CN101688229B - 包含egfr抗体和src抑制剂的组合物及其在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及EGFR介导的疾病，尤其是癌症的治疗，其通过以联合或同时方式抑制或阻断EGFR和src来进行。本发明涉及癌症，尤其是EGFR介导的疾病的治疗、预防或调节，其用一种或多种EGFR调节剂和src抑制剂的联合进行。本发明还涉及用抗EGFR抗体和src抑制剂进行的癌症治疗。描述了用抗体抗EGFR mAb806与一种或多种src抑制剂以联合或连续方式进行癌症治疗的方法和组合物。

Description

包含EGFR抗体和SRC抑制剂的组合物及其在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途
发明领域
本发明涉及EGFR介导的疾病，尤其癌症的治疗。提供了使用EGFR调节剂，尤其EGFR抗体和scr抑制剂的联合治疗癌症的方法。提供了MAb806抗体和scr抑制剂的方法和联合制剂。 
发明背景 
靶向癌症治疗设计用于破坏癌症发生和肿瘤生长所需的特定分子的功能，从而杀伤或阻止癌细胞的生长(Ji H等人(2006)Cell Cycle 5(18)：2072-2076 Equb 2006年9月15日)。与传统的细胞毒性化疗相对比，此类靶向癌症治疗可能更有效并且对正常细胞损害较小。靶向癌症治疗领域的主要努力方向是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的药剂的开发。EGFR是密切相关的受体ErbB家族的成员，该家族包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR的激活导致受体酪氨酸激酶的激活和介导下列过程的一系列下游信号事件：细胞增殖、迁移、粘附、侵袭、对化疗的抗性以及凋亡抑制、对癌细胞持续增殖和存活关键的过程。 
由于EGFR vIII突变体受体的表达受限于肿瘤细胞，它代表了高度特异性的抗体治疗靶标。因此，制备了对独特的肽de2-7EGFR有特异性的多克隆和单克隆抗体。在用独特的de2-7EGFR肽免疫之后分离的一系列小鼠mAb都显示出在裸鼠中对平截受体和靶向的de2-7EGFR阳性异种移植物(xenograft)生长的选择性和特异性(Wikstrand CJ等人(1995)Cancer Res 55：3140-3148；Okamoto，S等人(1996)Br J Cancer73：1366-1372；Hills D等人(1995)Int J Cancer 63：537-543；Reist CJ等人(1997)Cancer Res 57：1510-1515；Reist CJ等人(1995)Cancer Res55：4375-4382；美国专利5,401,828)。抗EGFR vIII抗体的实例包括ABX-EGF(帕尼单抗(panitumumab))、DH8.3、L8A.4和Y10。 
MAb806是新的鼠抗体，它最初使用表达EGFR vIII突变体的整个细 胞作为免疫原制备以识别独特的平截突变体EGFRvIII。重要的是，mAb806所识别的表位在无活性的野生型(wt)EGFR中不易接近，但是在过量表达EGFR和表达EGFRvIII的细胞中以过渡形式的wt EGFR暴露。MAb806结合EGFRvIII/Δ2-7EGFR突变体中存在或可用的表位，但是识别与突变体的连接肽LEEKKGNYVVTDH不同的表位。表位研究得到免疫组织化学研究的支持，该研究证明了806抗体结合胶质瘤以及多种表皮癌症中存在的表位，但是不结合正常人组织。这些和其他的临床前期数据表明mAb806可能具有与西妥昔单抗(cetuximab)和其他抗EGFR抗体不同的临床活性谱和副作用特征。在异种移植物模型中，mAb806显示出有效的抗肿瘤活性而不靶向正常组织。因此mAb806独特的靶向能力代表着癌症特异性分子靶向治疗的新范例。 
非受体蛋白酪氨酸Src是60-kDa蛋白，它是包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、Fgr、Blk和Yrk的9基因家族的一个成员，其在一些细胞过程的调节中起关键作用，如增殖、分化、迁移、粘附、侵袭、血管发生和免疫功能(Yeatman YJ.(2004)Nat Rev Cancer 4(6)：470-80；FrameMC.(2004)J Cell Sci 117：989-98)。Src家族激酶含有一个保守性差的结构域和三个保守的Src同源结构域：SH2、SH3和SH1或蛋白酪氨酸激酶结构域。对Src调节很关键的是COOH-末端酪氨酸(Y530)，当其在被C末端Src激酶(Csk)磷酸化时会产生更多的无活性Src构象。Src根据输入信号而与许多蛋白相互作用。人们还认为它的活性构象通过Y530的去磷酸化和Y418的自磷酸化达成。Src还与结构和信号传导蛋白结合，所得的复合体对Src在多种细胞过程中的作用很关键。据报道Src在一些癌症中过量表达或异常激活，如结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、脑癌和血癌(Dehm SM和Bonham K(2004)Biochem Cell Biol 2004；82：263-74)。有几种已知的src小分子抑制剂，一些已经进入临床试验，例如达沙替尼(dasatinib)(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PD166326。 
临床上需要用于EGFR介导的疾病(包括癌症)的增强的、更有效的 并且更广泛的有效治疗方案。 
本文所引用的参考文献不应被被理解为承认它们是本发明的现有技术。 
发明内容
本发明涉及如下的发现：改变src表达或活性增强抗EGFR治疗的效力。具体地，改变src表达或活性显著增强抗EGFR抗体效力，尤其是mAb806抗体的活性。 
本发明涉及用于治疗癌症或其他EGFR介导的疾病的EGFR和src抑制剂的联合制剂。 
本发明还提供在哺乳动物中治疗EGFR介导的癌症的方法，其包括以联合、同时、或一个接另一个的连续方式给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体。在一个方面，所述src抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个方面，抗EGFR抗体是MAb806。 
在本发明方法的一具体实施方式中，抗EGFR抗体为mAb806抗体或其活性片段。MAb806包括鼠抗体、重组抗体或人源化抗体。 
EGFR介导的癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症和膀胱癌。所述癌症还可以选自结肠癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、脑癌和血癌。具体地，所述癌症可以是胶质瘤。 
本发明提供在哺乳动物中治疗癌症的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂和抗EGFR抗体同时、联合或一个接另一个连续给予。在本发明方法的一个方面，所述抗EGFR抗体是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体是mAb806或其活性片段。 
在本发明方法中，src抑制剂可以选自达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)和PD166326。 在本发明方法中，所述src抑制剂具体为酪氨酸激酶抑制剂。在本发明方法的具体实施方式中，所述src抑制剂为达沙替尼，抗EGFR抗体为mAb806。 
所述癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症、膀胱癌、结肠癌、黑素瘤、胃癌、胰腺癌、脑癌和血癌。 
本发明提供在哺乳动物中阻断或降低EGFR介导的癌症的肿瘤生长的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂和抗EGFR抗体同时、联合或一个接另一个连续给予。在一个具体的此种方法中，所述抗EGFR抗体是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。所述抗EGFR抗体尤其为mAb806或其活性片段。 
本发明提供在哺乳动物中阻断或降低EGFR介导的癌症的肿瘤生长的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体，其中所述src抑制剂为达沙替尼，所述EGFR抗体为mAb806。 
EGFR介导的癌症可以选自成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症和膀胱癌。 
本发明还提供在哺乳动物中增强抗EGFR抗体效力或活性的方法，其包括给予所述哺乳动物抗EGFR抗体和src抑制剂的联合制剂。所述src抑制剂可以选自达沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)和PD166326。所述抗EGFR抗体尤其为识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体为mAb806。 
本发明还涉及药物组合物，其包含在药物上可接受的载体或稀释剂中的抗EGFR抗体和一种或多种src抑制剂。所包括的组合物为其中抗EGFR抗体为识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测 不到的EGFR表位的抗体。在一个具体的这种方面，所述抗EGFR抗体为mAb806。 
对本领域的技术人员来说，其他目的和优点可以从参考下列例示性附图进行的下列说明综述将显而易见。 
附图简述 
图1：EGFR的示意性代表图。de2-7EGFR中缺失的胞外区域用括号标记。de2-7EGFR的死亡激酶形式在721位处含有单个点突变(K→M)。de2-7EGFR的DY2形式在残基1068和1173处具有Y→F突变，而DY5变体也具有这些取代基以及992、1086和1148取代基。 
图2：不同异种移植物对EGFR特异性抗体的敏感性。通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射3×106细胞而建立异种移植物。当异种移植物达到约100mm3的平均体积时开始抗体治疗。用1mg mAb 528(左栏)或mAb 806(右栏)处理小鼠2周，每周3次(即，共6次注射)。数据表示为平均肿瘤体积±SE。 
图3：U87MG基细胞系的异种移植物生长曲线。通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射3×106细胞建立异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积±SE。 
图4A和4B：U87MG.Δ2-7、U87M G.DK和U87M G.DY5细胞中de2-7EGFR变体的体外磷酸化。A、用mAb 806、mAb 528或不相关的同型匹配对照抗体免疫沉淀de2-7EGFR蛋白，并对所得样品进行免疫印迹。所有de2-7EGFR变体在Y1045处的磷酸化均为阳性，Y1045是与泛素化和降解相关的主要位点(上栏)。如所预测，de2-7EGFR在Y1173位处被组成性磷酸化，而DK和DY5变体在此位点均为磷酸化阴性(中栏)。用EGFR的兔c末端多克隆抗体确定EGFR的存在(下栏)。这种c末端抗体不识别DY5变体，因为DY5变体含有Y1068F突变，Y1068F证明是抗体结合的关键残基。因此，在(B)中总DY5蛋白的存在通过用mAb 806免疫印迹来确定。 
图5A-5D：表达高水平de2-7EGFR的U87MG细胞。将U87MG.Δ2-7用FACS分选为低(L)、中(M)、和高(H)表达群体。A、在血清饥饿36小 时后裂解细胞，通过免疫印迹分析de2-7表达(C13)和de2-7EGFR的酪氨酸磷酸化(4G10)。磷酸化水平与de2-7EGFR相关。B、通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射1×106细胞建立亲代U87MG、U87MG-L、U87MG-M和U87MG-H异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积±SE。C、通过免疫印迹分析来自(B)的肿瘤的de2-7EGFR(C13)表达。D、用1mgmAb 528或mAb 806处理具有U87MG-H异种移植物的小鼠2周，每周三次(第4、6、8、11、13和15天)。数据表示为平均肿瘤体积±SE。 
图6A-6C：用EGFR特异性抗体处理NR6.Δ2-7异种移植物。通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射3×106细胞而建立异种移植物。当异种移植物达到约100mm3的平均体积时开始抗体治疗。用1mg mAb 806(A)或mAb 528(B)处理小鼠2周，每周3次(第22、25、29、32、36和39天)，或用mAb 528(C)处理3周，每周2次(第27、30、34、37、41和44天)。数据表示为平均肿瘤体积±SE。 
图7A-7C：de2-7EGFR和Src之间的相互作用。(A)使细胞血清饥饿过夜，然后用10μM PP1或PP2或溶媒(DMSO)处理30分钟或24h，然后用mAb528、mAb806或不相关的同型对照进行免疫沉淀。用EGFR的Y845特异性抗体进行免疫印迹，而总de2-7EGFR用兔c末端多克隆抗体呈现。所示结果代表4次独立实验。(B)通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射1×106细胞建立U87MG.Δ2-7载体对照和U87MG.Δ2-7DNSrc异种移植物以确定生长曲线。数据表示为平均肿瘤体积±SE。(C)通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射3×106细胞建立U87MG.Δ2-7DNSrc异种移植物。当异种移植物达到约100mm3的平均体积时开始抗体治疗。用1mg mAb 806处理小鼠2周，每周3次(第18、20、22、25、27和29天)。数据表示为平均肿瘤体积±SE。 
图8A和8B：U87MG.Δ2-7细胞中内化的mAb 806-Cy3和EEA1或lgp-120的共定位。(A)在4℃用mAb 806-Cy3(红)预孵育接种在玻璃盖玻片上的细胞(0分钟)。通过在37℃孵育10、20和30分钟来刺激内化。将细胞固定和透化，然后先后用抗EEA1、Cy2结合的驴抗小鼠抗体(绿)染色。共定位在融合图像中用黄色指示(箭头)。比例尺＝20μm。(B)用 GFP标记的lgp-120(lgp-120-GFP；绿)瞬时转染细胞。阳性转染细胞显示在lgp-120-GFP栏并由绿色箭头显示。转染后，在4℃用mAb 806-cy3(红)孵育细胞(红；0分钟)，然后通过在37℃孵育30、60和120分钟来诱导内化。接着，固定样品，mAb 806-Cy3和lgp-120-GFP的共定位由融合图像中黄色的存在来指示(白色箭头)。比例尺＝10μm。 
图9A-9F：在U87MG.Δ2-7细胞中mAb 806结合de2-7EGFR后网格蛋白介导的内吞作用和胞内mAb 806运输的电子显微镜分析。诱导内化5分钟后，在网格蛋白包被的凹陷(A-B)和小泡(C)中容易地检测出了金粒(mAb 806-Au；箭头)。在类似膜小内陷(caveolae)(空心箭头)的结构内不存在金粒(D)。内化10-15分钟后，在类似早期内体(E)的管状囊泡结构中检测到了金粒。在内化较长时间后，在多泡体中看到了金粒(F)。比例尺＝100nm。 
图10：NR6Δ2-7细胞中mAb 806和mAb 528的内化。在4℃用mAb806-Cy3(左栏)或mAb 528-Cy3(右栏)预孵育细胞(0分钟)，然后在37℃孵育不同的时间段诱导内化。示出了表示在37℃下15、30和60分钟孵育的图像。在内化前用两种抗体染色与细胞间的膜连接(蓝色箭头)和黏着斑(红色箭头)有关，而一些细胞显示很少的膜染色(红色箭头)。较晚时间点内化的抗体用白色箭头指示。比例尺＝20μm。 
图11：de2-7 EGFR变体与其他细胞组分相互作用的示意性代表图。de2-7 EGFR具有活性激酶，因此可以自磷酸化、磷酸根转移或为其他激酶磷酸化的靶标。相反，死亡激酶de2-7 EGFR仅可以为磷酸化的靶标。最后，DY5构建体可以为磷酸化的靶标并且磷酸根转移其他细胞靶标，如wt EGFR。考虑到mAb 528和806都抑制U87MG.DY5异种移植物，但是不抑制U87MG.DK异种移植物，表明这些抗体阻止其他细胞组分磷酸化的能力对它们的抗肿瘤活性是很关键的。 
图12：用单独的mAb 806和达沙替尼或它们的联合制剂进行的U87MG.Δ2-7src异种移植物治疗。通过在BALB/c裸鼠的两侧腹注射1×106细胞而建立U87MG.Δ2-7src异种移植物，当异种移植物达到约80mm3的平均体积时开始治疗。用溶媒(在dH2O中的4％DMSO)、PBS 中的1mg mAb 806、在4％DMSO(在dH2O中)中的10mg/kg-1达沙替尼或它们的联合制剂处理小鼠2周，每周三次，在所指定的日期进行。数据表示为平均肿瘤体积±SE。在第33天，联合处理组明显小于仅用mAb 806处理的组(p＜0.0076)。 
图13：用单独的mAb 806和达沙替尼或它们的联合制剂进行的U87MG.Δ2-7src异种移植物治疗。将来自上面实验的数据转化成kaplan-meier存活曲线，使用临死或肿瘤体积＞1500mm3时的两个端点通过Wilcoxon分析来进行分析。联合组比其他组存活时间长，Log Rankp＜0.0001。 
具体实施方式
根据本发明，可以采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整的解释。参见，例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1989)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”第I-III卷[Ausubel，R.M.，编辑(1994)]；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”第I-III卷[J.E.Celis，编辑(1994)]；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷[Coligan，J.E.，编辑(1994)]；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编辑1984)；“NucleicAcid Hybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1985)]；“Transcription And Translation”[B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)]；“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney，编辑(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymes”[IRL Press，(1986)]；B，Perbal，“A Practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。 
因此，如果在本文中出现，则下列术语应具有下列定义。 
术语“抗体”描述天然或部分或完全合成制备的免疫球蛋白。抗体包括结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆、单克隆、重组、人源化和嵌合抗体。该术语还涵盖具有为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽或蛋白。此术语还涵盖CDR移植抗体。 
由于抗体可以多种方式修饰，所以术语“抗体”应理解为涵盖含有具有 所需特异性的结合结构域的任何特异性结合部分或物质。因此，此术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能性等同物和同源物，其包括含有免疫球蛋白结合结构域的天然或完全或部分合成的任何多肽。因此，包括融合至另一多肽的含有免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美国专利No.4,816,397和4,816,567。 
据显示，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段；(iv)由VH结构域构成的dAb片段(Ward，E.S等人，Nature 341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包含两个相连的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接，所述肽连接字使两个结构域连接以形成抗原结合位点(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson，J Immunol.Methods 242：193-2049(2000))；(ix)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；和(x)通过基因融合构建的“双功能抗体(diabody)”、多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，(1993))。 
“抗体结合位点”是由特异性结合抗原的轻链或重链和轻链可变和高变区构成的抗体分子结构部分。 
如本文所用的各种语法形式的短语“抗体分子”涵盖完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。 
示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互补位的那些部分，包括本领域内已知的那些部分，如Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)，这些部分优选用于本文所述的治疗方法。 
抗体可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合部分，另一结合结构域具有不同的特异性，如募集效应子的功能等。 本发明的双特异性抗体包括：其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合部分，包括其片段，另一结合结构域是不同的抗体或其片段，包括不同的抗EGFR抗体，例如抗体528(美国专利No.4,943,533)、嵌合和人源化225抗体(美国专利No.4,943,533和WO/9640210)、抗de2-7抗体(如DH8.3)(Hills，D.等人(1995)Int.J.Cancer 63(4)：537-543)、抗体L8A4和Y10(Reist，CJ等人(1995)Cancer Res.55(19)：4375-4382；FoulonCF等人(2000)Cancer Res.60(16)：4453-4460)、ICR62(Modjtahedi H等人(1993)Cell Biophys.1月-7月；22(1-3)：129-46；Modjtahedi等人(2002)P.A.A.C.R.55(14)：3140-3148、或Wikstrand等人的抗体(Wikstand C.等人(1995)Cancer Res.55(14)：3140-3148)。另一结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如神经或胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可以与识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞的其他结合结构域或分子组合，如免疫调节因子(如，白细胞介素)、生长调节因子或细胞因子(如，肿瘤坏死因子(TNF)，尤其是2002年2月13日提交的U.S.S.N.60/355,838(其全文并入本文)中所展示的TNF双特异性形式)或毒素(如，蓖麻毒蛋白)或抗有丝分裂或凋亡的药剂或因子。 
抗体分子的Fab和F(ab’)2部分可以通过熟知的方法对基本上完整的抗体分子分别进行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应来制备。参见，例如授予Theofilopolous等人的美国专利No.4,342,566。Fab’抗体分子部分也是熟知的，它由F(ab’)2部分如下制备：如用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，接着用诸如碘代乙酰胺等试剂将所得蛋白硫醇烷基化。含有完整抗体分子的抗体在本文中是优选的。 
各种语法形式的短语“单克隆抗体”是指仅具有一种能够与特定抗原发生免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常表现出对与其发生免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。单克隆抗体还可以含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，每个抗体结合位点对不同抗原具有免疫特异性；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。 
术语“抗原结合结构域”描述含有特异性结合部分或整体的抗原并与其 互补的区域的抗体部分。当抗原很大时，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以有一个或多个抗体可变结构域。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。 
术语“mAb806”、“806抗体”、“单克隆抗体806”、“ch806”、“人源化806”以及没有特别列出的任何变体在本文中可以互换使用，并且如在整个本申请和权利要求提到中所用。因此，还涵盖了显示出基本上等同的或改变的活性的抗体，包括重组的、嵌合的、遗传修饰的或其他抗体。这些修饰可以是特意的，例如，通过定点突变获得的修饰；或可以是偶然的，如通过在为抗体或其片段的制造者的宿主中突变而获得的那些。术语“mAb806”、“806抗体”、“单克隆抗体806”、“ch806”、“人源化806”还旨在包括本文具体记载的以及技术人员已知的、公开揭示的在它们范围内的蛋白和免疫球蛋白，以及所有基本上同源的类似物和等位变体。mAb806抗体(包括其制备、具体活性、氨基酸和核酸序列、抗原结合结构域、可变区序列)已公开并且是技术人员已知的，包括下列文献中所提供的：WO02/092771；Luwor RB等人(2001)Cancer Res 61：5355-5361；Mishima K等人(2001)Cancer Res 61：5349-5354；Johns TG等人(2002)Int J Cancer98：398-408；Jungbluth AA等人(2003)Proc Natl Acad Sci 100(2)：639-644，其每一篇的全文以引用方式并入本文。 
应了解还在用于本发明方法的组合物范围内的是编码和/或有效表达抗EGFR抗体(尤其包括mAb806和ch806)的DNA序列，该DNA序列编码抗EGFR抗体、其抗原结合结构域、或其具有与mAb806抗体(如所公开的和技术人员已知的)相同的氨基酸序列的活性片段，但该序列简并成已知的mAb806序列。所谓“简并”意指不同的三字母密码子用来指定特定的氨基酸。 
短语“src抑制剂”涵盖并且包括降低src表达或活性、降低src磷酸化位点(尤其是EGFR上的)的磷酸化、或降低src激酶级联信号的任何调节因子。调节因子可以包括化学基团(chemical entity)、肽、抗体或其他此类药剂等。调节因子可以包括激酶抑制剂、磷酸酶等。 
已有几种已知的小分子src抑制剂，一些已经进入临床试验，例如达 沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嘧啶)、PD166326。 
短语“药物上可接受的”是指分子基团和组合物，其在给予人时为生理上可耐受的，并且通常不产生过敏或类似的不利反应，如心嘈、眩晕等。 
短语“治疗有效量”在本文中意指足以防止，优选降低至少约20％，更优选至少30％，仍然更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少90％的下列现象的量：在S期靶细胞团活性的临床显著改变；或靶细胞团或肿瘤的大小或体积的显著改变；或可能与其存在和活性有关的其他病理特征。 
抗体或活性片段可以配制成治疗组合物，为中和的药物上可接受的盐形式。药物上可接受的盐包括酸加成盐(与具有多肽或抗体分子的游离氨基一起形成)以及与诸如盐酸、磷酸等无机酸或诸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有机酸一起形成的那些。由游离羧基形成的盐也可以由诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物等无机碱以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱衍生。 
含有治疗抗体或活性片段的组合物通过例如注射单位剂量而进行常规的静脉内给予。术语“单位剂量”当指示本发明的治疗组合物时是指适合用作人的单位剂量的生理上离散的单元，各单元含有经计算能与所需稀释剂(即，载体或溶媒)一起产生所需的治疗效果的预定量的活性材料。 
组合物以与剂量、制剂相匹配的方式以治疗有效量给予。要给予的量取决于要治疗的受试者、受试者的免疫系统利用活性成分的能力、所需的抑制程度或靶向的肿瘤质量。需要给予的活性成分的精确量取决于执业医生的判断，并且每个个体都是独特的。然而，适宜的剂量可以介于约0.1至20，优选约0.5至约10，更优选1至若干毫克活性成分/千克个体体重/天，并且视给药途径而定。对于初始给药和加强注射的适宜方案也不同，但典型的是初始给药之后是以一个或多个小时间隔进行重复剂量的后续注射或另行给药。或者，构思足以维持血液中10纳摩尔至10微摩尔的浓度的连续静脉内输注。 
如本文所用，“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克， “mg”意指毫克，“ul”或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“l”意指升。 
因此通过证明抗EGFR抗体，尤其mAb806的抗肿瘤活性提供并提出(raised)了治疗和诊断应用和方法。如之前所显示和本文所进一步改进，本发明构思了EGFR所参与的反应和信号传导级联中的药物干扰以调节与EGFR突变(包括激酶结构域突变，原发和继发耐性突变)相关的肿瘤发生能力。 
本发明还提供在哺乳动物中治疗EGFR介导的癌症的方法，其包括给予所述哺乳动物src抑制剂和抗EGFR抗体。在一个方面，src抑制剂和抗EGFR抗体同时给予。在一个方面，src抑制剂和抗EGFR抗体在传统化疗之前或之后同时或连续且重复给予。 
所述抗EGFR抗体，尤其mAb806可以在该方法中单独给予或与其他抗EGFR抗体联合给予。MAb806也可以连续或与包括下列的其他抗EGFR vIII抗体联合给予：西妥昔单抗、ABX-EGF(帕尼单抗)、DH8.3、L8A4和/或它们的活性片段。src抑制剂可以在该方法中单独给予或可以与一种或多种抗EGFR抗体和任选地一种或多种src抑制剂联合给予。 
所述抗EGFR抗体可以与适宜的载体一起以能通过各种方法有效给予患者的强度制备成药物组合物。可以采用各种给药技术，尤其是肠胃外技术，如皮下、静脉内和腹膜内注射、导管插入等。抗体或其活性片段的量可以不同，具体应根据执业医师或兽医的建议和药方而定，包括对本文所提供的结果和数据的考虑。 
src抑制剂可以与适宜的载体一起以能通过各种方法有效给予患者的强度制备成药物组合物。可以采用各种给药技术，尤其是肠胃外技术，如皮下、肌内、静脉内和腹膜内注射、导管插入等；和/或口服给药或经皮给药或涂覆。src抑制剂的量可以不同，具体应根据执业医师或兽医的建议和药方而定，包括对本文所提供的结果和数据的考虑。还可制备适于给药的为一种或多种抗EGFR抗体和一种或多种src抑制剂的联合的药物组合物。 
本发明的抗体可以用可检测的或功能标签标记。可检测的标记包括但不限于放射性标记，如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、 59Fe、90Y、121I、124I、125I、131I、111In、211At、198Au、67Cu、225Ac、213Bi、 99Tc和186Re，它们可以使用抗体成像领域内已知的常规化学方法与本发明的抗体相连。标记还包括荧光标记和MRI-CT图像领域内常规使用的标记。它们还包括酶标记，如辣根过氧化物酶。标记还包括化学部分，如生物素，其可以通过结合特定同源可检测部分(如，标记的亲和素)而被检测到。 
功能标记包括经设计靶向肿瘤部位引起肿瘤组织破坏的物质。这种功能标记包括细胞毒性药物，如5-氟尿嘧啶或蓖麻毒蛋白和诸如细菌羧肽酶或硝基还原酶等能够在肿瘤部位将前体药物转化成活性药物的酶。 
放射性标记的抗EGFR抗体及其片段可用于体外诊断技术和体内放射成像技术以及放射免疫治疗。在体内成像的情况下，本发明的特异性结合部分可以与成像剂而非放射性同位素结合，成像剂包括但不限于磁共振成像增强剂，其中，例如抗体分子用大量顺磁离子通过螯和基团加载。螯和基团的实例包括EDTA、卟啉、聚胺冠醚和聚肟。顺磁离子的实例包括钆、铁、锰、铼、铕、镧(lanthanium)、钬和铽(ferbium)。在本发明另一方面中，放射性标记的特异性结合部分，尤其抗体及其片段，尤其是放射免疫结合物，可用于放射免疫治疗，尤其是作为放射性标记的抗体用于癌症治疗。在又一方面中，放射性标记的特异性结合部分，尤其抗体及其片段，可用于放射免疫引导的手术技术，其中它们可以在手术之前、之中或之后辨别并说明癌细胞、癌前细胞、肿瘤细胞和过度增殖细胞的存在和/或定位以清除这些细胞。 
其中本发明的特异性结合部分(尤其抗体及其片段)结合或连接到其他分子或药剂上的本发明免疫结合物或抗体融合蛋白还包括但不限于结合至化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性药剂、化疗剂或药物的结合部分。 
使用多种抗体免疫结合物的放射免疫治疗(RAIT)已经进入临床并且证明是有效的。已经在结肠直肠癌中评价131I标记的抗癌胚抗原(抗CEA)抗体hMN-14(Behr TM等人(2002)Cancer 94(4Suppl)：1373-81)，评估了在甲状腺髓样癌中具有90Y标记的相同抗体(Stein R等人(2002)Cancer94(1)：51-61)。还评估和报道了非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma) 和胰腺癌使用单克隆抗体的放射免疫治疗(Goldenberg DM(2001)CritRev Oncol Hematol 39(1-2)：195-201；Gold DV等人(2001)Crit Rev OncolHematol 39(1-2)147-54)。使用特定抗体的放射免疫治疗法还描述于美国专利6,306,393和6,331,175。放射免疫引导的手术(RIGS)也已经进入临床并且证明有效和有用，它们包括使用抗CEA抗体和针对肿瘤相关抗原的抗体(Kim JC等人(2002)Int J Cancer 97(4)：542-7；Schneebaum S等人(2001)World J Surg 25(12)：1495-8；Avital S等人(2000)Cancer89(8)：1692-8；McIntosh DG等人(1997)Cancer Biother Radiopharm 12(4)：187-94)。 
本发明的抗体可以经由任何适宜的途径给予需要治疗的患者，通常通过注射进血流或CSF，或直接注射进肿瘤部位。精确的剂量取决于许多因素，包括抗体是用于诊断还是治疗、肿瘤的大小和位置、抗体的确切性质(是否完整抗体、片段、双功能抗体等)、以及连接到抗体的可检测的或功能标记的性质。在使用放射性核素治疗时，适宜的最大单剂量为约45mCi/m2至最多约250mCi/m2。优选的剂量介于15至40mCi，更优选的剂量介于20至30mCi，或10至30mCi。这种治疗可能需要骨髓或干细胞替代。用于肿瘤成像或肿瘤治疗的通常抗体剂量介于0.5至40mg，优选1至4mg F(ab’)2形式的抗体。裸抗体的优选给予剂量为20至1000mg蛋白/剂量、或20至500mg蛋白/剂量、或20至100mg蛋白/剂量。这是用于成年患者单一治疗的剂量，它可以按比例调节用于儿童和婴儿，还可以分子量比例调节用于其他抗体形式。治疗可以按医师的判断以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复。src抑制剂的剂量和给药可以由医师或本领域内其他技术人员确定和变化。 
参考下列非限制性实施例可以更好地理解本发明，这些实施例作为本发明的示例提供。下列实施例的列举是为了更充分的例示本发明的优选实施方式，然而，它们不应该以任何方式理解为是对本发明范围广度的限制。 
实例1 
SRC失活或抑制后EGFR特异性抗体的效力增强
影响针对EGFR的治疗性单克隆抗体(mAb)效力的因素仍然不够了 解，尤其在胶质瘤中。检测了两种EFGR特异性mAb(mAb806和528)抗U87MG源胶质瘤异种移植物的效力，这种异种移植物表达EGFR变体。使用这种方法使得能够在改变EGFR形式的同时保持遗传背景恒定。这些变体包括在胶质瘤中表达的EGFR组成性活性突变体de2-7EGFR(或EGFRvIII)。 
mAb的效力与EGFR数目相关，然而最重要的因素是受体激活。尽管表达de2-7EGFR的U87MG异种移植物对治疗有反应，但展示死亡激酶de2-7EGFR的那些是不反应的。具有激酶活性但是自磷酸化缺陷型的经修饰的de2-7EGFR也有反应，这表明这些mAb在表达de2-7EGFR的异种移植物中通过阻断磷酸根转移起作用。由于表达de2-7EGFR的U87MG还共表达wt EGFR，所以还在分离物中测试了mAv抗表达de2-7EGFR的NR6异种移植物的效力。尽管mAb 806表现出对NR6异种移植物的抗肿瘤活性，但mAb528治疗是无效的，这表明mAb 528通过破坏de2-7和wt EGFR之间的相互作用介导其抗肿瘤活性。 
最后，表达de2-7EGFR的U87MG异种移植物中的基因破坏显著增强了mAb 806的效力。在胶质瘤中EGFR特异性抗体的有效使用依赖于具有活化EGFR的肿瘤的鉴别。EGFR和Src抑制剂的联合制剂提供了治疗胶质瘤的新且有效的策略。 
背景
表皮生长因子受体(EGFR)是具有内在酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。在许多表皮肿瘤中都观察到EGFR的过量表达，它通常与较差的临床预后有关(1-3)。EGFR的过量表达可能由EGFR基因扩增导致，尤其在胶质瘤中(4)。在胶质瘤中，基因扩增与最常见的突变EGFR重排有关，该突变de2-7EGFR(或EGFRvIII)的特征在于跨越编码序列的外显子2至7的801个碱基对框内缺失(4-6)。这种重排导致来自胞外结构域的267个氨基酸缺失和在融合位点一个新的甘氨酸插入，所有这些产生了独特的连接肽。尽管de2-7EGFR不能结合任何已知的配体，但是受体表现出低水平的组成性激活并且能够增强胶质瘤和乳腺癌异种移植物的生长(7，8)。 
抑制EGFR是开发新的癌症治疗法的合理策略。可能的治疗法包括针 对EGFR的单克隆抗体(mAb)(例如，C225、ABX-EGF、EMD 55900)(9-11)和EGFR的小分子量酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(例如，ZD1839、OSI774)(12)。事实上，这些治疗法的一些已在肺癌(ZD 1839，Iressa)和结肠癌(C225，Erbitux)的有限临床应用中得到批准。从这些临床试验很清楚的是并非所有EGFR阳性的患者对这些靶向治疗法都有反应(表1)。从患者的福利和经济观点来看，确定引起患者对EGFR治疗法易感的因素是重要的目标。同样理解耐EGFR治疗法的性质可以有助于确定克服它的方法。 
表1
与对EGFR治疗法敏感性相关的细胞方面 
  EGFR抑制剂   实验体系   观察   注释   参考文  献
  PD153035   体外多细胞  系   敏感性与  wtEGFR数目相  关   无体内数据   (32)
  C225   体外肾细胞  癌   仅含有VHL基因  的细胞是敏感的   无体内数据   (33)
  EMD55900  和  EMD72000   体外多细胞  系和异种移  植物   敏感性与  wtEGFR数目相  关     (34)
  SU1195和  ZD1839   体外多细胞  系和异种移  植物   在存在ErbB2的  条件下较难抑制  EGFR磷酸化     (35)
  mAbR3和  C225   A431异种移  植物   完全消退后复发  的异种移植物通  常对进一步治疗  有抗性   在抗性细胞系  中EGFR过量  表达是常见的  观察结果   (36)
  ZD 1839   A431和  NR6M(表达   表达de2-7EGFR  的异种移植物有   NR6M在wt  EGFR不存在   (37)
[0082] 
    de2-7EGFR)  异种移植物   抗性   下表达de2-7  EGFR，两者  在临床上共表  达  
  AG1478   体外胶质瘤  细胞系   抗性胶质瘤表达  IGFR-1，IGFR-1  被AG1478进一  步上调。IGFR-1  作用似乎通过  PI3K/Akt介导   观察限制在体  外单细胞系   (38)
  CGP59326   体外BT474  乳腺癌和  MKN7胃癌  细胞   Heregulin    对  erbB2/3杂二聚  体的激活产生抗  性   无体内数据   (39)
  ZD1839   体外多细胞  系   敏感性与wt  EGFR数目相关。  组成活性的  MAPK增加抗性   无体内数据   (40)
  AG1478   体外大细胞  板   敏感性的两个要  求：高wtEGFR  和通过进入细胞  循环对EGF反应  的能力   无体内数据   (41)
  ZD1839和  PD153035   体外多细胞  系   通过Akt或Erk  的持续信号传导  可以引起抗性   无体内数据   (42)
  ZD1839   体外A431和  MDA-468乳  腺癌细胞   通过Akt的持续  信号传导可以引  起抗性。PTEN的   无体内数据   (43)
[0083] 
      存在增加EGFR  治疗法的效力    
  ZD1839和  C225   体外A431和  多NSCLC   与EGFR数目无  关   无体内数据   (44)
  ZD1839   患有NSCLC  的患者   在EGFR激酶结  构域具有激活性  突变的患者更可  能反应   后来的数据表  明并非所有具  有突变的患者  都反应   (28，45)
  ZD1839   NR6成纤维  细胞和  U87MG胶质  瘤细胞   表达de2-7EGFR  的细胞是抗性  的，可能与不能  完全抑制de2-7  EGFR磷酸化有  关   无体内数据   (46)
  OSI-774   胶质瘤细胞  系板   能够在对治疗反  应中增加EGFR  的mRNA的细胞  耐性更高     (47)
  ZD1839和  OSI-774   患有NSCLC  的患者   EGFR激酶的继  发突变引起抗性     (48)
  C225和ABX   患有结肠直  肠癌的患者   反应与EGFR拷  贝数增加相关   样本数很小   (26)
  OSI-774和  ZD1839   患有胶质瘤  的患者   EGFR  vIII  与  PTEN的共表达  与反应性有关     (49)
引起对靶向EGFR的TKI抗性/易感性的机制已经进行了广泛的研究，而影响抗EGFR抗体效力的因素还不太了解(参见表1)。可以从这些研究得出一些关于TKI的概括。首先，细胞系对TKI抑制的敏感性与增加的细胞表面EGFR相关(表1)，这表明这些抑制剂起作用需要一些内在 水平的EGFR表达。其次，在EGFR失活后，维持通过PI3激酶/Akt通路的信号传导的能力降低TKI的效力(表1)。这些研究大部分在体外进行，因此不知道这些观察结果在体内环境中是否仍然正确。最近，一些研究分析了用易瑞沙(Iressa)(ZD 1839)治疗的肺癌患者中EGFR基因的状态，发现对治疗反应的患者通常获得了激酶结构域的功能突变(表1)。此外，还描述了导致易瑞沙抗性的继发性激酶突变(表1)。然而最初的研究表明，这些现象并不普遍，而且肺癌患者中所述的突变并没有在其他类型的肿瘤中观察到。
使用抗EGFR抗体的研究的有限数量使得很难得出任何关于对这些药剂易感性的概括(表1)。除了缺乏体内研究之外，这些易感性研究中的一些是用细胞板进行的，考虑到细胞系之间信号通路以及是否存在其他ErbB家族成员不同，使得很难确定与EGFR敏感性或抗性相关的单独因素。为了解决这些问题中的一些，我们检测了体内U87MG胶质瘤细胞系对两种EGFR特异性抗体的易感性，该细胞系表达适中水平的野生型(wt)EGFR。然后，我们用一些wt和de2-7EGFR构建体转染U87MG细胞以确定受体的数目和活化对抗体治疗易感性有何影响。 
此研究中所用的两种抗体为mAb 806和528。MAb 806是针对表达de2-7 EGFR的细胞产生的新型抗EGFR特异性抗体(13)。有趣的是，尽管mAb 806清楚地结合de2-7 EGFR，但是它还结合wt EGFR的一个亚型(约10％)，该亚型在过量表达该受体的细胞表面上表达(13)。最近的分析表明所述mAb 806表位仅在受体由其失活状态向活性状态转化时过渡存在的EGFR构象形式中暴露(14)。与wt EGFR不同，de2-7EGFR在此过渡构象中是组成性的，因此可用于mAb 806结合。我们先前的研究已显示用mAb 806处理表达de2-7或过量表达wt EGFR的异种移植物会引起肿瘤生长的显著抑制(15-17)。同时，制备和分离了528抗体作为鼠源C225抗体(Erbitux)，其表现出了类似的性质(18)。MAb 528用作配体拮抗剂，抑制体外和体内作为异种移植物生长的表达EGFR的细胞生长(18)。 
材料和方法
细胞系和单克隆抗体 
U87MG转染的细胞系U87MG.Δ2-7、U87MG.DK、U87MG.wt、U87MG.DY5和U87MG.DY2已在其他地方有详细描述(16，19)。A431细胞系之前也已有所描述(20)。所有细胞系都保持在含有下列物质的DMEM(DMEM/F12；Life Technologies，Inc，Grand Island，NY)或RPMI中：10％FCS(CSL，Melbourne，Victoria，Australia)、2mM谷氨酰胺(SigmaChemical Co，St.Louis，MO)、和青霉素/链霉素(Life Technologies，Inc，Grand Island，NY)。此外，转染的细胞系保持在400mg/ml的遗传霉素(LifeTechnologies，Inc，Melbourne，Victoria，Australia)中。 
mAb 806和528在生物制备机构(澳大利亚墨尔本的路德维格研究所)制备。抗EGFR特异性酪氨酸磷酸化位点的抗体和兔多克隆抗EGFR抗体得自Cell Signaling Technology(Danvers，MA)。用小鼠单克隆抗体v-src327(Oncogene Research Products，CA，USA)或c-Src H-12(SantaCruz Biotechnology，Inc，CA，USA)检测src。兔多克隆抗体PY418(BioSouce International，Inc.，CA，USA)用于检测磷酸-Src。抗磷酸酪氨酸抗体4G10购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。C13用于检测野生型和平截的EGFR，其得自BD Transduction Laboratory(SanDiego，Ca)。 
U87MG.Δ2-7DNSrc细胞系的制备 
显性负相(dominant negative，DN)激酶死亡Src构建体(K296R/Y528F)得自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY，USA)。将含有DNSrc的Hind III片段亚克隆到得自Invitrogen Life Technologies(Carlsvad，CA)的pcDNA3.1/Hygro(+)载体中，所得构建体通过电穿孔转染到U87MG.Δ2-7细胞。还制备仅用pcDNA3.1/Hygro载体转染的第二细胞系。将1ml等分试样中的细胞铺到96孔板上，密度为约2×104细胞/孔，在37℃下孵育48小时，然后添加100μg/ml潮霉素(Roche Diagnostic，Mannheim，Germany)。获得克隆后(约两周)，将细胞放回400μg/ml遗传霉素以及潮霉素中。 
转染的细胞首先通过FACS分析筛选以确定其保持de2-7 EGFR的表达。然后将克隆进行全细胞裂解或免疫沉淀，之后用Src特异性抗体(v-Src 327、c-Src H-12)进行western印迹。鉴别并扩增表现出显著增高水平的总src(Src水平在原始细胞系中极低)的几个克隆。然后通过用v-Src 327抗体免疫沉淀35S标记的细胞裂解物，对所得沉淀进行SDS-PAGE和定量放射自显影来进一步确定增加的Src水平。选择表达最高水平DNSrc的克隆，据显示DNSrc在Y418位处磷酸化，这表明它被正确折叠。 
体外生长分析 
按照以前的详细描述检测体外mAb 806和528的抗增殖效果。简言之，将细胞以1×104细胞/孔接种在24孔板上，细胞在含有0.5％FCS的培养基中。4天后用胰蛋白酶移除细胞并用血细胞计数器计数。抗体以100μg/ml的终浓度使用，该浓度与异种移植物中所得到的一致。 
异种移植物模型 
将在100μl PBS中的肿瘤细胞(3×106)皮下接种至4至6周龄的雌性裸鼠(Animal Research Centre，Perth，Australia)两侧腹。所有研究都使用如先前报道建立的肿瘤模型来进行(15，16)。当肿瘤达到约100mm3的平均体积时开始处理。使用公式(长×宽2)/2来确定肿瘤体积(mm3)，其中长为最长的轴，宽为与长呈直角的尺寸。每个处理组数据表示为平均肿瘤体积±SE。所有数据通过学生t检验分析显著性。每个研究中每组最少使用10个异种移植物。 
免疫印迹 
将细胞在冷裂解缓冲液(30mM HEPES、150mM NaCl；10mM NaF；1％Triton X-100；200μM NaO3V；0.4％H2O2和含有500μM AEBSF、150nM抑肽酶、1μM E-64蛋白酶抑制剂、0.5mM EDTA和1μM亮肽酶素的蛋白酶抑制剂混合物1(Calbiochem，San Diego，CA)，pH 7.4)。用mAb 806或528免疫沉淀裂解物，通过我们详细描述的免疫印迹分析所得沉淀物(21)。 
免疫荧光显微术 
使用花青素3(Cy3)单克隆抗体标记试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech UK Ltd，Buckinghamshire，England)根据厂家的说明用Cy3直接标记Mab 806和528。通过结合U87MG.Δ2-7细胞的流式细胞术分析来确 定成功标记的抗体。早期内体特异性的抗小鼠早期内体自身抗原1(EEA1)单克隆抗体购自Transduction实验室(San Diego，CA，U.S.A.)。Cy2结合的AffiniPure F(ab’)2片段驴抗小鼠IgG二抗和未标记的AffiniPure Fab片段羊抗小鼠IgG封闭抗体购自Jackson ImmunoResearch实验室(WestGrove，PA，U.S.A.)。在37℃下在补充有10％FBS、青霉素/链霉素和谷氨酸盐的MEM(GibcoBRL Grand Island，NY，U.S.A.)中使U87MG.Δ2-7或NR6.Δ2-7细胞在12mm玻璃盖玻片或12mm Biocoat细胞环境聚-D-赖氨酸盖玻片(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA，U.S.A.)上生长。在存在0.25％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO，U.S.A.)的条件下进行抗体与细胞的结合。Cy3结合的mAb 806和528分别以5μg/ml和2μg/ml的浓度使用，表面标记在加湿条件下在4℃下进行20分钟。将细胞在冰冷的0.25％牛血清白蛋白(BSA)/PBS中洗涤3次。表面结合抗体的内化通过在37℃下孵育各盖玻片而开始。在内化不同时间段之后，将各盖玻片从37℃移出，在冰冷的BSA/PBS中洗涤3次终止内化，将其在室温下在4％PFA中固定20分钟。然后将盖玻片在BSA/PBS中洗涤，之后在双蒸水(DDW)中洗涤，用fluoromount G封固剂(SouthernBiotechnology，Birmingham，AL，U.S.A.)将其封固在玻璃载玻片上。用共聚焦显微镜(Nikon Instech Co.，Ltd.，Kanagawa，Japan)使用适当的波长设置分析样品。对于共定位研究，用0.1％triton X-100将细胞透化1分钟。然后，洗涤样品，在室温下用未标记的山羊抗小鼠Fab片段孵育20分钟以封闭所有存在的小鼠结合位点(即，内化的mAb 806或528)。然后在BSA/PBS中洗涤样品，之后在室温下用抗EEA1孵育20分钟。最后洗涤细胞，用Cy2结合的驴抗小鼠F(ab’)2二抗片段孵育。绿色荧光蛋白(GFP)标记的溶酶体糖蛋白120(lgp-120-GFP)的DNA载体由Ira Mellman教授和来自耶鲁大学医学院(New Haven，CT，U.S.A.)的细胞生物学系的教授友情提供。细胞生长在含有包埋的14mm玻璃盖玻片的mat-tek玻璃底微孔皿(MatTek Corp.Ashland，MA，U.S.A.)中，使用LipofectAMINE试剂(InvitrogenTM Life Technologies，Mulgrave，Vic，Australia)按照厂家的说明对这些细胞转染过夜。转染24小时后进行阳性转染细胞的共聚焦成 像，阳性转染细胞在用488nm波长的光激发时发绿色荧光。 
结果
体外和体内敏感性之间的相关性 
表1中所述的许多研究已在体外进行。我们用靶向EGFR治疗的mAb和TKI进行实验均清楚地表明体外敏感性与体内反应不完全相关。事实上，我们最近公开的一个实施例中，两种细胞系在体外表现出对EGFR特异性TKI AG1478类似的敏感性，但它们对相同药剂的体内反应则显著不同(22)。使用先前所述的用于C225的标准体外生长抑制分析和与异种移植物部位所达到的浓度一致的抗体浓度，我们在体外抗体抑制和体内抗肿瘤活性之间看到了很小的相关性(参见表2)。mAb 528或806在体外均不抑制U87MG.Δ2-7细胞的生长，但是两种抗体在体内都显示出很强的抗肿瘤活性，该活性不依赖于免疫效应子功能(参见图2)。并且，即使一种靶向EGFR的抗体在特定细胞系显示出体外与体内的相关性(例如，mAb528在A431细胞和异种移植物中，表2)，这也不一定表明另一EGFR特异性抗体在相同的细胞系中是相关的(例如，mAb 806在A431细胞和异种移植物中，表2)。此样品分析与我们之前的观察结果一起清楚地表明体外分析在确定对EGFR治疗法敏感性中价值有限。 
表2
对EGFR治疗法敏感性的体外和体内比较
Figure G2008800161523D00241
＊A431异种移植物的体外数据来自我们最近的论文(16) 
表达不同形式EGFR的U87MG胶质瘤异种移植物的抗体治疗 
将表达中等水平的wt EGFR的亲本U87MG细胞、或用额外wtEGFR、de2-7EGFR或各种修饰形式的de2-7EGFR(图1)转染的相同细胞系皮下注射到裸鼠中以建立肿瘤异种移植物。在异种移植物达到约 100mm3时开始用抗体处理。用1mg mAb 528或806处理所有肿瘤2周，每周3次。选择这样的抗体治疗剂量和方案：其在我们的标准U87MG.Δ2-7异种移植物模型中引起强的抗肿瘤反应，但是不足以有效以致于在其他U87MG源细胞系(含有不同EGFR变体)中可能看到的任何抗肿瘤活性增加不明显。如下面所详细讨论，mAb 806和528的抗肿瘤效力在所有的U87MG源胶质瘤异种移植物中是类似的(图2)。 
1、亲本细胞(U87MG)：尽管事实上U87MG异种移植物表达中等水平的EGFR(约5×104受体/细胞)，但两种抗体都不抑制U87MG异种移植物的生长(13)。 
2、过量表达wt EGFR的细胞(U87MG.wt)：用wt EGFR转染U87MG细胞来增加表达(约1×106受体/细胞)并不改变异种移植物的体内生长速率(图3A)但是确实引起肿瘤变得对两种抗体都敏感。这对于mAb 806来说并不奇怪，因为它优先结合过量表达wt EGFR的细胞，而对于mAb528来说则有些出乎意料，因为这表明即使在不存在表型改变的条件下受体数目的增加也能诱导对抗体治疗的反应。在第31天，当处死对照组时，mAb 528诱导的抑制是显著的(p＜0.01)，溶媒组中异种移植物的平均肿瘤体积为950mm3，相比之下在mAb 528处理组中的为450mm3。在第39天mAb 806实验的分析表明抗体处理显著抑制异种移植物生长(p＜0.001)，其中PBS和mAb 806组的肿瘤体积分别为960mm3和470mm3。 
3、表达de2-7EGFR的细胞(U87M G.Δ2-7)：用组成活性的但不依赖于配体的de2-7EGFR转染的U87MG异种移植物的生长也被两种抗体抑制(图2)。与wt EGFR过量表达不同，在内源wt EGFR的存在下共表达de2-7EGFR会对U87MG异种移植物产生显著的生长优势(图3B)。该受体的组成性磷酸化用免疫印迹来确定(图4)。用mAb 528处理显著抑制肿瘤生长(p＜0.005)，其中在接种后第20天溶媒组的平均肿瘤体积为1170mm3，相比之下mAb 528组为510mm3。考虑到mAb 528的主要功能被认为是配体拮抗，其对表达不依赖配体的de2-7EGFR的异种移植物的抗肿瘤活性是意料之外的。因此，mAb 528可能通过其阻断配体能力之外的其他机制破坏EGFR信号传导。同样，在这些细胞中仅结合de2-7 EGFR而不结合wt EGFR的mAb 806一定不依赖于对配体相互作用的任何影响而介导其抗肿瘤活性，因为它抑制表达de2-7EGFR的异种移植物生长的水平与mAb 528类似。在第21天，当挑出溶媒组时，对照异种移植物的平均肿瘤体积为1500mm3，相比之下mAb 806处理组中则显著较低，为390mm3(p＜0.0001)。因此两种抗体都可以抑制表达不依赖配体但是为组成性活性形式的EGFR的胶质瘤异种移植物。 
4、表达de2-7EGFR死亡激酶形式的细胞(U87MG.DK)： 
用de2-7EGFR死亡激酶(DK)形式转染的U87MG细胞作为异种移植物以类似于亲本细胞的速率生长(图3B)，并且生长不被任一抗体显著抑制(图2)。这种受体缺乏与信号传导相关的主要位点的磷酸化，但是保留着与受体内化和降解相关的位点的磷酸化(图4)。两种抗体与这些细胞的结合在体外和体内都与表达de2-7EGFR的细胞中所看到的类似(16)。此外，由于de2-7EGFR的DK变体仅含有单个胞内点突变，结合胞外结构域的mAb 806和528的亲和力不应有变化。这个结果表明在体外由这些抗体介导的任何免疫效应子功能不足以启动抗肿瘤反应。此外，这表明抗EGFR抗体的抗肿瘤活性需要具有功能激酶结构域的受体。 
5、表达2个自磷酸化主要位点缺失形式的de2-7EGFR的细胞(U87MG.DY2)：表达在两个主要的自磷酸化位点不能自磷酸化的de2-7EGFR构建体(酪氨酸1068和1173变为苯丙氨酸)的U87MG异种移植物在作为肿瘤异种移植物生长时被两种抗体显著抑制(对于mAb 528和806分别为p＜0.01和0.006)(图2)。这种观察结果结合缺乏抗U87MG.DK异种移植物的活性表明，与自磷酸化相对的激酶活性与抗体治疗的反应性相关。 
6、表达不能自磷酸化形式的de2-7EGFR的细胞(U87MG.DY5)：表达在与信号传导相关的所有5个主要自磷酸化位点都不能自磷酸化的de2-7EGFR构建体(酪氨酸1173、1148、1086、1068和992变为苯丙氨酸)的U87MG细胞作为肿瘤异种移植物生长。这种受体缺乏在与信号传导相关的主要位点的磷酸化，但是保持在与受体内化和降解相关的位点的磷酸化(图4)。与用DY2异种移植物所获得的结果一致，两种抗体都显 著抑制表达DY5de2-7EGFR构建体的异种移植物的生长(对两种抗体均为p＜0.0001)(图2)。考虑到这个有些出乎意料的结果，我们用两种抗体在较低的剂量(0.5与1mg/注射)重复了此实验，又一次在两种情况下都得到了肿瘤生长的显著抑制(数据未显示)。由于de2-7EGFR的DY5形式不能够直接结合对下游信号传导很关键的衔接分子，这表明活性激酶结构域而非与这些分子的相互作用是导致对EGFR特异性抗体反应性的关键特征。 
表达高水平的de2-7EGFR的U87MG异种移植物的处理 
图2中的数据表明异种移植物对EGFR信号传导变得越依赖，其越可能对EGFR特异性抗体治疗反应。因此，我们使用FACS分选分离了表达极高水平de2-7EGFR的细胞(U87M G.Δ2-7高)(图5A)。U87MG.Δ2-7高异种移植物比原始U87MG.Δ2-7异种移植物生长得快(图5B)，这表明这些异种移植物的快速生长依赖于高水平的de2-7EGFR。由异种移植物裂解物的免疫印迹测定体内保持de2-7EGFR表达水平(图5C)。用mAb 806或mAb 528处理引起显著的U87MG.Δ2-7高异种移植物抑制，该抑制比任何其他U87MG源细胞系所观察到的都强(图5D)。在第18天，当由于伦理原因处死对照组时，溶媒、mAb 806和mAb 528组的平均肿瘤体积分别为1760、90和90mm3(p＜0.001)。显著的是，虽然在任何之前的U87MG源治疗研究中没有完全的消退(图2)，40％的mAb 806处理的和20％的mAb 528处理的U87M G.Δ2-7高异种移植物完全消退。mAb肿瘤中的一个在接种后第46天复发而其他的肿瘤直到第126天小鼠被处死时都没有复发。因此通过过量表达组成活性形式的EGFR而得到的异种移植物对EGFR特异性抗体更加敏感。 
所建立的NR6源异种移植物的mAb 806和528治疗 
NR6鼠成纤维细胞系不内源表达任何ErbB家族成员(23)，我们用EGFR、ErbB2和ErbB3的FACS确定该现象(数据未显示)。然后用人de2-7EGFR稳定转染这些细胞(NR6.Δ2-7)。由于用于测试mAb 806和528抗de2-7EGFR效力的所有U87MG源细胞系还共表达wt EGFR，所以我们估计它们在具有所建立的NR6.Δ2-7异种移植物的小鼠中的治 疗效力。mAb 806处理导致总体肿瘤生长速率与溶媒相比降低，该降低在接种后第42天特别显著(p＜0.003)(图6)。治疗最后一天(第39天)溶媒和mAb 806处理组的平均肿瘤体积分别为1520和670mm3(图6A)。 
还用mAb 528处理具有所建立的NR6.Δ2-7异种移植物的小鼠。在接种后第56天，当由于伦理原因处死动物时，用mAb 528处理的肿瘤大小与溶媒处理的异种移植物不同(图6B)。我们用略微不同的程序用mAb528进行了第二种治疗实验，其中小鼠接受抗体3周，每周2次。在这些条件下，mAb 528还是不能抑制所建立的NR6.Δ2-7异种移植物的生长(图6C)。因此，与mAb 806不同，mAb528在不存在wt EGFR的条件下不能抑制表达de2-7EGFR的异种移植物。 
Src活性调节表达de2-7EGFR的异种移植物对抗体治疗的反应性 
由于mAb 806和528抑制表达DY5形式的de2-7EGFR的异种移植物，并且由于两种抗体在体内作为单独药剂都不减少de2-7EGFR磷酸化(16)，所以很可能这些抗体通过破坏de2-7EGFR下游靶标的磷酸根转移而介导它们的抗肿瘤活性。我们用NR6.Δ2-7异种移植物的观察结果表明mAb 528的抗肿瘤活性取决于de2-7EGFR与另一ErbB家族成员的共表达，而mAb 806活性则不依赖这种相互作用。因此，我们检测de2-7EGFR是否能与src相互作用、wt EGFR的情况下如何、以及这种可能的相互作用是否与mAb 806效力有关。 
wt EGFR的激活导致Src激酶瞬时活化。Src活化以协同方式导致EGFR上的酪氨酸845(Y845)磷酸化，该位点不是自磷酸化位点而是src磷酸化的靶标(24)。我们用Y845特异性的抗体检测了de2-7EGFR中Y845的磷酸化。当在U87MG胶质瘤细胞中表达时，de2-7EGFR显示出Y845的强磷酸化(图7A)。通过用src家族激酶的抑制剂PP1和PP2孵育细胞快速阻断Y845位的磷酸化，而Y1173位的自磷酸化位点则相对不受影响(图7A)。 
考虑到de2-7EGFR似乎是Src激酶磷酸化的靶标，其方式与wt EGFR类似，我们试图确定这种相互作用是否是mAb 806活性的关键。首先，我们构建了含有Y845F取代基的de2-7EGFR，然而此蛋白在多个位点显示 出降低的磷酸化(Johns，未公开的观察结果)，因此认为不适于这些研究。因此，如材料方法中所述，我们开发了共表达de2-7EGFR和DNSrc的U87MG细胞系(U87MG.Δ2-7DNSrc)。U87MG.Δ2-7DNSrc异种移植物在裸鼠中作为肿瘤异种移植物生长，但是速率比用载体对照转染的U87MG.Δ2-7慢(图7B)。用mAb806处理U87MG.Δ2-7DNSrc导致肿瘤生长的强烈抑制(图7C)。在接种后第34天，溶媒组的平均异种移植物体积为1220mm3，而mAb806处理组为100mm3(p＜0.001)(图7C)。此外，在mAb 806处理组中所有U87M G.Δ2-7DNSrc异种移植物的60％完全消退，并且到接种后第50天尚未复发。因此抑制Src信号传导增加了mAb 806治疗的效力(图7C cf图2)。 
U87MG.Δ2-7细胞中mAb 806的内化。mAb 806在结合U87MG.Δ2-7细胞中表达的de2-7EGFR后的胞内运输通过共聚焦显微镜来研究。在4℃下mAb 806 Cy3孵育之后和在37℃下示踪之前，结合至de2-7EGFR的mAb 806沿原生质膜定位(图8A；0分钟，mAb 806-Cy3)。37℃下孵育之后，观察到mAb 806易位至小的、点状胞质囊泡上。然后用鉴别早期内体的抗早期内体自身抗原1(EEA1)进行免疫染色，如由黄色荧光的存在所呈现的，其显示出与mAb 806的部分共定位(图84；融合)。在37℃下示踪60分钟后，共定位最少(图8A；融合，60分钟)，这表明大部分抗体已经移出了早期胞吞区室。这些观察结果表明mAb 806在内化后立即定位在早期胞吞区室上，然后移动到另外的位置，之后进入其胞内运输循环。 
通过在用lgp-120-GFP瞬时转染的细胞中的共定位分析，在U87MG.Δ2-7细胞中进行了de2-7EGFR结合和内化后mAb 806的溶酶体共定位(图8B)。阳性转染lgp-120-GFP的细胞显示出胞质核周绿色荧光，这与预期的定位到溶酶体区室一致(图8B；lgp-120-GFP)。在诱导内化之前，mAb 806-Cy3仅在细胞表面检测到(图8B，0分钟，mAb 806-Cy3)，其不与lgp-120-GFP共定位(图8B；0分钟，融合)。在升温至37℃达30分钟后，观察到了对应于内化mAb 806的小胞内囊泡结构(图8B；30分钟后，mAb 806-Cy3)。这些结构中的一些与lgp-120-GFP共定位，然而 大部分的红色和绿色信号仍然是分开的(图8B；30分钟后，融合)。在37℃进行60和120分钟后的较长时间孵育引起内化的mAb 806-Cy3与lgp-120-GFP共定位增加(图8B；60-120分钟后，融合)。这些观察结果与如下的假说一致：mAb 806最初穿过早期内吞区室，但长时间后移入其在此聚集的溶酶体区室。 
在结合87MG.Δ2-7细胞上所表达的de2-7EGFR之后的mAb 806内化也用电子显微镜分析。在37℃孵育5分钟后，在类似网格蛋白包被的凹陷结构中观察到了对应于mAb 806的金粒(图9A和B)。还在位于胞质内的游离的网格蛋白包被的囊泡中检测到金粒(图9C)。在类似膜小内陷的结构中没有观察到金粒(图9D)。在37℃示踪10分钟后，mAb 806定位至类似早期内吞区室的大的管状囊泡结构(图9E)。30分钟的较长示踪阶段引起抗体定位在类似多泡体的结构中(图9F)。这些观察结果与表明mAb 806与lgp-120在30与60分钟之间共定位的免疫荧光显微镜数据一致。 
MAb 806和528在NR6.Δ2-7细胞中的内化 
考虑到mAb 806和528抗NR6.Δ2-7异种移植物的治疗效力不同，在这个细胞系中研究了每一抗体的内化特征。此外，由于NR6.Δ2-7细胞不表达任何内源的ErbB家族成员，这个细胞系可以测定这些抗体内化是否需要wt EGFR的存在。如所预期，在4℃下用mAb 806-Cy3孵育细胞显示出膜染色没有胞内荧光(图10；mAb 806，0分钟)。与U87MG.Δ2-7细胞相反(图8)膜染色不均匀。更强的染色与细胞间的膜连接(图10；mAb 806，0分钟)和黏着斑(图10；mAb 806，0分钟)有关。一些细胞显示极少的膜染色(图10；mAb 806，0分钟)。将温度增至37℃诱导内化后，观察到了特征性胞内点状囊泡结构。这些以核周形式的聚集(图10；mAb 52815至60分钟)与迅速的溶酶体定位一致。mAb 528的初始定位(图10；mAb 528，0分钟)和随后的内化(图10；mAb 528，1-60分钟)与mAb806相同。因此，两种抗体在结合至de2-7EGFR后即使在不存在wt EGFR的条件下也都迅速内化到溶酶体区室。 
讨论
mAb 528，许多但并非所有的先前研究表明细胞表面的EGFR数目是影响靶向EGFR的治疗法(尤其TKI)效力的一个因素(表1)。然而，这些实验通常比较了使用不同细胞系的抗肿瘤活性，因此没有关于下列方面的对照：遗传背景、其他ErbB家族成员的存在和能够调节EGFR信号通路的其他功能受体/激酶的出现。此外，这些研究中的许多在体外进行，而我们已经表明体外与体内活性并不相关。将wt EGFR数目增加10倍能将U87MG胶质瘤异种移植物由mAb 528抗性转化为抗体反应性。由于wt EGFR数目增加并不改变U87MG异种移植物的生长速率，所以抗肿瘤活性的获得并不简单地是mAb 528抑制所诱导的生长优势的结果。U87M G.wtEGFR异种移植物中更多wt EGFR的存在几乎一定会引起抗体在肿瘤部位定位增加。考虑到mAb 528具有低、但是可检测的免疫效应子功能(25)，抗体在肿瘤部位的水平增加可以增加补体沉积和促进肿瘤生长抑制的免疫细胞募集。然而，根据我们关于U87MG.DK异种移植物的数据，mAb 528在启动抗肿瘤活性中的免疫效应子功能的作用似乎是不可能的。这些异种移植物具有与U87MG.wtEGFR异种移植物一样多的mAb528结合位点，但是不被抗体抑制。一个有趣的可能性是wt EGFR过量表达引起了不依赖于配体的EGFR信号传导(亲本U87MG似乎不具有强的自分泌-配体环)，这继而使细胞变得对EGFR信号传导系统更加依赖。因此，U87MG.wtEGFR异种移植物对mAb 528治疗反应，因为与亲本细胞系不同，EGFR信号传导通路是活性且有功能的。因此，wt EGFR的过量表达是依赖EGFR信号传导的细胞的代表性标记，因此这些细胞更可能但并非一定对EGFR治疗反应(26)。 
据认为抗体(如mAb 528)的抗肿瘤活性主要是由它们拮抗EGFR配体激活的能力介导。考虑到mAb 528在不存在显著的配体表达的情况下抑制U87MG.wtEGFR异种移植物的生长，这表明其他机制可能作用于抗肿瘤效应。此外，mAb 528显示出抗表达不依赖配体的de2-7EGFR的异种移植物的显著效力。这种抗肿瘤活性可能不直接由mAb 528结合这些异种移植物中共表达的内源wt EGFR而引起，因为它不抑制亲本U87MG或U87MG.DK异种移植物的生长，U87MG或U87MG.DK都表达相同水平 的wt EGFR。除了免疫效应子功能之外，其他的抗肿瘤机制可能包括受体下调、不适当信号传导的诱导、受体向不适宜的膜结构域转移、以及受体二聚化和/或寡聚化的干扰。事实上，一些针对EGFR的TKI不仅通过抑制激酶活性起作用，而且还诱导能够“扫”除过量配体的失活二聚体，这是意料之外的抗肿瘤机制(27)。 
有趣的是，近期在结肠患者中分析EGFR表达的免疫组织化学研究表明对C225的不同反应，其报道几个EGFR“阴性”患者对这种EGFR特异性抗体具有临床反应(26)。推测这些患者具有低于免疫组织化学检测敏感性的EGFR水平，但是所存在的EGFR被激活并促进肿瘤生长/存活。这种观察结果表明EGFR激活如果不比简单的EGFR表达水平重要的话，至少也与其同样重要。我们的数据显示mAb 528不抑制表达死亡激酶形式的这种平截受体(U87MG.DK)的U87MG异种移植物生长，这支持EGFR特异性抗体的效力与激酶活性受体密切相关的观点。如上所建议，EGFR过量表达代表这种激活可以产生的一种机制；组成活性突变体(如de2-7EGFR)的表达则代表了另一种。这种连续的EGFR激活使得细胞变得“陷入”EGFR信号传导，这继而使得它们对抗EGFR治疗易感。这种概念与肺癌患者中的情况类似，其中大部分患者对EGFR特异性TKI反应，该TKI携带着EGFR激酶结构域中的激活性突变(28)。 
mAb 528抑制U87MG.DY2或DY5异种移植物生长的能力强调了与自磷酸化相对的活性激酶结构域作为效力决定因素的重要性。因此，是活性激酶决定了对抗体治疗的反应，而不是磷酸化酪氨酸与衔接蛋白或信号传导分子的直接相互作用。对这种结果的一个推论是mAb 528似乎通过阻止下游靶标的磷酸根转移来抑制U87MG.Δ2-7/DY2/DY5异种移植物生长(图11)。由于所有这些U87MG源细胞系共表达wt EGFR，并且考虑到我们最近证明了de2-7EGFR可以形成二聚体和磷酸化wt EGFR(29)，wtEGFR很可能是这种二级靶标的候选者。这种主张得到了如下事实的支持：表达de2-7EGFR的NR6细胞在不存在wt EGFR的条件下完全难以控制mAb 528的抗肿瘤效应。这些研究综合起来表明，连同其配体阻断性质一起，mAb 528部分是通过阻止过量表达的wt EGFR的同源二聚体化和wt 与de2-7EGFR之间的异源二聚体化起作用。有趣的是，C225(与mAb 528极其类似的抗体)与EGFR的复合体结构表明除了配体阻断外，这种抗体还可以通过部分抑制EGFR释放而阻止EGFR二聚体化(30)。 
mAb 806。体内U87MG源细胞系对mAb 806的反应性完全对映于用mAb 528所观察到的，这表明上述原理中的一些是适用的，但存在一些重要的差异。此研究确定并延伸了我们之前证明mAb 806反应性与EGFR激活有关的研究(16)。与mAb 528和临床评定中所有当前的抗体不同，mAb806不靶向正常组织，如肝，因为EGFR激活在诸如肝等器官中极低或不可检测。很多因素可以刺激肿瘤内的EGFR激活(参见综述(31))。我们已经确定了这些可以引起mAb 806的反应性因素中的至少三个：EGFR过量表达(15)、自分泌环(Johns等人，在准备中)的突变(17)和存在。Wt EGFR过量表达与mAb 806抗肿瘤活性的关系与其独特的特异性密切相关，因为过量表达通过多种机制(如不依赖于配体的激活和EGFR糖基化的改变)增加被mAb 806识别的瞬时的、游离形式的EGFR(21)。考虑到此处所述的工作与用EGFR特异性TKI所获得的临床数据一起表明EGFR抑制剂抵抗具有激活的EGFR的肿瘤最为有效，mAb 806特异性识别激活形式的EGFR的独特能力使得其成为有利的治疗法。 
分子模型表明mAb 806结合能组止活性wt EGFR二聚体的形成(4)，我们已通过解答mAb 806与其表位的复合体的晶体结构确定了该假说(Johns等人，准备中)。尽管这种mAb 806在异种移植物模型中不显著抑制de 2-7或wt EGFR的磷酸化，仍强烈地表明除阻断自磷酸化之外，还包括一些提出的mAb 806作用机制。此外，已知的EGFR信号传导下游靶标(如Akt和MAPK)也不受mAb 806抑制(T.G.Johns，未公开观察结果)。与此假说一致的是，mAb 806显示出抗U87M G.DY2/DY5的强抗肿瘤活性，在这两个模型中自磷酸化不相关。mAb 806缺乏抗U87MG.DK异种移植物的效力强调了活性激酶和磷酸根转移事件的存在(图11)是导致敏感性的关键因素。与mAb 528相反，mAb 806能够在不存在其他ErbB家族成员的条件下抑制表达de2-7EGFR的NR6细胞的生长。这个结果表明mAb 806可能破坏wt EGFR之外的de2-7EGFR磷 酸根转移的其他靶标。有趣的是，在NR6细胞中任一抗体与表面de2-7EGFR结合后，mAb 806和528的内化和胞内运输没有明显不同，这表明抗体运输不引起此异种移植物模型中效力的不同。 
我们在此首次报道了de2-7EGFR上的Y845以Src依赖性方式被磷酸化。因此，我们检测了de2-7EGFR与Src之间的相互作用是否是mAb806活性的可能靶标。如果mAb 806是通过抑制这种相互作用介导其部分抗肿瘤活性，则使用DNSrc从基因上破坏这种相互作用应能够降低mAb806的效力。与这种可能性相反的是，DNSrc的存在显著增强了mAb 806的抗肿瘤活性。这表明Src在限制EGFR治疗的效力方面起作用，并且为使用Src与EGFR抑制剂的联合制剂提供了基本原理。 
结论 
这些研究展示了用于分析细胞系对EGFR治疗的敏感性的体内研究相关性。与先前的研究不同，我们能够在相同的遗传背景下进行我们大部分的分析，使得主要的变量为EGFR的性质。我们使用这种方法最终显示出了受体数目对效力的重要性。尽管EGFR数目与EGFR治疗易感性相关，但仅仅这种因素是不够的，因为受体还需要含有功能激酶。事实上，尽管有些直观，但此工作从形式上显示通过wt EGFR过量表达或组成性活性突变体表达“迫使”细胞系使用EGFR信号传导，可以将其由非反应性转化为反应性。因此EGFR必须不仅存在于细胞表面，它必须对细胞的生长和存活显著起作用。因此，选择对EGFR治疗法反应的患者的策略应针对鉴别高度依赖于EGFR的肿瘤，而不仅仅是受体蛋白的存在与否。此任务在一些情况下(如，当存在de2-7EGFR、EGFR基因扩增或激酶激活性突变体时)是相当容易的，但是很清楚的是在wt EGFR在遗传上正常的时候较困难。在这些情况下，多种受体激酶的相互影响使得难以鉴别真正依赖于EGFR信号传导的那些肿瘤。要鉴别对各受体激酶独特的靶基因的长期、详细表达特征可能是解决此问题的仅有的可行方法。 
参考文献 
1.Arteaga CL.Overview of epidermal growth factor receptor biologyand its role as a therapeutic target in human neoplasia.Seminars in Oncology 2002；29：3-9. 
2.Baselga J.Why the epidermal growth factor receptor？Therationale for cancer therapy.Oncologist 2002；4：2-8. 
3.Mendelsohn J.Targeting the epidermal growth factor receptor forcancer therapy.Journal of Clinical Oncology 2002；20：1S-13S. 
4.Frederick L，Wang XY，Eley G，James CD.Diversity andfrequency of epidermal growth factor receptor mutations in humanglioblastomas.Cancer Res 2000；60：1383-7. 
5.Wong AJ，Ruppert JM，Bigner SH，等人.Structural alterations ofthe epidermal growth factor receptor gene in human gliomas.Proc NatlAcad Sci USA 1992；89：2965-9. 
6.Sugawa N，Ekstrand AJ，James CD，Collins VP.Identical splicingof aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplifiedrearranged genes in human glioblastomas.Proc Natl Acad Sci USA1990；87：8602-6. 
7.Tang CK，Gong XQ，Moscatello DK，Wong AJ，Lippman ME.Epidermal growth factor receptor vIII enhances tumorigenicity in humanbreast cancer.Cancer Res 2000；60：3081-7. 
8.Nishikawa R，Ji XD，Harmon RC，等人.A mutant epidermalgrowth factor receptor common in human glioma confers enhancedtumorigenicity.Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：7727-31. 
9.Baselga J，Pfister D，Cooper MR，等人.Phase I studies ofanti-epidermal growth factor receptor chimeric antibody C225 alone andin combination with cisplatin.J Clin Oncol 2000；18：904-14. 
10.Stragliotto G，Vega F，Stasiecki P，Gropp P，Poisson M，DelattreJY.Multiple infusions of anti-epidermal growth factor receptor(EGFR)monoclonal antibody(EMD55，900)in patients with recurrent malignantgliomas.Eur J Cancer 1996；32A：636-40. 
11.Lynch DH，Yang XD.Therapeutic potential of ABX-EGF：a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody forcancer treatment.Semin Oncol 2002；29：47-50. 
12.Siegel-Lakhai WS，Beijnen JH，Schellens JH.Current knowledgeand future directions of the selective epidermal growth factor receptorinhibitors erlotinib(Tarceva)and gefitinib(Iressa).Oncologist 2005；10：579-89. 
13.Johns TG，Stockert E，Ritter G，等人.Novel monoclonal antibodyspecific for the de2-7 epidermal growth factor receptor(EGFR)that alsorecognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of theEGFR gene.Int J Cancer 2002；98：398-408. 
14.Johns TG，Adams TE，Cochran JR，等人.Identification of theEpitope for the Epidermal Growth Factor Receptor-specific MonoclonalAntibody 806 Reveals That It Preferentially Recognizes an UntetheredForm of the Receptor.J Biol Chem 2004；279：30375-84. 
15.Luwor RB，Johns TG，Murone C，等人.Monoclonal antibody 806inhibits the growth of tumor xenografts expressing either the de2-7 oramplified epidermal growth factor receptor(EGFR)but not wild-typeEGFR.Cancer Res 2001；61：5355-61. 
16.Perera RM，Narita Y，Furnari FB，等人.Treatment of humantumor xenografts with monoclonal antibody 806 in combination with aprototypical epidermal growth factor receptor-specific antibody generatesenhanced antitumor activity.Clinical Cancer Research 2005；11：6390-9. 
17.Mishima K，Johns TG，Luwor RB，等人.Growth suppression ofintracranial xenografted glioblastomas overexpressing mutant epidermalgrowth factor receptors by systemic administration of monoclonalantibody(mAb)806，a novel monoclonal antibody directed to the receptor，[erratum appears in Cancer Res 2001 Oct 15；61(20)：7703-5].CancerResearch 2001；61：5349-54. 
18.Kawamoto T，Sato JD，Le A，Polikoff J，Sato GH，Mendelsohn J. Growth stimulation of A431 cells by epidermal growth factor：identification of high-affinity receptors for epidermal growth factor by ananti-receptor monoclonal antibody.Proc Natl Acad Sci USA 1983；80：1337-41. 
19.Huang HS，Nagane M，Klingbeil CK，等人.The enhancedtumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptorcommon in human cancers is mediated by threshold levels of constitutivetyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J Biol Chem1997；272：2927-35. 
20.Kwok TT，Sutherland RM.Differences in EGF relatedradiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and lownumbers of EGF receptors.British Journal of Cancer 1991；64：251-4. 
21.Johns TG，Mellman I，Cartwright GA，等人.The antitumormonoclonal antibody 806 recognizes a high-mannose form of the EGFreceptor that reaches the cell surface when cells over-express the receptor.Faseb J 2005；19：780-2. 
22.Johns TG，Luwor RB，Murone C，等人.Antitumor efficacy ofcytotoxic drugs and the monoclonal antibody 806 is enhanced by the EGFreceptor inhibitor AG1478.Proc Natl Acad Sci USA 2003；100：15871-6. 
23.Pruss RM，Herschman HR.Variants of 3T3 cells lackingmitogenic response to epidermal growth factor.Proc Natl Acad Sci USA1977；74：3918-21. 
24.Ishizawar R，Parsons SJ.c-Src and cooperating partners inhuman cancer.Cancer Cell 2004；6：209-14. 
25.Masui H，Moroyama T，Mendelsohn J.Mechanism of antitumoractivity in mice for anti-epidermal growth factor receptor monoclonalantibodies with different isotypes.Cancer Res 1986；46：5592-8. 
26.Chung KY，Shia J，Kemeny NE，等人.Cetuximab shows activityin colorectal cancer patients with tumors that do not express the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry.J Clin Oncol2005；23：1803-10. 
27.Lichtner RB，Menrad A，Sommer A，Klar U，Schneider MR.Signaling-inactive Epidermal Growth Factor Receptor/Ligand Complexesin Intact Carcinoma Cells by Quinazoline Tyrosine Kinase Inhibitors.Cancer Res 2001；61：5790-5. 
28.Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，等人.Activating mutations in theepidermal growth factor receptor underlying responsiveness ofnon-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med 2004；350：2129-39. 
29.Luwor RB，Zhu HJ，Walker F，等人.The tumor-specific de2-7epidermal growth factor receptor(EGFR)promotes cells survival andheterodimerizes with the wild-type EGFR.Oncogene 2004；23：6095-104. 
30.LiS，Schmitz KR，Jeffrey PD，Wiltzius JJ，Kussie P，FergusonKM.Structural basis for inhibition of the epidermal growth factorreceptor by cetuximab.Cancer Cell 2005；7：301-11. 
31.Normanno N，De Luca A，Bianco C，等人.Epidermal growthfactor receptor(EGFR)signaling in cancer.Gene 2006；366：2-16. 
32.Bos M，Mendelsohn J，Kim YM，Albanell J，Fry DW，Baselga J.PD153035，a tyrosine kinase inhibitor，prevents epidermal growth factorreceptor activation and inhibits growth of cancer cells in a receptornumber-dependent manner.Clin Cancer Res 1997；3：2099-106. 
33.Perera AD，Kleymenova EV，Walker CL.Requirement for thevon Hippel-Lindau tumor suppressor gene for functional epidermalgrowth factor receptor blockade by monoclonal antibody C225 in renalcell carcinoma.Clin Cancer Res 2000；6：1518-23. 
34.Hambek M，Solbach C，Schnuerch HG，等人.Tumor necrosisfactor alpha sensitizes low epidermal growth factor receptor(EGFR)-expressing carcinomas for anti-EGFR therapy.Cancer Res2001；61：1045-9. 
35.Christensen JG，Schreck RE，Chan E，等人.High levels of HER-2expression alter the ability of epidermal growth factor receptor(EGFR)family tyrosine kinase inhibitors to inhibit EGFR phosphorylation in vivo.Clin Cancer Res 2001；7：4230-8. 
36.Viloria-Petit A，Crombet T，Jothy S，等人.Acquired resistance tothe antitumor effect of epidermal growth factor receptor-blockingantibodies in vivo：a role for altered tumor angiogenesis.Cancer Res2001；61：5090-101. 
37.Heimberger AB，Learn CA，Archer GE，等人.Brain tumors inmice are susceptible to blockade of epidermal growth factor receptor(EGFR)with the oral，specific，EGFR-tyrosine kinase inhibitor ZD1839(iressa).Clin Cancer Res 2002；8：3496-502. 
38.Chakravarti A，Loeffler JS，Dyson NJ.Insulin-like growth factorreceptor I mediates resistance to anti-epidermal growth factor receptortherapy in primary human glioblastoma cells through continuedactivation of phosphoinositide 3-kinase signaling.Cancer Res 2002；62：200-7. 
39.Motoyama AB，Hynes NE，Lane HA.The efficacy of ErbBreceptor-targeted anticancer therapeutics is influenced by the availabilityof epidermal growth factor-related peptides.Cancer Res 2002；62：3151-8. 
40.Magne N，Fischel JL，Dubreuil A，等人.Influence of epidermalgrowth factor receptor(EGFR)，p53 and intrinsic MAP kinase pathwaystatus of tumor cells on the antiproliferative effect of ZD1839(″Iressa″).Br J Cancer 2002；86：1518-23. 
41.Bishop PC，Myers T，Robey R，等人.Differential sensitivity ofcancer cells to inhibitors of the epidermal growth factor receptor family.Oncogene 2002；21：119-27. 
42.LiB，Chang CM，Yuan M，McKenna WG，Shu HK.Resistance tosmall molecule inhibitors of epidermal growth factor receptor in malignant gliomas.Cancer Res 2003；63：7443-50. 
43.Bianco R，Shin I，Ritter CA，等人.Loss of PTEN/MMAC1/TEP inEGF receptor-expressing tumor cells counteracts the antitumor action ofEGFR tyrosine kinase inhibitors.Oncogene 2003；22：2812-22. 
44.Janmaat ML，Kruyt FA，Rodriguez JA，Giaccone G.Response toepidermal growth factor receptor inhibitors in non-small cell lung cancercells：limited antiproliferative effects and absence of apoptosis associatedwith persistent activity of extracellular signal-regulated kinase or Aktkinase pathways.Clin Cancer Res 2003；9：2316-26. 
45.Paez JG，Janne PA，Lee JC，等人.EGFR Mutations in LungCancer：Correlation with Clinical Response to Gefitinib Therapy.Science2004. 
46.Learn CA，Hartzell TL，Wikstrand CJ，等人.Resistance totyrosine kinase inhibition by mutant epidermal growth factor receptorvariant III contributes to the neoplastic phenotype of glioblastomamultiforme.Clin Cancer Res 2004；10：3216-24. 
47.Halatsch ME，Gehrke EE，Vougioukas VI，等人.Inversecorrelation of epidermal growth factor receptor messenger RNA inductionand suppression of anchorage-independent growth by OSI-774，anepidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，inglioblastoma multiforme cell lines.J Neurosurg 2004；100：523-33. 
48.Pao W，Miller VA，Politi KA，等人.Acquired resistance of lungadenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a secondmutation in the EGFR kinase domain.PLoS Med 2005；2：e73. 
49.Mellinghoff IK，Wang MY，Vivanco I，等人.Moleculardeterminants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors.N Engl J Med 2005；353：2012-24. 
实施例2
Src抑制剂达沙替尼和mAb806治疗的动物治疗研究
进行了动物治疗研究以评估单独的抗EGFR抗体mAb806或与src抑制剂达沙替尼联合制剂的体内效应。用1×106 U87MG.Δ2-7SRC皮下注射8周龄的雌性Balb/C nu nu小鼠。U87MG.Δ2-7SRC细胞表达活化的Src(Y529F突变)和Δ2-7突变体EGFR。通过将这些细胞注射到右侧腹和左侧腹的每侧而在各小鼠中制备两种肿瘤。当平均肿瘤体积达约80mm3时开始处理。以四个处理组(由4-5只小鼠/组构成)处理小鼠2周，每周3次。处理组如下：(1)对照-100μl稀释剂4％DMSO/dH2O；(2)达沙替尼-10mg/kg药剂溶解于稀释剂中；(3)mAb806-1mg；(4)mAb 8061mg和达沙替尼10mg/kg。 
抗体。使用小鼠单克隆抗体v-Src 327(Oncogene Research Products，CA，USA)或c-Src H-12(Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，USA)检测Src。使用兔多克隆抗体PY418(Biosource International，Inc.，CA，USA)检测磷酸-Src。 
U87MG.Δ2-7SRC细胞系构建。活化的Src构建体(Y529F突变)得自Upstate Technologies(Lake Placid，NY，USA)。将含有活化的Src c-DNA的Pmel片段亚克隆到得自Invitrogen Life Technologies(carlsbad，CA)的pcDNA3.1/Hygro(+)载体中，然后通过电穿孔转染U87MG.Δ2-7。将1ml等分试样中的细胞铺到96孔板上，密度为约2×104细胞/孔，在37℃下孵育48小时，然后添加100μg/ml潮霉素(Roche Diagnostic，Mannheim，Germany)和400μg/ml遗传霉素(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。 
首先通过FACS分析筛选转染的细胞以确定保留着de2-7EGFR的表达。然后将克隆进行全细胞裂解或免疫沉淀，之后使用Src特异性抗体(v-Src 327，PY418)进行western印迹。鉴别并扩增几个显示出总Src和磷酸化的Src水平显著增加的克隆(Src水平在原始细胞系中极低)。 
异种移植物模型。将在100μl PBS中的肿瘤细胞(1×106)皮下接种到8周龄雌性裸鼠(Animal Research Centre，Perth，Australia)的两侧腹。 所有研究都如之前一样使用所建立的肿瘤模型进行。当肿瘤达到约80mm3的平均体积时开始处理。使用公式(长×宽2)/2来确定肿瘤体积(mm3)，其中长为最长的轴，宽为与长呈直角的尺寸。每个处理组数据表示为平均肿瘤体积±SE(图12)。所有数据通过学生t检验分析显著性。还将数据转化成Kaplan-Meier存活曲线，使用临死时或体积＞1500mm3时两个端点的Wilcoxon分析来进行分析(图13)。 
在第33天，mAb806和达沙替尼处理组肿瘤生长显著小于仅用mAb806处理的组(p＜0.0076)(图12)。将来自肿瘤生长实验的数据转化为Kaplan-Meier存活曲线，使用临死时或体积＞1500mm3时两个端点的Wilcoxon分析来进行分析(图13)。mAb806和达沙替尼联合处理组比所有其他组存活更长(Log Rank p＜0.0001)。 
本发明可以在不背离其精神或基本特征的条件下以其他形式实现或以其他方式实施。因此，本发明公开内容应认为是如所有方面所例示的但并非限制性的，由所附权利要求所指示的本发明范围和在相等的意思和范围内进行的所有改变都旨在包含在本文中。 
此说明书全文引用了许多参考文献，它们中的每个的全文都以引用方式并入本文。 

Claims (11)

1.达沙替尼和mAb806在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述mAb806是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述癌症选自：成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、泌尿生殖系统癌症、结肠癌、黑素瘤、胃癌、胰腺癌、脑癌和血癌。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述癌症是前列腺癌或膀胱癌。
5.达沙替尼和mAb806在制备用于在哺乳动物中阻断或降低EGFR介导的癌症的肿瘤生长的药物组合物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述mAb806是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。
7.如权利要求5所述的用途，其中，所述EGFR介导的癌症选自：成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、肺癌、神经系统癌症、胃肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌和泌尿生殖系统癌症。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述癌症是前列腺癌或膀胱癌。
9.达沙替尼和mAb806在制备用于增强哺乳动物中抗EGFR抗体效力或活性的药物组合物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中，所述mAb806是识别在肿瘤发生、过度增殖或异常细胞中发现而在正常细胞中检测不到的EGFR表位的抗体。
11.药物组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的mAb806和达沙替尼。
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MX (1) MX2009009782A (zh)
WO (1) WO2008115404A1 (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100056762A1 (en) 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
EP2126127B1 (en) 2007-01-25 2016-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
US20100183615A1 (en) * 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
EP2188311B1 (en) 2007-08-14 2016-10-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
US8119129B2 (en) 2008-08-01 2012-02-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination of anti-CTLA4 antibody with dasatinib for the treatment of proliferative diseases
JP5589077B2 (ja) * 2009-07-20 2014-09-10 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 増殖性疾患の相乗的処置のための抗ｃｔｌａ４抗体と多様な治療レジメンとの組み合わせ
WO2011035465A1 (zh) * 2009-09-22 2011-03-31 上海市肿瘤研究所 特异性结合蛋白及其使用
KR101108642B1 (ko) * 2009-09-29 2012-02-09 주식회사 녹십자 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체
WO2012099968A1 (en) * 2011-01-19 2012-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating skin cancer associated diseases
JP2013116051A (ja) * 2011-12-01 2013-06-13 Sysmex Corp 腫瘍細胞のダサチニブへの感受性の判定方法およびその利用
WO2013152313A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer and diseases and conditions responsive to growth factor inhibition
KR20220025946A (ko) 2014-03-21 2022-03-03 애브비 인코포레이티드 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항체 약물 접합체
WO2015195721A1 (en) * 2014-06-16 2015-12-23 Purdue Research Foundation Compositions and methods for treating cancer
US20170022576A1 (en) 2015-03-18 2017-01-26 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for identifying anti-cancer, anti-metastatic and anti-stress agents
US20180338955A1 (en) * 2015-10-29 2018-11-29 Nikolaos Tapinos Methods for regulation and treatment of glioma cell migration and glioblastoma
CN113321700B (zh) * 2020-06-02 2022-07-01 泰比瑞医药科技(石家庄)有限公司 一种降解靶蛋白的双功能化合物及其用途
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr

Family Cites Families (246)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4151042A (en) * 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4162940A (en) 1977-03-31 1979-07-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing Antibiotic C-15003 by culturing nocardia
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4137230A (en) * 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) * 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) * 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) * 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4263294A (en) * 1978-11-20 1981-04-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids, pharmaceutical compositions thereof and method of use thereof
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) * 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) * 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) * 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5622790A (en) * 1979-07-31 1981-03-03 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
WO1982001188A1 (en) * 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4413132A (en) 1980-11-18 1983-11-01 The Upjohn Company Antibiotic CC-1065 indoline intermediates
US4313946A (en) * 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4867973A (en) 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
FR2523445A1 (fr) 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4418064A (en) 1982-09-29 1983-11-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids: treflorine, trenudine, and N-methyltrenudone
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0171407B1 (en) 1984-01-30 1993-11-18 Imperial Cancer Research Technology Limited Improvements relating to growth factors
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5851526A (en) 1985-04-19 1998-12-22 Ludwig Institute For Cancer Research Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4997913A (en) * 1986-06-30 1991-03-05 Oncogen pH-sensitive immunoconjugates and methods for their use in tumor therapy
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
USRE38008E1 (en) * 1986-10-09 2003-02-25 Neorx Corporation Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
US5034223A (en) 1986-10-09 1991-07-23 Neorx Corporation Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
US5047324A (en) 1986-12-09 1991-09-10 Miles Inc. Substantially pure enzyme-antibody conjugate preparations
US5332837A (en) 1986-12-19 1994-07-26 The Upjohn Company CC-1065 analogs
US4952394A (en) 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
US5563250A (en) 1987-12-02 1996-10-08 Neorx Corporation Cleavable conjugates for the delivery and release of agents in native form
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US4937183A (en) 1988-02-03 1990-06-26 Cytogen Corporation Method for the preparation of antibody-fragment conjugates
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
EP0329184A3 (en) * 1988-02-19 1990-05-23 Neorx Corporation Antimers and antimeric conjugation
US6010902A (en) * 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US5028697A (en) 1988-08-08 1991-07-02 Eli Lilly And Company Cytotoxic antibody conjugates of hydrazide derivatized methotrexate analogs via simple organic linkers
US5541339A (en) 1988-09-12 1996-07-30 The Upjohn Company CC-1065 analogs having two CPI subunits
US5171563A (en) 1988-09-30 1992-12-15 Neorx Corporation Cleavable linkers for the reduction of non-target organ retention of immunoconjugates
CA2000549A1 (en) 1988-10-12 1990-04-12 David V. Woo Radiotherapeutic immunoconjugates labeled with iodine-125
US5217713A (en) 1988-12-27 1993-06-08 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cytotoxic bispecific monoclonal antibody, its production and use
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5013547A (en) 1989-02-07 1991-05-07 Erbamont, Inc. Anticancer drug - antibody conjugates and method for preparing same
US5980896A (en) 1989-06-30 1999-11-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies reactive with human carcinomas
US6020145A (en) * 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5332567A (en) 1989-08-24 1994-07-26 Immunomedics Detection and treatment of infections with immunoconjugates
ATE135373T1 (de) 1989-09-08 1996-03-15 Univ Johns Hopkins Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
WO1991013356A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Coulter Corporation Improved antibody-enzyme direct conjugates and method of making same
EP0527189A1 (en) * 1990-04-25 1993-02-17 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Novel cc-1065 analogs
US6248332B1 (en) 1990-10-05 2001-06-19 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
FI101678B1 (fi) * 1990-12-31 1998-08-14 Akzo Nv Happolabiileja kytkentämolekyylejä
EP1362868A3 (en) 1991-03-06 2004-02-11 MERCK PATENT GmbH Humanized and chimeric monoclonal antibodies that bind epidermal growth factor receptor (EGF-R)
US6797492B2 (en) 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5869619A (en) * 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
DK0563475T3 (da) 1992-03-25 2000-09-18 Immunogen Inc Konjugater af cellebindende midler og derivater af CC-1065
DK0586002T3 (da) 1992-08-18 2000-06-19 Centro Inmunologia Molecular Monoklonale antistoffer, som genkender epidermisvækstfaktor-receptoren, celler og fremgangsmåder heraf og præparater indeho
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5674977A (en) 1993-02-05 1997-10-07 The Ontario Cancer Institute Branched synthetic peptide conjugate
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) * 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
JPH09510201A (ja) 1994-03-07 1997-10-14 メダレツクス・インコーポレーテツド 臨床的効用を有する二重特異性分子
RU2170257C2 (ru) 1994-03-17 2001-07-10 Мерк Патент Гмбх Анти-эфрр одноцепочечный fv, химерное анти-эфрр антитело и способ его получения, фармацевтическая композиция для лечения опухолей, средство для диагностики локализации или оценки роста опухоли
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US5612474A (en) * 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
CA2206343C (en) 1994-11-28 2009-04-07 Thomas Jefferson University Reagents and processes for targeting mutant epidermal growth factor receptors
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US7060808B1 (en) * 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
WO1996040662A2 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
WO1997012862A1 (en) 1995-10-03 1997-04-10 The Scripps Research Institute Cbi analogs of cc-1065 and the duocarmycins
US6699715B1 (en) * 1995-11-30 2004-03-02 Bristol-Myers Squibb Co. Modified sFv molecules which mediate adhesion between cells and uses thereof
ES2195036T3 (es) 1995-12-22 2003-12-01 Bristol Myers Squibb Co Conectores de hidrazona ramificados.
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
CA2255703A1 (en) 1996-05-31 1997-12-04 Dale L. Boger Analogs of cc-1065 and the duocarmycins
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
CA2290789A1 (en) 1997-05-22 1998-11-26 Dale L. Boger Analogs of duocarmycin and cc-1065
WO1999019298A1 (en) * 1997-10-14 1999-04-22 The Scripps Research Institute iso-CBI AND iso-CI ANALOGS OF CC-1065 AND THE DUOCARMYCINS
AU1807999A (en) 1997-12-08 1999-06-28 Scripps Research Institute, The Synthesis of cc-1065/duocarmycin analogs
US6417168B1 (en) 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
US20030224001A1 (en) 1998-03-19 2003-12-04 Goldstein Neil I. Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
CA2327505A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
US6962702B2 (en) * 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US20030215387A1 (en) 1998-09-04 2003-11-20 Peter Harrison Bifunctional antibodies and their use in targeting anti-tumour agents
CA2373815A1 (en) * 1999-05-14 2000-11-23 Imclone Systems Incorporated Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor antagonists
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
DE60032633T2 (de) * 1999-11-24 2007-10-04 Immunogen Inc., Cambridge Zytotoxische mittel, die taxane enthalten und ihre therapeutische anwendung
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
YU63302A (sh) 2000-02-25 2005-09-19 The Government Of The Un.Stat. Anti-egfrv iii scfvs sa pojačanom citotoksičnošću i povećanim prinosom, imunotoksini na bazi istog i metodi za upotrebu na bazi istog
WO2001068711A1 (en) 2000-03-10 2001-09-20 Thomas Jefferson University Sensitive detection of wild-type and mutant egfr by specific elisa assays in any biological sample
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
ES2637801T3 (es) * 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
EP1280771B1 (de) 2000-05-02 2004-10-13 Tietze, Lutz F., Prof. Dr. Neue prodrugs von 6-hydroxy-2,3-dihydro-1h-indolen, 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-pyrrolo 3,2-e]indolen und 5-hydroxy-1,2-dihydro-3h-benzo e]indolen sowie von 6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-benzo f]chinolin-derivaten für eine selektive krebstherapie
JP2001319456A (ja) * 2000-05-12 2001-11-16 Sony Corp テープカセット
ES2331646T3 (es) 2000-05-19 2010-01-12 Genentech, Inc. Ensayo para la deteccion de genes para mejorar la probabilidad de una respuesta eficaz a una terapia contra el cancer basada en antagonistas de erbb.
AUPQ841800A0 (en) 2000-06-28 2000-07-20 Biomolecular Research Institute Limited Truncated egf receptor
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
AR030612A1 (es) 2000-09-12 2003-08-27 Smithkline Beecham Corp Procedimiento e intermedios
DK1320522T3 (da) * 2000-09-19 2006-04-03 Moses Lee Achirale analoger af CC-1065 og af duocarmyciner samt præparater og metoder til anvendelse deraf
DE10048417A1 (de) 2000-09-29 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verbindungen mit verzweigtem Linker
WO2002030924A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives with anti-tumour activity
HUP0303173A2 (hu) 2001-02-19 2003-12-29 Merck Patent Gmbh Csökkent immunogenitású, módosított anti-EGFR-ellenanyagok
US20080008704A1 (en) * 2001-03-16 2008-01-10 Mark Rubin Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies
US20020156274A1 (en) 2001-03-16 2002-10-24 Terfloth Gerald J. Process for preparing maytansinol
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7256257B2 (en) 2001-04-30 2007-08-14 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US20030083263A1 (en) 2001-04-30 2003-05-01 Svetlana Doronina Pentapeptide compounds and uses related thereto
HUP0303976A3 (en) 2001-05-08 2006-11-28 Merck Patent Gmbh Combination therapy using anti-egfr antibodies and hormone antagonists
US20110313230A1 (en) 2001-05-11 2011-12-22 Terrance Grant Johns Specific binding proteins and uses thereof
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
WO2002092771A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Ludwig Institute For Cancer Research Specific binding proteins and uses thereof
CN101671335A (zh) * 2001-05-31 2010-03-17 梅达莱克斯公司 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
IL159225A0 (en) 2001-06-13 2004-06-01 Genmab As Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
US20050107595A1 (en) 2001-06-20 2005-05-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003014159A1 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of screening based on the egf receptor crystal structure
US20030109682A1 (en) 2001-09-07 2003-06-12 Daniel Santi Maytansines and maytansine conjugates
CA2459308A1 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Dale L. Boger Cbi analogues of cc-1065 and the duocarmycins
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
EP1458737A4 (en) 2001-11-21 2006-03-29 Univ Washington BIOSYNTHETIC MULTIGENIC FAMILY FOR ANTI-TUMOR AGENT ANSAMITOCIN MAYTANSINOIDE
US6716821B2 (en) * 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
JP2005532258A (ja) * 2002-01-03 2005-10-27 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 免疫コンジュゲートの調製方法
US6790954B2 (en) 2002-01-29 2004-09-14 Immunogen, Inc. Mutant Actinosynnema pretiosum strain with increased maytansinoid production
US7714113B2 (en) 2002-02-13 2010-05-11 Ludwig Institute For Cancer Research Fusion proteins of humanized g250 specific antibodies and uses thereof
WO2003080569A2 (en) 2002-03-19 2003-10-02 The Penn State Research Foundation Egfr ligands and methods of use
US6534660B1 (en) * 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
WO2003096782A2 (en) 2002-05-13 2003-11-27 Smithkline Beecham Corporation Process for preparing maytansinol
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
EP1575491A4 (en) * 2002-05-20 2006-09-27 Abgenix Inc TREATMENT OF RENAL CARCINOMA USING ANTIBODIES AGAINST THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR
WO2005056606A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
JP2006512895A (ja) 2002-06-28 2006-04-20 ドマンティス リミテッド リガンド
ES2544527T3 (es) * 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
EP1534674A4 (en) 2002-08-02 2007-11-28 Immunogen Inc CYTOTOXIC AGENTS CONTAINING NEW, EFFECTIVE TAXANES AND THEIR THERAPEUTIC USE
ES2361739T3 (es) 2002-08-16 2011-06-21 Immunogen, Inc. Reticulantes con elevada reactividad y solubilidad y su uso en la preparación de conjugados para el suministro dirigido de fármacos de molécula pequeña.
EP1578371A4 (en) * 2002-08-19 2009-05-20 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS
EP1549344B1 (en) 2002-10-10 2015-01-07 Merck Patent GmbH Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
EP1560599A1 (en) 2002-11-14 2005-08-10 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
US20040147428A1 (en) 2002-11-15 2004-07-29 Pluenneke John D. Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
CA2450289A1 (en) 2003-03-20 2005-05-19 Imclone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
EP1622941A2 (en) 2003-03-20 2006-02-08 ImClone Systems Incorporated Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor
US7432088B2 (en) 2003-05-08 2008-10-07 Immunogen Inc. Methods for the production of ansamitocins
US20050026987A1 (en) * 2003-05-13 2005-02-03 The Scripps Research Institute CBI analogues of the duocarmycins and CC-1065
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
WO2004110498A2 (en) * 2003-05-14 2004-12-23 Immunogen, Inc. Drug conjugate composition
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
JP2005010697A (ja) * 2003-06-23 2005-01-13 Sanyo Electric Co Ltd 表示装置
EP2457586A1 (en) * 2003-06-27 2012-05-30 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
JP4479194B2 (ja) * 2003-08-29 2010-06-09 富士ゼロックス株式会社 動作識別装置、及び対象物の姿勢識別装置
US8101720B2 (en) * 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
TWI233066B (en) * 2003-10-24 2005-05-21 Univ Nat Chiao Tung Monitoring system for burglarproof
SG149815A1 (en) 2003-11-06 2009-02-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
EP2275448A3 (en) 2003-12-19 2013-02-06 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
WO2005070457A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Seattle Genetics, Inc. Melphalan prodrugs
US7767792B2 (en) * 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
EP1718667B1 (en) * 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
TW200533339A (en) 2004-03-16 2005-10-16 Bristol Myers Squibb Co Therapeutic synergy of anti-cancer compounds
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
EP3611273A1 (en) 2004-03-31 2020-02-19 The General Hospital Corporation Method to determine responsiveness of cancer to epidermal growth factor receptor targeting treatments
US7838519B2 (en) 2004-04-14 2010-11-23 The Ohio State University Research Foundation Maytansinoid analogs as antitumor agents
BRPI0510909A2 (pt) * 2004-05-19 2008-12-16 Medarex Inc composto de ligaÇço fÁrmaco-ligante citotàxico, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula e mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de tumor
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
GB0412074D0 (en) * 2004-05-29 2004-06-30 Astrazeneca Ab Combination product
MXPA06014065A (es) 2004-06-01 2007-01-31 Genentech Inc Conjugados de droga-anticuerpo y metodos.
US20060029574A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Biomarkers for diagnosis, prognosis, monitoring, and treatment decisions for drug resistance and sensitivity
CN101065151B (zh) 2004-09-23 2014-12-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006132670A2 (en) 2004-11-12 2006-12-14 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the n terminus
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
US20070134243A1 (en) 2004-12-01 2007-06-14 Gazzard Lewis J Antibody drug conjugates and methods
EP1688415A1 (en) 2004-12-07 2006-08-09 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new C-2 modified taxanes
EP1669358A1 (en) * 2004-12-07 2006-06-14 Aventis Pharma S.A. Cytotoxic agents comprising new taxanes
US7301019B2 (en) 2005-01-21 2007-11-27 Immunogen, Inc. Method for the preparation of maytansinoid esters
AU2006213662B2 (en) 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
JP2008536493A (ja) 2005-04-01 2008-09-11 アムジエン・インコーポレーテツド 上皮増殖因子受容体遺伝子のコピー数
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
CA2614436C (en) * 2005-07-07 2016-05-17 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
PL3248613T3 (pl) 2005-07-18 2022-04-19 Seagen Inc. Koniugaty β-glukuronid-linker-lek
CA2615122A1 (en) * 2005-08-03 2007-02-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugate formulations
EP1909846B1 (en) 2005-08-05 2018-12-26 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers, conjugates comprising the same and processes for their preparation
WO2007021674A2 (en) * 2005-08-09 2007-02-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of acylating maytansinol with chiral amino acids
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP4963020B2 (ja) * 2005-08-23 2012-06-27 株式会社泉精器製作所 往復式電気かみそりの内刃
NZ609752A (en) 2005-08-24 2014-08-29 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
ES2283192B1 (es) * 2005-09-16 2008-09-16 GAMESA INNOVATION & TECHNOLOGY, S.L. Metodo de montaje de elementos en el interior de la torre de un aerogenerador.
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
ES2375843T3 (es) 2005-10-26 2012-03-06 Medarex, Inc. Procedimientos y compuestos para la preparación de an�?logos de cc-1065.
ATE540956T1 (de) 2005-11-08 2012-01-15 Immunogen Inc Verfahren zur herstellung von maytansinol
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
DK1948180T3 (da) 2005-11-11 2013-05-27 Boehringer Ingelheim Int Kombinationsbehandling af cancer omfattende EGFR/HER2 inhibitorer
PT1951759E (pt) 2005-11-12 2010-04-01 Lilly Co Eli Anticorpos anti-egfr
US20090214541A1 (en) 2006-01-04 2009-08-27 L'instut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Combination Therapy Using Anti-EGFR and Anti-HER2 Antibodies
CA2641899A1 (en) 2006-02-02 2007-08-09 Syntarga B.V. Water-soluble cc-1065 analogs and their conjugates
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
WO2007103288A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibody drug conjugates
EP1832577A1 (en) * 2006-03-07 2007-09-12 Sanofi-Aventis Improved prodrugs of CC-1065 analogs
EP1996193A2 (en) * 2006-03-13 2008-12-03 OSI Pharmaceuticals, Inc. Combined treatment with an egfr kinase inhibitor and an agent that sensitizes tumor cells to the effects of egfr kinase inhibitors
US20080010945A1 (en) * 2006-06-01 2008-01-17 Mckenna S J Handle assembly for packages and method of making same
US20110038856A1 (en) 2006-11-02 2011-02-17 Seattle Genetics, Inc. Methods of treating neoplastic, autoimmune and inflammatory diseases
US7790164B2 (en) 2006-11-14 2010-09-07 Van Andel Research Institute Fragments of antibodies to epidermal growth factor receptor and methods of their use
WO2008140493A2 (en) 2006-11-21 2008-11-20 The Regents Of The University Of Californina Anti-egfr family antibodies, bispecific anti-egfr family antibodies and methods of use thereof
EP2126127B1 (en) 2007-01-25 2016-09-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Use of anti-egfr antibodies in treatment of egfr mutant mediated disease
WO2008154927A1 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Genmab A/S Novel methods for treating egfr-associated tumors
WO2009017394A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Syntarga B.V. Substituted cc-1065 analogs and their conjugates
EP2188311B1 (en) 2007-08-14 2016-10-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Monoclonal antibody 175 targeting the egf receptor and derivatives and uses thereof
US20090269343A1 (en) 2008-04-11 2009-10-29 Duke University Dual Specific Immunotoxin for Brain Tumor Therapy
JP5769616B2 (ja) 2008-04-30 2015-08-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド クロスリンカーおよびそれらの使用
KR20110016959A (ko) 2008-06-03 2011-02-18 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US8426402B2 (en) 2009-02-05 2013-04-23 Immunogen, Inc. Benzodiazepine derivatives
MX2011011670A (es) * 2009-05-01 2011-11-18 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable dual y usos de las mismas.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hui K. Gan,et al.The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Tyrosine Kinase Inhibitor AG1478 Increases the Formation of Inactive Untethered EGFR Dimers， Implication for Combination Therapy with Monoclonal Antibody 806.《The Journal of Biological Chemistry》.2007,第282卷(第5期), *
S. Kopetz,et al.Synergistic effects of combination therapy with anti-EGFR and anti-Src therapy in vitro in colon cancer.《2007 Gastrointestinal Cancers Symposium》.2007,摘要. *

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