KR101108642B1

KR101108642B1 - 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체

Info

Publication number: KR101108642B1
Application number: KR1020090092401A
Authority: KR
Inventors: 김세호; 장기환; 홍광원; 신용원; 김민수; 이해원; 신용남; 류경환; 서동혁
Original assignee: 주식회사 녹십자
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2012-02-09
Also published as: CN102574919A; WO2011040668A1; HRP20161459T1; EP2483309B1; LT2483309T; CA2774427A1; PT2483309T; US8748175B2; RU2518239C2; US20120231021A1; DK2483309T3; JP5729839B2; ES2592883T3; PL2483309T3; EP2483309A4; SI2483309T1; EP2483309A1; CA2774427C; MY163502A; JP2013505736A

Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로, 본 발명의 항체는 표피 성장 인자 수용체에 우수한 결합 능력 및 중화 효과를 나타내므로, 표피 성장 인자 수용체를 통한 신호전달과 관련된 암 치료용 조성물에 사용될 수 있다.

표피 성장 인자 수용체, 항체, 상보성 결정 영역, 암, 항체 라이브러리, 패닝

Description

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 {Antibodies specifically binding to the epidermal growth factor receptor}

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)는 170kDa의 제 1형 막 단백질로서, 다양한 종류의 종양에서 과잉 발현되는 것으로 알려져 있다. 표피 성장 인자 수용체의 과잉발현은, 예컨대 특정 암인, 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부 및 경부 암, 난소암 및 전립선암에서 관찰되었다. 이러한 표피 성장 인자 수용체가 과잉 발현된 종양 세포는 표피 성장 인자 수용체의 리간드인, EGF(epidermal growth factor) 및 TGF-α(transforming growth factor)를 생산하는데, 상기 리간드는 표피 성장 인자 수용체에 결합하여 세포 증식과 종양 성장을 유도하는 것으로 입증되었다. 따라서, 표피 성장 인자 수용체에 대한 항체를 사용하여 표피 성장 인자 수용체에 표피 성장 인자(EGF)가 결합하는 것을 저해하면 암세포의 성장을 억제하여 암을 치료할 수 있으며, 이는 표피 성장 인자 수용체에 대한 단일클론 항체를 대상으로 하여 이미 실험적으로 증명되었다.

현재, 임상 분야에서 전이성 대장암의 치료에 사용되고 있는 C225 항체(제품명: Erbitux; ImClone사, 미국)는 키메라 항체로서, 마우스의 가변 영역과 인간 항체의 IgG1 불변 영역을 결합한 것(마우스 아미노산 서열 약 30% 포함)으로 시험관내에서 EGF에 의한 종양 세포 성장 및 표피 성장 인자 수용체의 인산화를 억제하며 누드 마우스에서 인간 종양이 형성되는 것을 억제한다. 또한, 상기 항체는 특정 화학치료제와 상승 작용하여 이종이식편 마우스 모델에서 인간 종양을 근절시키는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 상기 C225 항체는 환자에게 면역 반응을 유발(~10%)하는 문제점이 있어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 개선된 치료용 항체가 요구되고 있다.

최근 5년간 미국 식약청(FDA)이 허가한 항암 신약 가운데 표적 치료제가 50%를 차지하고 있다. 항체는 표적 특이성 및 면역계를 효과적으로 유발할 수 있는 능력을 갖고 있으며, 이러한 항체의 능력과 긴 반감기로 인해 많은 연구자들이 항체의 치유적 잠재력에 주목하였고 최근 미국 식약청은 암 치료를 위한 여러 가지 항체에 대해 승인하고 있다. 또한, 단일 클론 항체는 질환 치료에 있어 중요한 역할을 수행하고 있으며 최근의 기술 발전으로 완전한 인간 항체를 개발할 수 있게 되면서 훨씬 더 많은 관심을 받게 되었다.

이에, 본 발명자들은 패닝 및 친화도 성숙 과정을 통해 종래 알려지지 않은 새로운 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 인간 항체를 개발하였고, 상기 항체가 표피 성장 인자 수용체를 통한 신호전달을 저해하여 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.

상기 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 인간 항체는 표피 성장 인자 수용체에 우수한 결합 능력 및 중화 효과를 나타내므로, 표피 성장 인자 수용체를 통한 신호전달을 저해하는 암 치료용 항체로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) 서 열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체는 a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역; b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역; b) 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체는 a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역; b) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역; c) 중쇄 불변 영역; 및 d) 경쇄 불변 영역을 포함하는 항체일 수 있다.

본 발명의 항체들은 인간 항체인 것이 바람직하며, 표피 성장 인자(EGF)에 의한 신호전달을 저해함으로써 암 치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 표피 성장 인자 수용체에 특이적인 항체는 바람직하게는 파아지-디스플 레이 기술(Smith, Science, 228, 1315-1317, 1985; 및 Hoogenboom & Chames, Immunol Today, 21, 371-378, 2000)을 응용하여 선별될 수 있다. 다음과 같이 파아지-디스플레이 기술을 응용하여, 필라멘트(filamentous) 파아지(M13, Fd 및 F1) 표피 단백질을 발현하는 유전자(gene III)에 목적하는 항체를 발현하는 유전자를 융합시켜, 상기 융합된 항체가 박테리오 파아지 입자의 표면에 노출된 항체-파아지 형태의 바이러스 입자를 생성시키고, 상기 노출된 항체의 높은 특이도 및 친화도, 파아지의 높은 감염성을 이용하여 바이오패닝(biopanning) 기법을 통해 파아지 라이브러리로부터 원하는 항체를 선별할 수 있다(Burton & Barbas, Adv . Immunol., 57, 191-280, 1994; Winter et al., Annu . Rev . Immunol., 12, 433-455, 1994; 및 Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20, 1998). 상기 파아지-디스플레이 벡터로는 pKS4H(대한민국 특허등록 제 0635370호 참고) 또는 pCANTAB5E를 사용할 수 있으며, pKS4H가 바람직하다.

본 발명에서는 파아지 라이브러리를 통해 인간 항체(ER414)를 선별한 후, 표피 성장 인자 수용체에 대한 친화도와 중화능을 확인하였다(도 9 및 11). 선별된 상기 ER414 항체는 중화능을 갖지만 상용 항체인 C225항체에 비해 16배 정도 낮은 친화도를 갖고 있다. 따라서 효능이 개선된 항체를 얻기 위해 친화도를 증가시키는 친화도 성숙(Affinity maturation) 과정을 통해 친화도가 동등한 항체를 선별하였다. 즉, 본 발명에서 친화도 성숙 과정은 최초 선별된 인간 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; CDR) 아미노산 무작위화(randomization)를 통해 라이브러리를 구축한 후, 바이오패닝(Biopanning) 기법을 통해 친화도가 성숙된 항체를 선별하고 최종적으로 C225 항체와 동등 이상의 친화도를 갖는 항체(ER2 & ER79)를 선별하였다.

선별한 항체(ER2)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에서의 CDR 아미노산 서열을 분석한 결과, 중쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3은 각각 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 한편, 선별한 항체(ER79)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에서의 CDR 아미노산 서열을 분석한 결과, 중쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3은 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3은 각각 서열번호 9, 5 및 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 공지된 인간 항체의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역일 수 있으며, 바람직하게는 상기 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 각각 서열번호 43 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산을 가질 수 있다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 11의 염기서열, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 12의 염기서열 및 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열변호 7의 아미노산을 코딩하는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 15의 염기서열, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 16의 염기서열 및 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

나아가, 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 19의 염기서열, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 16의 염기서열 및 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제공한다. 바람직하게는, 상기 DNA는 상기 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 도 5에 개시된 개열지도를 갖는 "ER2-Heavy-pRC13" 또는 "ER79-Heavy-pRC13"일 수 있다.

구체적으로, 상기 벡터는 패닝 및 친화도 성숙 과정을 통해 선별한 항체의 VH 단편(1-a: ER2Ab-H 또는 1-b: ER79Ab-H)을 적절한 벡터, 예를 들어 pRC13 벡터(기탁번호 KCLRF-BP-00054; 대한민국 특허등록 제523732호 참조)에 삽입하여 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 각각 도 6 및 도 7에 개시된 개열지도를 갖는 "ER2-Light-pKC12" 또는 "ER79-Light-pKC12"일 수 있다.

구체적으로, 패닝 및 친화도 성숙 과정을 통해 선별한 항체의 VL 단편(2-a: ER2Ab-L 또는 2-b: ER79Ab-L)을 적절한 벡터, 예를 들어 pKC12 벡터(기탁번호 KCLRF-BP-00054; 대한민국 특허등록 제523732호 참조)에 삽입하여 제조될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기에서 제조된 항체의 중쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터 및 항체의 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터로 형질전환된 동물 세포주를 제공한다. 상기 중쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터는 바람직하게는 ER2-Heavy-pRC13 또는 ER79-Heavy-pRC13일 수 있으며, 상기 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터는 바람직하게는 ER2-Light-pKC12 또는 ER79-Light-pKC12일 수 있다. 상기 동물 세포주는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 293 세포 또는 NSO 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 CHO 세포일 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 위와 같은 발현벡터에서 발현된 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역이 서로 결합됨으로써 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 항원결합 친화도(affinity)는, 예를 들어 경쟁적 효소면역측정법(competitive ELISA; Kim et al., Hybridoma, 20, 265-272, 2001)에 의해 측정할 수 있는데, 도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 인간 항체들 중 ER2는 C225항체와 동등한 친화도를 갖고 ER79는 약 2배 정도 낮은 친화도를 갖는다. 또한, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 표피 성장 인자 수용체가 과량 발현되는 암세포주에서 표피 성장 인자 수용체에 결합함을 확인하였고(도 10), 유방암 세포의 표피 성장 인자 수용체 인산화 저해 실험을 통해서 두 인간 항체의 중화능을 확인하였다(도 11). 따라서, 본 발명의 인간 항체는 표피 성장 인자 수용체를 통한 신호전달을 저해하는 암 치료용 항체로 사용될 수 있으며, 이에 본 발명은 상기 항체를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 암 치료용 조성물은 항체 외에 시스플라틴(cisplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 독소루비신(doxorubicin), 5-FU(fluorouracil), 이리노테칸(irrinotecan) 및 파클리탁셀(paclitaxel)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 예시한 것들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 모든 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.

실시예 1: RNA의 분리

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체의 선별을 위하여, 항체 유전자 라이브러리를 구축하였다. 이때 사용된 RNA는 사람 골수 RNA(Human bone marrow total RNA), 사람 흉선 RNA(Human thymus total RNA), 사람 비장 RNA(Human spleen total RNA) 및 사람 B 세포 RNA를 혼합하여 사용하였고, 사람 B 세포 RNA 를 제외한 나머지 RNA는 Clontech사(미국)로부터 구입하였고, 사람 B 세포 RNA는 하기의 방법으로 분리하였다.

사람 B 세포 RNA는 건강한 성인 1인에게서 50 mL를 채혈하여 HBSS(Hank's balanced salt solution; Sigma사, 미국) 50 mL와 1:1로 희석하여 보관한 후, 50 mL 튜브에 Histoprep(Sigma사) 10 mL를 넣고 그 위에 HBSS와 1:1로 희석된 혈액 20 mL를 첨가하고 3000 rpm으로 원심분리하여 백혈구 층을 분리하였다. 상기 분리된 백혈구 2 mL를 6 mL의 HBSS와 혼합한 후, 1000 rpm으로 원심분리하였다. 분리된 백혈구 100 μL를 1 mL의 트리졸(Life Technology사, 미국)과 혼합하여 RNA를 분리하였다.

한편, 상기 분리된 RNA를 증류수로 희석한 후 260 nm에서 흡광도를 측정하여 그 양을 계산하였다(1.8 μg/μL; 울트라스펙 2000 자외선-가시광선 분광광도계, GE, 미국). 보다 자세한 과정은 다음과 같다.

백혈구 100 μL당 트리졸 1 mL를 넣고 피펫으로 세포를 잘 풀어준 후, 실온(15℃ 내지 30℃)에서 5분 동안 방치하였다. 그리고 나서, 트리졸 1 mL당 클로로포름 200 μL를 넣어 잘 섞고, 뚜껑을 닫고 손으로 15초 동안 세게 흔들어준 후 실온에서 3분 동안 방치하였다. 그 후, 2 내지 8℃에서 15분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. 트리졸 1 mL당 이소프로필 알콜 500 μL를 넣고 잘 섞어 준 다음, 실온에서 10분 동안 방치하였다. 그 후, 2 내지 8℃에서 10분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 트리졸 1mL당 75% 에탄올 1 mL를 넣고, 2 내지 8℃에서 5분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하 여 에탄올을 제거한 후, RNA 펠렛을 상온에서 5분 동안 건조시켰다. 상기 건조된 펠렛에 증류수 150 μL를 넣어 RNA를 잘 녹인 후, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였고, 나머지는 -20℃에서 보관하였다.

실시예 2: 항체 유전자 증폭

실시예 1에서 분리한 RNA 1 μg, pd(T)_12-18(0.5 μg/μL) 1 μL를 총 부피가 12.5 μL가 되도록 증류수를 넣고 혼합하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 2분간 반응시키고 얼음에서 냉각시킨 후, 5X 반응 완충액, 10 mM dNTP 혼합물, 재조합 RNase 저해제(recombinant RNase inhibitor), MMLV 역전사효소(Clontech, 미국)를 첨가하여 최종 20 μL로 맞추어 준 후 42℃ 1시간, 95℃ 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하여 LiquiMix QM Premix, Magenta(Neurotics Inc, 한국)를 사용하여 각각 scFv 영역(single chain Fv), 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역(kappa 및 lambda)에 맞게 고안된 각각의 프라이머(ScFv: 서열번호: 21, 22 및 23; 중쇄 가변영역: 서열번호: 24, 25, 26, 27; κ쇄: 서열번호: 28, 29, 30, 31, 32 및 33; λ쇄: 서열번호: 34, 35, 36 및 37) 1 μL (25 pmol/μL)씩을 이용하여 합성한 cDNA 4 μL, 증류수 19 μL를 넣고 PCR 반응을 실시하였다. 상기 PCR에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

PCR 반응에 사용한 프라이머

프라이머 종류	서열	서열번호
scFv-Forward	5'-GTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3'	21
scFv-Reverse	5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTT-3'	22
scFv-Reverse	5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACC-3'	23
VH1-Forward	5'-CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGG-3'	24
VH3-Forward	5'-CAGCCGGCCATGGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG-3'	25
VH4-Forward	5'-CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGC-3'	26
VH-Reverse	5'-CGATCCGCCACCTCCGGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3'	27
VK1/3A-Forward	5'-GGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'	28
VK1/3B-Forward	5'-GGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCA-3'	29
VK2-Forward	5'-GGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACCCAGACTCCACTC-3'	30
JK_A-Reverse	5'-TCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATWTCCACYTTGGTCCC-3'	31
JK_B-Reverse	5'-TCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCASCTTGGTCCC-3'	32
JK_C-Reverse	5'-TCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'	33
VL_A-Forward	5'-GGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCGCAGTCTGYSCTGACTCAGCCACCC-3'	34
VL_B-Forward	5'-GGTGGCTCCGGAGGTGGCGGATCGTCCTATGAGCTGACWCAGCCACCC-3'	35
JL_A-Reverse	5'-TTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTSASCTTGGTCCC-3'	36
JL_B-Reverse	5'-TTCTCGACTTGCGGCCGCACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3'	37

PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 2분으로 30회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 15분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다.

이렇게 합성된 항체 DNA를 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고(도 1 참조), 각 DNA를 퀴아젠 키트(Qiagen사, 독일)로 정제하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, PCR에서 중쇄 및 경쇄(kappa 및 lambda) 가변영역에 특이한 약 350 염기쌍의 DNA 밴드를 얻었다. 도 1에서 M은 사이즈 마커를, VH는 중쇄 가변영역(레인 1-중쇄 가변영역 타입1; 레인 2-중쇄 가변영역 타입3; 및 레인 3-중쇄 가변영역 타입4)을, VL은 경쇄 가변영역(레인 4-경쇄 가변영역 1/3 κ; 레인 5-경쇄 가변영역 2 κ; 및 레인 6-경쇄 가변영역 λ)의 PCR 결과를 나타낸다.

실시예 3 : 항체 DNA 의 제한효소 절단

실시예 2에서 준비된 DNA 중 VH는 제한효소 SfiI/BspEI로, VL(kappa 및 lambda)은 제한효소 BspEI/NotI을 사용하여 절단하고, 상기 제한효소로 절단한 각각의 절편을 1.2% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 분리한 DNA를 퀴아젠 키트로 정제하였다.

실시예 4: 항체 DNA 의 라이게이션 및 라이브러리의 제조

파아지-디스플레이 벡터 pKS4H(녹십자, 대한민국, 대한민국 특허등록 제 0635370호 참조)를 제한효소 SfiI/BspEI을 사용하여 절단하고, 1.2% 아가로스 겔 전기영동과 퀴아젠 키트로 정제하였다. 실시예 3에서 준비된 3 μg의 VH와 30 μg의 pKS4H(모두 SfiI/BspEI으로 절단)를 혼합하고 T4 DNA 라이게이즈(New England BioLabs, 미국)를 첨가하여 25℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 라이게이션 혼합물(ligation mixture)을 퀴아젠 키트로 정제하고 대장균 XL1 - blue 세포(Stratagene사, 미국)에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시켜 총 100 mL의 배지에서 하룻밤 동안 키운 후, 플라스미드를 분리하였고 이를 pKS4H-VH-△VL로 명명하였다.

이 pKS4H-VH-△VL 플라스미드를 제한효소 BspEI/NotI으로 절단하여 위와 같은 방식으로 정제하였고, 30 μg의 pKS4H-VH-△VL 플라스미드와 3 μg의 VL PCR DNA(모두 BspEI/NotI으로 절단)를 섞어주고 T4 DNA 라이게이즈(New England BioLabs, 미국)를 넣어 실온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 혼합물을 퀴아젠 키트로 정제하고 대장균 XL1-blue 세포에 전기천공법으로 형질전환시켜 카베니실린(carbenicillin) 및 테트라사이클린(tetracyclin)이 함유된 총 100 mL의 배지에서 37℃에서 2시간 동안 키운 후, M13 헬퍼 파아지(Stratagene사, 미국)를 접종하고 16시간 배양하여 엠베르그 등(Engberg et al., Mol . Biotechnol., 6, 287-310, 1996)에서 보고된 바와 같이 파아지 라이브러리를 제조하였다. 배양된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하였고, 이를 pKS4H-VH-VL로 명명하였다. 상기 pKS4H-VH-VL의 개열지도를 도 2에 나타내었다.

실시예 5: 표피 성장 인자 수용체에 결합하는 항체 선별

표피 성장 인자 수용체에 결합하는 항체는 패닝 기법(Engberg et al., Mol . Biotechnol., 6, 287-310, 1996; 및 Kim et al., Gene , 241, 19-25, 2000)을 응용하여 선별하였다. 구체적으로, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR ; Sigma사, 미국)를 PBS 버퍼로 희석하여 이뮤노튜브(immunotube, NUNC사, 덴마크)에 코팅한 후, 실시예 4에서 제조한 파아지 라이브러리 37℃에서 반응시키고, 0.1M 글라이신 버퍼(pH 2.0)로 표피 성장 인자 수용체에 붙어있는 파아지를 떼어냈다. 이를 대장균 XL1 - blue 세포에 감염시키고, 헬퍼 파아지(Stratagene사, 미국)를 넣어주어 하룻밤 동안 키운 다음, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액(20% PEG 8,000 및 15% NaCl을 함유하는 용액)을 첨가하고 파아지 입자를 침전시켜 파아지를 모았다(파아지 레스큐). 파아지를 다시 표피 성장 인자 수용체가 코팅된 이뮤노튜브에 반응시켜 위의 과정을 4회 반복하였다(패닝). 상기의 과정을 통해 인간 항체 ER2 및 인간 항체 ER79를 표피 성장 인자 수용체에 결합하는 항체로 선별하였으며, 파아지-디스플레이 라이브러리를 이용한 항체 선별의 과정을 도 3에 나타내었다.

4회의 패닝이 끝난 라이브러리의 각 콜로니를, 공지의 방법(Kim et al., Gene, 241, 19-25, 2000)에 따라 2 mL의 배지에 키우고 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하여 항체 발현을 유도하였다.

항체 발현 여부는 표피 성장 인자 수용체가 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법으로 측정하였다.

실시예 6: 선별된 항체의 시퀀싱

상기 실시예 5에서 선별한 인간 항체 ER2 및 인간 항체 ER79의 항체 분비 콜로니를 50 μg/mL의 카베니실린이 들어있는 LB 배지 10 mL에서 밤새 배양한 다음, 퀴아젠 플라스미드 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 이용하여 재조합 플라스미드를 분리하였다. 플라스미드를 제한효소 SfiI/NotI로 절단한 후, 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하여 항체의 단편이 올바르게 삽입되어 있는 것을 확인한 다음, 플라스미드에 삽입된 scFv의 DNA 염기서열을 확인하였다. 염기서열 결정에 사용된 시퀀싱 프라이머는 서열번호 38의 p033을 사용하였고, 염기서열 결정은 공지의 방법에 따라 Genotech사(대전, 대한민국)에 의뢰하여 분석하였다. 대조군으로, 마우스에 표피 성장 인자 수용체를 면역화시켜 선별한 중화능이 있는 마우스 항체인 M96(녹십자사, 대한민국, 대한민국 특허등록 제 0680141호 참고)의 염기서열을 사용하였다. 인간 항체(ER2), 인간 항체(ER79) 및 마우스 항체(M96)의 scFv의 DNA 염기서열을 결정한 후, 결정된 DNA 염기서열을 아미노산 서열로 번역하는 웹 기반의 프로그램(www.expasy.org: DNA to Protein translate tool)을 이용하여 아미노산 서열로 번역하였다. 번역 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 M96는 마우스 항체(M96)의 scFv의 아미노산 서열을, ER2 및 ER79는 각각 인간 항체(ER2) 및 인간 항체(ER79)의 scFv의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 패닝을 통해 선별된 상기 ER2 및 ER79의 인간 항체는 서로 다른 아미노산 서열을 갖고 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 동물세포 발현벡터 제조

선별된 항체 단편을 완전한 형태의 면역글로블린을 생산하기 위한 형태로 전환하기 위해, 녹십자사의 항체 발현벡터 pRC13 및 pKC12(Ｂ형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간 항체의 가변영역을 삽입할 수 있는 항체발현 플라스미드, 대한민국 특허등록 제 523732호 참조; 기탁번호 KCLRF-BP-00054)를 사용하였다.

중쇄 발현벡터 pRC13 벡터는 HindIII 부위와 ApaI 부위를 이용해서 선별된 항체의 VH 단편을 간편하게 삽입할 수 있도록 구축하였다. 도 5에 예시된 바와 같이, 본 발명에서는 인간 항체 ER2 또는 인간 항체 ER79의 중쇄 가변영역의 DNA를 서열번호: 39 및 서열번호: 40의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 후, 얻어진 각각의 VH와 pRC13을 모두 HindIII/ApaI으로 절단하고 절단된 VH를 절단된 pRC13에 삽입하여 "ER2-Heavy-pRC13 또는 ER79-Heavy-pRC13"로 명명하였다(도 5 참조). 상기 사용한 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.

PCR 반응에 사용한 프라이머

프라이머 종류	서열	서열 번호
VH-Forward	5'-GGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAA-3'	39
VH-Reverse	5'-GAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC-3'	40

한편, 경쇄 발현벡터 pKC12 벡터는 NheI 부위와 ApaI 부위를 이용해서 선별된 항체의 VL 단편을 간편하게 삽입할 수 있도록 구축하였다. 도 6 및 7에 예시된 바와 같이, 본 발명에서는 인간 항체 ER2 및 인간 항체 ER79의 경쇄 가변영역의 DNA를 각각 서열번호: 41 및 서열번호: 42의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 후 얻어진 각각의 VL과 pKC12를 모두 NheI/ApaI으로 절단하고 절단된 VL을 절단된 pKC12에 삽입하여 각각 "ER2-Light-pKC12" 및 "ER79-Light-pKC12"로 명명하였다(도 6 및 7 참조). 상기 사용한 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다.

PCR 반응에 사용한 프라이머

프라이머 종류	서열	서열 번호
VL-Forward	5'-TAGGGAGACCCGCTAGCGGAGCAAGATGGATTCACAGGCCCAGGT-3'	41
VL-Reverse	5'-TATAGAATAGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACCTAACACTCTCCCCT-3'	42

실시예 8: 항체분비 동물세포주 제조

실시예 7에서 제조한 ER2-Heavy-pRC13 및 ER2-Light-pKC12와 ER79-Heavy-pRC13 및 ER79-Light-pKC12를 각각 동물 세포주에 도입하기 24시간 전에, 2×10⁵개의 CHO(Chinese hamster ovary) 세포를 10%의 FBS(Life Technologies사, 미국)를 포함하는 알파-MEM(Life Technologies사, 미국) 배지가 든 T-25 플라스크(NUNC사, 덴마크)에서 배양하였다. CHO 세포의 배양은 5% CO₂의 존재하에 37℃ 배양기에서 실시하였다. 다음날 세포의 컨플루언시(confluency)가 50% 정도임을 확인하고, 30 μg의 리포펙틴(Life Technologies사, 미국)을 1.5 mL의 옵티-MEM(Life Technologies사, 미국) 배지에 넣고 상온에 90분간 방치하였다. 그리고 동시에 pRC13-ER2H 8 μg과 pKC12-ER2L 7 μg 그리고 pRC13-ER79H 8 μg과 pKC12-ER79L 7 μg을 각각 혼합하여 1.5 mL의 옵티-MEM 배지에 넣고 상온에 90분간 방치하였다. 90분 경과 후, 리포펙틴이 들어있는 배지와 ER2-Heavy-pRC13와 ER2-Light-pKC12 그리고 ER79-Heavy-pRC13와 ER79-Light-pKC12이 각각 들어있는 배지를 섞은 다음 15분간 상온에서 반응시켰다. 반응시키는 동안 도입될 세포가 자란 플라스크 안에 들어있는 배지를 제거하고 PBS로 3회 세척하였다. 세척된 세포에 15분간 반응시킨 혼합액을 넣어주고 배양하였다. 6시간이 지나면 혼합액을 제거하고 알파-MEM 배지를 넣고 48시간 배양하였다. 48시간 배양이 끝난 세포를 트립신(Life Technologies사, 미국)으로 처리하여 플라스크에서 떼어낸 후 알파-MEM 배지로 희석하고 96 웰 플레이트(NUNC사, 덴마크)에 계대하였다. 이때 알파-MEM 배지에는 리보뉴클레오사이드와 데옥시리보뉴클레오사이드가 포함되어 있지 않고 10%의 투석 FBS(Life Technologies사, 미국) 및 550 μg/mL의 G418(Sigma사, 미국)을 포함한다. 2일마다 배지를 교환해주며 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 회수하여 ELISA를 수행하고 선별된 세포는 12 웰로 옮겨주었다. 12 웰에서 잘 자라면 6 웰로 옮겨주고 6 웰에서도 잘 자라면 메토트렉세이트(MTX, 중외제약, 한국)를 처리하였다. 처음에는 20 nM의 MTX를 처리하되, 잘 자라면 80 nM을 처리하고 MTX 농도를 320 nM, 1 μM로 점점 높여주었다. 1 μM에서 생존하면서 항체 분비량이 많은 세포주를 선별하여 대량 배양하였다. 대량 배양은 스피너 플라스크와 무혈청배지를 사용하며 배양조건이 65 rpm, 5% CO₂ 및 37℃인 배양기에서 실시하였다. 250 mL 스피너 플라스크에 무혈청 배지 100 mL에 10⁸ 세포를 넣고 키우며 세포수가 2배가 되면 배양액을 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 배양 상청과 세포를 따로 분리하여 회수하였다. 분리한 세포를 200 mL의 배지가 든 500 mL 스피너 플라스크에서 배양하였다. 세포수가 2배가 되면 배양액을 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 배양 상청과 세포를 분리하고 분리한 세포를 400 mL 배지가 든 1 L 스피너 플라스크에서 배양하였다. 세포수가 2배가 되면 역시 세포를 분리하여 1 L의 배지가 든 3 L 스피너 플라스크로 옮겨주었다. 부티르산 나트륨(Aldrich사, 미국)을 최종 농도 2 mM이 되도록 첨가하고 5일간 배양한 후 배양 상청을 회수하였다. 스피너 플라스크에서 배양하여 회수한 모든 배양상청으로부터 단백질 A-아가로스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech사, 미국)을 사용하여 항체를 정제하였고 이를 SDS-PAGE를 통해 분석하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 결과 환원조건에서 50 kd 정도의 중쇄와 25 kd 정도의 경쇄 밴드가 관찰되었으며, 이 사실로부터 항체가 정확하게 합성되어 생산되고 있음을 알 수 있었다.

실시예 9: 항체의 친화도 측정

실시예 8에서 얻은 항체의 표피 성장 인자 수용체에 대한 친화도를 경쟁 ELISA법(Kim et al., Hybridoma, 20, 265-272, 2001)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 자세한 과정은 다음과 같다.

(1) 적정 항체농도의 결정

A. 플레이트의 준비

표피 성장 인자 수용체(Sigma사, 미국)를 PBS 버퍼로 2 μg/mL로 희석하여 100 μL씩 분주하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 PBST로 1회 세척한 다음, 1% BSA-PBS 용액을 300 μL씩 분주하고 실온에서 1시간 보관하였다.

B. 1차 반응

정제된 항체를 0.5 μg/mL로 맞추어 2배씩 희석하여 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 넣고, 실온에서 2시간 반응시킨 후 PBST로 4회 세척하였다.

C. 2차 반응

염소 항-인간 IgG(Fab specific)-퍼옥시데이즈 접합체(Sigma)를 1% BSA-PBS 용액으로 5,000배 희석하여 각 웰에 100 μL씩 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST로 4회 세척하였다.

D. 기질반응

TMB(3,3’,5,5’-테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine), 마이크로웰 퍼옥시데이즈 서브스트레이트 시스템(KPL, MD, 미국)) 용액 100 μL씩을 각 웰에 첨가한 다음, 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다. 최대 결합치(Maximum binding)를 나타내는 항체 농도의 1/2 농도를 적정 항체 농도로 결정하였다.

(2) 경쟁 ELISA

A. 플레이트의 준비

표피 성장 인자 수용체(Sigma사, 미국)를 PBS 버퍼로 2μg/mL로 희석한 다음, 각 웰에 100 μL씩 분주하고 4℃에서 밤새 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 1회 세척한 다음, 1% BSA-PBS 용액을 각 웰에 300 μL씩 분주하고, 실온에서 1시간 보관하였다.

B. 1차 반응

표피 성장 인자 수용체 2 μg을 2배수로 희석하여 10 μL씩 준비된 플레이트에 넣은 다음, 항체를 (1)에서 결정된 적정 항체 농도로 희석하여 90 μL씩 넣고 실온에서 2시간 반응시킨 후 PBST로 4회 세척하였다.

C. 2차 반응

염소 항-인간 IgG(Fab specific)-퍼옥시데이즈 접합체(Sigma) 1% BSA-PBS 용액으로 5,000배 희석하여 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBST로 4회 세척하였다.

D. 기질반응

TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine), 마이크로웰 퍼시데이즈 서브스트레이트 시스템(KPL, MD, 미국)) 용액 100 μL씩을 각 웰에 첨가한 다음, 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다. 최대 결합치(경쟁하는 표피 성장 인자 수용체가 없는 상태의 ELISA O.D 값)의 50%를 저해하는 표피 성장 인자 수용체 농도를 친화도(Kd)로 산정하였다.

도 9에서 보는 바와 같이, 앞서 개발된 키메라 항체인 C225(Erbitux)의 표패 성장 인자 수용체에 대한 친화도와 비교하여 볼 때, 본 발명의 인간 항체 ER2는 동등한 친화도를 가지며, ER79는 약 63% 정도의 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 한편, 바이오패닝 이전 단계의 인간항체인 ER414 및 그 외 인간항체인 ER15와 ER78과 비교하여 볼 때, 본 발명의 항체가 표피 성장 인자 수용체에 대한 친화도가 높음을 알 수 있었다.

실시예 10: 항체의 암세포주 내 표피 성장 인자 수용체와의 결합성 확인

본 발명에 따른 항체(ER2 및 ER79)가 암세포주에서 과량 발현되는 표피 성장 인자 수용체와 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다. 구체적으로, 표피 성장 인자가 과량 발현되는 피부암세포주인 A431 세포주(한국 세포주 은행, KCLB 80005)를 1% 우혈청알부민(BSA)-인산염버퍼식염수(PBS)로 세척한 후, 본 발명의 항체 10 μg과 A431 세포주(1X10⁶ 세포)를 혼합하여 4℃에서 2시간 동안 흔들어 반응시킨 다음, 1% BSA-PBS로 2회 재현탁하여 세척하였다. 비교를 위하여, 상기와 동일한 방법으로 항체없이 A431 세포주만 반응시킨 음성 대조군(Mock), 항 파상풍 단일클론항체인 hTT-2(녹십자사, 대한민국, 대한민국 특허등록 제 0624011호 참고) 10 μg을 A431과 반응시킨 군 및 양성 대조군으로서 마우스항체인 M96(녹십자사, 대한민국, 대한민국 특허등록 제 0680141호 참고) 10 μg을 A431과 반응시킨 군을 준비하였다. 그리고 나서, 염소 항-마우스 (Fab 특이적) FITC 접합체를 넣고 얼음에서 40분간 반응시킨 다음, 1% BSA-PBS로 2회 세척하였다. 1 mL의 1% BSA-PBS로 현탁한 다음 유세포분석기(FACS Calibur, BD Biosciences)로 분석하였다. 실험결과, 도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체인 ER2 및 ER79는 A431 세포에 반응을 하는데 반하여, 항 파상풍 단일클론항체인 hTT-2는 반응을 하지 않는 것으로 나타났다.

실시예 11: 항체의 유방암 세포 표피 성장 인자 수용체 인산화 저해 측정

본 발명의 인간 항체 ER2 및 ER79의 표피 성장 인자 수용체 인산화 저해능을 확인하기 위하여, 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주(한국세포주은행, KCLB 30026)를 24웰 마이크로 플레이트(Nunc 사)에 세포수 1x10⁵이 되도록 깔아주었다. 2일이 경과한 후 본 발명의 단일클론항체인 ER2 및 ER79를 각각 5 μg, 25 μg, 50 μg 및 100 μg의 양으로 처리하고 표피 성장 인자(EGF)를 50 ng으로 고정 처리하였다. 비교를 위하여, 상기 ER2 및 ER79 대신에 M96 항체(녹십자사, 대한민국, 대한민국 특허등록 제 0680141호 참고), C225 항체(제품명: Erbitux; ImClone사, 미국), 및 ER414 항체를 각각 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 30분 경과 후, 상기 MDA-MB-231 세포에 0.5 mL의 용해 버퍼(lysis buffer; 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium orthovanadate)를 가하여 재현탁한 후 파쇄하고, 상기 파쇄물을 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 밴드를 분리하고, 이를 니트로셀룰로스막에 전기적인 방법으로 이전(transfer)시켰다. 막에 이전된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해 5% 소혈청알부민 용액으로 30분 동안 막을 차단한 후, 성장 인자 수용체의 인산화 형태에 특이적으로 반응하는 항-포스포티로신(phosphotyrosine) 특이적 퍼옥시데이즈 접합체(Zymed사, 미국)를 사용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 0.05% 트윈이 포함된 인산완충액으로 세척한 후, 0.018%(v/v) 4-클로로-1-나프톨과 0.045% 과산화수소가 인산완충액과 메탄올에 녹아있는 기질을 이용하여 발색 반응을 시켰다. 실험결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에서의 (-) 레인은 표피 성장 인자(EGF)를 처리하지 않은 대조군에 대한 실험결과를, (+) 레인은 표피 성장 인자만 처리한 대조군에 대한 실험결과이다. 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 항체량이 달라짐에 따라 표피 성장 인자 수용체의 인산화 정도가 달라지며, 특히 5 μg의 양으로 처리한 실험군에서 ER2와 ER79가 양성 대조군인 Erbitux와 유사한 표피 성장 인자 수용체의 인산화 저해능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

실시예 12: 항체의 표피 성장 인자 수용체와 결합 부위 확인

본 발명의 인간 항체(ER2 및 ER79)가 앞서 개발된 키메라 항체 C225(제품명: Erbitux; ImClone사, 미국)와 표피 성장 인자 수용체에 대한 결합 부위가 동일한지 여부를 확인하기 위해 표면 플라즈몬 공명기술(SPR; Biacore 2000)을 이용하여 분석하였다. 항원인 표피 성장 인자 수용체를 카르복시메틸화된 덱스트란 표면 칩(carboxymethylated dextran surface chip)(CM5 chip: Pharmacia)에 약 1,000 반응 단위(response unit)로 고정화한 후, C225 항체를 흘려주고 항원과 항체의 해리 과정 없이 곧 바로 본 발명의 인간 항체 ER2와 ER79를 각각 흘려주어 결합 반응을 25℃에서 측정하였다. 측정결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명의 인간 항체(ER2 및 ER79)들은 모두 C225 항체의 결합 부위와 다른 결합 부위를 가지고 있는 것으로 나타났다.

도 1은 PCR에 의해 합성된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 DNA를 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에서 사용된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역이 삽입된 파아지-디스플레이 벡터 pKS4H를 도시한 것이다.

도 3은 패닝법을 이용하여 항체 라이브러리로부터 항체를 선별하는 방법을 도식화한 것이다.

도 4는 항체 라이브러리로부터 선별된 항체(ScFV)의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 인간 항체의 중쇄 발현벡터 ER2-Heavy-pRC13 또는 ER79-Heavy-pRC13를 나타낸 것이다.

도 6 및 7은 본 발명에 따른 인간 항체의 경쇄 발현벡터 ER2-Light-pKC12 및 ER79-Light-pKC12를 각각 나타낸 것이다.

도 8은 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명에 따른 인간 항체 ER2 및 ER79의 표피 성장 인자 수용체에 대한 친화도를 키메라 항체(C225, Erbitux) 및 기타 인간 항체(ER414)와 비교한 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 세포분석기를 이용하여 표피 성장 인자 수용체가 과량 발현되는 암세포주에서의 항체의 결합성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 항체의 유방암 세포 표피 성장 인자 수용체의 인산화 저해를 측정한 결과이다.

도 12는 표면 플라즈몬 공명기술을 이용하여 본 발명에 따른 항체의 표피 성장 인자 수용체와 결합하는 부위를 키메라 항체인 C225(Erbitux)와 비교한 결과이다.

<110> GREEN CROSS Corporation <120> Antibodies specifically binding to the epidermal growth factor receptor <130> FPD/200908-0042 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of heavy chain variable region of human antibody <400> 1 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of heavy chain variable region of human antibody <400> 2 Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of heavy chain variable region of human antibody <400> 3 His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 4 Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of light chain variable region of human antibody <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of light chain variable region of human antibody <400> 6 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of human antibody <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Trp Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 9 Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly 20 25 30 Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of heavy chain variable region of human antibody <400> 11 gactacgaca tgagc 15 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of heavy chain variable region of human antibody <400> 12 gggatccttg gtggtagtga gcgttcgtac tatagggact ccgtgaaggg c 51 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of heavy chain variable region of human antibody <400> 13 cacggcagcc cgggatacac gttgtatgcg tgggactac 39 <210> 14 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of human antibody <400> 14 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactacgaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atccttggtg gtagtgagcg ttcgtactat 180 agggactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggaa aaccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacacggc 300 agcccgggat acacgttgta tgcgtgggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 15 aggtctaatc aggacttgac ccatagtaac ggaaacacct atttggag 48 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of light chain variable region of human antibody <400> 16 aaggtttcta accggttctc t 21 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of light chain variable region of human antibody <400> 17 atgcaaggta cacactggcc gtggacg 27 <210> 18 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 18 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcatgca ggtctaatca ggacttgacc catagtaacg gaaacaccta tttggagtgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccaaga ctcctaattt ataaggtttc taaccggttc 180 tctgtctcca aagacaaccg gtgtggcagt ggggcaggta caaccgtcac actgagaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggat atcaaacgt 339 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 19 aggtctagtc agagcgtcga catggggatc ggaaacaact atttggag 48 <210> 20 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 20 gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcatgca ggtctagtca gagcgtcgac atggggatcg gaaacaacta tttggagtgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccaaga ctcctaattt ataaggtttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggta cagatttcac actgagaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggat atcaaacgt 339 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-forward primer <400> 21 gttgttcctt tctatgcggc ccagccggcc atggcc 36 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-reverse primer <400> 22 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt 30 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-reverse primer <400> 23 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacc 27 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1-forward primer <400> 24 cagccggcca tggcccaggt gcagctggtg cagtctggg 39 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3-forward primer <400> 25 cagccggcca tggccsaggt gcagctggtg gagtctggg 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH4-forward primer <400> 26 cagccggcca tggcccaggt gcagctgcag gagtcgggc 39 <210> 27 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-reverse primer <400> 27 cgatccgcca cctccggagc cacctccgcc tgaaccgcct ccacc 45 <210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK1/3A-forward primer <400> 28 ggtggctccg gaggtggcgg atcggacatc cagatgaccc agtctcca 48 <210> 29 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK1/3B-forward primer <400> 29 ggtggctccg gaggtggcgg atcggaaatt gtgttgacgc agtctcca 48 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VK2-forward primer <400> 30 ggtggctccg gaggtggcgg atcggatatt gtgatgaccc agactccact c 51 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JK_A-reverse primer <400> 31 tcgacttgcg gccgcacgtt tgatwtccac yttggtccc 39 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JK_B-reverse primer <400> 32 tcgacttgcg gccgcacgtt tgatctccas cttggtccc 39 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JK_C-reverse primer <400> 33 tcgacttgcg gccgcacgtt taatctccag tcgtgtccc 39 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_A-forward primer <400> 34 ggtggctccg gaggtggcgg atcgcagtct gysctgactc agccaccc 48 <210> 35 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_B-forward primer <400> 35 ggtggctccg gaggtggcgg atcgtcctat gagctgacwc agccaccc 48 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JL_A-reverse primer <400> 36 ttctcgactt gcggccgcac ctaggacggt sascttggtc cc 42 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JL_B-reverse primer <400> 37 ttctcgactt gcggccgcac cgaggacggt cagctgggtg cc 42 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P033 sequencing primer <400> 38 caacgtgaaa aaattattat tcgc 24 <210> 39 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-forward primer <400> 39 ggagacccaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa 60 60 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-reverse primer <400> 40 gaagaccgat gggcccttgg tggaggctga ggagacggtg ac 42 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-forward primer <400> 41 tagggagacc cgctagcgga gcaagatgga ttcacaggcc caggt 45 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-reverse primer <400> 42 tatagaatag ggccccccct cgaggtcgac ctaacactct cccct 45 <210> 43 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region of human antibody <400> 43 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 44 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region of human antibody <400> 44 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역;

b) 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역;

c) 중쇄 불변 영역; 및

d) 경쇄 불변 영역

을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항에 있어서,

a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역;

b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역;

c) 중쇄 불변 영역; 및

d) 경쇄 불변 영역

을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체.
a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역;

b) 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역;

c) 중쇄 불변 영역; 및

d) 경쇄 불변 영역

을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체.
제3항에 있어서,

a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역;

b) 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역;

c) 중쇄 불변 영역; 및

d) 경쇄 불변 영역

을 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 표피 성장 인자(EGF)에 의한 신호전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 항체.
서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제7항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 11의 염기서열, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 12의 염기서열 및 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제9항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제11항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 15의 염기서열, 상기 서열번호 5의 아미노산을 코딩하는 서열번호 16의 염기서열 및 상기 서열번호 6의 아미노산을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제13항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제15항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 9의 아미노산을 코딩하는 서열번호 19의 염기서열, 상기 서열번호 5의 아미노산을 코딩하는 서열번호 16의 염기서열 및 상기 서열번호 6의 아미노산을 코딩하는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA.
제17항에 있어서, 상기 DNA가 상기 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
제7항의 DNA를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터.
제19항에 있어서, 상기 벡터가 도 5의 개열지도를 갖는 ER2-Heavy-pRC13 또는 ER79-Heavy-pRC13인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제11항의 DNA를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터.
제21항에 있어서, 상기 벡터가 도 6의 개열지도를 갖는 ER2-Light-pKC12인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제15항의 DNA를 포함하는, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역을 발현시키는 발현벡터.
제23항에 있어서, 상기 벡터가 도 7의 개열지도를 갖는 ER79-Light-pKC12인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제19항의 발현벡터 및 제21항의 발현벡터로 형질전환된 동물 세포주.
제25항에 있어서, 상기 동물 세포주가 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 293 세포 또는 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
제19항의 발현벡터 및 제23항의 발현벡터로 형질전환된 동물 세포주.
제27항에 있어서, 상기 동물 세포주가 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 293 세포 또는 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 동물 세포주.
제1항 또는 제3항의 항체를 포함하는 EGFR 과발현과 관련된 암 치료용 조성물.
제29항에 있어서, 상기 조성물이 시스플라틴, 젬시타빈, 독소루비신, 5-FU(fluorouracil), 이리노테칸(irrinotecan) 및 파클리탁셀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR 과발현과 관련된 암 치료용 조성물.