100 ng. Las mediciones muestran que los TioMabs HER2 tienen una alta reactividad tiol.
La cistelna se introdujo en el anticuerpo anti-EphB2R 2H9 de longitud completa en ciertos residuos. El mutante cis sencillo H-A121C de 2H9 se expreso en celulas CHO (ovario de hamster chino) mediante fermentacion transitoria en medios que contienen cistelna 1 mM. La secuencia de la cadena pesada mutante (450 aa) de 2H9 A121C es la SEQ ID NO: 28.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTEYWMHWVRQAPGKGLEWVGFXNPSTGYTDY NQKFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRPKIPRHANVFWGQGTIiVTVSS CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCI.VKDYFPEFVTVSWNSGAI.TSGVHTFPAVLQSS GLYELSSWTVPSSSLGTQTYICNVHHKPENTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEUjGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKKQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESMGQPEKNYKTTPPVLDSDGSPFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:28
Los anticuerpos tio-2H9 modificados por ingenierla genetica con cistelna comprenden las siguientes secuencias de la cadena pesada de la region constante Fc con un amino acido cistelna libre (SEQ ID NOS: 29-38).
Mutante
Secuencia SEQ ID NO:
V273C
HEDPECKFNWYVDGVEVHNAKTKPR SEQ ID NO:29
V279C
HEDPEVKFNWYCDGVEVHNAKTKPR SEQ ID NO:30
V282C
HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR SEQ ID NO:31
V284C
HEDPEVKFNWYVDGVECHNAKTKPR SEQ ID NO:32
A287C
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNCKTKPR SEQ ID NO:33
S324C
YKCKVCNKALP SEQ ID NO:34
S337C
IEKTICKAKGQPR SEQ ID NO:35
A339C
IEKTISKCKGQPR SEQ ID NO:36
S375C
KGFYPCDIAVE SEQ ID NO:37
S400C
PPVLDCDGSFF SEQ ID NO:38
La Figura 16 muestra el analisis SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) desnaturalizante no reductor (arriba) y reductor (abajo) de las variantes de Fc TioMab 2H9 (de izquierda a derecha, carriles 1-9): A339C; S337C; S324C; A287C; v284C; V282C; V279C y V273C, con el tipo silvestre 2H9, despues de la purificacion sobre la 5 Protelna A inmovilizada. El carril de la derecha es una escalera marcador de tamano, indicando que las protelnas intactas son aproximadamente de 150 kDa, los fragmentos de cadena pesada de 50 kDa y los fragmentos de cadena ligera de aproximadamente 25 kDa. La figura 17A muestra el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida no reductor (izquierda) y reductor (derecha) de las variantes de TioMab 2H9 (de izquierda a derecha, carriles 1-4): L-V15C; S179C; S375C; S400C, despues de la purificacion sobre la Protelna A inmovilizada. La Figura 10 17B muestra el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante no reductor (izquierda) y reductor
(+DTT) (derecha) de las variantes de TioMab adicionales 2H9 y 3A5 despues de la purificacion sobre la Protelna A inmovilizada. Las variantes de TioMab 2H9 (en el Fab as! como la region Fc) se expresaron y purificaron como se describe. Como se ve en las figuras 16, 17A y 17B, todas las protelnas son homogeneas en sDS-PAGE seguido por el procedimiento de reduction y la oxidation del Ejemplo 11 para preparar TioMab reactivos para la conjugation 15 (Ejemplo 12).
La cistelna se introdujo en el anticuerpo anti-MUC16 3A5 de longitud completa en ciertos residuos. El mutante de Cis sencillo H-A121C de 3A5 se expreso en celulas CHO (ovario de hamster chino) mediante fermentation transitoria en medios que contienen cistelna 1 mM. La secuencia de la cadena pesada mutante 3A5 A121C (446 aa) 20 comprende la SEQ ID NO: 39.
DVQLQESGPGLVNPSqSLSLTCTVTGYSITHDYAWNWIRQFPGNKLBWMGYINYSGYTTY HPSLKSRI SI TRDTSKHQFFmUlSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTLVTVSACSTK GPSVFPLAPESKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWKSGALTSGVHTFPAVIiQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKFSHTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEIJjGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHHAKTKPREEQYHSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKTVLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPEREEMTKN
qvsltclvkgfypsdiaveweengqpennykttppvldsdgsfflysicltvdksrwqqgn
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:39
Los anticuerpos anti-MUC16 tio-3A5 modificados por ingenierla genetica con cistelna comprenden las siguientes 25 secuencias de la cadena pesada de la region variable con un aminoacido cistelna libre (SEQ ID NOS: 40-44).
Mutante
Secuencia SEQ ID NO:
F45C
NWIRQCPGNK SEQ ID NO:40
A90C
LNSCTTEDTAT SEQ ID NO:41
A121C
GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL SEQ ID NO:42
A175C
HTFPCVLQSSGLYS SEQ ID NO:43
V176C
HTFPACLQSSGLYS SEQ ID NO:44
Los anticuerpos anti-MUC16 tio-3A5 modificados por ingenierla genetica con cistelna comprenden las siguientes secuencias de la cadena ligera de la region variable con un aminoacido cistelna libre (SEQ ID NOS: 45-49).
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Mutante
Secuencia SEQ ID NO:
L15C
FLSVSCGGRVT SEQ ID NO:45
A43C
QKPGNCPRLLI SEQ ID NO:46
V110C
EIKRTCAAPSV SEQ ID NO:47
A144C
FYPRECKVQWK SEQ ID NO:48
S168C
VTEQDCKDSTY SEQ ID NO:49
REACTIVIDAD DEL TIOL DE LOS TIOMAB
La reactividad de los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna IgG de longitud completa se midio 35 por biotinilacion y union a estreptavidina. Se establecio un ensayo de transferencia Western se creo para detectar el
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TioMab que se conjuga especlficamente con biotina-maleimida. En este ensayo, los anticuerpos se analizaron en SDS-PAGE y la presencia de biotina se probo especlficamente por incubacion con estreptavidina-HRP. Como se ve en la figura 18, la interaction estreptavidina-HRP o bien se observa en la cadena pesada o cadena ligera dependiendo de en la cual se esta usando la variante cis manipulada y no se ve interaccion con el tipo silvestre, lo que indica que las variantes TioMab especlficamente se conjugaron con la biotina en el residuo Cis modificado por ingenierla genetica. La figura 18 muestra el analisis en gel de desnaturalizacion de las variantes Tio-IgG biotiniladas, reducidas tras la captura en anti-IgG-HRP inmovilizada (parte superior del gel) y estreptavidina-HRP (gel inferior). Carril 1: 3A5 H-A121C. Carril 2: 3A5 L-V110C. Carril 3: 2H9 H-A121C. Carril 4: ZH9 L-V110C. Carril 5: anti-2H9 EphB2R parental, de tipo silvestre. Cada mutante (carriles 1-4) fue capturado por los anticuerpos anti-IgG con detection de HRP (arriba) lo que indica que la selectividad y afinidad fueron retenidas. La captura por estreptavidina inmovilizada con deteccion de HRP (parte inferior) confirmo la localization de la biotina en las cadenas pesadas y ligeras. La ubicacion de la mutation de cistelna en los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna en los carriles 1 y 3 es la cadena pesada. La ubicacion de la mutacion de cistelna en los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna en los carriles 2 y 4 es la cadena ligera. El sitio de la mutacion de la cistelna se somete a conjugation con el reactivo de biotina-maleimida.
El analisis de los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna TioMab de la Figura 18 y una variante 2H9 V15C por LC/MS dio indication cuantitativa de la reactividad del tiol (Tabla 5).
Tabla 5. Cuantificacion por LC/MS de la biotinilacion de los TioMab - reactividad del tiol
Variante TioMab
Numero de biotina por TioMab
2H9 wt
0.0
2H9 L-V15C
0.6
2H9 L-V110C
0.5
2H9 H-A121C
2.0
3A5 L-V110C
1.0
3A5 H-A121C
2.0
La introduction de la cistelna se llevo a cabo en el dominio constante, es decir region Fc, de los anticuerpos IgG. Varios sitios de aminoacidos se convirtieron en sitios de cistelna y los mutantes expresados, los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna, fueron evaluados en cuanto a la reactividad del tiol. Las variantes de Fc TioMab 2H9 biotilinadas se evaluaron en cuanto a la reactividad del tiol por cuantificacion con HRP por captura en estreptavidina inmovilizada en un ensayo ELISA (Figura 19). Se establecio un ensayo ELISA para cribar rapidamente los residuos de Cis con grupos tiol reactivos. Como se representa en el diagrama esquematico de la figura 19, la interaccion estreptavidina-biotina se controla probando con anti-IgG-HRP seguido de la medicion de la absorbancia a 450 nm. Estos resultados confirmaron las variantes 2H9-TioFc V282C, A287C, A339C. S375C y S400C tenlan reactividad del tiol de moderada a alta reactividad. El grado de conjugacion de biotina de las variantes de Fc TioMab 2H9 se cuantifico por analisis de LS/MS como se informa en la Tabla 6. El analisis LS/MS confirmo que las variantes A282C, S375C y S400C tenlan 100% de conjugacion con biotina y V284C y A339C tenlan 50% de conjugacion, lo que indica la presencia de un grupo tiol de la cistelna reactivo. Las otras variantes TioFc, y la parental, de tipo silvestre 2H9, o bien tenlan muy poca o ninguna biotinilacion.
Tabla 6 Cuantificacion por LC/MS de la biotinilacion de los Fc TioMab 2H9
Variante de Fc TioMab 2H9
% de biotinilacion
V273C
0
V279C
31
V282C
100
V284C
50
A287C
0
S324C
71
S337C
0
A339C
54
S375C
100
S400C
100
(2H9 tipo silvestre)
0
REACTIVIDAD DEL TIOL DE LAS VARIANTES DE LA CADENA LIGERA DE FAB TIO-4D5
El cribado de varias variantes Fab de la cadena ligera modificados por ingenieria genetica con cisteina del anticuerpo antiErbB2 4D5 dio un numero de variantes con un valor de reactividad tiol de 0,6 y mayor (Tabla 7), tal como se mide por el ensayo de PHESELECTOR de la Figura 8. Los valores de reactividad tiol de la Tabla 7 se normalizan a la variante TioFab de la cadena pesada 4D5 (HC-A121C) que se fija en 100%, suponiendo biotinilacion completa de la variante HC-A121C, y representada como valores por ciento.
5
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25
30
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40
45
50
Tabla 7 Reactividad del tiol en valores porcentuales de las variantes de la cadena ligera de TioFab 4D5
Variante de TioFab 4D5
Valor de reactividad del tiol (%)
V15C
100
V110C
95
S114C
78
S121C
75
S127C
75
A153C
82
N158C
77
V205C
78
(HC-A121C)
100
(tipo silvestre 4D5)
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CONJUGADOS ANTICUERPO-FARMACO
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna de la invencion se pueden conjugar con cualquier agente terapeutico, es decir, resto de farmaco, el cual se puede unir covalentemente al anticuerpo a traves de un grupo tiol de cistelna reactivo.
Un ejemplo de realization de un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna y un resto de farmaco (D) en el que el anticuerpo tiene uno o mas aminoacidos de cistelna libres que tienen un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0 y el anticuerpo esta unido a traves del uno o mas aminoacidos libres por un resto enlazador (L) a D; teniendo la composition la Formula L
Ab-(L-D)p I
donde p es 1, 2, 3, o 4. El numero de restos de farmaco que pueden estar conjugados a traves de un resto enlazador reactivo con tiol a una molecula de anticuerpo esta limitado por el numero de residuos de cistelna que se introducen por los metodos descritos en la presente memoria. Ejemplos de ADC de Formula I, por tanto, comprenden anticuerpos que tienen 1, 2, 3, o 4 aminoacidos modificados por ingenierla genetica con cistelna.
Otro ejemplo de realizacion de un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna, un peptido de union a albumina (ABP) y un resto de farmaco (D) en el que el anticuerpo esta unido al resto de farmaco por un resto enlazador (L) y el anticuerpo esta unido al peptido de union a albumina mediante un enlace amida o un segundo resto enlazador; teniendo la composicion la Formula la:
ABP-Ab-(L-D)p la
donde p es 1,2, 3, o 4.
Los compuestos de ADC de la invencion incluyen aquellos que tienen utilidad para la actividad contra el cancer. En particular, los compuestos incluyen un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna conjugado, es decir, unido covalentemente por un enlazador, a un resto de farmaco, es decir, la toxina. Cuando el farmaco no esta conjugado con un anticuerpo, el farmaco tiene un efecto citotoxico o citostatico. La actividad biologica del resto de farmaco se modula as! por la conjugation a un anticuerpo. Los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de la invencion proporcionan selectivamente una dosis eficaz de un agente citotoxico al tejido tumoral mediante el cual se puede lograr una mayor selectividad, es decir, una dosis mas baja eficaz.
En una realizacion, la biodisponibilidad del ADC de la invencion, o un metabolito intracelular del ADC, se mejora en un mamlfero en comparacion con un compuesto de farmaco que comprende el resto de farmaco del ADC. Tambien, la biodisponibilidad del ADC, o un metabolito intracelular del ADC se mejora en un mamlfero en comparacion con el analogo de la ADC que no tiene el resto de farmaco.
RESTOS DE FARMACO
El resto de farmaco (D) de los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) incluye cualquier compuesto, resto o grupo que tiene un efecto citotoxico o citostatico. Restos de farmaco incluyen: (i) agentes quimioterapeuticos, que pueden funcionar como inhibidores de la microtubulina, inhibidores de la mitosis, inhibidores de la topoisomerasa, o intercaladores de ADN; (ii) las toxinas de protelnas, que pueden funcionar enzimaticamente; y (iii) radioisotopos.
Ejemplos de restos de farmaco incluyen, pero no se limitan a, un maitansinoide, una auristatina, un dolastatina, un tricoteceno, CC1065, una caliqueamicina y otros antibioticos de enedina, un taxano, una antraciclina, y estereoisomeros, isosteros, analogos o derivados de los mismos.
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Compuestos maitansina adecuados para el uso como restos de farmaco maitansinoide son bien conocidos en la tecnica, y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con metodos conocidos, producidos mediante tecnicas de ingenierla genetica (vease Yu et al (2002) PROC. NAT. ACAD. SCL (USA) 99:7968-7973) o maitansinol y analogos de maitansinol preparados sinteticamente de acuerdo con metodos conocidos.
Ejemplos de restos de farmaco maitansinoides incluyen aquellos que tienen un anillo aromatico modificado, tal como: C-19-descloro (documento US 4256746) (preparado por reduccion con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) +/-C-19-descloro (patentes US-4361650 y US-4307016) (preparado por desmetilacion usando Streptomyces o Actinomyces o decloracion usando LAH) y C-20-desmetoxi, C- 20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (patente US-4.294.757) (preparado por acilacion usando cloruros de acilo) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones.
Ejemplos de restos de farmacos maitansinoides tambien incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C- 9-SH (documento US 4424219) (preparado por la reaccion de maitansinol con H2S o P2S5); C-14- alcoximetilo(desmetoxi/CH2OR) (documento US 4331598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (documento US 4450254) (preparado a partir de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (documento US 4.364.866) (preparado por la conversion de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (patentes US-4.313.946 y US- 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora); C-18-N-desmetilo (patentes US-4.362.663 y US-4.322.348) (preparado por la desmetilacion de maitansinol por Streptomyces) y 4,5-desoxi (documento US 4371533) (preparado por la reduccion con tricloruro de titanio/LAH de maitansinol). Por ejemplo, para la formation de un enlace ester, son adecuadas la position C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la position C-14 modificada con hidroximetilo, la position C- 15 modificada con un grupo hidroxilo y la posicion C-20 que tiene un grupo hidroxilo.
El resto de farmaco (D) de los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de Formula I incluye maitansinoides que tienen la estructura:
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donde la llnea ondulada indica la union covalente del atomo de azufre de D a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-farmaco (ADC). R puede ser independientemente H o un alquilo C1-C6 seleccionado de metilo, etilo, 1- propilo, 2-propilo, 1-butilo, 2-metil-1-propilo, 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1-butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2 pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4- metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo y 3,3-dimetil-2-butilo. La cadena de alquileno que une el grupo amida al atomo de azufre puede ser metanilo, etanilo o propilo, es decir, m es 1, 2, o 3.
Los compuestos maitansina inhiben la proliferation celular mediante la inhibicion de la formacion de microtubulos durante la mitosis a traves de la inhibition de la polimerizacion de la protelna microtubular, tubulina (Remillard et al (1975), Science 189: 1002-1005). La maitansina y los maitansinoides son altamente citotoxicos pero su uso cllnico en la terapia del cancer ha sido en gran medida limitada por sus graves efectos secundarios sistemicos atribuidos principalmente a su escasa selectividad para los tumores. Los ensayos cllnicos con maitansina se hablan suspendido debido a los efectos adversos graves en el sistema nervioso central y el sistema gastrointestinal (Issel et al (1978) Can. El tratamiento Rev. 5: 199-207).
Los restos de farmacos maitansinoides son restos de farmaco atractivos en conjugados de anticuerpo farmaco debido a que son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentation o modification qulmica o derivatizacion de productos de fermentacion, (ii) favorecen la derivatizacion con grupos funcionales adecuados para la conjugacion mediante enlazadores no disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) eficaces contra varias llneas celulares tumorales (documentos US 2005/0169933; WO 2005/037992; US 5208020).
Como sucede con otros restos de farmaco, todos los estereoisomeros del resto de farmaco maitansinoide se contemplan para los compuestos de la invention, es decir, cualquier combination de las configuraciones R y S en los carbonos quirales de D. En una realization, el resto de farmaco maitansinoide (D) tendra la siguiente estereoqulmica:
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Ejemplos de realizaciones de restos de farmaco maitansinoide incluyen: DM1, DM1, (CR2)m = CH2CH2; DM3, (CR2)m = CH2CH2CH(CH3) y DM4. (CR2)m = CH2CH2C(CH3)2, que tienen las estructuras:
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El enlazador puede unirse a la molecula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace ester mediante la reaccion con un grupo hidroxilo usando tecnicas de acoplamiento convencionales. La reaccion puede producirse en la posicion C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posicion C-14 modificada con hidroximetilo, la posicion C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posicion C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realizacion preferida, el enlace se forma en la posicion C-3 del maitansinol o un analogo de maitansinol.
Los conjugados resto de farmaco (D) de los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de Formula I tambien incluyen dolastatinas y sus analogos peptldicos, las auristatinas (patentes US-5.635.483; US-5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinamica de los microtubulos, la hidrolisis de GTP y la division nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12):3580-3584) y tienen actividad anticancerlgena (documento US 5.663.149) y antifungica (Pettit y col. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965). Varias formas de un resto de farmaco dolastatina o auristatina se pueden unir covalentemente a un anticuerpo a traves del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto de farmaco peptldico (documento WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458- 1465).
Los restos de farmaco incluyen dolastatinas, auristatinas (documentos US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431) y analogos y derivados de las mismas. Se ha demostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinamica de los microtubulos, la hidrolisis de GTP y la division nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12):3580-3584) y tienen actividad anticancerlgena (documento US 5.663.149) y antifungica (Pettit y col. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965). El resto de farmaco de dolastatina o auristatina puede estar unido al anticuerpo a traves del extremo N (amino) o al extremo C (carboxilo) del resto de farmaco peptldico (documento WO 02/088172).
Ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen los restos de farmaco monometilauristatina unida al N terminal DE y DF, divulgadas en: el documento WO 2005/081711; Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research Volumen 45, Numero de resumen 623, presentado el 28 de marzo de 2004, la divulgacion de cada uno de los cuales se incorporan expresamente por referencia en su totalidad.
El resto de farmaco (D) de los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de Formula I incluyen los restos de farmaco monometilauristatina MMAE y MMAF unidos a traves del N-terminal con el anticuerpo, y que tiene las estructuras:
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Normalmente, los restos de farmaco basados en peptidos pueden prepararse formando un enlace peptldico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos de peptido. Tales enlaces peptldicos pueden prepararse, por ejemplo, segun
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el metodo de slntesis en fase llquida (vease E. Schroder y K Lubke, "The Peptides", volumen 1, pag. 76-136, 1965, Academic Press) que es muy conocido en el campo de la qulmica de los peptidos.
El resto de farmaco incluye caliqueamicina y analogos y derivados de la misma. La familia de antibioticos de la caliqueamicina puede producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones inferiores a picomolares. Para la preparacion de conjugados de la familia de la caliqueamicina veanse los documentos US 5712374; US 5714586; US 5739116; US 5767285; US 5770701, US 5770710; US 5773001; US 5877296. Los analogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Y11, a2', as', N-acetil-Y1', PSAG y 9h (Hinman et al Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al Cancer Research 58:2925-2928 (1998).
Las toxinas protelna incluyen: cadena A de la difteria, fragmentos activos de no union de toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, protelnas de Aleurites fordii, protelnas de diantina, protelnas de Phytolaca americana (PAP', PAP'' y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos (documento WO 93/21232).
Radioisotopos terapeuticos incluyen: 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 212Pb e isotopos
radiactivos de Lu.
El radioisotopo u otros marcadores se pueden incorporar en el conjugado segun las formas conocidas (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminapentaacetico (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugacion del radionuclido con el anticuerpo (documento WO94/11026).
ENLAZADORES
Un "enlazador" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que puede ser utilizado para enlazar uno o mas restos de farmacos (D) y una unidad de anticuerpo (Ab) para formar conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) de Formula I. Los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) se pueden preparar convenientemente usando un enlazador que tiene funcionalidad reactiva para la union al farmaco y al anticuerpo. Un tiol de cistelna de un anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna pueden formar un enlace con un grupo funcional de un reactivo enlazador, un resto de farmaco o intermedio farmaco-enlazador.
En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrofilo que es reactivo frente a una cistelna nucleofila presente en un anticuerpo. El tiol de la cistelna del anticuerpo es reactivo con un grupo electrofilo en un enlazador y forma un enlace covalente con un enlazador. Grupos electrofilos utiles incluyen, pero no se limitan a, grupos maleimida y haloacetamida.
Los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna reaccionan con reactivos enlazadores o intermedios farmaco-enlazador, con grupos funcionales electrofilos tales como maleimida o a-halo carbonilo, de acuerdo con el metodo de conjugacion en la pagina 766 de Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773 y de acuerdo con el protocolo del Ejemplo 4.
En una realizacion, el enlazador L de un ADC tiene la Formula:
-Aa-WwYy
en la que:
- A- es una unidad de estirador covalentemente unida a un tiol de la cistelna del anticuerpo (Ab); a es 0 o 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido; w es independientemente un numero entero que oscila de 0 a 12;
-Y- es una unidad espaciadora covalentemente unida al resto de farmaco; e y es 0, 1 o 2.
UNIDAD DE ESTIRADOR
La unidad de estirador (-A-), cuando esta presente, puede unir una unidad de anticuerpo a una unidad de aminoacido (-W-). A este respecto, un anticuerpo (Ab) tiene un grupo tiol de la cistelna libre que puede formar un enlace con un grupo funcional electrofilo de una unidad de estirador. Unidades de estirador representativas de esta realizacion se representan dentro de los corchetes cuadrados de Formulas IIIa y IIIb en las que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definen anteriormente y R17 es un radical divalente seleccionado de (CH2)r, carbociclilo C3-C8, O- (CH2)n arileno, (CH2)r-arileno, -arileno-(CH2)r-, (CH2)r-(carbociclilo C3-C8), (carbociclilo C3-Cs)-(CH2)r, heterociclilo C3- Ca, (CH2)r-(heterocicliclo C3-C8), -(heterociclilo C3-Cs)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb-(CH2)r-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)r-
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CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC-(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -
(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-, and -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-; donde Rb es H, alquilo Ci-Ca, fenilo o bencilo; y r es independientemente un numero entero que oscila de 1-10.
Arileno incluye radicales de hidrocarburo aromatico divalente de 6-20 atomos de carbono derivados por la eliminacion de dos atomos de hidrogeno del sistema de anillo aromatico parental. Grupos arileno tlpicos incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.
Grupos heterociclilo incluyen un sistema de anillo en el que uno o mas atomos del anillo es un heteroatomo, por ejemplo, nitrogeno, oxlgeno y azufre. El radical heterociclo comprende 1 a 20 atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos seleccionados de N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros de anillo (2 a a atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos seleccionados de N, O, P y S) o un biciclo que tiene 7 a 10 miembros de anillo (4 a 9 atomos de carbono y 1 a 3 heteroatomos seleccionados de N, O, P y S), por ejemplo: un sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los Capltulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta el presente), en particular los volumenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.
Ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y no limitacion piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bistetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1 H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, 4H-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinollo
Grupos carbociclilo incluyen un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 atomos de carbono como un monociclo o 7 a 12 atomos de carbono como un biciclo. Carbociclos monoclclicos tienen 3 a 6 atomos de anillo, todavla mas normalmente 5 o 6 atomos de anillo. Carbociclos biclclicos tienen 7 a 12 atomos de anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 atomos de anillo dispuestos como un sistema de biciclo [5,6] o [6,6]. Ejemplos de carbociclos monoclclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1ciclopent-1-enilo, 1- ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
Debe entenderse de todos los ejemplos de realizaciones de ADC de Formula I tales como III-VI, que incluso cuando no se denote expresamente, de 1 a 4 restos de farmaco estan unidos a un anticuerpo (p = 1-4), dependiendo del numero de residuos de cistelna modificados por ingenierla genetica.
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CH2—CONH—R17-C<0)—Ww-Yy—D I
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Un ejemplo de unidad de estirador es el de Formula Ilia y se deriva de maleimido-caproil (MC) en la que R17 es -
(CH2)5-:
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Un ejemplo de unidad de estirador es el de Formula Ilia y se deriva de maleimido-propanoil (MP) en la que R17 es - (CH2)5-:
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Otro ejemplo de unidad de estirador es el de Formula Ilia en la que R17 es -(CH2CH2OV-CH2- y r es 2:
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Otro ejemplo de unidad de estirador es el de Formula Ilia en la que R17 es -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2- donde Rb es H y cada r es 2:
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Otro ejemplo de unidad de estirador es el de Formula IIIa en la que R17 es -(CH2)5-:
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En otra realizacion, la unidad de estirador esta ligada a la unidad de anti-anticuerpo por un enlace disulfuro entre un atomo de azufre de la unidad de anticuerpo y un atomo de azufre de la unidad de estirador. Una unidad de estirador representativa de este realizacion se representa por la Formula IV en la que R17, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definen anteriormente.
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En otra realizacion mas, el grupo reactivo del estirador contiene un grupo funcional reactivo con tiol que puede formar un enlace con un tiol de la cistelna libre de un anticuerpo. Ejemplos de grupos funcionales de reaccion con tiol incluyen, pero no se limitan a, maleimida, a-haloacetilo, esteres activados tales como esteres de succinimida, esteres 4-nitrofenllios, esteres pentafluorofenllicos, esteres tetrafluorofenllicos, anhldridos, cloruros de acido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Unidades de estirador representativas de esta realizacion se representan por las Formulas Va y Vb, en las que -R17-, Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se definen anteriormente
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En otra realizacion, el enlazador puede ser un enlazador de tipo dendrltico para la union covalente de mas de un resto de farmaco mediante un resto de enlazador multifuncional de ramificacion con un anticuerpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990). Los enlazadores dendrlticos pueden aumentar la relacion molar entre el farmaco y el anticuerpo, es decir, la carga, que esta relacionada con la potencia del ADC. Por tanto, si un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna lleva solo un grupo tiol de la cistelna reactivo, una multitud de restos de farmaco pueden unirse mediante un enlazador dendrltico.
UNIDAD DE AMINOACIDO
El enlazador puede comprender residuos de aminoacidos. La unidad de aminoacido (-Ww-), cuando esta presente, une el anticuerpo (Ab) con el resto de farmaco (D) del conjugado de anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna-farmaco (ADC) de la invencion.
-Ww- es una unidad de dipeptido, tripeptido, tetrapeptido, pentapeptido, hexapeptido, heptapeptido, octapeptido, nonapeptido, decapeptido, undecapeptido o dodecapeptido. Los residuos de aminoacidos que comprenden la unidad de aminoacido incluyen aquellos que se producen naturalmente, ademas de aminoacidos menores y analogos de aminoacidos que no existen de forma natural, tales como citrulina. Cada unidad de -W- tiene independientemente la formula denotada a continuacion en los corchetes y w es un numero entero que oscila de 0 a 12:
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en la que R19 es hidrogeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, - CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH,-(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2,-(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, - (CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2,-CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo,
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La unidad de aminoacido puede escindirse enzimaticamente por una o mas enzimas, que incluyen una proteasa asociada a tumor, para liberar el resto de farmaco (-D), que en una realizacion se protona in vivo tras la liberacion para proporcionar un farmaco (D).
Pueden disenarse unidades -Ww- utiles y optimizarse en su selectividad para la escision enzimatica por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor. En una realizacion, una unidad -Ww- es aquella cuya escision se cataliza por la catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Ejemplos de unidades de aminoacido -Ww- incluyen un dipeptido, un tripeptido, un tetrapeptido o un pentapeptido. Ejemplos de dipeptidos incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alaninafenilalanina (af o ala-phe). Ejemplos de tripeptidos incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicinaglicina-glicina (gly-gly-gly).
Si R19 es distinto de hidrogeno, el atomo de carbono al que R19 esta unido es quiral. Cada atomo de carbono con el que R19 esta unido esta independientemente en la configuracion (S) o (R), o es una mezcla racemica. Por tanto, las unidades de aminoacidos pueden ser enantiomericamente puras, racemicas o diaestereomericas.
UNIDAD ESPACIADORA
La unidad espaciadora (-Yy-), cuando esta presente (y = 1 o 2), une una unidad de aminoacido (-Ww-) con el resto de farmaco (D) cuando una unidad de aminoacido esta presente (w = 1-12). Como alternativa, la unidad espaciadora une la unidad de estirador con el resto de farmaco cuando la unidad de aminoacido esta ausente. La unidad espaciadora tambien une el resto de farmaco con la unidad de anticuerpo cuanto tanto la unidad de aminoacido como la unidad de estirador estan ausentes (w, y = 0). Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: auto- inmolativas y no auto-inmolativas. Una unidad espaciadora no auto-inmolativa es una en la que parte o toda la unidad espaciadora sigue unida al resto de farmaco despues de la escision, particularmente enzimatica, de una unidad de aminoacido del conjugado de anticuerpo-farmaco o el resto de farmaco-enlazador. Si un ADC que contiene una unidad espaciadora de glicina-glicina o una unidad espaciadora de glicina se somete a escision enzimatica por una proteasa asociada a celula de tumor, una proteasa asociada a celula de cancer o una proteasa asociada a linfocito, una glicina-glicina-resto de farmaco o una glicina-resto de farmaco se escinde de Ab-Aa-Ww-. En una realizacion, dentro de la celula diana tiene lugar una reaccion de hidrolisis independiente, escindiendo la glicina-resto de farmaco unido y liberando el farmaco.
En otra realizacion, -Yy- es una unidad de p-aminobencilcarbamollo (PAB) (vease Esquemas 2 y 3) cuya porcion de fenileno esta sustituida con Qm en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halogeno, -nitro o -ciano; y m es un numero entero que oscila de 0-4.
Ejemplos de realizaciones de una unidad espaciadora no auto-inmolativa (-Y-) son: - Gly-Gly-; -Gly-; -Ala-Phe-; -Val- Cit-.
En una realizacion se proporciona un resto de farmaco-enlazador o un ADC en el que la unidad espaciadora esta ausente (y = 0), o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.
Como alternativa, un ADC que contiene una unidad espaciadora auto-inmolativa puede liberar -D. En una realizacion,
-Y- es un grupo PAB que esta ligado a -Ww- por el atomo de nitrogeno amino del grupo PAB, y conectado directamente con -D por un grupo carbonato, carbamato o eter, en el que el ADC tiene la estructura a modo de ejemplo
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en la que Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que oscila de 0-4; y p oscila de 1 a 4.
Otros ejemplos de espaciadores auto-inmolativos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromaticos que son electronicamente similares al grupo PAB tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse espaciadores que experimentan ciclacion tras la hidrolisis del enlace amida, tales como amidas de acido 4-aminobutlrico sustituidas y sin sustituir (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) y amidas de acido 2-aminofenilpropionico (Amsberry et al. (1990) J. Org. Chem. 55: 5867). La eliminacion de farmacos que contienen amina que estan sustituidos en la glicina (Kingsbury y col. (1984) J. Med. Chem. 27:1447) tambien son ejemplos de espaciador auto-inmolativo util en ADC.
En una realizacion, la unidad espaciadora es un bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado, que se puede usar para incorporar y liberar multiples farmacos, que tiene la estructura:
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que comprende una unidad de dendrlmero 2-(4-aminobenciliden)propan-1,3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494), en la que Q es alquilo -C1-C8, -O-alquilo-C1-Cs, -halogeno, -nitro o ciano; m es un numero entero que oscila de 0-4; n es 0 o 1 y p oscila de 1 a 4.
ENLAZADORES DENDRITICOS
En otra realizacion, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrltico para la union covalente de mas de un resto de farmaco mediante un resto de enlazador multifuncional de ramificacion con un anticuerpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistr y Letters 12: 2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistr y 11:1761-1768). Los enlazadores dendrlticos pueden aumentar la relacion molar entre farmaco y anticuerpo, es decir, la carga, que esta relacionada con la potencia del ADC. Por tanto, si un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna lleva solo un grupo tiol de la cistelna reactivo, una multitud de restos de farmaco pueden unirse mediante un enlazador dendrltico.
Los siguientes ejemplos de realizaciones de reactivos de enlazador dendrltico permiten conjugar hasta nueve reactivos de resto de farmaco nucleofilos por reaccion con los grupos funcionales de la mostaza de nitrogeno cloroetilo:
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O
CH2OCHaCH2CNHCH2CY3
En otra realizacion de una unidad espaciadora, se pueden emplear como enlazadores en los compuestos de la invencion enlazadores dendriticos ramificados con unidades de dendrimero 2,6-bis(hidroximetil)-p-cresol y 2,4,6- tris(hidroximetil)-fenol auto-inmolativos (WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15688-15689; Shamis et al (2004) J. Amer. Chem. Soc. 126:1726-1731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499).
En otra realizacion, los restos D son los mismos.
En otra realizacion mas, los restos D son diferentes.
En un aspecto, las unidades espaciadoras (-Yy-) se representan por las Formulas (X)-(XII):
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en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halogeno, -nitro o -ciano y m es un numero entero que oscila de 0-4;
HN—CH2—CO-j j—NHCH2C(0)-NHCH2C(0)-
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Realizaciones de los compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco de Formula I incluyen XIIIa (val-cit), XIIIb (MC- val-cit), XIIIc (MC-val-cit-PAB):
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Ejemplos de otras realizaciones de compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco de la Formula la incluyen XlVa-e:
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donde X es:
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Y es:
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y R es independientemente H o alquilo C1-C6 y n es 1 a 12.
En otra realization, un enlazador tiene un grupo funcional reactivo que tiene un grupo nucleofilo que es reactivo con un grupo electrofilo presente en un anticuerpo. Grupos electrofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, grupos carbonilo de aldehldo y cetona. El heteroatomo de un grupo nucleofilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Grupos nucleofilos utiles en un enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida. El grupo electrofilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la union con un enlazador.
Normalmente, los enlazadores de tipo peptido pueden prepararse formando un enlace peptldico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos de peptido. Tales enlaces peptldicos pueden prepararse, por ejemplo, segun el metodo de slntesis en fase llquida (E. Schroder y K. Lubke (1965) "The Peptides", volumen 1, pag. 76-136, Academic Press) que es muy conocido en el campo de la qulmica de los peptidos.
Los productos intermedios de enlazador pueden ensamblarse con cualquier combination o secuencia de reacciones que incluyen unidades de espaciador, estirador y de aminoacido. Las unidades de espaciador, estirador y de aminoacido pueden emplear grupos funcionales reactivos que son de naturaleza electrofila, nucleofila o de radicales libres. Grupos funcionales reactivos incluyen, pero no se limitan a
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donde X es un grupo saliente, por ej., O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br, -I o maleimida.
En otra realizacion, el enlazador puede estar sustituido con grupos que modulan la solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente cargado tal como sulfonato (-SO3-) o amonio puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo y facilitar la reaction de acoplamiento del reactivo de enlazador con el anticuerpo o el resto de farmaco, o facilitar la reaccion de acoplamiento de Ab-L (producto intermedio de anticuerpo-enlazador) con D, o D-L (producto intermedio de farmaco-enlazador) con Ab, dependiendo de la ruta de slntesis empleada para preparar el ADC.
Los compuestos de la invention contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos enlazadores: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) y que incluye reactivos bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3 y BM(PEO)4, que estan disponibles comercialmente de Pierce Biotechnology, Inc., Departamento de Servicio al Cliente, Apartado postal Box 117, Rockford, IL. 61105 U.S.A., U.S.A. 1-800-874-3723, Internacional + 815-968-0747. Ver paginas 467-498, 2003-2004 Manual de Aplicaciones y Catalogo. Los reactivos bis-maleimida permiten la union del grupo tiol de un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna a un resto de farmaco que contiene tiol, marcador o enlazador intermedio, de forma secuencial o concurrente. Otros grupos funcionales ademas de maleimida, que son reactivos con un grupo tiol de un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna, resto de farmaco, marcador o enlazador intermedio incluyen yodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
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BM(PEO)3 BM(PEO)4
Reactivos enlazadores utiles tambien se pueden obtener a traves de otras fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO), o sintetizarse de acuerdo con procedimientos descritos en Toki et al (2002) 5 J. Org. Chem. 67: 1866-1872; Walker, M. A. (1995) J. Org. Chem. 60: 5352-5355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7: 180-186 y en los documentos US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583 y WO 04/032828.
Se pueden introducir los estiradores de Formula (IIIa) en un enlazador por reaccion de los siguientes reactivos 10 enlazadores con el N terminal de una unidad de aminoacidos:
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donde n es un numero entero que oscila de 1 a 10 y T es -H o -SO3Na;
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donde n es un numero entero que oscila de 0 a 3;
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Se pueden introducir unidades de estirador en un enlazador por reaccion de los siguientes reactivos bifuncionales con el N terminal de una unidad de aminoacido:
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donde X es Br o I. Unidades estirador de formula tambien se pueden introducir en un enlazador por reaccion de los siguientes reactivos bifuncionales con el N terminal de una unidad de aminoacidos:
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Se pueden introducir unidades de estirador de Formula (Va) en un enlazador por reaccion de los siguientes intermedios con el N-terminal de una unidad de aminoacido:
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Los estiradores de isotiocianato de la formula mostrada a continuacion pueden prepararse a partir de cloruros de acido isotiocianatocarboxllico como se describe en Angew. Chem., (1975)87(14), 517.
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en la que -R17- es como se describe en la presente memoria.
Un ejemplo de enlazador dipeptldico valina-citrulina (val-cit o vc) que tiene un estirador maleimida y un espaciador para-aminobencilcarbamollo (PAB) auto-inmolativo tiene la estructura:
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donde Q es alquilo -Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, nitro o ciano y m es un numero entero de 0-4.
Un ejemplo de un reactivo enlazador dipeptldico phe-lys(Mtr) que tiene una unidad estiradora y una unidad espaciador auto-inmolativa de p-aminobencilo se puede preparar de acuerdo con Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38: 5257-60, y tiene la estructura:
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donde Mtr es mono-4-metoxitritilo, Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, nitro o ciano; y m es un numero entero de 0-4.
Ejemplos de compuestos conjugados anticuerpo-farmaco de la invencion incluyen:
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donde Val es valina; Cit es citrulina; p es 1, 2, 3, o 4; y Ab es un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna. Otros ejemplos de conjugados anticuerpo-farmaco en los que el resto de farmaco maitansinoide DM1 esta
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unido a traves de un enlazador BMPEO a un grupo tiol de trastuzumab tienen la estructura:
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donde Ab es un anticuerpo modificado por ingenieria genetica con cisteina; n es 0, 1, o 2; y p es 1,2,3 o 4. PREPARACION DE CONJUGADOS ANTICUERPO-FARMACO
El ADC de Formula I puede prepararse por varias rutas empleando reacciones de quimica organica, condiciones y reactivos conocidos para aquellos expertos en la materia, que incluyen: (1) reaccion de un grupo cisteina de un anticuerpo modificado por ingenieria genetica con cisteina con un reactivo de enlazador, para formar el producto intermedio de anticuerpo-enlazador Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reaccion con un resto de farmaco D activado; y (2) reaccion de un grupo nucleofilo de un resto de farmaco con un reactivo de enlazador, para formar el producto intermedio de farmaco-enlazador D-L, mediante un enlace covalente, seguido de la reaccion con un grupo cisteina de un anticuerpo modificado por ingenieria genetica con cisteina. Los procedimientos de conjugacion (1) y (2) pueden emplearse con varios anticuerpos modificados por ingenieria genetica con cisteina, restos de farmaco y enlazadores para preparar los conjugados de anticuerpo-farmaco de Formula I.
Los grupos tiol de la cisteina del anticuerpo son nucleofilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en los reactivos de enlazador y productos intermedios de farmaco-enlazador que incluyen: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformiatos y haluros de acido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehidos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida; y (iv) disulfuros, que incluyen disulfuros de piridilo, por intercambio de sulfuro. Grupo nucleofilos en un resto de farmaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en restos de enlazador y reactivos de enlazador
La maitansina puede, por ejemplo, convertirse en May-SSCH3, que se puede reducir en el tiol libre, May-SH, y reaccionar con un anticuerpo modificado (Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131) para generar un inmunoconjugado maitansinoide-anticuerpo con un enlace disulfuro. Se han descrito conjugados anticuerpo- maitansinoide con enlaces disulfuro (documentos WO 04/016801; US 6884874; US 2004/039176 A1; WO 03/068144; US 2004/001838 A1; patentes US-6441163, US-5208020, US-5416064; WO 01/024763). El enlazador de disulfuro SPP se construye con el reactivo enlazador N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato.
En ciertas condiciones, los anticuerpos modificados por ingenieria genetica con cisteina pueden hacerse reactivos para la conjugacion con reactivos de enlazador mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (reactivo de Cleland, ditiotreitol) o TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Los anticuerpos monoclonales modificados por ingenieria genetica con cisteina de longitud completa (TioMab) expresados en celulas CHO se reducen con aproximadamente un exceso de 50 veces de TCEP durante 3 h a 37 °C para reducir enlaces disulfuro que pueden formarse entre los residuos de cisteina recientemente introducidos y la cisteina presente en los medios de cultivo. El TioMab reducido se diluye y se carga sobre una columna HiTrap S en acetato sodico 10 mM, pH 5, y se eluye con PBS que contiene cloruro sodico 0,3 M. Los enlaces disulfuro se restablecieron entre residuos de cisteina presentes en el Mab parental con sulfato de cobre (CuSO4) acuoso diluido (200 nM) a temperatura ambiente, durante la noche. Pueden usarse otros oxidantes, es decir, agentes de oxidacion, y condiciones de oxidacion, que se conocen en la tecnica. Tambien es eficaz la oxidacion con aire ambiente. Esta etapa de reoxidacion parcial suave forma eficientemente disulfuros dentro de las cadenas con alta fidelidad. Un exceso de aproximadamente 10 veces de producto intermedio de farmaco-enlazador, por ejemplo. BM(PEO)4-DM1, se anadio, se mezclo y se dejo reposar durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugacion y formar el conjugado de anticuerpo (Tiomab)-farmaco. La mezcla de conjugacion se filtro en gel y se cargo y se eluyo mediante una columna HiTrap S para eliminar el producto intermedio de farmaco-enlazador en exceso y otras impurezas.
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La Figura 15 muestra el proceso general para preparar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna expresado a partir de cultivo celular para la conjugacion. Los aductos de cistelna, supuestamente junto con diversos enlaces disulfuro entre cadenas, se escinden reductoramente para dar una forma reducida del anticuerpo. Los enlaces disulfuro entre cadenas entre residuos de cistelna emparejados se vuelven a formar bajo condiciones de oxidacion parcial, tal como exposicion a oxlgeno ambiental. Los residuos de cistelna recientemente introducidos, modificados por ingenierla genetica y desemparejados siguen estando disponibles para la reaccion con reactivos de enlazador o productos intermedios de farmaco-enlazador para formar los conjugados del anticuerpo de la invencion. Los TioMab expresados en llneas celulares de mamlfero producen aducto de Cis externamente conjugado con una Cis manipulada mediante la formacion de enlaces -S-S-. De ahl que los TioMab purificados se traten con los procedimientos de reduction y reoxidacion como se describen en el Ejemplo 11 para producir TioMab reactivos. Estos TioMab se usan para conjugarse con farmacos citotoxicos que contienen maleimida, fluoroforos y otras marcas.
Se prepararon varios conjugados de anticuerpo TioFab y TioMab-anticuerpo (Ejemplos 4-8) El mutante de cistelna hu4D5Fabv8 (V110C) se conjugo con el resto de farmaco maitansinoide DM1 con un reactivo enlazador bis- maleimido BMPEO para formar hu4D5Fabv8 (V110C) -BMPEO-DM1 (Ejemplo 8).
ENSAYOS DE PROLIFERACION CELULAR IN VITRO
Generalmente, la actividad citotoxica o citostatica de un conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) se mide mediante: exposicion de las celulas de mamlfero que tiene las protelnas del receptor, por ejemplo HER2, al anticuerpo del ADC en un medio de cultivo celular; cultivando las celulas durante un perlodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 dlas y midiendo la viabilidad celular. Los ensayos in vitro basados en celulas se usaron para medir la viabilidad (proliferation), la citotoxicidad, y la induction de la apoptosis (activation de la caspasa) del ADC de la invencion.
La potencia in vitro de los conjugados anticuerpo-farmaco se midio mediante un ensayo de proliferacion celular (Figuras 10 y 11, Ejemplo 9). El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® es un metodo de ensayo homogeneo disponible comercialmente (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresion recombinante de la luciferasa de Coleoptera (patentes US-5583024; US-5674713 y US-5700670). Este ensayo de proliferacion celular determina el numero de celulas viables en cultivo basandose en la cuantificacion del ATP presente, un indicador de las celulas metabolicamente activas (Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; documento US 6602677). El ensayo CellTiter-Glo® se llevo a cabo en formato de 96 pocillos, por lo que es susceptible de cribado de alto rendimiento automatizado (HTS) (Cree et al Drogas (1995) AntiCancer 6: 398-404). El procedimiento de ensayo homogeneo implica la adicion de un unico reactivo (CellTiter-Glo® Reactivo) directamente a las celulas cultivadas en medio suplementado con suero. No se requiere el lavado de celulas ni la elimination de etapas de pipeteado medias y multiples. El sistema detecta tan solo 15 celulas/pocillo en un formato de 384 pocillos en 10 minutos despues de la adicion del reactivo y la mezcla. Las celulas pueden ser tratadas continuamente con ADC, o pueden ser tratadas y separadas con ADC. Generalmente, las celulas tratadas brevemente, es decir, 3 horas, mostraron los mismos efectos de potencia que las celulas tratadas de forma continua.
El formato "medida anadir-mezclar" homogeneo provoca la lisis celular y la generation de una senal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al numero de celulas presentes en el cultivo. El ensayo CellTiter-Glo® genera una senal luminiscente "tipo resplandor" producida por la reaccion de la luciferasa, que tiene una semivida generalmente mayor de cinco horas, dependiendo del tipo de celulas y medio utilizados. Las celulas viables se reflejan en unidades relativas de luminiscencia (RLU). El sustrato, luciferina de escarabajo, se descarboxila oxidativamente por la luciferasa de luciernaga recombinante con la conversion concomitante de ATP en AMP y la generacion de fotones. La vida media prolongada elimina la necesidad de utilizar inyectores de reactivos y proporciona flexibilidad para el procesamiento de modo continuo o por lotes de placas multiples. Este ensayo de proliferacion celular se puede utilizar con varios formatos multipocillo, por ejemplo, formato de 96 o 384 pocillo. Los datos pueden ser registrados por luminometro o un dispositivo de obtencion de imagenes por camara CCD. La salida de la luminiscencia se presenta como unidades relativas de luz (RLU), medidas en el tiempo. Como alternativa, los fotones de luminiscencia pueden ser contadas en un contador de centelleo en presencia de un agente de centelleo. Las unidades de luz se pueden representar entonces como CPS - recuentos por segundo.
Luciferasa
ATP -tLuciferina+ Oz—-----------Oxiluciferina + AMP + PPi + COg+luz
Mg+Z
Los efectos antiproliferativos de los conjugados anticuerpo-farmaco se midieron por la proliferacion celular, el ensayo de destruction celular in vitro anterior contra la llnea celular de tumor de mama SK-BR-3 (Figuras 10 y 11). Los valores de CI50 del ADC se establecieron contra las celulas SK-BR-3, que son conocidas por sobreexpresar la protelna del receptor HER2.
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La Figura 10 muestra que trastuzumab-SMCC-DMI (CI50 = 0,008-0,015 qg/ml) era mas potente que el conjugado de mutante de cistelna de la cadena pesada hu4D5Fabv8 - (A121C) -BMPEO-DM1 (q= 0,04pg/ml). Ambos conjugados fueron significativamente mas potentes en la destruccion de celulas que trastuzumab desnudo (CI50 = 0,1 qg/ml). La carga de farmacos para el trastuzumab-SMCC-DM1 fue de 2,8 DM1/Ab y para hu4D5Fabv8 (A121C)-BMPEO-Dm1 fue de 0,6 DM1/Ab.
La Figura 11 muestra que trastuzumab-SMCC-DM1 (CI50 = 0,008 a 0,015 qg/ml) fue mas potente que el mutante de cistelna de la cadena ligera hu4D5Fabv8 (V110C)-BMPEO-DM1 (CI50= 0,07 qg/ml). Ambos conjugados eran mas potentes en la destruccion de celulas que el trastuzumab desnudo (CI50 = 0,1 qg/ml). La carga de farmacos para el trastuzumab-SMCC-DM1 fue de 2,8 DM1/Ab y para hu4D5Fabv8 (V110C)-BMPEO-DM1 fue de 0,9 DM1/Ab.
Los conjugados de IgG TioMab de longitud completa se ensayaron para determinar in vitro la eficacia la proliferacion celular y en comparacion con los anticuerpos parentales. La Figura 20 muestra los resultados de un ensayo de celulas SK-BR-3 tratadas con: anticuerpo trastuzumab parental (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.); trastuzumab- SMCC-DM1 con una carga de farmaco de aproximadamente 3,4 DM1/Ab y tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 con una carga de farmaco de aproximadamente 1,6 DM1/Ab. El conjugado trastuzumab-SMCC-DM1 esta ligado al anticuerpo a traves del enlazador ester NHS con amino reactivo SMCC, mientras que los conjugados tio- trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 se unen mediante el enlazador maleimida BMPEO con tiol reactivo. Ambos conjugados eran potentes contra las celulas SK-BR-3 y mostraron una actividad comparable, mientras que trastuzumab no ejercio ningun efecto citotoxico. La Figura 21A muestra los resultados de un ensayo de celulas HT 1080EphB2 tratadas con: anti-EphB2R 2H9 parental y conjugado tio BMPEO-DM1 2H9 (A121C). La Figura 21B muestra los resultados de un ensayo de celulas BT 474 tratadas con: anti-EphB2R 2H9 parental y conjugado tio BMPEO-DM1 2H9 (A121C). El conjugado TioMab 2H9 contra las celulas HT 1080EphB2 y BT 474, era mas potente que el conjugado de anticuerpo parental 2H9. El conjugado Tio-2H9-BMPEO-DM1 mostro actividad de destruccion celular funcional en la llnea celular especlfica EphB2 (HT1080EphH2) en comparacion con una llnea celular no EphB2, BT474 en la que solo se observa actividad marginal.
Los conjugados de anticuerpo-farmaco se compararon en el caso en el que el anticuerpo es un anticuerpo parental y en el caso en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna. La Figura 22 muestra los resultados de un ensayo de celulas PC3/neo tratadas con: anti-MUC16-SMCC-DM1 3A5 y tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1. La Figura 23 muestra los resultados de un ensayo de celulas PC3/MUC16 tratadas con: 3A5 anti MUC16-SMCC-DM1 y tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1. La Figura 24 muestra los resultados de un ensayo de celulas OVCAR-3 tratados con: 3A5 anti MUC16-SMCC-DM1 y tio 3A5 (A121C) BMPEO-DM1. Tio-3A5-BMPEO- DM1 no mostro ninguna actividad significativa de destruccion celular en la llnea celular PC3/neo de control, aunque mostro una actividad comparable a 3A5-SMCC-DM1 en la llnea celular PC3/MUC16. El conjugado Tio-3A5-DM1 tambien mostro actividad en el OVCAR-3 que expresa antlgeno MUC16 endogeno.
EFICACIA IN VIVO
La eficacia in vivo de dos conjugados peptido de union a albumina-DM1 DM1 (maitansinoide)-anticuerpo-farmaco (ADC) de la invencion se midio con un modelo en raton de explante transgenico de alta expresion de HER2 (Figura 12, Ejemplo 10). Se propago un aloinjerto del raton transgenico Fo5 mmtv que no responde a, o responde mal a, la terapia con HERCEPTlN®. Los sujetos fueron tratados una vez con ABP-rhuFab4D5-cis (cadena ligera)-DM1; ABP- rhuFab4D5 (cadena pesada)-DM1 y el control de tampon de PBS placebo (vehlculo) y se controlaron durante mas de 3 semanas para medir el tiempo de duplicacion del tumor, el log de muerte celular y la reduccion del tumor.
Muestra
Dosis Ti PR CR TDV (dlas)
Vehlculo (tampon PBS)
7/7 0/7 0/7 3
ABP-rhuFab4D5-V110C (cadena ligera)-DM1 (0,9 DM1/Ab)
25 mg por kg (1012 qg/m2 de DM1) 7/7 7/7 0/7 14
ABP-rhuFab4D5-A121C(cadena pesada)-DM1 (0,6 DM1/Ab)
37,5 mg por kg (1012 qg/m2 de DM1) 7/7 4/7 0/7 16
El termino Ti es el numero de animales en el grupo de estudio con tumor en T = 0 + total de animales en el grupo.
El termino PR es el numero de animales que alcanzan la remision parcial del tumor + animales con tumor en el momento T = 0 en el grupo. El termino CR es el numero de animales que alcanzan la remision completa del tumor + animales con tumor a T = 0 en el grupo. El termino TDV es el tiempo de duplicacion del tumor, es decir, el tiempo en dlas para que el volumen del tumor del control se duplique.
Los siete ratones tratados con 25 mg por kg (1,012 pg/m2 de DM1) de ABP-rhuFab4D5-cis (cadena ligera)-DM1 eran todos positivos para el tumor y un animal mostro remision parcial despues de 20 dlas. Los siete ratones tratados con 37,5 mg por kg (1,012 pg/m2 de DM1) de ABP-rhuFab4D5-cis (cadena pesada)-DM1 eran todas positivos para el tumor y cuatro animales mostraron remision parcial despues de 20 dlas.
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La variante de anticuerpo IgG TioMab de longitud completa con la mutacion de cistelna A121C y conjugada con el enlazador BMPEO y el resto de farmaco DM1 fue probado frente al conjugado trastuzumab-SMCC-DM1 parental en ratones portadores del tumor MMTV-HER2 Fo5. El tamano del tumor en el dla 0 de la inyeccion fue de aproximadamente 100-200 mm de tamano. La figura 25 muestra el cambio de volumen medio del tumor de mas de 21 dlas en ratones desnudos atlmicos con aloinjertos de tumor mamario MMTV-HER2 Fo5, despues de una sola dosis en el Dla 0 con: Vehlculo (tampon); trastuzumab-SMCC-DM1 10 mg/kg; tio trastuzumab (A121C)-SMCC-DM1 21 mg/kg y tio trastuzumab (A121C) -SMCC-DM1 10 mg/kg.
Muestra
Dosis Ti PR CR
Vehlculo (tampon PBS)
10/10 0/10 0/10
trastuzumab-SMCC-DM1 3,4 DM1/Ab
10 mg Ab por kg de raton (490 ug/m2 de DM1) 10/10 7/10 0/10
tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 1,6 DM1/Ab
21 mg Ab por kg de raton (496 ug/m2 de DM1) 8/10 6/10 4/10
tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 1,6 DM1/Ab
10 mg Ab por kg de raton (236 ug/m2 de DM1) 10/10 0/10 0/10
Puede verse en la figura 25 que cada conjugado ejerce un efecto significativo de retraso del crecimiento del tumor en relacion con placebo (vehlculo). Cada uno de los diez ratones en los cuatro grupos anteriores recibio una sola inyeccion en el dla 1. El conjugado trastuzumab-SMCC-DM1 parental se cargo con mas del doble (3,4 DM1/Ab) el numero de restos de farmaco que el conjugado modificado por ingenierla genetica con cistelna tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 (1,6 DM1/Ab). La cantidad eficaz de DM1 era por lo tanto aproximadamente igual entre trastuzumab-SMCC-DM1 parental y tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 (21 mg Ab) de dosis mas alta. Estas dos muestras mostraron la mayor potencia. Catorce dlas despues de la inyeccion, la mayorla de los animales que recibieron estos conjugados estaban en remision parcial o completa. La menor eficacia de la muestra de tio- trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1 de dosis inferior confirmo una respuesta relacionada con la dosis de DM1. Tio- Trastuzumab-DM1 se dosifico en una cantidad de anticuerpo equivalente (10 mg/kg) o de farmaco DM1 (21 mg/kg) a la del conjugado trastuzumab-SMCC-DM1 de control. Como se ve en la Figura 25, Tio-BMPEO-DM1 (21 mg/kg) mostro ligeramente mejor respuesta que el del grupo de trastuzumab-SMCC-DM1, ya que algunos de los animales mostraron una respuesta completa con Tiomab-DM1 mientras que solo habla respuesta parcial con trastuzumab- SMCC-DM1.
ADMINISTRACION DE CONJUGADOS ANTICUERPO-FARMACO
Los conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) de la invencion pueden administrarse por cualquier via apropiada para la afeccion que va a tratarse. El ADC se administrara normalmente por via parenteral, es decir, infusion, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica, intratecal y epidural.
formulaciones farmaceuticas
Las formulaciones farmaceuticas de los conjugados anticuerpo-farmaco (ADC) terapeuticos de la invencion se preparar normalmente para administracion parenteral, es decir, bolo, inyeccion intravenosa, intratumoral, con un vehlculo parenteral farmaceuticamente aceptable y en unidad de administracion de forma inyectable. Un conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) que tiene el grado de pureza deseado se mezcla opcionalmente con diluyentes, vehlculos, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980), en forma de soluciones acuosas o liofilizadas u otras formulaciones acuosas.
Los diluyentes, vehlculos, excipientes o estabilizadores aceptables son no toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio) ; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenolico, butllico o bencllico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3- pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); protelnas tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; pollmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protelna) y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, formulaciones anti-ErbB2 liofilizadas se describen en el documento WO 97/04801.
Los principios activos tambien pueden estar atrapados en una microcapsula preparada, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcapsula de poli-(metacilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartlculas y nanocapsulas) o en
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macroemulsiones. Tales tecnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980).
Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen el ADC, cuyas matrices que estan en forma de artlculos moldeados, por ejemplo, pellculas o microcapsula. Ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinllico)), polilactidas (patente US-3773919), copollmeros de acido L-glutamico y L-glutamato de gamma-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copollmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copollmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutlrico.
Las formulaciones que van a usarse para la administracion in vivo son generalmente esteriles, las cuales se realizan facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para las vlas de administracion anteriores. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de la farmacia. Las tecnicas y formulaciones en general se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tales metodos incluyen la etapa de poner en asociacion el principio activo al vehlculo que constituye uno o mas componentes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e Intimamente en asociacion el principio activo a vehlculos llquidos o vehlculos solidos finamente divididos o ambos, y despues, si es necesario, dando forma al producto.
Las suspensiones acuosas de la invencion contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabrication de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen un agente de suspension, tal como carboximetilcelulosa de sodio, croscarmelosa, povidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma de acacia y agentes dispersantes o humectantes tales como un fosfatido de origen natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensation de un oxido de alquileno con un acido graso (por ejemplo, estearato de polioxietileno), un producto de condensacion de oxido de etileno con un alcohol alifatico de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol), un producto de condensacion de oxido de etileno con un ester parcial derivado de un acido graso y un anhldrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitan). La suspension acuosa tambien puede contener uno o mas conservantes tales como p-hidroxi- benzoato de etilo o n-propilo, uno o mas agentes colorantes, uno o mas agentes aromatizantes y uno o mas agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Las composiciones farmaceuticas de ADC pueden estar en la forma de una preparation inyectable esteril, tal como una suspension acuosa u oleaginosa inyectable esteril. Esta suspension se puede formular segun la tecnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspension que se han mencionado anteriormente. La preparacion inyectable esteril puede ser tambien una solution o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no toxico, tal como una solucion en 1,3-butano-diol o puede prepararse como un polvo liofilizado. Entre los vehlculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan agua, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro sodico. Ademas, los aceites fijos, esteriles, convencionalmente se pueden emplear como medio disolvente o de suspension. Para este proposito se puede emplear cualquier aceite fijo blando incluyendo mono- o digliceridos sinteticos. Ademas, en la preparacion de inyectables se pueden usar tambien acidos grasos tales como acido oleico.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con el material vehlculo para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del hospedador tratado y del modo particular de administracion. Por ejemplo, una solucion acuosa destinada a la infusion intravenosa puede contener de aproximadamente 3 a 500 pg de principio activo por mililitro de solucion con el fin de que se pueda realizar la infusion de un volumen adecuado a una velocidad de aproximadamente 30 ml/h.
Las formulaciones adecuadas para administracion parenteral incluyen soluciones de inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos y solutos que hacen la formulation isotonica con la sangre del receptor previsto y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes.
Aunque la administracion oral de protelnas terapeuticas esta desfavorecida debido a la hidrolisis o la desnaturalizacion en el intestino, las formulaciones de ADC adecuadas para la administracion oral se pueden preparar como unidades discretas tales como capsulas, sellos o comprimidos conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ADC.
Las formulaciones se pueden envasar en envases de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado secado por congelation (liofilizado) que requiere solo la adicion del vehlculo llquido esteril, por ejemplo, agua para inyeccion inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyeccion extemporanea se preparan a partir de polvos esteriles, granulos y comprimidos del tipo
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descrito previamente. Las formulaciones de dosificacion unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad de subdosis diaria, como se ha indicado anteriormente, o una fraccion apropiada de la misma, del principio activo.
La invencion proporciona ademas composiciones veterinarias que comprenden al menos un principio activo como se ha definido anteriormente junto con un vehlculo veterinario para el mismo. Los vehlculos veterinarios son materiales utiles para el proposito de administrar la composicion y pueden ser materiales solidos, llquidos o gaseosos que son de otro modo inertes o aceptables en la tecnica veterinaria y son compatibles con el principio activo. Estas composiciones veterinarias se pueden administrar por via parenteral, por via oral o por cualquier otra via deseada.
TRATAMIENTOS CONJUGADO ANTICUERPO-FARMACO
Se contempla que los conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) de la presente invencion puedan usarse para tratar diversas enfermedades o trastornos, por ejemplo, caracterizados por la expresion en exceso de un antlgeno de tumor. Ejemplos de afecciones o trastornos hiperproliferativos incluyen tumores benignos o malignos; leucemia y tumores malignos linfoides. Otros incluyen trastornos neuronales, de la glia, astroclticos, hipotalamicos, glandulares, macrofagicos, epiteliales, del estroma, blastocelicos; inflamatorios, angiogenicos e inmunologicos, que incluyen autoinmunitarios. Todavla otros incluyen canceres de prostata, pulmon y colon.
Los compuestos de ADC que se identifican en los modelos animales y ensayos basados en celulas pueden probarse adicionalmente en primates superiores que tienen un tumor y ensayos cllnicos humanos. Los ensayos cllnicos humanos pueden disenarse para probar la eficacia del anticuerpo monoclonal anti-HER2 HERCEPTIN® en pacientes con canceres de mama metastasico que sobreexpresan HER2 que han recibido terapia anticancerosa anterior extensa como se describe por Baselga et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744. El ensayo cllnico puede disenarse para evaluar la eficacia de un AND en las combinaciones con reglmenes terapeuticos conocidos, tal como radioterapia y/o quimioterapia que implican agentes quimioterapeuticos y/o citotoxicos.
En general, la enfermedad o trastorno a tratar es una enfermedad proliferativa, tal como el cancer. Ejemplos de cancer a tratar incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Mas ejemplos particulares de tales canceres incluyen cancer de celulas escamosas (por ejemplo, cancer de celulas escamosas epiteliales) , cancer de pulmon que incluye cancer de pulmon microcltico, cancer de pulmon no microcltico, adenocarcinoma de pulmon y carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago que incluye cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de hlgado, cancer de vejiga, cancer de las vlas urinarias, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glandulas salivales, cancer de rinon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma de pene, ademas de cabeza y cuello.
El cancer puede comprender celulas que expresan HER-2, de forma que el ADC de la presente invencion puede unirse a las celulas cancerosas. Para determinar la expresion de ErbB2 en el cancer estan disponibles diversos ensayos de diagnostico/pronostico. En una realizacion, la sobreexpresion de ErbB2 puede analizarse por IHC, por ejemplo, usando el HERcEPTEST (Dako). Los cortes de tejido incluidos en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al ensayo de IHC y examinarse los criterios de la intensidad de tincion de la protelna ErbB2 como sigue: Puntuacion 0, no se observa tincion o la tincion de la membrana se observa en menos de 10 % de las celulas tumorales; Puntuacion 1+, se detecta una tincion de membrana debil/apenas perceptible en mas del 10 % de las celulas tumorales, las celulas solo se tinen en parte de su membrana; Puntuacion 2+, se observa una tincion debil a moderada completa de la membrana en mas del 10 % de las celulas tumorales; Puntuacion 3+, se observa un tincion moderada a fuerte de la membrana completa en mas del 10 % de las celulas tumorales. Esos tumores con puntuaciones 0 o 1+ para la evaluacion de la sobreexpresion de ErbB2 pueden caracterizarse como que no sobreexpresan ErbB2, mientras que aquellos tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que sobreexpresan ErbB2.
Como alternativa, o adicionalmente, pueden llevarse a cabo ensayos FISH tales como INFORM™ (Ventana Co, Ariz.) o PATHVISION™ (Vysis, Ill.) en el tejido tumoral incluido en parafina y fijado en formalina para determinar el grado (dado el caso) de sobreexpresion de ErbB2 en el tumor.
Las enfermedades autoinmunitarias para las que pueden ser utilizados los compuestos de ADC en el tratamiento incluyen trastornos reumatologicos (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, slndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tal como LES y nefritis lupica, polimiositis/ dermatomiositis, crioglobulinemia, slndrome de anticuerpos anti-fosfollpido, y artritis psoriasica), artrosis, trastornos gastrointestinales y hepaticos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y enfermedad cellaca), vasculitis (tales como, por ejemplo, vasculitis asociada a ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y poliarteriitis), trastornos neurologicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, esclerosis multiple, opsoclonus mioclono, miastenia grave, neuromielitis optica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatlas autoinmunitarias), trastornos renales
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(como, por ejemplo, glomerulonefritis, slndrome de Goodpasture y la enfermedad de Berger), trastornos dermatologicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, habones, penfigo vulgaris, penfigoide bulloso y lupus eritematoso cutaneo), alteraciones hematologicas (tales como, por ejemplo, purpura trombocitopenica, purpura trombocitopenica trombotica, purpura postransfusional y anemia hemolltica autoinmunitaria), aterosclerosis, uveitis, enfermedades de la audicion autoinmunitarias (tales como, por ejemplo, enfermedad del oldo interno y perdida de audicion), enfermedad de Behcet, slndrome de Raynaud, trasplante de organos, y trastornos endocrinos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la diabetes tales como la diabetes mellitus insulino dependiente (DMID), enfermedad de Addison, y enfermedad tiroidea autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)). De estas enfermedades, las mas preferidas incluyen, por ejemplo, la artritis reumatoide, colitis ulcerosa, vasculitis asociada a ANCA, lupus, esclerosis multiple, slndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, DMID, anemia perniciosa, tiroiditis, y glomerulonefritis.
Para la prevention o el tratamiento de enfermedad, la dosificacion apropiada de un ADC dependera del tipo de enfermedad que vaya a tratarse, como se define anteriormente, la gravedad y la evolution de la enfermedad, si la molecula se administra para fines preventivos o terapeuticos, terapia previa, la historia clinica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del medico. La molecula se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0, 1-20 mg/kg) de molecula es un dosificacion candidata inicial para administration al paciente, tanto si es, por ejemplo, por una o por mas administraciones separadas como por infusion continua. Una dosificacion diaria tipica podria oscilar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Un ejemplo de dosificacion de ADC que va a administrarse a un paciente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente.
Para administraciones repetidas durante varios dias o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento es sostenido hasta que se produce una supresion deseada de los sintomas de la enfermedad. Un ejemplo de pauta de dosificacion comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg de un anticuerpo anti-ErbB2. Pueden ser utiles otras pautas posologicas. El progreso de esta terapia se monitoriza facilmente por tecnicas y ensayos convencionales.
TERAPIA DE COMBINACION
Un conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC) de la invention puede combinarse en una formulation de combination farmaceutica, o pauta de dosificacion, como terapia de combinacion, con al menos un segundo compuesto que tiene propiedades anticancerigenas. El al menos segundo compuesto de la formulacion de combinacion farmaceutica o pauta de dosificacion tiene preferentemente actividades complementarias a las del ADC de la combinacion de forma que no se afectan adversamente entre si.
El segundo compuesto puede ser un agente quimioterapeutico, agente citotoxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal y/o cardioprotector. Tales moleculas estan adecuadamente presentes en combinacion en cantidades que son eficaces para el fin previsto. Una composition farmaceutica que contiene un ADC de la invencion tambien puede tener una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente quimioterapeutico tal como un inhibidor de la formation de tubulina, un inhibidor de la topoisomerasa o un aglutinante de ADN.
Pueden combinarse otras pautas terapeuticas con la administracion de un agente anticancerigeno identificado segun la presente invencion. La terapia de combinacion puede administrarse como una pauta simultanea o secuencial. Si se administra secuencialmente, la combinacion puede administrarse en dos o mas administraciones. La administracion combinada incluye coadministracion, usando formulaciones separadas o una unica formulacion farmaceutica y administracion consecutiva en cualquier orden, en el que preferentemente hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultaneamente sus actividades biologicas.
En una realization, el tratamiento con un ADC implica la administracion combinada de un agente anticancerigeno identificado en la presente memoria y uno o mas agentes quimioterapeuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluyen coadministracion de mezclas de diferentes agentes quimioterapeuticos. Agentes quimioterapeuticos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibioticos de antraciclina. La preparation y los programas de dosificacion para tales agentes quimioterapeuticos pueden usarse segun instrucciones del fabricante o como se determina empiricamente por el medico experto. La preparacion y las pautas posologicas para tal quimioterapia tambien se describen en "Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
El ADC se puede combinar con un compuesto anti-hormonal; por ejemplo, un compuesto anti-estrogeno como el tamoxifeno; una anti-progesterona, tal como onapristona (documento EP 616812) o un anti-androgeno, tal como flutamida, en dosis conocidas para tales moleculas. Cuando el cancer a tratar es un cancer independiente de hormonas, el paciente puede haber sido previamente sometido a terapia anti-hormonal y, despues de que el cancer se convierte en hormono independiente, el ADC (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente memoria) se pueden administrar al paciente. Puede ser beneficioso coadministrar tambien un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfuncion miocardica asociada a la terapia) o una o mas citocinas al paciente. Ademas de los
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reglmenes terapeuticos anteriores, el paciente puede someterse a extirpacion quirurgica de las celulas cancerosas y/o radioterapia.
Dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes anteriormente coadministrados son aquellas usadas en la presente y pueden reducirse debido a la accion combinada (sinergia) del agente recientemente identificado y otros agentes o tratamientos quimioterapeuticos.
La terapia de combinacion puede proporcionar "sinergia" y demuestra ser "sinergica", es decir, el efecto conseguido cuando los principios activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Puede obtenerse un efecto sinergico cuando los principios activos: (1) se coformulan y se administran simultaneamente en una formulacion de dosificacion unitaria combinada; (2) se administran por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por alguna otra pauta. Si se administra en terapia de alternancia, un efecto sinergico puede obtenerse cuando los compuestos se administran secuencialmente, por ejemplo, por diferentes inyecciones en jeringuillas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, una dosificacion eficaz de cada principio activo se administra secuencialmente, es decir, seriadamente, mientras que en terapia de combinacion, las dosificaciones eficaces de dos o mas principios activos se administran juntas.
METABOLITOS DE LOS CONJUGADOS ANTICUERPO-FARMACO
Dentro del alcance de esta invencion tambien se encuentran los productos metabolicos in vivo de los compuestos de ADC descritos en la presente memoria, hasta el punto de que tales productos son novedosos y no obvios con respecto a la tecnica anterior. Tales productos pueden resultar, por ejemplo, de la oxidacion, reduccion, hidrolisis, amidacion, esterificacion o escision enzimatica del compuesto administrado. Por consiguiente, la invencion incluye compuestos novedosos y no obvios producidos mediante un proceso que comprende poner en contacto un compuesto de la presente invencion con un mamlfero durante un periodo de tiempo suficiente para dar un producto metabolico del mismo.
Los productos de metabolitos normalmente se identifican preparando un ADC radiomarcado (por ejemplo, 14C o 3H), administrandolo parenteralmente en una dosis detectable (por ejemplo, superior a aproximadamente 0,5 mg/kg) a un animal tal como rata, raton, cobaya, mono, o al hombre, dejando tiempo suficiente para que se produzca el metabolismo (normalmente aproximadamente 30 segundos a 30 horas) y aislando sus productos de conversion de la orina, sangre u otras muestras biologicas. Estos productos se alslan facilmente ya que estan marcados (otros se alslan por el uso de anticuerpos que pueden unirse a epitopes que sobreviven en el metabolito). Las estructuras de metabolito se determinan de forma convencional, por ejemplo, por analisis de EM, EM/CL o RMN. En general, el analisis de metabolitos se hace de la misma forma que los estudios de metabolismo de farmacos convencionales muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Los productos de conversion, mientras que no se encuentren de otro modo in vivo, son utiles en ensayos de diagnostico para la dosificacion terapeutica de los compuestos de ADC de la invencion.
METODOS DE OBTENCION DE IMAGENES DE ANTICUERPOS MARCADOS
En otra realization de la invencion, los anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna pueden marcarse mediante el tiol de la cistelna con radionuclidos, colorantes fluorescentes, restos de sustratos desencadenantes de bioluminiscencia, restos de sustratos desencadenantes de quimioluminiscencia, enzimas y otros marcadores de detection para experimentos de obtencion de imagenes con aplicaciones de diagnostico, farmacodinamicas y terapeuticas. Generalmente, el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cisteina marcado, es decir, "biomarcador" o "sonda", se administra mediante inyeccion, perfusion o ingestion oral a un organismo vivo, por ejemplo, ser humano, roedor u otro animal pequeno, un organo perfundido o muestra de tejido. La distribution de la sonda se detecta durante un transcurso de tiempo y se representa por una imagen.
articulos manufacturados
En otra realizacion se proporciona un articulo manufacturado o "kit", que contiene materiales utiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El articulo manufacturado comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al recipiente. Envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, envase blister, etc. Los envases pueden formarse a partir de varios materiales tales como vidrio o plastico. El envase contiene una composition de conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC) que es eficaz para tratar la afeccion y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solution intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo en la composicion es un ADC. La etiqueta o prospecto indica que la composicion se usa para tratar la afeccion de election, tal como cancer. Como alternativa o adicionalmente, el articulo manufacturado puede comprender adicionalmente un segundo (o tercer) envase que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable tal como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI) , solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Adicionalmente puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
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Ejemplo 1 - Preparacion de TioFab fago biotinilado
Se hizo reaccionar TioFab-fago (5 x 1012 particulas de fago) con 150 veces en exceso de biotina-PEO-maleimida ((+)-biotinil-3-maleimidopropionamidil-3,6-dioxaoctainediamina, Oda et al (2001) Nature Biotechnology 19: 379-382, Pierce Biotechnology, Inc.) durante 3 horas a temperatura ambiente. El exceso de biotina-PEO-maleimida fue retirado del fago conjugado con biotina mediante precipitaciones de PEG repetidas (3-4 veces). Se pueden usar otros reactivos de biotinilacion comercialmente disponibles con grupos electrofilos que son reactivos con los grupos tiol de la cisteina, incluyendo biotina-BMCC, PEO-yodoacetil biotina, yodoacetil-LC-biotina y biotina-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.), y W“-(3-malcimidilpropionil)biocitina (MPB, Molecular Probes, Eugene, OR). Otras fuentes comerciales para la biotinilacion, reactivos enlazadores bifuncionales y multifuncionales incluyen Molecular Probes, Eugene, OR y Sigma, St. Louis, MO.
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Ejemplo 2 - Ensayo PHESELECTOR
La albumina de suero bovino (BSA), el dominio extracelular de ErbB2 (HER2) y estreptavidina (100 ql de 2 qg/ml) se recubrieron por separado en placas de 96 pocillos Maxisorp. Despues de bloquear con Tween-20 0,5 % (en PBS), se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente hu4D5Fabv8-TioFab-Fago (2x1010 particulas de fago) biotinilado y no biotinilado seguido de incubacion con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rabano (HRP) (proteina de la cubierta del fago anti-M13, anticuerpo anti-proteina pVIII). La Figura 8 ilustra el Ensayo PHESELECTOR mediante una representacion esquematica que representa la union de Fab o TioFab a HER2 (arriba) y TioFab biotinilado a estreptavidina (abajo).
Se llevo a cabo la reaccion con HRP estandar y la absorbancia se midio a 450 nm. La reactividad del tiol se midio mediante el calculo de la relacion entre la DO450 para estreptavidina/DO450 para HER2. Un valor de la reactividad del tiol de 1 indica biotinilacion completa del tiol de la cisteina. En el caso de las mediciones de union a proteinas Fab, se utilizo hu4D5Fabv8 (2-20 ng) seguido por incubacion con anticuerpos anti-Fab policlonales de cabra marcados con HRP.
Ejemplo 3a - Expresion y purification de TioFabs
Los TioFabs se expresaron despues de la induction de 34B8, una cepa de E. coli no supresora (Baca et al (1997) Journal of Biological Chemistry 272 (16):10678-84). El sedimento celular cosechado se resuspendio en PBS (solution salina tamponada con fosfato), la lisis total de celulas se llevo a cabo mediante el paso a traves de un microfluidizador y los TioFabs se purificaron por cromatografia de afinidad con proteina G SEPHAROSE™ (Amersham).
Los TioFabs L-V15C, L-V110C, H-A88C, y H-A121C se expresaron y se purificaron por cromatografia en columna de Proteina G-SEPHAROSE™. El Fab oligomerico estaba presente en las fracciones 26 a 30 y la mayoria de la forma monomerica estaba en las fracciones 31-34. Las fracciones que consisten en la forma monomerica se agruparon y se analizaron por SDS-PAGE junto con hu4D5Fabv8and de tipo silvestres y se analizaron en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras (con DTT o BME) y no reductoras (sin TDT o BME). Las fracciones de filtracion en gel de A121C-TioFab se analizaron en SDS-PAGE no reductora.
Los TioFabs se conjugaron con biotina-PEO-maleimida como se ha descrito anteriormente y los TioFab biotinilados se purificaron adicionalmente por cromatografia de filtracion en gel Superdex-200™ (Amersham), que elimino la biotina-PEO-maleimida libre y la fraction oligomerica de TioFabs. Se incubaron por separado hu4D5Fabv8 de tipo silvestre y hu4D5Fabv8 A121C-TioFab (en cantidad de 0,5 mg) y se incubaron por separado con un exceso de 100 veces molar de biotina-PEO-maleimida durante 3 horas a temperatura ambiente y se cargaron en una columna de filtracion en gel Superdex-200 para separar la biotina libre asi como los Fab oligomericos de la forma monomerica.
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Los fragmentos de la digestion enzimatica de TioFab hu4D5Fabv8 (A121C) biotinilado y hu4D5Fabv8 de tipo silvestre se analizaron mediante cromatografla llquida-espectrometrla de masas de ionizacion por electronebulizacion (LS-ESI-MS). La diferencia entre el la masa primaria 482.945 de hu4D5Fabv8 biotinilado (A121C) y la masa primaria 47.737,0 de hu4D5Fabv8 de tipo silvestre era 557,5 unidades de masa. Este fragmento indica la presencia de un unico resto de biotina-PEO-maleimida (C23H36N5O7S2). La Tabla 4 muestra la asignacion de los valores de fragmentacion que confirma la secuencia.
Tabla 4. Analisis LC-ESI-Espectrometrla de masas de TioFab hu4D5Fabv8 A121C biotinilado despues de la digestion con tripsina____________________________________________________________
Aminoacido
Fragmento b Fragmento y
A (alanina)
72
M (metionina)
203 2505
D (acido aspartico)
318 2374
Y (tirosina)
481 2259
W (triptofano)
667 2096
G (glicina)
724 1910
Q (glutamina)
852 1853
G (glicina)
909 1725
T (treonina)
1010 1668
L (leucina)
1123 1567
V (valina)
1222 1454
T (treonina)
1323 1355
V (valina)
1422 1254
S (serina)
1509 1155
S (serina)
1596 1068
C (cistelna) + biotina
2242 981
S (serina)
2329 335
T (treonina)
2430 248
K (lisina)
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Antes y despues de filtracion en gel Superdex-200, se llevaron a cabo analisis de gel SDS-PAGE, con y sin reduccion por TDT o BME, de ABP- hu4D5Fabv8-A121C, ABP-hu4D5Fabv8-V110C biotinilado, ABP-hu4D5Fabv8- (V110C-A88C) doble cis biotilinado y ABP-hu4D5Fabv8- (V110C-A121C) doble cis biotilinado.
El analisis de espectroscopla de masas (MS/MS) de hu4D5Fabv8- (V110C)-BMPEO-DM1 (despues de la purificacion por filtracion en gel Superdex-200): Fab+1 516 075, Fab 50515.5. Estos datos muestran 91,2 % de conjugacion. Analisis de MS/MS de hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1 (reducido): LC 23447,2, 24537,3 LC+1, HC (Fab) 27072,5. Estos datos muestran que todos los DM1 esta en la cadena ligera del Fab.
Ejemplo 4 - Preparacion de ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAE mediante la conjugacion de ABP-hu4D5Fabv8- (V110C) y MC-MMAE
El reactivo enlazador del farmaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), es decir MC-MMAE, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a una concentracion conocida y se anade a TioFab ABP-hu4D5Fabv8- (V110C) refrigerado en solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Despues de aproximadamente una hora, se anade un exceso de maleimida para detener la reaccion e inactivar cualquier grupo tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reaccion se concentra por ultrafiltracion centrlfuga y ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAE se purifica y desala mediante elucion a traves de resina G25 en PBS, se filtra a traves de filtros de 0,2 pm en condiciones esteriles y se congela para su almacenamiento.
Ejemplo 5 - Preparacion de ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAF por conjugacion de ABP-hu4D5Fabv8-(V110C) y MC-MMAF
ABP-hu4D5Fabv8-(V110C)-MC-MMAF se prepara por conjugacion de Tio Fab ABP-hu4D5Fabv8-(V110C) y MC- MMAF siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 6 - Preparacion de ABP-A121C-TioFab-MC-val-cit-PAB-MMAE mediante la conjugacion de ABP-A121C- TioFab y MC-val-cit-PAB-MMAE
ABP-hu4D5Fabv8-(A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAE se prepara mediante la conjugacion de ABP-hu4D5Fabv8- (A121C) y MC-val-cit-PAB-MMAE siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
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Ejemplo 7 - Preparacion de ABP-A121C-TioFab-MC-val-cit-PAB-MMAF por coniuaacion de ABP-A121C-TioFab y MC-val-cit-PAB-MMAF
ABP-hu4D5Fabv8-(A121C)-MC-val-cit-PAB-MMAF se prepara mediante la conjugacion de ABP-hu4D5Fabv8- (A121C) y MC-val-cit-PAB-MMAF siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
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Eiemplo 8 - Preparacion de TioFab hu4D5Fabv8-(V110C)-BMPEO-DM1
La cistelna libre del TioFab hu4D5Fabv8-(V110C) se modifico mediante el reactivo bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), dejando un grupo maleimido sin reaccionar en la superficie del anticuerpo. Esto se logro mediante la disolucion de Bm(PEO)4 en una mezcla de etanol 50 %/agua a una concentracion de 10 mM y anadiendo un exceso molar de diez veces de BM(PEO)4 a una solucion que contiene hu4D5Fabv8-(V110C) TioFab en solucion salina tamponada con fosfato a una concentracion de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolar) y permitiendo que reaccione durante 1 hora. El exceso de BM(PEO)4 se elimino por filtracion en gel (columna HiTrap, Pharmacia) en citrato 30 mM, pH 6 con tampon de NaCl 150 mM. Se anadio un exceso molar de aproximadamente 10 veces de DM1 disuelto en dimetilacetamida (DMA) al intermedio hu4D5Fabv8- (V110C) TioFab-BMPEO. Tambien se puede emplear dimetilformamida (DMF) se puede emplear tambien para disolver el reactivo resto de farmaco. La mezcla de reaccion se dejo reaccionar durante la noche antes de la filtracion en gel o dialisis en PBS para eliminar el farmaco no reaccionado. La filtracion en gel en columnas S200 en PBS se utilizo para eliminar los agregados de alto peso molecular y proporcionar hu4D5Fabv8-(V110C) TioFab-BMPEO-DM1 purificado.
Siguiendo el mismo protocolo, se preparo hu4D5Fabv8 (A121C) TioFab-BMPEO-DM1.
Eiemplo 9 - Ensayo de proliferacion celular in vitro
La eficacia de los ADC se midio mediante un ensayo de proliferacion celular que emplea el protocolo siguiente (Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo, Promega Corp. Boletln Tecnico TB288; Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62: 5485-5488):
1. Una allcuota de 100 ql de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 celulas (SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en medio se deposito en cada pocillo de una placa de paredes opacas de 96 pocillos.
2. Se prepararon pocillos de control que contienen el medio y sin celulas.
3. Se anadio ADC a los pocillos experimentales y se incubo durante 3-5 dlas.
4. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5. Se anadio un volumen de reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocillo.
6. El contenido se mezclo durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
7. La placa se incubo a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la senal de luminiscencia.
8. La luminiscencia se registro y se registro en los graficos como RLU = unidades relativas de luminiscencia.
Determinadas celulas se siembran a razon de 1.000-2.000/pocillo (llneas PC3) o 2.000-3.000/pocillo (OVCAR-3) en una placa de 96 pocillos, 50 ql/ pocillo. Despues de uno (PC3) o dos (OVCAR-3) dlas, se anaden ADC en volumenes de 50 ql hasta una concentracion final de 9.000, 3.000, 1.000, 333, 111, 37, 12,4, 4,1 o 1,4 ng/ml, donde los pocillos de control "sin ADC" solo recibieron medio. Las condiciones son por duplicado o triplicado. Despues de 3 (PC3) o 4-5 (OVCAR-3) dlas, se anaden 100 ql/pocillo de Cell TiterGlo II (ensayo basado en luciferasa; proliferacion medida por los niveles de ATP) y los recuentos celulares se determinan usando un luminometro. Los datos se representan como la media de la luminiscencia para cada conjunto de replicados, con barras del error de la desviacion estandar. El protocolo es una modificacion del Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo (Promega):
1. Sembrar 1.000 celulas/pocillo de PC3/MUC16, PC3/neo (en 50 ql/pocillo) de medios. Las celulas OVCAR3 deben colocarse en placas a razon de 2.000 celulas/pocillo (en 50 ql) de sus medios de comunicacion (recetas a continuacion). Permitir que las celulas se unan durante la noche.
2. El ADC se diluyo en serie 1:3 en los medios comenzando con una concentracion de trabajo de 18 qg/ml (esto
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da como resultado una concentration final de 9 |jg/ml). Se anaden 50 |jl de ADC diluido a los 50 |jl de celulas y los medios ya existentes en el pocillo.
3. Incubar 72-96 horas (el patron es de 72 horas, pero observar la concentracion de 0 jig/ml para detener el ensayo cuando las celulas muestran una confluencia del 85 al 95 %).
4. Anadir 100 pl/pocillo de reactivo Promega Cell Titer Glo, agitar 3 min. y leer en los medios del luminometro: PC3/neo y PC3/MUC16 cultivadas en 50/50/FBS 10 %/glutamina/250 pg/ml de G-3-4180VCAR cultivada en RFMI/FBS 20 %/glutamina.
Ejemplo 10 - Inhibition del crecimiento tumoral, eficacia in vivo en explantes de ratones transgenicos con niveles altos de expresion de HER2
Los animales adecuados para experimentos transgenicos se pueden obtener de fuentes comerciales estandar tales como Taconic (Germantown, N.Y.). Muchas razas son adecuadas, pero se prefieren los ratones hembra FVB debido a su mayor susceptibilidad a la formation de tumores. Se usaron machos FVB para el apareamiento y se utilizaron sementales CD.1 vasectomizados para estimular la seudogestacion. Los ratones vasectomizados se pueden obtener de cualquier proveedor comercial. Los fundadores fueron cruzados con ratones FVB o con ratones heterocigotos129/BL6 x FVB p53. Los ratones con la heterocigosidad en alelo p53 se utilizaron para aumentar potencialmente la formacion de tumores. Sin embargo, esto ha demostrado ser innecesario. Por lo tanto, algunos tumores F1 son de raza mixta. Los tumores fundadores son FVB solamente. Se obtuvieron seis fundadores con algunos tumores en desarrollo sin tener camadas.
Los animales que tienen tumores (aloinjerto propagado de ratones transgenicos Fo5 mmtv) fueron tratados con una dosis unica o multiple por inyeccion IV de ADC. El volumen del tumor se evaluo en diversos puntos temporales despues de la inyeccion.
Los tumores surgen facilmente en ratones transgenicos que expresan una forma mutacionalmente activada de neu, el homologo en rata de HER2, pero HER2 que se sobreexpresa en los canceres de mama humanos no esta mutada y la formacion de tumores es mucho menos robusta en los ratones transgenicos que en la HER2 no mutado sobreexpresada (Webster et al (1994) Semin. Cancer Biol 5: 69-76).
Para aumentar la formacion de tumores con HER2 no mutada, los ratones transgenicos se produjeron usando un plasmido de ADNc de HER2 en el que se elimino un ATG en direction 3' con el fin de evitar la initiation de la traduction en dichos codones ATG en direccion 3', lo que de otro modo reducirla la frecuencia de iniciacion de la traduction del autentico codon de iniciacion en direccion 5' de HER2 (por ejemplo, vease Child et al (1999) J. Biol. Chem. 274:24335-24341). Ademas, se anadio un intron quimerico al extremo 5', que tambien deberla aumentar el nivel de expresion como se ha descrito anteriormente (Neuberger y Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6713; Buchman y Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 4395; Brinster et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 836). El intron quimerico se derivo de un vector Promega, vector de expresion de mamlfero Pci-neo (pb 890-1022). El extremo 3 ' del ADNc esta flanqueado por los exones 4 y 5 de la hormona del crecimiento humana y secuencias de poliadenilacion. Ademas, se utilizaron ratones FVB porque esta raza es mas susceptible al desarrollo de tumores. Se utilizo el promotor de MMTV-LTR para asegurar la expresion de HER2 especlfica de tejido en la glandula mamaria. Los animales fueron alimentados con la dieta AIN 76A con el fin de aumentar la susceptibilidad a la formacion de tumores (Rao et al (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158).
Ejemplo 11 - Reduccion/oxidacion de TioMabs para la conjugation
Los anticuerpos monoclonales modificados por ingenierla genetica con cistelna de longitud completa (TioMab) expresados en celulas CHO se redujeron con aproximadamente un exceso de 50 veces de TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem Vol 273: 73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) durante 3 horas a 37 °C. El TioMab reducido (Figura 15) se diluyo y se cargo en una columna HiTrap S en acetato de sodio 10 mM, pH 5 y se eluyo con PBS que contenla cloruro de sodio 0,3 M. El TioMab eluido reducido se trato con sulfato de cobre acuoso (CuSO4) 200 nM a temperatura ambiente, durante la noche. La oxidation del aire ambiental tambien fue eficaz.
Ejemplo 12 - Conjugacion de TioMabs
Los TioMabs reoxidados del Ejemplo 11, incluyendo tio-trastuzumab (A121C), tio-2H9 (A121C) y tio-3A5 (A121C), se combinaron con un exceso de 10 veces de intermedio de farmaco-enlazador, BM(PEO)4-DM1, se mezclo y se dejo reposar durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente para efectuar la conjugacion y formar los conjugados anticuerpo TioMab-farmaco, incluyendo tio-trastuzumab (A121C)-BMPEO-DM1, tio-2H9 (A121C)- BMPEO-DM1 y tio-3A5 (A121C)-BMPEO-DM1. La mezcla de conjugacion se filtro en gel o se cargo y se eluyo a traves de una columna HiTrap S para eliminar el exceso de intermedio de farmaco-enlazador y otras impurezas.
La presente invention no esta limitada en su alcance por las realizaciones especlficas divulgadas en los ejemplos que se pretenden como ilustraciones de unos pocos aspectos de la invencion y cualquier realization que sea funcionalmente equivalente esta dentro del alcance de esta invencion.

Claims (49)

  1. 5
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    15
    20
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    30
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    1. Un proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna, que comprende uno o mas aminoacidos cistelna libres que tienen un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0 y una secuencia en la cadena pesada seleccionada de las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42:
    NSLRCEDTAV
    (SEQ ID NO:10)
    LVTVCSASTKGPS
    (SEQ ID NO:11)
    LVTVSSCSTKGPS
    (SEQ ID NO:13)
    LVTVSSACTKGPS
    (SEQ ID NO:14)
    HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR
    (SEQ ID NO:31)
    YKCKVCNKALP
    (SEQ ID NO:34)
    KGFYPCDIAVE
    (SEQ ID NO:37)
    PPVLDCDGSFF
    (SEQ ID NO:38)
    GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL
    (SEQ ID NO:42)
    donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42 es el aminoacido cistelna libre o una secuencia en la cadena ligera seleccionada de las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27:
    SLSASCGDRVT
    (SEQ ID NO:17)
    EIKRTCAAPSV
    (SEQ ID NO:19)
    TCAAPCVFIFPP
    (SEQ ID NO:20)
    FIFPPCDEQLK
    (SEQ ID NO:21)
    DEQLKCGTASV
    (SEQ ID NO:22)
    WKVDNCLQSGN
    (SEQ ID NO:24)
    ALQSGCSQESV
    (SEQ ID NO:25)
    GLSSPCTKSFN
    (SEQ ID NO:27)
    donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27 es el aminoacido cistelna libre; en donde el proceso comprende sustituir uno o mas residuos de aminoacidos de un anticuerpo parental con el residuo de aminoacido cistelna libre, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antlgeno y el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se une selectivamente al mismo antlgeno que el anticuerpo parental; y en donde el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna es un anticuerpo humano, quimerico o humanizado.
  2. 2. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 1 preparado mediante un proceso que comprende:
    (i) mutagenizar una secuencia de acido nucleico que codifica el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna;
    (ii) expresar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna; y
    (iii) aislar y purificar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna.
  3. 3. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 2, que comprende ademas:
    (i) hacer reaccionar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna con un reactivo de afinidad que reacciona con tiol para generar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad; y
    (ii) medir la union del anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad a un medio de captura.
  4. 4. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 3, en el que el reactivo de afinidad que reacciona con tiol comprende un resto biotina y un resto maleimida.
  5. 5. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 3, en el que el medio de captura comprende estreptavidina.
  6. 6. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo parental es una protelna de fusion que comprende el peptido de union a albumina (ABP) seleccionado de CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 1), QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 2), QRLIEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 3), RLIEDICLPRWGCLWEDD (SEQ ID NO: 4) y DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 5).
  7. 7. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo parental se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un
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    anticuerpo biespecifico y un fragmento de anticuerpo.
  8. 8. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 7, en el que el anticuerpo parental se selecciona de huMAb4D5-8 (trastuzumab), un anticuerpo anti-EphB2R y un anticuerpo anti-MUC16.
  9. 9. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de:
    SEQ ID NO:6:
    evqlvesggglvqpggslrlscaasgfnikdtyihwvrqapgkglewvariyptngytry
    ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRCEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYTPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
    GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
    PSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYXTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK, o
    SEQ ID NO:7:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTY1HWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRY
    ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
    CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
    GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
    PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
    STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
    MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
    QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGIC, o
    SEQ ID NO:8:
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC, o
    SEQ ID NO:28:
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFINPSTGYTDY
    NQKFKDRFT1SADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRPKIPRHANVFWGQGTLVTVSS
    CSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
    GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
    PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
    STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
    MTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
    QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK,
    y SEQ ID NO:39:
    DVQLQESGPGLVNPSQSLSLTCTVTGYSITNDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYINYSGYTTY
    NPSLKSRISITRDTSKNQFFLHLNSVTTEDTATYYCARWDGGLTYWGQGTLVTVSACSTK
    GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
    LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF
    LFPPKPKDTLM1SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
    WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN
    QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
    WSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
  10. 10. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo parental es un anticuerpo intacto seleccionado de IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
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  11. 11. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 10, en el que la IgG se selecciona de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
  12. 12. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o 10-11, en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna o el anticuerpo parental se unen a uno o mas receptores (1)-(36):
    (1) BMPR1B (receptor de la protelna morfogenetica osea tipo IB);
    (2) E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3) STEAP1 (antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata);
    (4) 0772P (CA125, MUC16);
    (5) MPF (MPF, MSLN, SmR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina);
    (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de vehlculos de soluto 34 (fosfato sodico), miembro 2, vehlculo de fosfato dependiente de sodio tipo II 3b);
    (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmatico corto, (semaforina) 5B);
    (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN gen 2700050C12);
    (9) ETBR (receptor de endotelina tipo B);
    (10) MSG783 (RNF124, protelna hipotetica FLJ20315);
    (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen asociado al cancer de prostata 1, protelna asociada al cancer de prostata 1, antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata 2, protelna de la prostata de seis dominios transmembrana);
    (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal cationico de potencial de receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4);
    (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);
    (14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein Barr) o Hs.73792);
    (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (inmunoglobulina beta asociada), B29);
    (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SpAp1A (protelna 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);
    (17) HER2;
    (18) NCA;
    (19) MDP;
    (20) IL20Ra;
    (21) Brevican;
    (22) EphB2R;
    (23) ASLG659;
    (24) PSCA;
    (25) GEDA;
    (26) BAFF-R (receptor del factor de activacion de linfocitos B, receptor BLyS 3, BR3);
    (27) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B);
    (28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa asociada, una protelna especlfica de linfocitos B que interacciona covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moleculas de IgM, transduce una senal implicada en la diferenciacion de linfocitos B);
    (29) CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la protelna G que se activa por la quimiocina CXCL13, interviene en la migracion de linfocitos y en la defensa humoral, desempena un papel en la infeccion por VIH-2 y quizas en el desarrollo del SIDA, linfoma, mieloma y leucemia);
    (30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molecula MHC de clase II (antlgeno Ia) que une los peptidos y los presenta a los linfocitos T CD4+);
    (31) P2X5 (canal ionico activado por ligando del receptor purinergico P2X 5, canal ionico activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmision sinaptica y la neurogenesis, cuya deficiencia puede contribuir a la fisiopatologla de la inestabilidad idiopatica del detrusor);
    (32) CD72 (antlgeno de diferenciacion de linfocitos B CD72, Lyb-2);
    (33) LY64 (antlgeno linfocitario 64 (RP105), protelna de membrana tipo I de la familia de protelnas con repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activacion de linfocitos B y la apoptosis, la perdida de funcion esta asociada a una mayor actividad en pacientes con lupus eritematoso sistemico);
    (34) FcRH1 (protelna de tipo receptor Fc 1, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene los dominios similares a Ig tipo C2 e ITAM, puede tener un papel en la diferenciacion de linfocitos B);
    (35) IRTA2 (receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas asociado con la translocacion, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de los linfocitos B y la linfomagenesis; en algunas neoplasias de linfocitos B se produce alteracion de la desregulacion del gen mediante translocacion); y
    (36) TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con familia EGF/heregulina de los factores de crecimiento y folistatina).
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  13. 13. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo esta unido covalentemente a un marcador de captura, un marcador de deteccion o un soporte solido.
  14. 14. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo esta unido covalentemente a un marcador de deteccion que es un colorante fluorescente seleccionado de un tipo de fluorescelna, un tipo de rodamina, dansilo, Lissamina, una cianina, una ficoeritrina, rojo Texas y un analogo de los mismos.
  15. 15. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo esta unido covalentemente a un marcador de deteccion radionuclido seleccionado de 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At y 213Bi.
  16. 16. El proceso para producir un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna de la reivindicacion 13, en el que el anticuerpo esta unido covalentemente a un marcador de deteccion mediante un ligando quelante seleccionado de DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA y TETA.
  17. 17. Un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco que comprende un anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna, que comprende un aminoacido cistelna libre que tiene un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0,6 a 1,0 y un resto de farmaco (D) seleccionado de un maitansinoide, una auristatina, una dolastatina y una caliqueamicina, en donde el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna esta unido a traves de uno o mas aminoacidos de cistelna libres mediante un resto enlazador (L) a D; teniendo el compuesto la Formula I:
    Ab-(L-D)p I
    donde p es 1, 2, 3 o 4; y en donde el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se prepara mediante un proceso que comprende sustituir uno o mas residuos de aminoacidos de un anticuerpo parental con el uno o mas aminoacidos cistelna libres, donde el anticuerpo parental se une selectivamente a un antlgeno y el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se une selectivamente al mismo antlgeno que el anticuerpo parental, en donde el compuesto conjugado anticuerpo-farmaco comprende:
    una o mas secuencias en la cadena pesada seleccionadas de las SEQ ID NOS: 10, 11, 13;
    42:
    NSLRCEDTAV
    LVTVCSASTKGPS
    LVTVSSCSTKGPS
    LVTVSSACTKGPS
    HEDPEVKFNWYVDGCEVHNAKTKPR
    YKCKVCNKALP
    KGFYPCDIAVE
    PPVLDCDGSFF
    GQGTLVTVSACSTKGPSVFPL
    (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 42)
    14, 31, 34, 37, 38 y
    donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 10, 11, 13, 14, 31, 34, 37, 38 y 42 es el aminoacido cistelna libre; o una o mas secuencias en la cadena ligera seleccionadas de las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27:
    SLSASCGDRVT
    EIKRTCAAPSV
    TCAAPCVFIFPP
    FIFPPCDEQLK
    DEQLKCGTASV
    WKVDNCLQSGN
    ALQSGCSQESV
    GLSSPCTKSFN
    (SEQ ID NO:17) (SEQ ID NO:19) (SEQ ID NO:20) (SEQ ID NO:21) (SEQ ID NO:22) (SEQ ID NO:24) (SEQ ID NO:25) (SEQ ID NO:27)
    donde la cistelna en las SEQ ID NOS: 17, 19, 20, 21, 22, 24, 25 y 27 es el aminoacido cistelna libre, y en donde el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna es un anticuerpo humano, quimerico o humanizado.
  18. 18. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se prepara mediante un proceso que comprende:
    (a) sustituir uno o mas residuos de aminoacidos de un anticuerpo parental con cistelna y
    (b) determinar la reactividad del tiol del anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna haciendo reaccionar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna con un reactivo que reacciona con tiol;
    en donde el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna es mas reactivo que el anticuerpo parental
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    con el reactivo que reacciona con tiol.
  19. 19. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, que comprende ademas una secuencia de un peptido de union a albumina (ABP) seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
  20. 20. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna se une a un receptor de ErbB seleccionado de EGFR, HER2, HER3 y HER4.
  21. 21. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna o el anticuerpo parental se une a uno o mas de los receptores (1)-(36):
    (1) BMPR1B (receptor de la protelna morfogenetica osea tipo 1B);
    (2) E16 (LAT1, SLC7A5);
    (3) STEAP1 (antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata);
    (4) 0772P (CA125, MUC16);
    (5) MPF (MPF, MSLN, SmR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina);
    (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia de vehlculos de soluto 34 (fosfato sodico), miembro 2, vehlculo de fosfato dependiente de sodio tipo II 3b);
    (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de trombospondina (tipo 1 y similar a tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplasmatico corto, (semaforina) 5B);
    (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN gen 2700050C12);
    (9) ETBR (receptor de endotelina tipo B);
    (10) MSG783 (RNF124, protelna hipotetica FLJ20315);
    (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen asociado al cancer de prostata 1, protelna asociada al cancer de prostata 1, antlgeno epitelial de seis dominios transmembrana de la prostata 2, protelna de la prostata de seis dominios transmembrana);
    (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal cationico de potencial de receptor transitorio, subfamilia M, miembro 4);
    (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma);
    (14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein Barr) o Hs.73792);
    (15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (inmunoglobulina beta asociada), B29);
    (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SpAp1A (protelna 1a de anclaje de fosfatasa que contiene el dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C);
    (17) HER2;
    (18) NCA;
    (19) MDP;
    (20) IL20Ra;
    (21) Brevican;
    (22) EphB2R;
    (23) ASLG659;
    (24) PSCA;
    (25) GEDA;
    (26) BAFF-R (receptor del factor de activacion de linfocitos B, receptor BLyS 3);
    (27) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B);
    (28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa asociada, una protelna especlfica de linfocitos B que interacciona covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moleculas de IgM, transduce una senal implicada en la diferenciacion de linfocitos B);
    (29) CXCR5 (receptor del linfoma de Burkitt 1, un receptor acoplado a la protelna G que se activa por la quimiocina CXCL13, interviene en la migracion de linfocitos y en la defensa humoral, desempena un papel en la infeccion por VIH-2 y quizas en el desarrollo del SIDA, linfoma, mieloma y leucemia);
    (30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molecula MHC de clase II (antlgeno Ia) que une los peptidos y los presenta a los linfocitos T CD4+);
    (31) P2X5 (canal ionico activado por ligando del receptor purinergico P2X 5, canal ionico activado por ATP extracelular, puede estar implicado en la transmision sinaptica y la neurogenesis, cuya deficiencia puede contribuir a la fisiopatologla de la inestabilidad idiopatica del detrusor);
    (32) CD72 (antlgeno de diferenciacion de linfocitos B CD72, Lyb-2);
    (33) LY64 (antlgeno linfocitario 64 (RP105), protelna de membrana tipo I de la familia de protelnas con repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activacion de linfocitos B y la apoptosis, la perdida de funcion esta asociada a una mayor actividad en pacientes con lupus eritematoso sistemico);
    (34) FcRH1 (protelna de tipo receptor Fc 1, un supuesto receptor del dominio Fc de inmunoglobulina que contiene los dominios ITAM y similares a Ig tipo C2, puede tener un papel en la diferenciacion de linfocitos B);
    (35) IRTA2 (receptor 2 de la superfamilia de inmunoglobulinas asociado a la translocacion, un supuesto inmunorreceptor con posibles papeles en el desarrollo de los linfocitos B y la linfomagenesis; en algunas
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    neoplasias de linfocitos B se produce alteracion de la regulacion del gen mediante translocacion) y
    (36) TENB2 (supuesto proteoglicano transmembrana, relacionado con familia EGF/heregulina de los factores de
    crecimiento y folistatina).
  22. 22. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que p es 1 o 2.
  23. 23. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que L tiene la formula:
    -Aa-Ww-Yy-
    donde:
    A es una unidad de estirador covalentemente unida a un tiol de la cistelna del anticuerpo (Ab) modificado por ingenierla genetica con cistelna; a es 0 o 1;
    cada W es independientemente una unidad de aminoacido; w es un numero entero que oscila de 0 a 12;
    Y es una unidad espaciadora covalentemente unida al resto de farmaco e y es 0, 1 o 2.
  24. 24. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 23 que tiene la formula:
    imagen1
    donde PAB es para-aminobencilcarbamollo y R17 es un radical divalente seleccionado de (CH2)r, carbociclilo C3-C8, O-(CH2)n, arileno, (CH2)r-arileno, -arileno-(cH2)r-, (CH2)r-(carbociclilo C3-C8), (carbociclilo C3-C8)-(CH2)r, heterociclilo C3-C8, (CH2)r-(heterocicliclo C3-C8), -(heterociclilo C3-C8)-(CH2)r-, -(CH2)rC(O)NRb-(CH2)r-, -(CH2CH2OV-,
    -(CH2CH2O)r-CH2-, -(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2)rC-(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-,
    -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-, -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2- y -(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-; donde Rb es H, alquilo C1-C6, fenilo o bencilo; y r es independientemente un numero entero que oscila de 1 a 10.
  25. 25. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 24, en el que Ww es valina-citrulina.
  26. 26. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 24, en el que R17 es (CH2)5 o (CH2)2.
  27. 27. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 24 que tiene la formula:
    imagen2
  28. 28. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 27, en el que R17 es (CH2)5 o (CH2)2.
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen3
  29. 30. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que L esta formado por el reactivo enlazador SmCC o BMPEO.
  30. 31. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el resto de farmaco D se selecciona de un inhibidor de la microtubulina, un inhibidor de la mitosis, un inhibidor de la topoisomerasa y un intercalador de ADN.
  31. 32. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el resto de farmaco D se selecciona de un maitansinoide, una auristatina, una dolastatina y una caliqueamicina.
  32. 33. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que D es MMAE, que tiene la estructura:
    imagen4
    donde la llnea ondulada indica el sitio de union al enlazador L.
  33. 34. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que D es MMAF, que tiene la estructura:
    imagen5
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen6
    o DM4, que tiene la estructura:
    imagen7
    donde la llnea ondulada indica el sitio de union al enlazador L.
  34. 36. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo parental se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespeclfico y un fragmento de anticuerpo.
  35. 37. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo parental se selecciona de huMAb4D5-8 (trastuzumab), un anticuerpo anti-ErbB2, un anticuerpo anti-EphB2R, un anticuerpo anti- CD22 y un anticuerpo anti-MUC16.
  36. 38. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, en el que el anticuerpo parental es un anticuerpo intacto seleccionado de IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
  37. 39. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 38, en el que la IgG se selecciona de las subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
  38. 40. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17 que tiene la estructura:
    imagen8
    en la que n es 0, 1 o 2 y Ab es un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna.
    5 41. El compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de la reivindicacion 17, seleccionado de las estructuras:
    10
    imagen9
    imagen10
    imagen11
    imagen12
    y
    15 en las que Val es valina y Cit es citrulina.
  39. 42. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 41 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y un diluyente, un vehlculo o un excipiente farmaceuticamente aceptables.
    20
  40. 43. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 42 que comprende ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente quimioterapeutico adicional.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  41. 44. Uso del compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 41, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
  42. 45. Un compuesto conjugado anticuerpo-farmaco de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 41, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en un metodo para el tratamiento del cancer.
  43. 46. Un metodo de cribado de anticuerpos modificados por ingenierla genetica con cistelna para la reactividad del tiol, que comprende:
    (a) introducir uno o mas aminoacidos de cistelna en un anticuerpo parental con el fin de generar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna;
    (b) hacer reaccionar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna con un reactivo de afinidad que reacciona con tiol para generar un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad, en donde el reactivo de afinidad que reacciona con tiol comprende un resto de biotina y
    (c) medir la union del anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna marcado por afinidad a un medio de captura, en donde el medio de captura comprende estreptavidina, comprendiendo el metodo ademas determinar la reactividad del tiol del anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna con el reactivo que reacciona con tiol.
  44. 47. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 46, en el que la etapa (a) del proceso comprende:
    (i) la mutagenesis dirigida al sitio de un gen que codifica el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna en un plasmido bicatenario (ds) y
    (ii) expresar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna.
  45. 48. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 47, que comprende ademas aislar y purificar el anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna expresado.
  46. 49. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 46, en el que el reactivo que reacciona con tiol comprende un resto maleimida.
  47. 50. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 46, en el que el anticuerpo parental es una protelna de fusion que comprende un peptido de union a albumina (ABP).
  48. 51. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 50, en el que el ABP comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
  49. 52. El metodo de cribado de acuerdo con la reivindicacion 46, en el que el anticuerpo parental es un fragmento de anticuerpo Fab.
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