JP2013505736A - 上皮成長因子受容体に特異的に結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
上皮成長因子受容体に特異的に結合する抗体を選別するため、ヒト抗体ライブラリーを構築した。ヒト骨髄全RNA、ヒト胸腺全RNA、ヒト脾臓全RNA及びヒトB細胞RNAの混合物を用いた。ヒトB細胞RNAを除いた全てのRNAはClontech社(米国)から購入し、ヒトB細胞RNAは下記のように分離した。
実施例1で分離したRNA1μg及びpd(T)12−18(0.5μg/μL)1μLを最終体積が12.5μLになるように蒸留水を入れて混合した。前記混合物を70℃で2分間反応させて氷浴で冷却させた。それから、ここに5X反応緩衝液、10mM dNTP混合物、組換え型RNase阻害剤(recombinant RNase inhibitor)、MMLV逆転写酵素(Clontech社製、米国)を添加して最終体積を20μLに合わせた後、42℃で1時間、95℃で5分間反応させてcDNAを合成した。LiquiMix QM Premix、Magenta(Neurotics Inc社製、韓国)、鋳型として4μLのcDNA、蒸留水19μL、ならびに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域(κ及びλ)に結合するように考案されたそれぞれのプライマー1μLを用いてPCR反応を行った。PCRに用いられたプライマー及びこれらのヌクレオチド配列が表1に示されている。
<表1>
PCR反応で用いたプライマー
実施例2で製造したVH及びVL(κ及びλ)をそれぞれ制限酵素SfiI/BspEI及びBspEI/NotIで切断し、切断された断片を1.2%アガロースゲルから分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。
ファージ−ディスプレイベクターpKS4H(緑十字社製、韓国、韓国特許登録第0635370号参照)を制限酵素SfiI/BspEIを用いて切断し、1.2%アガロースゲル電気泳動を用いて分離した後、キアゲンキットを用いて精製した。30μgのpKS4Hを実施例3で製造した3μgのVHと混合し、ここにT4 DNAリガーゼ(New England BioLabs社製、米国)を添加した後、25℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をキアゲンキットを用いて精製して大膓菌XL1−blue(Stratagene社製、米国)に電気穿孔法で形質転換させた。前記形質転換体を100mLの培地で一晩培養した後、プラスミドを分離した。前記プラスミドを「pKS4H−VH−ΔVL」と命名した。
EGFRに結合する抗体をパニング法(Engberg et al.、Mol. Biotechnol.、6、287−310、1996;及びKim et al.、Gene、241、19−25、2000)の改変法によって選別した。具体的には、EGFR(Sigma社製、米国)をPBSで希釈して各イムノチューブ(immunotube、NUNC社製、デンマーク)上にコーティングした。次いで、前記コーティングされたイムノチューブに実施例4で製造したファージライブラリーを加えて37℃で2時間反応させた。EGFRに結合したファージを0.1Mのグリシンバッファー(pH2.0)で溶離した。その後、大膓菌XL1−blueを前記ファージに感染させ、ヘルパーファージを添加した。前記大膓菌を37℃で一晩培養して、ここに20%PEG8,000及び15%NaClを含む溶液を添加した。それから、沈澱したファージを回収して(ファージレスキュー)、ファージを再びEGFR−コーティングされたイムノチューブに反応させ、前記パニング手順を4回繰り返した。前記手順を通じてEGFRに結合するヒト抗体であるER2及びER79を選別した。ファージディスプレイライブラリーを用いて抗体を選別する工程を図3に示した。
前記実施例5で選別したヒト抗体ER2及びER79を分泌するコロニーを50μg/mLのカルベニシリンを含むLB培地10mLで一晩培養した後、キアゲンプラスミドミニキット(Qiagen社製、Valencia、CA、米国)を用いてプラスミドを分離した。前記プラスミドを制限酵素SfiI/NotIで切断した後、アガロースゲル電気泳動によって抗体の断片の挿入を確認した。プラスミドに挿入されたscFvのDNA配列を分析した。
抗体断片を完全な形態の免疫グロブリンに転換するため、抗体発現ベクターpRC13及びpKC12(B型肝炎ウイルスの表面抗原に対するヒト抗体の可変領域を挿入するためのプラスミド;韓国特許第523732号;受託番号KCLRF−BP−00054)を使用した。
<表2>
PCR反応で用いたプライマー
トランスフェクションの24時間前に、2×105個のCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞を5%CO2の存在下で37℃培養器で10%のFBS(Life Technologies社製、米国)を含むα−MEM培地(Life Technologies社製、米国)が入っているT−25フラスコ(NUNC社製、デンマーク)で密集度(confluency)が50%に到逹するまで培養した。それから、30μgのリポフェクチン(Life Technologies社製、米国)を1.5mLのオプティ(opti)−MEM(Life Technologies社製、米国)に添加して室温で90分間放置した。同時にER2−Heavy−pRC13 8μg & ER2−Light−pKC12 7μg、ER79−Heavy−pRC13 8μg & ER79−Light−pKC12 7μgを混合してオプティ−MEM培地で1.5mLにした後、室温で90分間培養した。90分後、リポフェクチンを含有する培地を、それぞれER2−Heavy−pRC13 & ER2−Light−pKC12及びER79−Heavy−pRC13 & ER79−Light−pKC12を含有する培地と混合した後、室温で15分間反応させた。反応中に細胞から培地を除去し、前記細胞をトランスフェクションのためにPBSで3回洗浄した。前記洗浄された細胞に前記反応混合物を加えて6時間培養した。6時間後、前記反応混合物を除去した後、α−MEM培地を入れて48時間培養した。それから、細胞をトリプシン(Life Technologies社製、米国)で処理してフラスコから剥離した後、α−MEM培地で希釈して96ウェルプレート(NUNC社製、デンマーク)にて継代した。この時、α−MEM培地はリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有しない一方、10%の透析FBS(Life Technologies社、米国)及び550μg/mLのG418(Sigma社製、米国)を含有する。前記培地を2日ごとに新しい培地に取り替えた。コロニーを形成した培養上清液をELISAによる抗体発現のために回収した後、選別された細胞を12−ウェルプレートに移した。前記細胞を6−ウェルプレートに移してメトトレキセート(MTX、中外製薬社製、韓国)処理をした。MTXの初期濃度は20nMであり、細胞適応度に応じて80nM、320nM及び1μMに増加させた。1μMの濃度で生存しながら抗体分泌量の高い細胞株を選別した。スピナーフラスコと無血清培地を用いて、65rpm、5%CO2及び37℃の培養器で大量培養を行った。108細胞を100mLの無血清培地が入っている250mLスピナーフラスコで培養した。細胞数が初期播種の2倍になると、1,000rpmで5分間遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞を200mLの培地が入っている500mLスピナーフラスコで再培養した。細胞数が初期播種の2倍になると、1,000rpmで5分間遠心分離して細胞を回収してこれを1Lの培地が入っている3Lスピナーフラスコに移した。ここに酪酸ナトリウム(Aldrich社製、米国)を最終濃度2mMになるように添加し、細胞を5日間培養した後、培地から培養上清液を回収した。スピナーフラスコで回収した上清液から、タンパク質A−アガロースコラム(Amersham Pharmacia Biotech社製、米国)を用いて抗体を精製し、これをSDS−PAGEによって分析した。
実施例8で得られた抗体のEGFRに対する親和度を競合ELISA法(Kim et al.、Hybridoma、20、265−272、2001)によって測定し、その結果を図9に示した。簡略な手順は次のようである。
A.プレートの準備
PBSで2μg/mLで希釈した100μLのEGFR(Sigma社製、米国)をELISAプレートの各ウェルに添加して4℃で一晩培養した。プレートの各ウェルをPBSTで1回洗浄した後、各ウェルに300μLの1%BSA−PBS溶液を加えて室温で1時間培養した。
B.1次反応
連続希釈した各精製抗体(0.5μg/mL)100μLをプレートの各ウェルに添加して、室温で2時間培養した後、PBSTで4回洗浄した。
C.2次反応
1%BSA−PBS溶液で1:5000で希釈したヤギ抗ヒトIgG(Fab特異的)−ペルオキシダーゼ複合体(Sigma社製)100μLを各ウェルに添加して、室温で1時間反応させた後、PBSTで4回洗浄した。
D.基質反応
100μLのTMB(3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(Microwell peroxidase substrate system)(KPL、MD、米国))を各ウェルに添加した後、405nmでO.D値を測定した。適正抗体濃度をEGFR−コーティングされたプレートに対して最大半量結合(half−maximum binding)を示す抗体濃度で決定した。
A.プレートの準備
PBSで2μg/mLで希釈した100μLのEGFR(Sigma社製、米国)をELISAプレートの各ウェルに添加して4℃で一晩培養した。各ウェルをPBSTで1回洗浄した後、各ウェルに300μLの1%BSA−PBS溶液を加えて室温で1時間培養した。
B.1次反応
2μgのEGFRに2倍連続希釈して、前記希釈された10μLのEGFRをプレートの各ウェルに添加した。次いで、前記(1)で決定された適正濃度で希釈された90μLの抗体を各ウェルに添加して、室温で2時間培養した後、PBSTで4回洗浄した。
C.2次反応
1%BSA−PBS溶液で1:5000で希釈したヤギ抗ヒトIgG(Fab特異的)−ペルオキシダーゼ複合体(Sigma社製)100μLを各ウェルに添加して、室温で1時間反応させた後、PBSTで4回洗浄した。
D.基質反応
100μLのTMB(3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン、マイクロウェルペルオキシダーゼ基質システム(KPL社製、MD、米国))を各ウェルに添加した後、405nmでO.D値を測定した。最大結合量(競合するEGFRが存在しないO.D値)の50%を抑制するEGFRの濃度をKdとして決定した。
腫瘍細胞株で過剰発現されたEGFRに対する本発明の抗体であるER2及びER79の結合をFACSによって確認した。要するに、EGFRを過剰発現する皮膚癌(epidermoid carcinoma)細胞株であるA431細胞株(受託番号KCLB 80005)を1%BSA−PBSで洗浄した。前記洗浄された細胞(1×106細胞)を10μgの本発明の抗体とともに4℃で2時間培養した後、1%BSA−PBSで2回洗浄した。Mock(抗体なし)及び10μgのhTT−2(抗破傷風モノクローナル抗体、緑十字社製、韓国特許第0624011号)を陰性対照群として用い、10μgのM96(マウス抗−EGFR)を陽性対照群として用いた。FITC−標識ヤギ抗マウス抗体(Fab特異的)複合体を加えて氷上で40分間培養した。前記細胞を1%BSA−PBSで2回洗浄した後、1mLの1%BSA−PBSに懸濁させてフローサイトメトリー(製品名:FACS Calibur、BD Biosciences社製)で分析した。実験結果が図10に示されている。これらの結果は、本発明の抗体であるER2及びER79はA431細胞でEGFRに結合する一方、hTT−2(抗破傷風モノクローナル抗体)は結合しないことを示す。
本発明の抗体ER2及びER79のEGFRリン酸化を抑制する能力を試した。要するに、乳癌細胞株であるMDA−MB−231細胞(受託番号KCLB 30026)を24−ウェルプレート(NUNC)に1×105の細胞濃度で培養した。2日後、各ウェルに本発明の抗体をそれぞれ5μg、25μg、50μg及び100μgの量で加えた後、50ngのEGFを各ウェルに加えて30分間培養した。比較のため、M96抗体(緑十字社製、韓国、韓国特許第0680141号)、C225抗体(製品名:Erbitux、ImClone社製、米国)、及びER414抗体を使用した。ウェル当り0.5mLの溶解バッファー(lysis buffer;10mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA、1%Triton X−100、1mM オルトバナジン酸ナトリウム)を用いて細胞抽出物を製造した。前記細胞抽出物をSDS−PAGEを行い、分離したタンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写した。前記膜を5%BSA溶液を用いて30分間ブロッキングした後、リン酸化されたEGFRと特異的に反応する抗ホスホチロシン特異的ペルオキシダーゼ複合体(Zymed社、米国)を用いて4℃で一晩免疫ブロッティングした。前記免疫ブロットされた膜をPBSTで洗浄してPBS及びメタノール中の0.018%(v/v)4−クロロ−1−ナフトール及び0.045%過酸化水素の基質を用いて発色反応をさせた。その結果を図11に示した。これらの結果は抗体の量がEGFRリン酸化に影響を与え、Erbituxで処理された陽性対照群と比較してER2及びER79が類似したEGFRリン酸化の抑制能を有することを示す。
本発明の抗体ER2及びER79がキメラ抗体C225(Erbitux、ImClone社製、米国)とEGFRに対して同一の結合部位を有するか否かを確認するために表面プラズモン共鳴法(SPR;Biacore 2000)を使用した。EGFR抗原をカルボキシメチル化したデキストラン表面チップ(carboxymethylated dextran surface chip)(CM5 chip:Pharmacia社製)に約1,000の反応単位(response unit)で固定化した。その後、C225抗体をチップ上に注入して、抗原と抗体の解離過程なしに直ちにER2とER79とをそれぞれ注入した後、結合反応を25℃で測定した。その結果を図12に示した。本発明のヒト抗体はC225抗体と異なる結合部位を有することが示された。
Claims (30)
- a)それぞれ配列番号1、配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2及び3を含む重鎖可変領域と、
b)それぞれ配列番号4、配列番号5及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖可変領域と、
c)重鎖定常領域と、
d)軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。 - a)配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
b)配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
c)重鎖定常領域と、
d)軽鎖定常領域と
を含む請求項1に記載の上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。 - a)それぞれ配列番号1、配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖可変領域と、
b)それぞれ配列番号9、配列番号5及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖可変領域と、
c)重鎖定常領域と、
d)軽鎖定常領域と
を含む、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。 - a)配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、
c)重鎖定常領域と、
d)軽鎖定常領域と
を含む請求項3に記載の上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。 - 前記抗体がヒト抗体である請求項1〜4のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。
- 前記抗体が上皮成長因子(EGF)によって誘導されるシグナル伝逹を遮断する請求項1〜4のいずれか一つに記載の上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体。
- それぞれ配列番号1、配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む抗体重鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号1のアミノ酸配列をコードする配列番号11のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号2のアミノ酸配列をコードする配列番号12のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号3のアミノ酸配列をコードする配列番号13のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項7に記載のDNA。
- 配列番号7のアミノ酸配列を有する抗体重鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列番号14のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項9に記載のDNA。
- それぞれ配列番号4、配列番号5及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む抗体軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号4のアミノ酸配列をコードする配列番号15のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号5のアミノ酸配列をコードする配列番号16のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号6のアミノ酸配列をコードする配列番号17のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項11に記載のDNA。
- 配列番号8のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号8のアミノ酸配列をコードする配列番号18のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項13に記載のDNA。
- それぞれ配列番号9、配列番号5及び配列番号6のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2及びCDR3を含む抗体軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号9のアミノ酸をコードする配列番号19のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号5のアミノ酸配列をコードする配列番号16のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び配列番号6のアミノ酸配列をコードする配列番号17のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項15に記載のDNA。
- 配列番号10のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖可変領域をコードするDNA。
- 前記DNAが配列番号10のアミノ酸配列をコードする配列番号20のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む請求項17に記載のDNA。
- 請求項7に記載のDNAを含む、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
- 前記ベクターが、図5にマップが示されているER2−Heavy−pRC13またはER79−Heavy−pRC13である請求項19に記載の発現ベクター。
- 請求項11に記載のDNAを含む、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
- 前記ベクターが、図6にマップが示されているER2−Light−pKC12である請求項21に記載の発現ベクター。
- 請求項15に記載のDNAを含む、上皮成長因子受容体(EGFR)に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を発現させる発現ベクター。
- 前記ベクターが、図7にマップが示されているER79−Light−pKC12である請求項23に記載の発現ベクター。
- 請求項19に記載の発現ベクター及び請求項21に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
- 前記動物細胞株がCHO(チャイニーズハムスター卵巣)、HEK293、またはNSO細胞株である請求項25に記載の動物細胞株。
- 請求項19に記載の発現ベクター及び請求項23に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞株。
- 前記動物細胞株がCHO(チャイニーズハムスター卵巣)、HEK293またはNSO細胞株である請求項27に記載の動物細胞株。
- 請求項1又は3に記載の抗体を含む癌治療用組成物。
- 前記組成物がシスプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、5−FU、イリノテカン及びパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも一つをさらに含む請求項29に記載の癌治療用組成物。
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