JP2003501348A - ＴＧＦβ１に対する特異的抗体および抗体フラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＳＬ１５の（配列番号４）、およびＪＴ１８２の（配列番号１０）抗体ＶＨ領域のＣＤＲ３配列に基づく、例えば抗体可変ドメインの形態の、特異的結合成員を提供するものである。この抗体はＴＧＦβ₁に対する強力な中和活性を持ち、過剰のＴＧＦβ₁活性に付随する病気、例えば線維症、免疫反応および腫瘍の進行の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 この出願は、１９９９年４月３０日出願の米国仮出願６０／１３１９８３号か
らの優先権を主張するものであり、当該仮出願の内容は引用によりその全体を本
明細書の一部とする。

【０００２】 発明の分野 本発明は、トランスフォーミング成長因子１（ＴＧＦβ₁）に結合する特異的
結合成員、特に抗体およびそのフラグメントに関するものである。より詳細には
、本発明は、抗体ＳＬ１５（かつてKylieとして知られた抗体）のＶＨ ＣＤＲ３
、特にＳＬ１５ ＶＨドメインを含む特異的結合成員に関するものであり、これ
はＳＬ１５ＡまたはＳＬ１５Ｓ ＶＬドメインと組み合わせることもできる。さ
らに、本発明は、特に線維症の疾患の治療、創傷治癒の調節および癌の治療のた
めの医薬製剤への、かかる特異的結合成員の使用に関するものである。

【０００３】 発明の背景 ＷＯ９７／１３８４４号として公開されたＰＣＴ／ＧＢ９６／０２４５０号は
、ヒトＴＧＦβ₁に特異的なヒト抗体およびヒトＴＧＦβ₂に特異的なヒト抗体の
単離を開示している。これは、３１Ｇ９ ＶＨドメインおよびこのドメインの変
異体を有する抗体を記載している。より詳細には、この出願は、３１Ｇ９ ＶＨ
ドメインをＣＳ３７ ＶＬおよびこのドメインの変異体と共に含み、 （ｉ）ＥＬＩＳＡにおいてＴＧＦβ₁への結合に関してＣＳ３７と競合し、 （ii）ＴＧＦβ₃に関してはＴＧＦβ₁と優先的に結合し、そして （iii）ＴＧＦβ₁を中和する、 抗体を包含する、抗体ＣＳ３７を記載していた。

【０００４】 発明の説明 本発明は、ＣＳ３７に関連する抗体であってＴＧＦβ₁の結合および中和に関
して予期し得ない有利な性質を有する抗体の同定を基礎とするものである。これ
らはＴＧＦβ₂またはＴＧＦβ₃には結合せず、またこれらを中和しない。

【０００５】 本発明に係る抗体は、活性なＴＧＦβ₁を強力に中和する。これらの抗体のた
めのエピトープはＴＧＦβ₁のＣ末端領域（残基８３−１１２）に存在し、ＴＧ
Ｆβのレセプターと相互作用することが確認されている領域である、フィンガー
２としても知られるＴＧＦβ₁の残基９２−９８より成るループを含んでいる。
この抗体は潜在性ＴＧＦβ₁に関して活性ＴＧＦβ₁と優先的に結合する。

【０００６】 ＴＧＦβ₁を強力に中和するＳＬ１５Ｓの変異体もまた本明細書に開示する。
これらは主としてＶＨまたはＶＬドメインのＣＤＲ３中のアミノ酸置換によって
異なっている。しかしながら置換が施され得るその他の部位もまた存在し、例え
ば、軽鎖の残基２５においてアラニンが置換され、ＩｇＧ４抗体、ＳＬ１５Ａ
ＩｇＧ４、ＣＡＴ−１９２が生成し得る。強力な中和活性の保持と共存し得る幾
つかの置換が施されることもある。本発明に係る抗体は、線維症の疾患、例えば
肺線維症の治療に、瘢痕形成反応、例えば創傷治癒および角膜瘢痕形成の調節に
、そして下記に詳述するその他の状況、例えば腫瘍の治療に特に有用であろう。

【０００７】 特異的結合蛋白、例えば本明細書に定義する有利な抗体ＶＨおよびＶＬドメイ
ンの相補性決定領域（ＣＤＲ）、とりわけＣＤＲ３領域を基礎とする抗体は、前
述の目的に役立ち、本発明の態様を表現するものである。

【０００８】 様々な側面のうち本発明の最も好ましい態様は、本明細書に定義するＳＬ１５ ＶＨドメインのＶＨ ＣＤＲ３、ＳＬ１５ ＶＨ ＣＤＲ３を包含するＶＨドメイ
ン、特にＳＬ１５ ＶＨドメイン自身、およびかかるＶＨドメインと、ＶＬドメ
イン、特にＳＬ１５ＡまたはＳＬ１５Ｓ ＶＬドメイン、またはＳＬ１５ ＶＬ
ＣＤＲ３を含むその他のＶＬドメインとの対合に基づくものである。抗体の抗原
結合ドメインＳＬ１５（いずれの形でもよく、例えばｓｃＦｖまたはＩｇＧ４）
は、ＳＬ１５ ＶＨと、二つの変異体ＳＬ１５Ａ ＶＬ（ＣＳ３７）またはＳＬ１
５Ｓ ＶＬ（Ａ２５Ｓを伴うＣＳ３７）のいずれかで構成される。いずれの変異
体においてもＳＬ１５はかつてKylieとして知られていた抗体である。ＳＬ１５
Ｓ ｓｃＦｖはＣＡＴ１９１として；ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４はＣＡＴ−１９２とし
て；そしてＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４はＣＡＴ−１９３としても知られている。

【０００９】 本発明の様々な側面において、そのさらなる態様は、ＪＴ１８２ ＶＨ ＣＤＲ
３、ＪＴ１８２ ＶＨ ＣＤＲ３を包含するＶＨドメイン、特にＪＴ１８２ ＶＨ
ドメイン、および、かかるＶＨドメインと、ＶＬドメイン、特にＣＳ３７ ＶＬ
ドメインとの対合に基づくものである。ＪＴ１８２はＳＬ１５ほど有効ではない
が、意外なことにＣＳ３７より優れた性質を有している。

【００１０】 第一の態様において、本発明は、ＴＧＦβ₁と結合できる単離された特異的結
合成員を提供し、ここで当該特異的結合成員は、第１表または第２表にＳＬ１５
またはＪＴ１８２のＶＨ ＣＤＲ３として実質上開示したアミノ酸配列を有する
ＶＨ ＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを含んでいる。

【００１１】

【表１】

【００１２】 さらに本発明は、ＣＳ３７ ＶＨのＶＨ ＣＤＲ１およびＶＨ ＣＤＲ２の一方
または両方、好ましくは両方として実質的に開示される（第２表）アミノ酸配列
を有するＶＨ ＣＤＲ１またはＶＨ ＣＤＲ２をさらに含む前記の単離された特異
的結合成員を提供する。

【００１３】

【表２】

【００１４】 好ましい態様において、結合ドメインはヒト抗体フレームワークに存在してい
る。かかる態様の、一つの好ましい例は、ＪＴ１８２ ＶＨドメインとして実質
的に開示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインであって、その配列は配
列番号１０に開示されている。さらなる好ましい態様は、ＳＬ１５ ＶＨドメイ
ンとして実質的に開示されているアミノ酸配列を有するＶＨドメインであって、
その配列は配列番号４に開示されている。

【００１５】 第二の態様において、本発明は、ＴＧＦβ₁と結合できる単離された特異的結
合成員を提供し、ここで当該特異的結合成員は、ＳＬ１５Ｓ ＶＬドメインとし
て実質上開示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗原結合ドメイン
を含み、その配列は配列番号８に開示されている。

【００１６】 さらなる態様において、本発明は、第一の態様に関して上に開示されるＶＨド
メイン、およびＶＬドメイン［ここで好ましくはＶＬドメインは、ＣＳ３７ Ｖ
Ｌ（ＳＬ１５Ａ）(その配列は配列番号６に開示されている)、またはＳＬ１５Ｓ ＶＬ（その配列は配列番号８に開示されている）として実質的に開示されてい
るアミノ酸配列を有する］を含む、ＴＧＦβ₁と結合できる特異的結合成員を提
供する。

【００１７】 特に好ましい態様において、本発明は、ＣＳ３７ ＶＬドメインと、ＪＴ１８
２ ＶＨおよびＳＬ１５ ＶＨから選ばれるＶＨドメイン、最も好ましくはＳＬ１
５ ＶＨを含む、特異的結合成員を提供する。さらなる特に好ましい態様では、
本発明は、ＳＬ１５ ＶＨおよびＳＬ１５Ａ ＶＬ（ＣＳ３７ ＶＬ）またはＳＬ
１５Ｓ ＶＬを含む特異的結合成員を提供する。

【００１８】 本発明に係る好ましい態様は、１、２、３、４または５個のアミノ酸置換がＣ
ＤＲ、例えばＣＤＲ３、および／またはＦＲに施されている、ＪＴ１８２ ＶＨ
またはＳＬ１５ ＶＨドメインを含む特異的結合成員（ここでこの特異的結合成
員は、ＴＧＦβ₁と結合する能力を保持している）を提供する。さらなる好まし
い態様は、ＳＬ１５Ａ（ＣＳ３７）ＶＬもしくはＳＬ１５Ｓ ＶＬ、または１、
２、３、４または５個のアミノ酸置換がＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、および／また
はＦＲに施されている、ＳＬ１５ＡもしくはＳＬ１５Ｓ ＶＬドメインを含む特
異的結合成員（ここでこの特異的結合成員は、ＴＧＦβ₁と結合する能力を保持
している）を提供する。このようなアミノ酸置換は一般に「保存性」であり、例
えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンといった１個の疎水性
残基を別のものに、または１個の極性残基を別のものに置換すること、例えばア
ルギニンをリジンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、またはグルタミンをア
スパラギンに置換することである。或る種の位置では非保存性置換が許容できる
。

【００１９】 このような特異的結合成員はＴＧＦβ₁と結合することができる。好ましい態
様は、ＴＧＦβ₂および／またはＴＧＦβ₃との、好ましくはＴＧＦβ₂およびＴ
ＧＦβ₃との有意な交差反応性を欠失している。

【００２０】 好ましい態様は、放射性レセプター検定（Lucas C等(1991) Meth in Enzymolo
gy 198、303-16）においてＣＳ３７の少なくとも５倍、より好ましくは約１０倍
、１５倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍または１５０倍の力価をもってＴ
ＧＦβ₁を強力に中和する。力価は、被検抗体とＣＳ３７とを、同等の分子形式
で、例えば一価抗体（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）として、または二価抗体（ＩｇＧ
１またはＩｇＧ４）として測定する。

【００２１】 好ましい態様は、潜在性ＴＧＦβ₁よりも活性ＴＧＦβ₁に優先的に結合する。

【００２２】 その配列が本明細書中に開示され、そしてＴＧＦβ₁のための特異的結合成員
に使用できる、ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、配列変更ま
たは突然変異およびスクリーニングの方法によって取得できる。かかる方法もま
た本発明により提供される。

【００２３】 抗体配列に加えて、特異的結合成員は、例えば折り畳まれたドメインといった
ようなペプチドまたはポリペプチドを形成している、または、当該分子に、抗原
に結合する能力に加え、別の機能的性質を付与するための、他のアミノ酸を含ん
でいるかもしれない。本発明に係る特異的結合成員は、検出可能な標識を持って
いるかもしれず、または、毒素もしくは酵素とコンジュゲートしているかもしれ
ない（例えばペプチド結合またはリンカーを介して）。

【００２４】 さらなる態様では、本発明は、上記定義による特異的結合成員をコードしてい
る配列を含む単離された核酸配列、および、当該結合成員の発現を引き起こす条
件の下で当該核酸を発現させ、そして該結合成員を回収することを含む、本発明
に係る特異的結合成員を製造する方法を提供するものである。

【００２５】 本発明に係る特異的結合成員は、人間または動物の身体の治療または診断方法
、例えば、本発明に係る特異的結合成員の有効量を当該患者に投与することを含
む、人間の患者における疾病または疾患の治療方法（これは予防的処置を包含し
得る）に使用することができる。本発明に従って治療可能な状態は下に述べる。

【００２６】 これらのおよびその他の本発明の態様のさらなる詳細を下に述べる。

【００２７】 本明細書に記載する全ての文書は引用により本明細書の一部とする。本明細書
に記載する配列は、別途個別的記載を行わない限り、核酸およびアミノ酸配列に
ついてそれぞれ５’から３’への、およびＮからＣ末端への常套的表記によって
示され、且つそれを意味する。

【００２８】 （発明の詳細な説明） 用語 特異的結合成員 これは、相互に結合特異性を有する一対の分子の成員を表す。特異的結合対の
成員は、天然由来であってよく、または全体がもしくは部分的に合成により生成
されていてもよい。この一対の分子の一方の成員は、他方の成員の特定の空間的
および極性構成と特異的に結合し、それ故、該構成に対し相補的である、表面上
の領域または空洞を有する。したがって、この対の成員は、相互に特異的に結合
する性質を持っている。特異的結合対の種類の例は、抗原−抗体、ビオチン−ア
ビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質で
ある。この出願は、抗原−抗体型の反応に関するものである。

【００２９】 抗体 これは、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成により生成されたも
のであるかに拘わらず、免疫グロブリンを表す。さらにこの用語は、抗体結合ド
メインである、または抗体結合ドメインと実質上相同である、結合ドメインを有
する任意のポリペプチドまたは蛋白を包含する。これらは天然原料から誘導でき
、またはこれらは一部もしくは全体を合成により生成することができる。抗体の
例は、免疫グロブリンイソタイプおよびそれらのイソタイプサブクラス；Ｆａｂ
、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄといったような抗原結合ドメインを含むフラグ
メント；およびジアボディ（diabody）である。

【００３０】 モノクローナルおよびその他の抗体を取得し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用
して、元の抗体の特異性を保持する別の抗体またはキメラ分子を産生することが
可能である。このような技術は、或る抗体の免疫グロブリン可変領域または相補
性決定領域（ＣＤＲ）をコードしているＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常
領域または定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを含み得る。例え
ば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４
００を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞を遺伝
子突然変異またはその他の変化に付すことができ、これは産生される抗体の結合
特異性を変えることも変えないこともある。

【００３１】 抗体は幾つかの方法で修飾することができるため、「抗体」という語は、必要
な特異性を伴う結合ドメインを有する任意の特異的結合成員または物質を包含す
るものと解するべきである。従って、この用語は、天然であるかまたは全体的も
しくは部分的に合成品であるかに拘わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む
任意のポリペプチドを包含する、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価
物および同族体を包含する。故に、別のポリペプチドに融合した、免疫グロブリ
ン結合ドメインを含むキメラ分子、または等価物が包含される。キメラ抗体のク
ローニングおよび発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０
２３に記載されている。

【００３２】 抗体全体のフラグメントが抗原を結合する機能を発揮し得るということが示さ
れている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメ
インで構成されるＦａｂフラグメント；（ii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインで構成
されるＦｄフラグメント：（iii）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインで構成
されるＦｖフラグメント；（iv）ＶＨドメインで構成されるｄＡｂフラグメント
（Ward,E.S.等、Nature 341、544-546(1989)）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；
（vi）連結した２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ(
ａｂ’)２フラグメント；（vii）２個のドメインを結びつけて抗原結合部位を形
成させるペプチドリンカーによってＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結して
いる、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird等、Science、242、423-426、1988；H
uston等、PNAS USA、85、5879-5883、1988）；（viii）二重特異性一本鎖Ｆｖ二
量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ix）遺伝子融合によって組み立
てられた多価または多特異性フラグメントである、「ジアボディ」（ＷＯ９４／
１３８０４；P.Holliger等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448、1993）で
ある。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはdiabody分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結す
るジスルフィド橋を組み込むことによって安定化することができる（Y.Reiter等
、Nature Biotech、14、1239-1245、1996）。ＣＨ３ドメインに結合させたｓｃ
Ｆｖを含むミニボディ（minibody）もまた製造することができる（S.Hu等、Canc
er Res.、56、3055-3061、1996）。

【００３３】 ジアボディはポリペプチドの多量体であって、各々のポリペプチドは、免疫グ
ロブリン軽鎖の結合領域を含む第一ドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域
を含む第二ドメインとを含み、この二つのドメインは連結している（例えばペプ
チドリンカーによって）が、相互に結びついて抗原結合部位を形成することはで
きない。抗原結合部位は、この多量体内部の一つのポリペプチドの第一ドメイン
と、この多量体内部の別のポリペプチドの第二ドメインとの結合によって形成さ
れる（ＷＯ９４／１３８０４）。

【００３４】 二重特異性抗体を使用する場合、これらは、様々な方法（Holliger,P.およびW
inter G. Current Opinion Biotechnol. 4、446-449(1993)）で製造、例えば化
学的に調製され、またはハイブリッドハイブリドーマから製造することができ、
または、上述の二重特異性抗体フラグメントのうち任意のものである、常套的二
重特異性抗体であってよい。全抗体よりはｓｃＦｖ二量体またはジアボディを使
用することが好ましいであろう。ジアボディおよびｓｃＦｖは、抗イディオタイ
プ反応の影響を低減させると思われる可変ドメインのみを使用して、Ｆｃ領域な
しで組み立てることができる。

【００３５】 二重特異性全抗体とは対照的に、二重特異性ジアボディは、さらに、E.coli中
で容易に組み立て、発現できるため、特に有用である。適当な結合特異性を有す
るジアボディ（およびその他の多くのポリペプチド、例えば抗体フラグメント）
は、ライブラリー由来のファージディスプレー（ＷＯ９４／１３８０４）を使用
して容易に選択することができる。ジアボディの一方の腕を、例えば抗原Ｘに対
する特異性と共に一定に保ちたい場合は、他方の腕が変化しているライブラリー
を作成し、適当な特異性の抗体を選択することができる。二重特異性全抗体は、
knobs-into-holes法によって作成することができる（J.B.B.Ridgeway等、Protei
n Eng.、9、616-621、1996）。

【００３６】 本出願に開示するＶＨおよびＶＬドメインにより作成されたＴＧＦβ₁のため
の一方の結合部位、およびＴＧＦβ₂のための他方の結合部位を有するジアボデ
ィを作成することができる。ＴＧＦβ₂結合部位は、例えば抗体６Ｂ１のＶＨお
よびＶＬドメインから作成することができる（ＷＯ９７／１３８４４）。

【００３７】 抗原結合ドメイン これは、抗原の一部または全体と特異的に結合し且つこれに対し相補的である
領域を含む、抗体の一部分を表す。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定部分と
のみ結合するが、この部分をエピトープと称する。抗原結合ドメインは１または
それ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインで構成される、いわゆるＦ
ｄ抗体フラグメント）によって提供し得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、
抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【００３８】 特異的 これは、特異的結合対の一方の成員が、その特異的結合相手以外の分子と有意
な結合を示さない状況を指すのに用いることができる。この用語は、例えば抗原
結合ドメインが、幾つかの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合に
も適用可能であり、その場合、抗原結合ドメインを有する特異的結合成員は、該
エピトープを有する種々の抗原に結合することができるであろう。

【００３９】 含む これは一般に、包含する、即ち、１以上の特徴または構成成分の存在を許容す
るという意味に使用する。

【００４０】 単離された これは、本発明に係る特異的結合成員、または係る結合成員をコードしている
核酸が本発明に合致する状態を指す。成員および核酸は、それらが本来結合して
いる物質、例えば、天然環境において、または、インビトロもしくはインビボで
実施される組換えＤＮＡ技術によって製造される場合はそれらが製造される環境
（例えば細胞培養）において、見出される他のポリペプチドまたは核酸を含まな
い、または実質上含まないであろう。成員および核酸は、希釈剤またはアジュバ
ントと共に調合することができ、それでいて実際的目的のために単離することが
できる。例えばこの成員は、通常、イムノアッセイに使用するための微量滴定板
の被覆に使用する場合はゼラチンまたはその他の担体と混合し、または、診断も
しくは治療に使用する場合は薬学上許容し得る担体または希釈剤と混合する。特
異的結合成員は、天然状態で、または異種真核細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳ０
（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）細胞）の系によりグリコシル化されていてよく
、またはグリコシル化されていなくともよい（例えば原核細胞における発現によ
って産生される場合）。

【００４１】 「実質的に開示されるような」とは、本発明に係るＣＤＲまたはＶＨもしくは
ＶＬドメインが、本明細書に開示される配列の特定領域と同一である、または高
度に類似していることを意味する。「高度に類似している」とは、１〜５、好ま
しくは１〜４、例えば１〜３または１もしくは２、または３もしくは４個の置換
がＣＤＲおよび／またはＶＨもしくはＶＬドメインに施されているかも知れない
ことを企図するものである。

【００４２】 本発明に係るＣＤＲを有するための構造は、一般に、当該ＣＤＲが、再編成さ
れた免疫グロブリン遺伝子によりコードされている天然に存在するＶＨおよびＶ
Ｌ抗体可変ドメインのＣＤＲに対応する位置に存在する、抗体重鎖または軽鎖配
列またはその実質的な部分の構造となるであろう。免疫グロブリン可変ドメイン
の構造および位置は、（Kabat,E.A.等、Sequences of Proteins of Immunologic
al Interest 第4版、US Department of Health and Human Services 1987、およ
びその更新版、現在インターネット上で利用可能（http://immuno.bme.nwu.edu
））を参照して決定できる。ＣＤＲは一般にKabatにより定義された通りである
。さらに、ＣＤＲには、Kabat ＶＨ ＣＤＲ１に隣接するChothiaにより定義され
たループの移植残基を移植することもできる。ＳＬ１５Ｓに関しては、これは重
鎖の残基２６〜３０を含むであろう（ＧＦＴＧＳ）。

【００４３】 好ましくは、第１表に実質上開示するアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメイン
中のＣＤＲ３またはその実質的一部分として存在する。

【００４４】 本発明において使用する可変ドメインは、任意の生殖細胞系または再編成され
たヒト可変ドメインから誘導されてよく、または、既知のヒト可変ドメインのコ
ンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってよい。本発明に係るＣＤＲ由
来配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ３領域を欠失する可変ドメインの
レパートリー中に導入することができる。

【００４５】 例えば、Marks等(Bio/Technology、1992、10:779-783)は、抗体可変ドメイン
のレパートリーを生成する方法を記載しており、この方法では、可変ドメイン領
域の５’末端を目的とし、またはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒ
トＶＨ遺伝子の第三フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと組み
合わせて使用し、ＣＤＲ３を欠失するＶＨ可変ドメインのレパートリーを得る。
Marks等はさらに、このレパートリーが特定の抗体のＣＤＲと如何にして結合で
きるかを記載している。類似の技術を使用して、本発明に係るＣＤＲ３由来配列
を、ＣＤＲ３を欠失するＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャフルし、
このシャフルした完全なＶＨまたはＶＬドメインを同起源のＶＬまたはＶＨドメ
インと合して、本発明に係る特異的結合成員を得ることができる。次いでこのレ
パートリーを適当な宿主系、例えばＷＯ９２／０１０４７号のファージディスプ
レー系中でディスプレーすると、その結果、好適な特異的結合成員が選択できる
。レパートリーは、１０⁴以上の個々の成員、例えば１０⁶〜１０⁸または１０¹⁰
の成員から構成し得る。

【００４６】 類似のシャフルまたは組み合わせ技術はStemmerによっても開示されており（N
ature、1994、370:389-391）、これは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を
記載しているが、このアプローチは抗体の産生に使用できることを観察している
。

【００４７】 さらなる別法は、可変ドメイン全体に突然変異を導入するため、例えばＳＬ１
５もしくはＪＴ１８２のＶＨ遺伝子またはＳＬ１５ＡもしくはＳＬ１５ＳのＶＬ
遺伝子の無作為突然変異誘発を使用して、本発明に係るＣＤＲ由来配列を有する
新規なＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。このような技術はGram等(199
2、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、89:3576-3580)により記載されており、誤りがち
なＰＣＲを使用している。

【００４８】 使用できるもう一つの方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に突然変異
誘発を実施することである。このような技術はBarbas等（1994、Proc.Natl.Acad
.Sci.,USA、91:3809-3813）およびSchier等(1996、J.Mol.Biol. 263:551-567)に
より開示されている。

【００４９】 上記の技術は全て当分野において自体既知であり、それ自体で本発明の一部を
形成する訳ではない。当業者は、当分野における通常の方法を用いて本発明に係
る特異的結合成員を得るために、このような技術を使用することができるであろ
う。

【００５０】 本発明のさらなる態様は、ＴＧＦβ₁に特異的な抗体抗原結合ドメイン、およ
び、好ましくは、本発明に係る態様に従う特異的結合成員のために本明細書に開
示される１以上のさらなる性質を取得するための方法を提供するものであって、
この方法は、本明細書に開示されるＶＨドメイン（ＳＬ１５またはＪＴ１８２）
のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸を付加、除去、置換または挿入することに
より、当該ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを取得し、こ
のように取得したＶＨドメインを１以上のＶＬドメインと合し、そしてこのＶＨ
／ＶＬの組み合わせ物（群）を試験して、ＴＧＦβ₁に特異的な、そして所望に
より１以上の好ましい前記性質を有する、抗体抗原結合ドメインを同定すること
を含むものである。このＶＬドメインは、ＳＬ１５Ａ ＶＬとして実質的に開示
されているアミノ酸配列（ＣＳ３７）を有するか、またはＶＬとして実質的に開
示されているアミノ酸配列を有することができる。

【００５１】 本明細書に開示されているＶＬドメインの１以上の配列変異体を１以上のＶＨ
ドメインと合する、類似の方法を使用することもできる。

【００５２】 本発明に係るさらなる態様は、ＴＧＦβ₁に対し特異的な特異的結合成員を製
造する方法を提供し、この方法は、 ａ）置換されるべきＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３コード化領域を欠失す
る、ＶＨドメインをコードしている核酸の出発レパートリーを提供し； ｂ）当該レパートリーを、ドナー核酸が当該レパートリーのＣＤＲ３領域中に
挿入されるよう、ＳＬ１５またはＪＴ１８２ ＶＨ ＣＤＲ３として本明細書に実
質的に開示されているアミノ酸配列をコードしているドナー核酸と合して、ＶＨ
ドメインをコードしている核酸のレパートリー生成物を提供し； ｃ）当該レパートリー生成物の核酸を発現させ；そして、 ｄ）ＴＧＦβ₁に対し特異的な特異的結合成員を選択し；そして、 ｅ）当該特異的結合成員またはそれをコードしている核酸を回収する、 ことを含む。

【００５３】 また、本発明に係るＶＬ ＣＤＲ３を、置換されるべきＣＤＲ３を含むか、ま
たはＣＤＲ３コード化領域を欠失する、ＶＬドメインをコードしている核酸のレ
パートリーと合する、類似方法を使用することもできる。

【００５４】 同様に、１以上、または３個全てのＣＤＲをＶＨまたはＶＬドメインのレパー
トリー中に導入し、次いでこれを、特異的結合成員またはＴＧＦβ₁に特異的な
特異的結合成員についてスクリーニングすることができる。

【００５５】 免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３個のＣＤＲ領域
を、それらに介在するフレームワーク領域と共に含むであろう。好ましくは、こ
の部分はさらに、第一および第四フレームワーク領域の片方または両方の、少な
くとも約５０％を含むであろう［ここで、この５０％とは、第一フレームワーク
領域のＣ末端の５０％および第四フレームワーク領域のＮ末端の５０％である］
。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端にあるさらなる残基は、天然
に存在する可変ドメイン領域には通常結合していないものであるかもしれない。
例えば、組換えＤＮＡ技術によって作成される本発明に係る特異的結合成員の組
み立ては、−または、クローニングまたはその他の操作工程を容易にするために
導入されるリンカーによりコードされているＣ末端残基の導入を産むかもしれな
い。その他の操作工程は、本発明に係る可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、
その他の可変ドメイン（例えば、ジアボディの生成において）またはより詳しく
下記に論ずる蛋白標識を包含するさらなる蛋白配列に連結するためのリンカーの
導入を包含する。

【００５６】 本発明に係る好ましい態様において、一対のＶＨおよびＶＬドメインを含む特
異的結合成員が好ましいものの、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれかに基づ
く単一の結合ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。単一免疫グロブリ
ンドメイン、特にＶＨドメインは、特異的に標的抗原を結合することができるこ
とが知られている。

【００５７】 一本鎖の特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインを用いて、
ＴＧＦβ₁に結合できる２ドメイン特異的結合成員を形成することのできる相補
的ドメインをスクリーニングすることができる。

【００５８】 これは、ＷＯ９２／０１０４７号に開示されるいわゆる序列的二元的組み合わ
せアプローチを用いるファージディスプレースクリーニング法によって達成する
ことができ、この方法では、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロ
ニーを使用して、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードしているクローンの完全なラ
イブラリーを感染させ、得られる二本鎖の特異的結合成員を、この参考文献に記
載されるようなファージディスプレー技術に従って選択する。この技術はMarks
等、同書、にも開示されている。

【００５９】 本発明に係る特異的結合成員は、さらに抗体定常領域またはその一部を含み得
る。例えば、ＳＬ１５Ａ ＶＬまたはＳＬ１５Ｓ ＶＬといったようなＶＬドメイ
ンをそれらのＣ末端で、ヒトＣκまたはＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖を含む抗体軽
鎖定常ドメインに結合させることができる。同様に、ＳＬ１５ ＶＨに基づく特
異的結合成員をそれらのＣ末端で、任意の抗体イソタイプ、例えばＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥおよびＩｇＭならびに任意のイソタイプサブクラス、特にＩｇＧ１お
よびＩｇＧ４から誘導される免疫グロブリン重鎖の全てまたは一部に結合させる
ことができる。ＩｇＧ４が好ましい。

【００６０】 本発明に係る抗体は、検出可能なまたは機能的な標識で標識することができる
。検出可能な標識とは、¹³¹Ｉまたは⁹⁹Ｔｃといった放射性標識を包含し、これ
らは抗体画像化の分野で既知の常套的化学を用いて本発明に係る抗体に結合させ
ることができる。標識はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素標識を
包含する。標識はさらに、同起源の特異的検出部分、例えば標識されたアビジン
に結合させることによって検出できる、ビオチンのような化学的部分を包含する
。

【００６１】 本発明に係る抗体は、人間または動物対象、好ましくは人間における診断また
は治療方法に使用するよう設計される。

【００６２】 ヒトＴＧＦβ₁に対し特異的な抗体は、線維症の疾患および慢性関節リウマチ
または癌のようなＴＧＦβ₁が過剰発現されるその他の疾患の治療に対して動物
モデルにおいて有効であることが示された。ＴＧＦβ₁に対する抗体は、糸球体
腎炎（W.A.Border等、Nature 346 371-374、1990）；神経瘢痕形成（A.Logan等
、Eur.J.Neurosci. 6 355-363、1994）；皮膚瘢痕形成（M.Shah等、Lancet 339
213-214、1992；M.Shah等、J.Cell.Science 107 1137-1157、1994；M.Shah等、1
08 985-1002、1995）、および肺線維症（Giri等、Thorax 48、959-966、1993）
の治療に有効であることが示された。さらに、イソ型ＴＧＦβ１、２および３と
交差反応性の抗体は、肺線維症、照射誘発性線維症（Barcellos-Hoff、米国特許
５６１６５６１(1997)）、骨髄線維症、火傷、デュプイトラン拘縮、胃潰瘍およ
び慢性関節リウマチ（Wahl等、J.Exp.Medicine 177 225-230、1993）のモデルに
おいて有効であることが示された。

【００６３】 ＴＧＦβ₁に対する抗体の投与により改善し得る、細胞外マトリックス沈着を
伴う幾つかの状態がさらに存在する。これらは、全身性硬化症、術後癒着、ケロ
イドおよび過形成性瘢痕形成、増殖性硝子体網膜症、緑内障ドレナージ手術、角
膜損傷、白内障、ペーロニー病、糖尿病性腎症、成人呼吸困難症候群、肝硬変、
心筋梗塞後、血管形成術後再狭窄、ケロイド性瘢痕、くも膜下出血後瘢痕形成、
多発性硬化症、椎弓切除術後線維症、腱およびその他の修復後の線維症、入れ墨
除去、硬化性胆管炎、心膜炎、胸膜炎、気管切開術、貫通性ＣＮＳ損傷、好酸球
性筋痛症候群、血管再狭窄、静脈閉塞病、膵炎および乾癬性関節症を包含する。
幾つかの場合には、ＴＧＦβ₂に対する抗体、例えば６Ｂ１ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−
１５２）（ＷＯ９７／１３８４４号を参照されたい）と組み合わせた治療が、例
えば皮膚瘢痕形成の治療において有効に使用できる。角膜上皮創傷治癒の治療に
おけるＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４の有効性を実施例６に立証する。

【００６４】 角膜創傷治癒の促進におけるＣＡＴ−１９２の成功は、上皮再形成の促進が有
益であるその他の状態においてこれが有用であるという適応を提供する。これら
は、皮膚の疾患、例えば静脈性潰瘍、虚血性潰瘍（褥創）、糖尿病性潰瘍、移植
部位、移植ドナー部位、擦過傷および火傷、気管支上皮の疾患、例えば喘息、Ａ
ＲＤＳ、腸管上皮の疾患、例えば細胞障害性治療に伴う粘膜炎、十二指腸潰瘍（
反射性疾患）、胃潰瘍、小腸および大腸の病変（炎症性腸疾患）を包含する。

【００６５】 ＴＧＦβはまた、内皮増殖を阻害し、よって抗ＴＧＦβは、アテローム性プラ
ークの安定化および血管吻合の高速治癒に使用することができる。ＴＧＦβは平
滑筋の増殖を刺激し、よって抗ＴＧＦβ治療はさらに、動脈疾患および喘息に対
して適当であり得る。

【００６６】 喘息は、空気の流れの間欠的な閉塞として現れ、時と共に進行性となり得る、
気道の慢性炎症性疾患である。アレルギー性および非アレルギー性形態のいずれ
においても、Ｔｈ−２サイトカイン放出に傾く局所Ｔ細胞反応の変化と、その結
果起こるＢ細胞イソタイプのＩｇＥへの変換、肥満細胞、好酸球および好塩基球
の増加、ならびに広範囲の炎症仲介物質の活性化および放出の証拠がある。しか
しながら、炎症は単独では慢性喘息の多くの特徴を説明することができず、気道
壁の再構築もまた必要であることが明らかとなった（Holgate ST等、J.Allergy
Clin.Immunol. 2000(印刷中)）。この「リモデリング」反応は、持続性気管支過
剰反応（ＢＨＲ）(Lundgren R等、(1988) Eur.Respir.J. 1(10)、883-889)、お
よび経時的な肺機能の進行性減衰（これは、より慢性且つ重篤な疾患に伴う喘息
において起こる）(Lange P等、(1998) N.Engl.J.Med. 339(17)、1194-1200)を伴
うコルチコステロイドの不完全な治療上の有効性を説明するものである。

【００６７】 上皮下および粘膜下線維症が喘息に関連している。高分解能ＣＴで評価すると
、重篤な喘息の患者は、正常な対象または疾患が軽度である患者に比較して、よ
り肥厚した気道を有する（Awadh N等、(1998) Thorax 53(4)、248-253）。これ
は、ＳＢＭコラーゲン層の肥厚および密度増加を含み、平滑筋および微小血管ネ
ットワークの増加を含む（Carroll N等、(1993) Am.Rev.Respir.Dis. 147(2)、4
05-410）。人間の気道およびモルモットの慢性抗原曝露モデルで実施した測定に
基づくと、ＳＢＭ肥厚は気道壁全体の肥厚を反映している。ＳＢＭ−コラーゲン
の肥厚は、疾患の重篤度、慢性度およびＢＨＲと相関していることが示された。

【００６８】 ＳＢＭの肥厚は、網状板への介在性コラーゲンＩ、IIIおよびＶ型ならびにフ
ィブロネクチンの沈着が原因であり、その数および活性が喘息時に増大し（Brew
ster CE等、(1990) Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 3(5)、507-511）アレルゲンの
曝露によりさらに増強される（Gizycki MJ等、(1997) Am.J.Respir.Cell Mol.Bi
ol. 16(6)、664-673）、筋線維芽細胞に由来している。気管支の生検および洗浄
の研究は、上皮が前線維形成成長因子の供給源である可能性があるという事の動
かしがたい事例を提供した。喘息では、ＴＧＦβおよびｂ−ＦＧＦの免疫染色は
、マトリックスの上皮局在および広範囲の染色を共に示し、この事は、これらの
成長因子とマトリックスプロテオグリカンとの間の、特異的グリコサミノグリカ
ン（ＧＡＧ）結合部位を介した重要な相互作用を示唆するものである（Redingto
n AE等、(1998) J.Pathol. 186(4)、410-415）。ＴＧＦβ₁およびｂ−ＦＧＦは
共に洗浄液中に濃度が増大して見出され、さらなる増大がアレルゲンの曝露後に
見出された（Redington AE等、(1997) Am.J.Respir.Crit.Care Med. 156(2、Pt1
)、642-647）。成長因子、サイトカインおよびケモカインの組織分析は、これら
は主として複合体、高分子量形態で存在することを示した。潜在性関連ペプチド
がＴＧＦβ結合分子として同定され、気管支の外植片モデルを使用して、喘息粘
膜組織のアレルゲン曝露が、プラスミン活性に依存するＴＧＦβの活性化を引き
起こし、一方ｂ−ＦＧＦは、ヘパリンおよびへパリナーゼにより、それぞれ肥満
細胞および好酸球から可溶性型で放出されることが示された（McConnell W等、E
ur.Respir.J. 152s.1999、Ref Type:Abstract）。

【００６９】 喘息はさらに、上皮の傷害および気道のリモデリングに関与している。喘息に
おけるリモデリングされた気道の特徴は、炎症性細胞生成物により惹起される広
範な上皮の損傷である（Laitinen LA等、(1985) Am.Rev.Respir.Dis. 131(4)、5
99-606）。粘膜の損傷は、組織を損傷する分子がスムーズに気道壁中を通過する
ことを可能にするのみならず、様々な前炎症性ケモカイン、オータコイド仲介物
質および接着分子を発現させつつ（これらは慢性炎症に貢献する）上皮の「活性
化」を惹起する（Holgate ST等、J.Allergy Clin.Immunol. 2000(印刷中)）。傷
ついたそして修復しつつある上皮細胞は、ＴＧＦβイソ型を包含する線維増殖性
および前線維形成性成長因子の産生増加を介する気道リモデリングの重要な調節
物質でもある（Zhang S等、(1999) Lab.Invest. 79(4)、395-405）。表皮成長因
子レセプター（ＥＧＦＲ）により仲介される上皮の修復の障害は、筋線維芽細胞
培養に条件培地を添加する時、損傷した上皮細胞によるＴＧＦβ₂の放出を大幅
に増加させ、そしてコラーゲンIII遺伝子の発現を顕著に増強することが、近年
判明した。ＴＧＦβイソ型は上皮細胞増殖の強力なインヒビターであるため、喘
息におけるＴＧＦβの過剰産生は、喘息の上皮に見出される増殖マーカーＰＣＮ
Ａの発現が意外なほど低レベルであることを説明できる（Demoly P等、(1994) A
m.J.Respir.Crit.Care Med. 150(1)、214-217）。このようにして、上皮下の筋
線維芽細胞によるコラーゲン生合成に好都合な条件は、上皮の修復を遅延させる
ことにより、疾病の慢性度にも貢献し得る。したがって、本発明に係る特異的結
合成員の使用によるＴＧＦβレベルの低減は、慢性且つ重篤な喘息において気管
支の筋線維芽細胞によるマトリックス蛋白生合成を妨げ、同時に非活性化上皮表
現型および正常な障壁機能を回復するための気管支上皮修復を促進する必要性を
標的とするものと期待できるであろう。

【００７０】 ＴＧＦβ₁はまた、例えば悪性腫瘍および感染症に反応して免疫および炎症反
応を調節する。ＴＧＦβ₁に対する抗体は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎または結核のよ
うな感染症に対する免疫反応を改善するために、または、例えば腫瘍もしくはＡ
ＩＤＳ感染症もしくは肉芽腫疾患により誘導される免疫抑制を減少させるために
使用できる。ＴＧＦβ₁に対する抗体は、臓器移植の急性および慢性拒絶および
悪性腫瘍の治療に有用であり、シクロスポリン治療により誘発される癌細胞の拡
散の防止に使用することができる。

【００７１】 ＴＧＦβ₁に対する抗体は免疫療法のアジュバントとして使用することができ
る。

【００７２】 ＴＧＦβ₁に対する抗体は、例えば腫瘍の治療において血管新生の阻害に使用
することができる。腫瘍細胞の大部分は検出可能レベルのＴＧＦβ₁を発現する
（Wojtowicz-Praga 1997、J.Immuther. 20(3):165-77）。さらに、高レベルのＴ
ＧＦβ₁を産生する細胞は、高い転移（Blanckaert等、1993、Cancer.Res. 53(17
);4057-81）または侵襲（Arteaga等、1993、Cell Growth and Differentiation
4(3):193-201）可能性を持っている。多くの癌においてＴＧＦβ₁の血漿レベル
は疾病の経過と相関している。したがって、ＴＧＦβ₁の供給源は、腫瘍細胞お
よび周囲組織であり得る。

【００７３】 ＴＧＦβは正常な健康な上皮組織における悪性変化の強力な抑制物質であり、
増殖を阻害することができる。しかしながら、多くの進行癌は、II型ＴＧＦβレ
セプター（Markowitz等、1995、Science 268(5215):1336-8）またはＳＭＡＤシ
グナル伝達（Hata等、1998、Mol.Med.Today 4(6):257-62）の異常の結果、ＴＧ
Ｆβの生長阻害作用に対して耐性となる。

【００７４】 腫瘍は１mm³を超える成長および転移のためには血液の供給を必要とする（Fol
kman 1995、Breast Cancer Res.Treat. 36(2):109-18）。この事が、充実性腫瘍
の抗血管形成治療の急速な発展につながってきた。

【００７５】 ＴＧＦβ₁は、インビトロおよびインビボでＶＥＧＦ産生をアップレギュレー
ションすることにより間接的に血管新生を惹起することが示された。乳癌は多数
の浸潤するマクロファージを含んでいる。これらの腫瘍内部の細胞の役割および
機能は依然として明らかでないが、幾つかの研究は、予後不良との結びつきを見
出している。腫瘍細胞および腫瘍マクロファージはいずれもインビトロでＶＥＧ
Ｆを産生し、産生はＴＧＦβ₁によりアップレギュレーションされる。血清ＶＥ
ＧＦレベルは乳癌患者において亢進し、これらのレベルは血清ＴＧＦβ₁レベル
に直接相関している。したがって、乳癌細胞および癌関連マクロファージによる
ＴＧＦβ₁発現は、ＶＥＧＦの生成によって血管新生反応を選択することができ
る（Donovan等、1997、Ann.Surg.Oncol. 4(8):621.7；Harmey等、1998、Ann.Sur
g.Oncol. 5(3):217-8）。

【００７６】 Ueki等（1992、Japanese Journal of Cancer Research 84(6):589-93）は、Ｔ
ＧＦβ₁がインビボで腫瘍の成長を増強することを立証した。このグループはＣ
ＨＯ細胞をＴＧＦβ₁遺伝子で離断（transect）し、ＴＧＦβ₁の過剰発現を引き
出した。ＴＧＦβ₁を分泌するＣＨＯ細胞は、ヌードマウスに皮下注射すると、
離断されていない細胞より迅速に増殖することが示された。顕著な血管新生がＴ
ＧＦβ₁−離断細胞から誘導された腫瘍で観察され、非離断細胞では、血管新生
は減少した。加えて、抗ＴＧＦβ₁中和抗体は、ＴＧＦβ₁−離断細胞から誘導さ
れた腫瘍における成長および血管新生の両者を阻害することができた。したがっ
て、腫瘍細胞によるＴＧＦβ₁の過剰産生は、腫瘍の成長および新生血管形成に
寄与していた。

【００７７】 癌を持っている患者は不完全な免疫系を有することが知られている。近年、Ｔ
ＧＦβ₁は腫瘍関連免疫抑制において重要な役割を果たしていることが示唆され
た。この話題は最近の総説の焦点となっている（Wojtowicz-Praga、1997、同書
）。確かにＴＧＦβ₁は強力な免疫抑制物質であるように見受けられ、そしてこ
れは様々な腫瘍細胞系統から、そして腫瘍を持っている宿主の血漿中に一貫して
検出されている。

【００７８】 モノクローナル抗体によるＴＧＦβ₁の中和またはアンチセンスによる産生の
阻害は、動物モデルにおいて腫瘍の成長および転移能の減弱を産む。マウスにお
ける、ＴＧＦβ₁によって離断されたＭＣＦ−７乳癌細胞の成長は、２Ｇ７（反
復i.p.用量）、抗ＴＧＦβ_{1 2 3}抗体によって妨げられる（Arteaga等、同書）。
正常なＭＣＦ−７細胞の成長は２Ｇ７によって妨げられるが、これは処置が腫瘍
細胞の接種時に開始された場合に限る。さらに、抗ＴＧＦβ抗体が、腫瘍により
誘導される免疫抑制を再現する作用の、より信ずべき証拠が提供された（Arteag
a等、J.Clin.Invest. 92(6):2569-76）。ＭＤＡ−２３１、ヒト乳癌細胞系統が
、ヌードマウスにおいてi.p.接種後に脾臓ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の
低下を惹起した。２Ｇ７（２００μg、２日毎、i.p.）は、腹腔内腫瘍および肺
転移を減弱させると共に、脾臓ＮＫ細胞活性を顕著に増大させた。さらに、ＭＤ
Ａ−２３１腫瘍細胞の培養由来の条件培地はヒト血液のＮＫ細胞活性を阻害し、
２Ｇ７はこれをも妨げた。ＭＤＡ−２３１細胞の皮下異種移植片の成長は、２Ｇ
７によって一時的に阻害されたに過ぎなかった。腫瘍成長、転移、およびＮＫ細
胞活性に及ぼす２Ｇ７の作用は、ベージュＮＫ細胞欠損ヌードマウスでは存在し
なかった（Arteaga等、J.Clin.Invest. 92(6):2569-76）。

【００７９】 さらなる研究では、ＩＬ−２（１００００Ｕ、腹腔内、２回／日）と組み合わ
せた２Ｇ７抗ＴＧＦβ抗体（５００μg 、腹腔内、隔日）は、Ｂ１６黒色腫の肺
転移を低減することができたが、静脈内接種ほど有効ではなかった。２Ｇ７単独
もまた肺転移の数を低下させたが、併用治療ほど有効ではなかった。血漿ＴＧＦ
β₁レベルは抗体処置動物において有意に低下した（Wojtowicz-Praga等、1996、
J.Immunother.Emphasis Tumour Immunol. 19(3):169-75）。先の二つの研究はい
ずれも、抗ＴＧＦβ₁およびＩＬ−２の組み合わせを使用した場合の効果を示す
ことができないか、または些少の効果を惹起したに過ぎなかった（それぞれGrid
ley等、1993、Cancer Biother. 8(2);159-70；Mao等、1994、Cancer Biother. 9
(4):317-27）が、これらの研究で使用した抗ＴＧＦβ₁抗体の用量は小さかった
（それぞれ１００ngおよび１μg）。したがって、動物モデルのデータから、抗
ＴＧＦβ療法と免疫刺激との組み合わせは、癌に対するこの治療的アプローチの
概念の証拠を提供するように見受けられる。

【００８０】 HoeferおよびAnderer（1995、Cencer Immunol.Immunother. 41(5):302-8）は
、ヒト癌腫細胞系統ＳＬＵ−１、および極めて転移性のサブラインＳＬＵ−Ｍ１
が、ヌードマウスにおいて皮下接種後に転移を引き起こすことを立証した。転移
の発生および一次腫瘍の成長は、抗ＴＧＦβ₁抗体による処置によって低下した
（３日目からの処置、腫瘍部位に１００μg を、皮下に、３−４日毎）。この著
者は、当該抗体がＴＧＦβ₁により誘発される免疫抑制を逆転させ、腫瘍の成長
および転移の阻害を導くと示唆した。

【００８１】 過去の研究はさらに、抗ＴＧＦβ抗体がインビボで腫瘍の転移を低減させ得る
ことを立証した（Arteaga等、1993、J.Clin.Invest. 92(6):2569-76；Hoeferお
よびAnderer、1995、同書；Wojtowicz-Praga等、1996、同書）。これらの研究か
らの最初の結論は、ＴＧＦβ₁により誘発される免疫抑制が、これらの腫瘍の異
種移植片の転移をさせることを示唆した。しかしながら、最近の論文は、ＴＧＦ
β₁が細胞の侵襲および転移能力を直接亢進し得ることを示唆している(Hojo等、
1999、Nature 397:530-534)。シクロスポリンは、培養中のヒト肺腺癌細胞から
のＴＧＦβ₁の放出を用量依存的に誘発するが、シクロスポリンによるＴＧＦβ
産生のメカニズムは分かってい〜クロスポリン（またはＴＧＦβ₁）による腺癌
細胞の処理は、膜の波打ち運動、偽足の形成、足場非依存的（侵襲的）成長およ
び運動性を引き起こす。抗ＴＧＦβ₁抗体はインビトロでこれらの細胞形態およ
び運動性の変化を阻害する。同様の観察が、腎細胞腺癌、乳腺上皮細胞およびミ
ンクの肺上皮肺細胞についてなされた。免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｔ
細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞における欠損）において、シクロスポリンは、マウス腎
細胞腺癌、ルイス肺癌またはヒト膀胱癌細胞のインキュベーション（静脈内）後
の転移の数を増加させた。抗ＴＧＦβ_{1 2 3}中和抗体、１Ｄ１１.１６による処置
（２００μg／日、腫瘍細胞接種の１日前に最初の投与）は、シクロスポリン処
置マウスにおいて肺転移の数を著しく低下させた（シクロスポリン非処置対照群
以下のレベルまで）。したがって、ＴＧＦβ₁産生に依存する作用により、シク
ロスポリンは、宿主免疫系に独立して動物モデルにおける侵襲および転移を増大
させると思われる（Hojo等、1999、同書）。

【００８２】 インビトロおよびインビボモデルからの証拠は、ＴＧＦβ₁が３つの主要メカ
ニズム；血管新生、免疫抑制、ならびに侵襲および転移行動を増大させる腫瘍細
胞の表現型の変化、を利用して、腫瘍形成を増強し得るということを示唆してい
る。したがって、ＴＧＦβ₁の阻害は、人間における悪性腫瘍を阻害し、１個の
分子内部で複合的な抗癌治療を提供すると期待される。

【００８３】 ＴＧＦβ₁が関与している癌は、乳房、前立腺、卵巣、胃、結腸直腸、皮膚、
肺、子宮頸部および膀胱癌、ならびに様々な白血病および肉腫、例えばカポジ肉
腫を包含する。したがって、本発明に係る抗体は、ＴＧＦβ₁が血管新生、転移
または腫瘍の進行に関与している、前記の状態の癌を包含する癌の治療のために
投与することができる。癌療法の文脈では、「治療」とは、腫瘍の成長の遅化ま
たは腫瘍転移の低減、ならびに患者の予測寿命を延長するための癌の部分的寛解
を産む、任意の医学的介入を包含することが、むろん理解されるであろう。

【００８４】 癌の治療のための抗体療法は、当分野において確立した治療である。現在、臨
床治験の第Ｉ相、第II相または第III相にあるその他多数の抗癌抗体に加えて、
３つの抗癌抗体が、米国および／またはヨーロッパで臨床使用のために現在認可
されている（結腸直腸癌治療のためのPanorex、Ｂ細胞リンパ腫のためのRituxan
および乳癌のためのHerceptin）。これらの抗体はしばしば末期治療に使用され
、前段落の基準により有効であると考えられると同時に、幾つかの症例では、腫
瘍の完全な寛解をもたらす。

【００８５】 したがって、本発明のさらなる態様は、提供された特異的結合成員の投与を含
む治療方法、係る特異的結合成員を含む医薬組成物、および、投与のための医薬
の製造、例えば該特異的結合成員を薬学上許容し得る賦形剤と共に調合すること
を含む、医薬または医薬組成物の製造方法におけるこのような特異的結合成員の
使用、を提供するものである。

【００８６】 本発明に従い、提供される組成物は個人に投与することができる。投与は好ま
しくは、患者にとって有益性を示すに充分な、「治療上有効な量」で行われる。
かかる有益性は、少なくとも１個の症状の、少なくとも改善であってよい。実際
の投与量、および投与の速度および時間的推移は、治療されるべきものの性質お
よび重篤度に依存するであろう。治療の処方、例えば用量の決定等は、一般医お
よびその他の医師の責任範囲にある。抗体の適当な用量は当分野でよく知られて
おり、Ledermann J.A.等、(1991)「Int J.Cancer」47:659-664；Bagshawe K.D.
等、(1991)、「Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals」4:915
-922を参照されたい。

【００８７】 組成物は、単独で、または他の治療と組み合わせて、治療されるべき状態に応
じて同時にまたは連続的に投与することができる。

【００８８】 本発明に係る抗体は、治療を必要とする患者に、任意の適当な経路を介して、
通常、血流中に、または治療すべき部位、例えば角膜、創傷、腫瘍等に直接注射
することによって、投与できる。正確な用量は、抗体が診断用であるか治療用で
あるか、治療すべき領域（例えば創傷）の大きさおよび位置、抗体の正確な性質
（例えば全抗体、フラグメントまたはジアボディ）、および抗体に結合させた検
出標識またはその他の分子があればそのものの性質、を包含する、幾つかの因子
に依存するであろう。典型的な抗体用量は、糸球体腎炎での線維症または癌の治
療といった全身適用については０.５mg〜１００ｇ、そして皮膚瘢痕形成の治療
といった局所適用については１０μｇ〜１mgの範囲となるであろう。典型的には
、当該抗体は、抗体全体、好ましくはＩｇＧ４イソタイプである。これは成人患
者の一回治療のための用量であって、子供および幼児のためには比例させて調節
することができ、また、他の抗体形式については分子量に比例して調節すること
ができる。治療は医師の裁量で、毎日、週に２回、毎週または毎月の間隔で反復
することができる。

【００８９】 現在、全身および局所適用にはＩｇＧ４イソタイプの全抗体を使用するのが好
ましいが、局所適用にはｓｃＦｖ抗体が特に価値がある。

【００９０】 本発明に係る特異的結合成員は、通常、医薬組成物の形で投与するが、これは
、該特異的結合成員に加えて少なくとも１つの構成成分を含み得る。

【００９１】 本発明に係る、そして本発明に従う用途のための、医薬組成物は、活性成分に
加えて薬学上許容し得る賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者によく知ら
れるその他の材料を含んでいてよい。かかる材料は非毒性でなければならず、且
つ活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体またはその他の材料の正確な性
質は、投与経路に依存し、これは経口、または注射、例えば静脈注射によるもの
であってよい。

【００９２】 経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液体剤型とす
ることができる。錠剤はゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含むこ
とができる。液体の医薬組成物は一般に、水、石油、動物性もしくは植物性油、
鉱油または合成油といった液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは
その他の糖類溶液またはグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレン
グリコールまたはポリエチレングリコールを包含し得る。点眼薬のような製剤は
、目の線維症または瘢痕形成の予防または治療にとって価値がある。

【００９３】 静脈注射または罹患部位への注射のためには、当該活性成分は、発熱物質を含
まず、且つ適切なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容し得る水溶
液の剤型であろう。当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、
乳酸化リンゲル注射液といったような等張媒質を用いて適当な溶液を調製するこ
とが十分可能である。保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその
他の添加物を必要に応じて含有させることができる。

【００９４】 当該抗体は、線維症を予防するため持続供給系から投与することができ、また
は、挿入に伴う線維症の発症を予防するため股関節置換具のような装具上に被覆
することができる。

【００９５】 組成物は単独で、または他の治療と組み合わせて、治療されるべき状態に応じ
て同時にまたは連続的に投与することができる。他の治療とは、適当な用量の疼
痛緩和薬、例えば非ステロイド抗炎症薬（例えばアスピリン、パラセタモール、
イブプロフェンまたはケトプロフェン）もしくはモルヒネのようなアヘン剤、ま
たは制吐剤の投与を包含することができる。

【００９６】 本発明は、本発明において提供される特異的結合成員の、ＴＧＦβ₁への結合
を引き起こす、またはそれを許容することを含む方法を提供する。言及したよう
に、このような結合は、例えば特異的結合成員または特異的結合成員をコードし
ている核酸の投与後に、インビボで起こり得、またはこれはインビトロで起こり
得る。

【００９７】 ＴＧＦβ₁への、特異的結合成員の結合量を決定することができる。定量は被
検試料中のＴＧＦβ₁の量に関係しているかもしれず、これは診断上の興味が持
たれ、例えば、ＴＧＦβ₁の測定値は、アテローム性動脈硬化症の指標としても
提唱されている（低い濃度は進行したアテローム性動脈硬化症と相関している）
。

【００９８】 試料上での抗体の反応性は、任意の適当な手段によって決定することができる
。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は一つの可能性である。放射標識されたＴＧ
Ｆβ₁を非標識ＴＧＦβ₁（被検試料）と混合し、当該抗体と結合させる。結合し
たＴＧＦβ₁を非結合ＴＧＦβ₁から物理的に分離し、抗体に結合した放射性ＴＧ
Ｆβ₁の量を決定する。被検試料中にＴＧＦβ₁が多ければ多いほど、より少ない
放射性ＴＧＦβ₁が抗体に結合する。リポーター分子に結合させたＴＧＦβ₁また
はＴＧＦβ₁の類似体を使用して、非放射性ＴＧＦβ₁を用いる競合的結合検定を
使用することもできる。リポーター分子は、スペクトル的に孤立した吸収または
発光特性を有する、蛍光色素、燐またはレーザー色素とすることができる。好適
な蛍光色素は、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびテキサス
レッドを包含する。好適な色素生成染料はジアミノベンジジンを包含する。

【００９９】 その他のリポーターは、巨大分子のコロイド粒子または粒子材料、例えば着色
した、磁性もしくは常時性のラテックスビーズ、および、視認でき、電気的に検
出でき、またはその他の手段で記録できる、検出シグナルを直接もしくは間接的
に惹起できる、生物学的もしくは化学的に活性な物質を包含する。これらの分子
は、発色させもしくは色調を変化させ、または例えば電気的性質の変化を惹起す
る反応を触媒する酵素であってよい。それらは、エネルギー状態間の電子転移が
特徴的なスペクトル吸収または発光を招くよう、分子的に励起させ得る。それら
はバイオセンサーと組み合わせて使用する化学物質を包含し得る。ビオチン／ア
ビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出
系が使用できる。

【０１００】 個々の抗体−リポーターコンジュゲートにより生成されるシグナルを用いて、
試料中の（正常および被検）関連する抗体結合の、定量可能な絶対的または相対
的データを誘導することができる。

【０１０１】 本発明はさらに、競合検定でＴＧＦβ₁レベルを測定するための、上記特異的
結合成員の用途、即ち、本発明により提供される特異的結合成員を競合検定に使
用することによって試料中のＴＧＦβ₁のレベルを測定する方法を提供する。こ
れは、結合したＴＧＦβ₁を非結合ＴＧＦβ₁から物理的に分離することを必要と
しない場合であってよい。結合時に物理的または視覚的変化が起こるよう、リポ
ーター分子を特異的結合成員と結合させることが、一つの可能性である。リポー
ター分子は直接または間接的に、検出可能な、そして好ましくは測定可能なシグ
ナルを生成することができる。リポーター分子の結合は、直接的または間接的、
共有結合的、例えばペプチド結合を介して、または非共有結合的であってよい。
ペプチド結合を介する結合は、抗体およびリポーター分子をコードしている遺伝
子融合の組換え発現の結果であるかもしれない。

【０１０２】 本発明はさらに、例えばバイオセンサー系において本発明に係る特異的結合成
員を使用することにより、ＴＧＦβ₁のレベルを直接測定することを提供する。

【０１０３】 結合を決定する様式は本発明の特徴ではなく、当業者は好みおよび一般知識に
従って適当な様式を選択することができる。

【０１０４】 さらに本発明は、ＴＧＦβ₁との結合について、いずれもＴＧＦβ₁と結合する
任意の特異的結合成員と競合し、そして、本明細書に実質上開示されているアミ
ノ酸を有するＣＤＲを含むＶドメインまたは本明細書に実質上開示されているア
ミノ酸配列を有するＶドメインを含む、特異的結合成員にまで拡大できる。結合
成員間の競合は、別の標識されていない結合成員の存在下で検出できる、１個の
結合成員に、特異的リポーター分子を結合させ、同じエピトープまたは部分重複
するエピトープに結合する特異的結合成員の同定を可能にすることにより、イン
ビトロで容易に検定することができる。競合は、例えば実施例１に記載のＴＧＦ
β₁ ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。

【０１０５】 ＴＧＦβ₁のための好ましい特異的結合成員は、ＴＧＦβ₁との結合に関して、
ＣＡＴ１９１、ＣＡＴ１９２および／またはＣＡＴ１９３と競合する。

【０１０６】 好ましい態様は、放射性レセプター検定において、ＣＳ３７の少なくとも５倍
、より好ましくは約１０倍、１５倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍または
１５０倍の力価で強力にＴＧＦβ₁を中和する（Lucas C等(1991) Meth in Enzym
ology 198、303-16）。力価とは、同等の分子形式、例えば一価抗体（ｓｃＦｖ
またはＦａｂ）または二価抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）としての被検抗体お
よびＣＳ３７による尺度である。

【０１０７】 或る態様において、本発明に係る特異的結合成員は、ＴＧＦβ₁の残基９２−
９８のアミノ酸配列を包含するペプチドに結合する（ＣＳ３７と同じエピトープ
）。

【０１０８】 これを試験する際には、いずれかの末端に１以上のアミノ酸が加わったこの配
列を有するペプチドを使用することができる。このようなペプチドは、明記した
配列で「本質上構成されている」と言うことができる。本発明に係る特異的結合
成員は、ＴＧＦβ₁に関するそれらの結合が、与えられた配列を有するまたはそ
れを含むペプチドによって阻害されるような成員であり得る。これを試験する際
には、配列プラス１以上のアミノ酸を有するペプチドを使用することができる。

【０１０９】 特異的ペプチドに結合する特異的結合成員は、例えば該ペプチドを用いて調べ
ることにより、ファージディスプレーライブラリーから単離することができる。

【０１１０】 さらに本発明は、本発明に係る特異的結合成員をコードしている単離された核
酸を提供する。核酸とはＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。好ましい態様において
本発明は、前記定義のような、本発明に係るＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメ
インをコードしている核酸を提供する。

【０１１１】 本発明はまた、上記のポリヌクレオチドを少なくとも１個含む、プラスミド、
ベクター、転写もしくは発現カセットの形態の組み立て物を提供する。

【０１１２】 本発明はさらに、１以上の上記組み立て物を含む組換え宿主細胞を提供する。
任意のＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメインまたはそれ自身提供される特異的結合
成員をコードしている核酸は、本発明の一つの態様を形成し、それをコードして
いる核酸からの発現を含む、コードされた生成物の産生方法もまた本発明の一つ
の態様を形成する。発現は、当該核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培
養することにより、簡便に達成できる。発現による産生の後、ＶＨもしくはＶＬ
ドメイン、または特異的結合成員を単離し、そして／または任意の適当な技術を
用いて精製し、その後適宜使用することができる。

【０１１３】 本発明に係る、特異的結合成員、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、およびコ
ード化核酸分子およびベクターは、例えばそれらの天然環境から、実質上純粋ま
たは相同な形態で、または、核酸の場合には、必要な機能を持つポリペプチドを
コードしている配列以外の核酸または遺伝子起源を持たずに、または実質上持た
ずに、単離されそして／または精製されて提供されることがある。本発明に係る
核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、全体がもしくは部分的に合成であっても
よい。本明細書に開示するヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤ
ＮＡ分子を包含し、そして文脈が別途必要としない限り、ＴがＵに置き換えられ
たその特定配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

【０１１４】 様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のため
の系がよく知られている。好適な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母および
バキュロウイルス系を包含する。異種ポリペプチドの発現のために当分野で取得
可能な哺乳動物細胞系統は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、幼体
ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞およびその他多数を包含する。一般
的な好ましい細菌宿主はE.coliである。

【０１１５】 E.coliのような原核細胞での抗体および抗体フラグメントの発現は、当分野で
充分に確立されている。総説として、例えばPluckthun、「A. Bio/Technology」
9:545-551(1991)を参照されたい。培養中の真核細胞での発現もまた、特異的結
合成員の産生のための選択枝として当業者が利用できる。最近の総説として、例
えば、Reff,M.E. (1993)「Curr.Opinion Biotech.」4:573-576；Trill J.J.等 (
1995)「Curr.Opinion Biotech」6:553-560を参照されたい。

【０１１６】 プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー
配列、マーカー遺伝子およびその他の配列を適宜包含する、適当な調節配列を含
む、適切なベクターを選択し、または組み立てることができる。ベクターは、適
宜、プラスミド、ウイルス性、例えば「ファージ」またはファージミドとするこ
とができる。さらなる詳細については、例えば「Molecular Cloning: a Laborat
ory Manual」第２版、Sambrook等、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
sを参照されたい。例えば核酸組み立て物の調製、突然変異誘発、配列決定、細
胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびに蛋白の分析において、核酸を操
作するための、既知の多くの技術およびプロトコルが、「Short Protocols in M
olecular Biology」、第２版、Ausubel等編、John Wiley & Sons、1992に詳細に
記載されている。Sambrook等およびAusubel等の記述は引用により本明細書の一
部とする。

【０１１７】 したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に開示する核酸を含む宿主細
胞を提供する。さらに別の態様は、かかる核酸を宿主細胞中に導入することを含
む方法を提供する。この導入は、任意の利用可能な技術を用いることができる。
真核細胞のためには、好適な技術は、燐酸カルシウムトランスフェクション、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム仲介トランスフェクション、およ
び、レトロウイルスまたはその他のウイルス、例えばワクシニア、または昆虫細
胞のためにはバキュロウイルスを使用する、トランスダクションを包含し得る。
細菌細胞のためには、好適な技術は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔および
バクテリオファージを用いるトランスフェクションを包含し得る。

【０１１８】 この導入の後、例えば宿主細胞を当該遺伝子の発現のための条件下で培養する
ことにより、核酸からの発現を惹起または許容する。

【０１１９】 或る態様において、本発明に係る核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）
中に組み込まれる。組み込みは、標準技術に従い、組換えを促進する配列をゲノ
ムに含ませることによって進めることができる。

【０１２０】 本発明はまた、上記のような特異的結合成員またはポリペプチドを発現させる
ため、上記の組み立て物を発現系に使用することを含む方法を提供する。

【０１２１】 以下の実施例は本発明の側面および態様を例示するものである。

【０１２２】 実施例１ ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）およびＪＴ１８２の同定 実施例２ 抗体ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）およびＳＬ１５Ｓ Ｉ
ｇＧ４（ＣＡＴ−１９３）を発現する細胞系統の組み立て 実施例３ ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ
４（ＣＡＴ−１９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９３）の中和特
性の評価 実施例４ 活性および潜在性ＴＧＦβ₁への、抗体ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（Ｃ
ＡＴ−１９１）およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）の結合 実施例５ 抗体ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＣＳ３７ ｓｃＦｖのエピトープマ
ッピング 実施例１ ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）およびＪＴ１８２の同定 本発明者等は、ＷＯ９７／１３８４４号に開示されたＣＳ３７抗体のドメイン
に関連するが、予期し得ないほど良好な性質を有する、抗体ＣＤＲならびにＶＨ
およびＶＬドメインを同定した。

【０１２３】 ＣＳ３７ ＶＨ（３１Ｇ９）ドメイン配列およびこれをコードしている核酸を
、それぞれ配列番号２および配列番号１に示す。

【０１２４】 本発明に係るＳＬ１５（KYLIEとしても知られる）ＶＨドメイン配列およびこ
れをコードしている核酸を、それぞれ配列番号４および配列番号３に示す。

【０１２５】 それぞれのＶＨ ＣＤＲ３配列を第１表に、そしてＶＨおよびＶＬドメインの
ためのＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含む第２表に示す。

【０１２６】 ＣＳ３７（３１Ｇ９）およびＳＬ１５（Kylie）ＶＨドメインの比較は、フレ
ームワーク残基中、残基１（グルタミンＣＳ３７がグルタミン酸ＳＬ１５に）、
６（グルタミンＣＳ３７がグルタミン酸ＳＬ１５に）および４４（グリシンＣＳ
３７がグルタミン酸ＳＬ１５に）に三つのさらなる相違を示す。

【０１２７】 ＳＬ１５ ＶＨドメインは異なるＶＬドメインと対合することができ、このよ
うな二つのＳＬ１５変異体が同定された。ＳＬ１５Ａとして知られる一方はＣＳ
３７ ＶＬを含む。ＳＬ１５Ｓとして知られる他方は、ＳＬ１５Ａ（ＣＳ３７）
でアラニンである残基２５がＳＬ１５Ｓでセリンであることを除けばＣＳ３７Ｖ
Ｌに対応するＶＬを含んでいる。

【０１２８】 ＳＬ１５Ａ ＶＬ（ＣＳ３７）ドメイン配列およびこれをコードしている核酸
を、配列番号６および配列番号５にそれぞれ示す。

【０１２９】 ＳＬ１５Ｓ ＶＬドメイン配列およびこれをコードしている核酸を、配列番号
８および配列番号７にそれぞれ示す。

【０１３０】 ＪＴ１８２ ＶＨドメイン配列およびこれをコードしている核酸を、配列番号
１０および配列番号９にそれぞれ示す。

【０１３１】 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ、ＣＳ３７ ｓｃＦｖおよび関連抗体ＪＴ１８２を、ファ
ージ上清として、ＴＧＦβ₁に結合する能力についてＥＬＩＳＡ検定でスクリー
ニングした。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル；Falcon）は非被覆、または組換
えＴＧＦβ₁（０.２μg/mL）で被覆した。抗原で被覆したプレートに特異的に結
合するファージを羊抗ｆｄ抗血清（Pharmacia）、引き続きアルカリホスファタ
ーゼコンジュゲート化抗羊（Sigma）および燐酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ
）基質（Sigma）を用いて検出した。

【０１３２】 続いてｓｃＦｖフラグメントを、実施例３に記載のプロトコル（下記参照）を
用いて、Ａ５４９細胞に対する¹²⁵Ｉ−ＴＧＦβ₁の結合を中和する能力について
放射性レセプター結合検定（ＲＲＡ）で試験した。このＲＲＡについては、個々
のクローンを可溶性ｓｃＦｖとして発現させ、その後固定化金属親和クロマトグ
ラフィー（ＩＭＡＣ）によってペリプラズム調製物から精製し、次いでSuperdex
75カラム（Pharmacia）上でのゲル濾過ＦＰＬＣによりモノマーｓｃＦｖの分画
を実施した。

【０１３３】 ＳＬ１５ ｓｃＦｖ（ＳＬ１５ ＶＨ／ＳＬ１５ ＶＬ）は、ＲＲＡにおいて最
も高い中和力価を持ち、それはＣＳ３７より少なくとも１００倍良好なＩＣ₅₀で
ある１００pMであった。ＴＧＦβ₁イソ型に対するＳＬ１５ ｓｃＦｖの完全特異
性がＴＦ１検定で確認されたが、ＴＧＦβ₂またはＴＧＦβ₃との相互作用は全く
検出されなかった。

【０１３４】 ｓｃＦｖ抗体ＳＬ１５Ｓ（ＳＬ１５ ＶＨ／ＳＬ１５ ＶＬ；ＣＡＴ−１９１(K
ylie ｓｃＦｖとしても知られる)）およびＳＬ１５Ａ（ＳＬ１５ ＶＨ／ＣＳ３
７ＶＬ）が全抗体に変換された。

【０１３５】 実施例２ 抗体ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（Ｃ
ＡＴ−１９３）を発現する細胞系統の組み立て ヒトＩｇＧ４,κ抗体を発現する細胞系統の組み立てのため、ＳＬ１５ ｓｃＦ
ｖ重鎖および軽鎖可変ドメインを、ヒトＩｇＧ４およびヒトκ定常ドメインをそ
れぞれ含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。二つの型ＳＬ１５Ａ
ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９３）を
調製した。この抗体はKylie ＩｇＧとも称する。

【０１３６】 重鎖発現ベクター ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ ＤＮＡ由来のＶＨをオリゴヌクレオチドＰ８０（配列番
号２５）およびＰ６４（配列番号２２）でＰＣＲ増幅し、オリゴヌクレオチドＰ
１０（配列番号２０）およびＰ６４（配列番号２２）を使用して、ＰＣＲを部分
重複させることにより、シグナル配列、スプライス部位およびＭ１３ＶＨＰＣＲ
１由来のイントロンを含む１５９bp ＤＮＡフラグメント（Orlandi等、1989、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 86、3833-3837）に結合させた。この５５８bp ＰＣＲ生
成物をＨｉｎｄIIIおよびＡｐａＩで切断し、ＨｉｎｄIII−ＡｐａＩ切断ｐＧａ
ｍｍａ４（Lonza Biologicsより入手）にクローニングした。ライゲーションし
たＤＮＡをE.coli TG1中に導入し、アンピシリン耐性コロニーをスクリーニング
した。正しい挿入物を有するプラスミドを同定し、pKylieＶＨγ４と命名した。

【０１３７】 軽鎖発現ベクター ＣＳ３７ ｓｃＦｖ ＤＮＡまたはＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ由来のＶκをオリゴヌ
クレオチドＰ６５（配列番号２３）およびＰ６６（配列番号２４）でＰＣＲ増幅
し、オリゴヌクレオチドＰ１１（配列番号２１）およびＰ６６（配列番号２４）
を使用して、ＰＣＲを部分重複させることにより、シグナル配列、スプライス部
位およびＭ１３ＶＫＰＣＲ１由来のイントロンを含む１６８bp ＤＮＡフラグメ
ント（Orlandi等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86、3833-3837）に結合させ
た。この５１０bp ＰＣＲ生成物をＢｓｔＢＩおよびＢｓｉＷＩで切断し、Ｂｓ
ｔＢＩ−ＢｓｉＷＩ切断ｐＭＲ１５.１にクローニングした。ライゲーションし
たＤＮＡをE.coli TG1中に導入し、アンピシリン耐性コロニーをスクリーニング
した。正しい挿入物を有するプラスミドを同定し、ｐＣＳ３７κまたはpKylieκ
と命名した。

【０１３８】 縦列発現ベクター 重鎖および軽鎖両方のＤＮＡおよびｇｓ選択マーカーを含む単一のプラスミド
を、Kylie変異体の各々について組み立てた。重鎖ベクターpKylieＶＨγ４をBａ
ｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｈ鎖ＤＮＡを含む４４９７ｂｐフラグメントを
精製した。軽鎖ベクターｐＣＳ３７ＶκまたはpKylieκはＢａｍＨＩおよびＮｏ
ｔＩで同様に消化し、Ｌ鎖ＤＮＡを含む９６１１ｂｐフラグメントを単離した。
二つの精製されたフラグメントをライゲーションし、E.coli TG1細胞中に導入し
、アンピシリン耐性コロニーをスクリーニングした。正しい挿入物を有するプラ
スミドを同定し、Ｖ領域を配列決定により確認した。この最後の発現ベクターは
pKylieg4γsと命名した。二つの型はＳＬ１５Ｓ ＶＬまたはＣＳ３７ ＶＬを含
むよう調製した。

【０１３９】 ＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４の発現 ＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４をマウス骨髄腫細胞系統ＮＳ
０（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）で発現させた。５０μgのpKylie4γsを、Ｐ
ｖｕＩで消化することにより線状化し、エタノール沈殿し、１００μLの水に溶
解した。１０⁷のＮＳ０細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ ０.９mLに再懸濁し、ベ
クターＤＮＡと混合し、氷中に５分間保持した。次いでこの細胞を、９６０μFd
、２５０Vの単一パルスで電気穿孔し、氷中で１０分間インキュベートした。次
に、トランスフェクトさせた細胞を、Bebbington等(1992)「Bio/Technology」10
169-175に記載のように２mMグルタミンおよび１０％透析牛胎児血清（ＦＣＳ）
を含有するダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）３０mLに添加し、５０μ
Lアリコートを６ｘ９６ウェルプレートに分配した。２４時間後、無グルタミン
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（Bebbington等、1992）を各ウェルに加えた。

【０１４０】 トランスフェクションの３〜６週間後、コロニーを、ヒトＩｇＧを分泌する能
力についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートのウェル
（Immulon 4、Dynatech）を、ウェル当たり１００ngのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（H
arlan）を含む５０mM重炭酸／炭酸ナトリウム（pH９.６）で被覆した。トランス
フェクトされたコロニーを含むウェル由来の上清を、０.０５％（ｖ／ｖ）Tween
20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）の入ったウェルに１時間添加した。プレート
をＰＢＳＴで３回洗浄し、捕捉されたヒトＩｇＧを、ＰＢＳＴ中の１：２０００
希釈西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたヤギ抗ヒト
κ抗体１００μL（Harlan）で検出した。室温で３０分後、プレートをＰＢＳＴ
で３回洗浄し、ＯＰＤ基質１００μＬを加えた。５〜１０分後、１２.５％（ｖ
／ｖ）硫酸５０μLの添加により反応を停止させ、Ａ４９０nmを測定した。

【０１４１】 最も大量のＩｇＧを分泌するトランスフェクト体を、還元ＦＣＳ、無ガンマグ
ロブリンＦＣＳ中、またはＦＣＳ無しの無グルタミン培地で増殖拡大させた。細
胞系統をその後限界希釈によってクローニングした。

【０１４２】 ＩｇＧの精製 プロテインＡ親和クロマトグラフィーおよびこれに続くサイズ排除クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）により、ヒトＩｇＧ抗体を精製した。ＩｇＧを分泌するトラ
ンスフェクトされたＮＳ０細胞の成長由来の上清を、遠心分離および０.２２μm
膜による濾過によって精製した。プロテインＡセファロースFast Flowマトリッ
クス（Pharmacia）のカラムを０.３Ｍ ＮａＣｌ、５０mM燐酸ナトリウム（ｐＨ
８.０）で平衡化し、上清を適用した。次いでこのカラムを５０mM燐酸ナトリウ
ム（pH８.０）でよく洗浄した。ヒトＩｇＧを０.１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３
.０）で溶出した。溶出した画分を１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９.０）で中和し、蛋
白含有画分を、２８０nmの吸光度を測定することにより同定した。ＳＥＣによる
精製はSuperdex 200カラム上、ＰＢＳ中で実施した。最後にこのＩｇＧを、ＹＭ
３０ ＭＷＣＯフィルター（Amicon）を使用し発熱性物質を含まないＰＢＳに対
してダイアフィルトレーションすることにより、濃縮した。

【０１４３】 実施例３ ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ
−１９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９３）の中和特性の評価 ＴＧＦβ₁の中和力価を、放射性レセプター検定および細胞増殖検定（ＴＦ１
）を用いて、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（Kylie ｓｃＦｖ）およびその誘導体につい
て測定した。

【０１４４】 材料 ［¹²⁵Ｉ］ＴＧＦβ₁はAmershamにより供給された（比活性範囲８００〜２２０
０Ci/mmol）。組換えヒトＴＧＦβ₁、β₂、β₃、潜在性ＴＧＦβ₁、ＧＭ−ＣＳ
ＦおよびＩＬ−５はR&D Systems（ミネアポリス、米国）から取得した。ＴＧＦ
β₁、β₂およびβ₃に対するGenzymeマウスｍＡｂはGenzyme（ケンブリッジ、Ｍ
Ａ、米国）から取得した。ＴＦ１細胞系統はRobin Thorpe（NIBSC、英国）によ
り供給され、下に詳述するように培養した。Ａ５４９ヒト肺上皮癌セルラインは
ＡＴＣＣから取得し、１０％ＦＣＳおよび２mMグルタミンを含有するＤＭＥＭ中
で増殖させた。他の試薬は全てSigmaにより供給された。

【０１４５】 方法 放射性レセプター検定 Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに、ウェル当たり２ｘ１０⁵細胞で＞９０
％密集を達成するため２４時間接種した。検定の直前に単層を緩衝液（１：１の
ＤＭＥＭ：Ｈａｍｓ−Ｆ１２）で２回洗浄し、検定緩衝液（１：１のＤＭＥＭ：
Ｈａｍｓ Ｆ１２＋０.１％ＢＳＡ）０.５mLを加えた。検定緩衝液で抗体の２ま
たは３倍連続希釈液を調製し、検定緩衝液に入れた等容量の４０pM［¹²⁵Ｉ］Ｔ
ＧＦβ₁に加えた。

【０１４６】 室温で１時間後、この抗体／［¹²⁵Ｉ］ＴＧＦβ₁混合物０.５mLを細胞（既に
検定緩衝液０.５mLに入れてある）にｎ＝２で加え、３７℃で１時間インキュベ
ートした。［¹²⁵Ｉ］ＴＧＦβ₁の最終濃度は１０pMであった。最大結合（細胞に
対して、抗体無し）および最小結合（ウェルを緩衝液でインキュベートするが細
胞は無し）としての対照を少なくともｎ＝３で含んでいた。

【０１４７】 最後にプレートを氷冷ＰＢＳで４回洗浄し、その後可溶化緩衝液（２５mM Tri
s pH７.５、１０％グリセロール、１％Triton x100）０.８mLを加えた。プレー
トを振盪プラットフォーム上で少なくとも２０分間放置し、その後各ウェルの内
容物をガンマカウンターを用いて計数した。

【０１４８】 データは最小結合を差し引いた後、最大結合の％として表した。

【０１４９】 潜在性ＴＧＦβ₁を用いた研究では、各条件の組について％最大値を算出した
（例えば、潜在性ＴＧＦβ₁、酸活性化した潜在性ＴＧＦβ₂または活性ＴＧＦβ ₁ の存在下）。

【０１５０】 （Lucas C等 (1991) Meth in Enzymology 198、303-16） ＴＦ１検定 ＴＦ１細胞は、２ng/mL ＧＭ−ＣＳＦを有する５％ＦＣＳおよび２mMグルタミ
ン（成長培地）を含有するＲＰＭＩ１６４０で常套的に増殖させた。実験の直前
に、細胞を２回洗浄し、ＴＧＦβ₁、β₂、またはβ₃（各々５０pM）を含むまた
は含まない、４ng/mL IL-5を添加した新鮮な培地に４ｘ１０⁵細胞／mLで再懸濁
し、１００μLアリコートを９６ウェルプレートに移した。この検定に使用した
ｓｃＦｖ調製物は、エンドトキシンを除去したＦＰＬＣ精製画分であった。

【０１５１】 成長培地中に抗体（二倍希釈系列）を調製し、１００μLをｎ＝２で細胞に加
えた。対照は、ＴＧＦβのみを加えた細胞（抗体無し、増殖の最大阻害、）およ
びＴＧＦβも抗体も加えていない細胞（最小阻害）であった。細胞は３７℃で４
８時間インキュベートした。

【０１５２】 検定の終了時にCellTiter96（Promega）を使用して細胞数を検定し、データを
中和％、即ち、 （被検値−最大阻害） 中和％ ＝ ─────────── ｘ１００ （最小阻害−最大阻害） で表した。

【０１５３】 潜在性ＴＧＦβ₁の研究においては、データは様々な試験条件の各々における
活性ＴＧＦβ₁の量としての対照の％（ＴＧＦβ₁不在下での増殖）として表した
。

【０１５４】 （Randall LA等 (1993) J.Immunol Meth 164、61-7） 抗体の産生 ＳｃＦｖ抗体およびＩｇＧ４抗体は上記のように製造および精製した。

【０１５５】 結果 バイオアッセイ（ＴＦ１検定）におけるＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９
１）およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）の力価 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）がＴＧＦβ₂またはβ₃ではなくＴＧ
Ｆβ₁を認識する能力をＴＦ１検定で調べた。

【０１５６】 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（Kylie ｓｃＦｖとしても知られる）はＴＧＦβ₁により
誘導される増殖阻害を中和したが、ＴＧＦβ₂またはＴＧＦβ₃により誘導された
増殖阻害は中和しなかった（図１）。対照として、ＴＧＦβ₁、ＴＧＦβ₂および
ＴＧＦβ₃を中和するモノクローナル抗体Genzyme Ｍａｂ １.Ｄ.１１.１６を使
用した（Genzyme、Dasch,J.R.等、J.Immunol.、142、1536-1541、1989）。Ｍａ
ｂ １.Ｄ.１１.１６は、肺線維症、照射により誘発される線維症（Barcellos-Ho
ff、米国特許５６１６５６１、1997）および慢性関節リウマチ（Wahl等、J.Exp.
Medicine、177、225-230、1993）のモデルにおいて有効であることが示されてい
る。ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖはＴＧＦβ₁に対してGenzyme Ｍａｂ １.Ｄ.１１.１６
対照に匹敵する力価を示す。

【０１５７】 潜在性ＴＧＦβ₁を使用する研究において、ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１
９２；Kylie ＩｇＧ４とも呼ばれる）の活性もまたＴＦ１検定で示された（図５
ｂ）。

【０１５８】 放射性レセプター検定における、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）、
ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（ＣＡＴ− １９３）の力価 ＴＧＦβ₁を認識し、Ａ５４９細胞に対するＴＧＦβ₁の結合を中和するＳＬ１
５Ｓ ｓｃＦｖの能力を、放射性レセプター検定で測定した。

【０１５９】 ｓｃＦｖのｈｉｓ−ｐｒｅｐｓの比較においては、ＳＬ１５Ｓ（Kylie）を親
抗体ＣＳ３７およびＪＴ１８２と比較し（図２）、１００〜１５０倍および１０
倍活性であることが判明した。ＳＬ１５は、ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１
９２）およびＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９３）という二つの型でＩｇＧ
として再配列させた。ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ、ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４、ＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４およびＭａｂ １Ｄ.１１.１６（Genzyme ｍＡｂ）の精製品もまた分析
した（図３）。

【０１６０】 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖはGenzyme Ｍａｂ １.Ｄ.１１.１６に匹敵する力価を持
ち、これは動物モデルにおいて有効である。要約すると、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ
は、０.０３〜０.１nMの範囲のＩＣ₅₀値を有する、ＴＧＦβ₁のための高力価の
中和抗体である。

【０１６１】 実施例４ 活性および潜在性ＴＧＦβ₁への、抗体ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９
１）およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）の結合 本実施例に記載の実験は、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４
が、活性ＴＧＦβ₁には結合しこれを中和するが、潜在性ＴＧＦβ₁には結合およ
び中和を行わないことを証明した。

【０１６２】 潜在性ＴＧＦβ₁は、ＴＧＦβ₁が細胞から分泌される際の生物学的に不活性な
型であって、潜在性会合ペプチド二量体（２個の２４９アミノ酸単量体より成る
）および成熟ＴＧＦβ₁二量体（２個の１１２アミノ酸単量体より成る）で構成
されている。潜在性ＴＧＦβ₁は細胞表面のＴＧＦβレセプターにより認識され
ない。

【０１６３】 活性ＴＧＦβ₁は、インビボではプロテアーゼの作用によって放出されると考
えられており、これはインビトロにおける酸性化になぞらえることができる。

【０１６４】 潜在性ＴＧＦβ₁は、増殖検定での検定によると、酸性化の前後でそれぞれ０.
４３nMおよび２pMのＥＤ５０を有すると報告されている。活性ＴＧＦβ₁は増殖
検定においておよそ２pMのＥＤ５０を有すると報告されている。おそらく、酸性
化前の潜在性ＴＧＦβ₁の効果は若干の活性ＴＧＦβ₁の存在によるものであろう
。この残留活性は、結果の解釈の際に考慮されねばならない。

【０１６５】 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４の力価を、様々な量の潜在性
ＴＧＦβ₁、酸活性化されたＴＧＦβ₁および活性ＴＧＦβ₁の存在下で、放射性
レセプター検定およびＴＦ１増殖検定を用いて試験した。当該抗体が潜在性ＴＧ
Ｆβ₁を認識するならば、それらの力価は減じられねばならない。両検定の解釈
は、潜在性調製物中に存在するかもしれない活性ＴＧＦβ₁が結合に関して［¹²⁵ Ｉ］ＴＧＦβ₁と競合し、細胞への生物活性を有するという事実によって複雑と
なる。

【０１６６】 潜在性ＴＧＦβ₁を、潜在性ＴＧＦβ₁ １mLに０.５Ｍ ＨＣｌ２μLを添加する
ことによって室温で１５分間酸活性化し、次いで０.０５Ｍ ＮａＯＨ／０.０１
Ｍ Hepes ４３μLで中和した。

【０１６７】 結果は、放射性レセプター検定において、潜在性ＴＧＦβ₁（０.１nM）にはＳ
Ｌ１５Ｓ ｓｃＦｖ（Kylie ｓｃＦｖ）またはＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（Kylie Ｉｇ
Ｇ）の力価に及ぼす有意な効果はなく、一方、潜在性ＴＧＦβ₁の酸活性化、ま
たは同等濃度の活性ＴＧＦβ₁は、該抗体が［¹²⁵Ｉ］ＴＧＦβ₁結合を中和する
能力を低下させることを示している（図４）。

【０１６８】 ＴＦ１増殖検定は、潜在性ＴＧＦβ₁調製物中の活性ＴＧＦβ₁の活性に対して
極めて鋭敏である。にもかかわらず、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖまたはＳＬ１５Ａ Ｉ
ｇＧ４は、潜在性調製物の中の小部分の活性ＴＧＦβ₁を中和することができ、
且つこの潜在性ＴＧＦβ₁が酸活性化されている場合、これを効率的に中和でき
ることが判明した（図５）。

【０１６９】 故に、ｓｃＦｖまたはＩｇＧ形態のＳＬ１５は、放射性レセプター検定および
ＴＦ１中和検定の両方で測定したところによると、活性ＴＧＦβ₁のみを結合お
よび中和し潜在性ＴＧＦβ₁を結合および中和しない。

【０１７０】 実施例５ 抗体ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＣＳ３７ ｓｃＦｖのエピトープマッピング この実施例では、抗体ＣＳ３７およびＳＬ１５Ｓが結合するＴＧＦβ₁上のエ
ピトープを決定した。

【０１７１】 ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₂は類似構造を有するが、ＴＧＦβII型レセプターに
対する結合親和性および幾つかの生物検定における力価が相違する（O.G.Ottman
nおよびL.M.Pelus J.Immunol. 140 2661-2665、1988；J.R.Merwin等、Am.J.Path
ol. 138 37-51、1991；K.C.Flanders等、Development 113 183-191、1991；L.Su
ardet等、Cancer Res. 52 3705-3712、1992）。Qian等（J.Biol.Chem. 271 3065
6-30662、1996）は、親和性の相違を利用して、II型レセプターに対するＴＧＦ
β₁の高親和性結合に関与している重要残基を同定した。これは、ＴＧＦβ₁およ
びＴＧＦβ₂の間の、一連のキメラ分子を作製し、インビトロ（Qian等、上記）
およびインビボ（J.K.Burmester等 Growth Factors 15 231-242、1998）で高親
和性レセプター結合を保持しているものを同定することによってなされた。この
ようにして、ＴＧＦβ₁の残基８３−１１２により包含されるＣ末端領域が、有
効なレセプター結合を保持するのに充分であるとして同定された。

【０１７２】 ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₂の配列の比較は、残基９２−９８より成るループを
包含する幾つかの相違を同定したが、このループには、ＴＧＦβ₁およびＴＧＦ
β₂の間に４個のアミノ酸の相違を含んでいる。ＴＧＦβ₂由来のこれらの残基を
ＴＧＦβ₁主鎖に導入するとレセプター結合は甚だしく低下し、この事により、
これらがＴＧＦβ₁とII型レセプターとの相互作用における重要残基であること
が確認された。

【０１７３】 キメラ分子を同様な方法で使用して、ＴＧＦβ₁上のＣＳ３７およびＳＬ１５
Ｓ ｓｃＦｖ（ＣＡＴ−１９１）の結合部位をマッピングした。ＴＧＦβ₁／β₂
（８３−１１２）は、ＴＧＦβ₂の残基８３−１１２のＣ末端領域に融合した、
ＴＧＦβ₁の残基１−８２のＮ末端および中央領域に相当する。ＴＧＦβ₂／β₁
８３−１１２は、ＴＧＦβ₁の残基８３−１１２のＣ末端領域に融合した、ＴＧ
Ｆβ₂の残基１−８２のＮ末端および中央領域に相当する。最後にＴＧＦβ₁−β ₂ （４０−１１２）は、ＴＧＦβ₁の残基１−３９のＮ末端領域、およびＴＧＦβ ₂ の残基４０−１１２の中央およびＣ末端領域に相当する。以後、これらはそれ
ぞれイソ型の相対的組成を反映させて、１−１−２、２−２−１および１−２−
２と称する。

【０１７４】 これら３つの分子はＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₂と共に、固定化ＴＧＦβ₁に対
するＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＣＳ３７ ｓｃＦｖの結合阻害について以下のご
とく解析した。

【０１７５】 ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖまたはＣＳ３７ ｓｃＦｖをディスプレーしているファー
ジを、ｐＣＡＮＴＡＢ６においてＭ１３Ｋ０７重感染によりクローンから調製し
た。ファージをＰＥＧ沈殿させ、２％Marvelを含有するＰＢＳに再懸濁した。０
.５μg/mLのＴＧＦβ₁で被覆した、プレブロックしたＥＬＩＳＡプレートに、フ
ァージ（５０μL中２.５〜５ｘ１０¹⁰）を３０分間添加した。

【０１７６】 阻害の分析のため、同濃度のファージを使用して、ＴＧＦβ濃度の希釈系列を
、上記のＴＧＦβキメラ分子（J.Burmester、National Institutes of Healthか
らの寄贈）およびＴＧＦβ₁および２つのイソ型の各々について準備した。

【０１７７】 これらを４℃で一夜インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。
抗原で被覆したプレートに特異結合したファージを、羊抗ｆｄ抗血清（Pharmaci
a）、その後アルカリホスファターゼコンジュゲート化抗羊免疫グロブリン（Sig
ma）および燐酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）基質（Sigma）を用いて検出し
た。

【０１７８】 Kylieについての非阻害値（即ち０nM）は１.６７（３個の読み取りの平均）で
あり、ＣＳ３７については１.２１６（７個の読み取りの平均）であった。図６
および７に示す結果は、ＣＳ３７ ｓｃＦｖおよびＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖの両者に
より認識されるエピトープは、ＴＧＦβ₁の残基８３−１１２の間に存在すると
いうことを示している。さらに、ＴＧＦβ₂配列の残基９２−９８と共にＴＧＦ
β₁を含む突然変異体分子ＴＧＦβ₁−β₂（９２−９８）もまた、ＴＧＦβ₁に対
するＣＳ３７およびＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖの結合を阻害するが、これは効果が低
く、特にＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖについては低いものである。この事は、これらの
抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部は、９２−９８領域内部に存
在するということを証明している（これは９２、９４、９５および９８位という
４個の残基を有し、それはＴＧＦβ₁とＴＧＦβ₂の間で相違している）。

【０１７９】 実施例６ 抗ＴＧＦβ₁モノクローナル抗体ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）の存
在下での角膜上皮創傷治癒の加速 ＴＧＦβは創傷治癒（目および皮膚の両方）の調節に関わっており、角膜上皮
再形成の速度を阻害することが示されている。ここでは、角膜上皮創傷治癒の速
度に及ぼすＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−１９２）の局所適用の効果を、組織
培養モデルを用いて評価した（DM Foreman等、Exp.Eye Res. 62、555-564、1996
）。

【０１８０】 牛の角膜に穿孔器による切除創傷（直径５mm、深さ２５０μm）を創った。角
膜強膜環を、無血清の空気界面組織培養系で９６時間まで維持した。切開時に、
そしてその後１日に２回、（ｉ）１０ng/mL ＴＧＦβ₁；（ii）１００μg/mL 抗
ＴＧＦβ₁ ｍＡｂ；（iii）（ｉ）および（ii）の組み合わせ；（iv）１００μg
/mL ヌル抗体（２Ｇ６ ＩｇＧ４）；（ｖ）１００μg/mL抗体希釈液；または（v
i）添加無し（各群についてｎ＝９）を含有する無血清Ｔ８培地１００μLを上皮
表面および縁に滴下した。画像分析系を用いて上皮再形成を評価し、上皮で覆わ
れた元の創傷面積のパーセントとして表した。

【０１８１】 培地のみ、ヌル抗体または抗体希釈液を投与された対照角膜は７２時間までに
完全な上皮再形成を示した。１００μg/mLの抗ＴＧＦβ₁ ｍＡｂによる処置は上
皮再形成速度を増大させ、その結果、角膜は４８時間までに完全に上皮再形成し
た（図８）。１０ng/mLのＴＧＦβ₁による角膜の処置は２４時間までに遅延した
上皮再形成を示し、この阻害効果は抗ＴＧＦβ₁ ｍＡｂにより破壊された（図９
）。言及した相違は全て有意である（ｐ＜０.０５）。２〜４８時間の間のデー
タの点について線形回帰を実施し（図８を参照されたい）、上皮再形成の速度を
決定した。ＣＡＴ１９２はこの変数において有意な増大を惹起した（第３表）。
組織学的分析は画像分析結果を支持し、且つ、抗ＴＧＦβ₁ ｍＡｂの添加は角膜
構造に有害な影響を及ぼさないことを確認した。

【０１８２】 第３表 穿孔器による切除創傷後、空気界面組織培養中の牛の単離角膜の上
皮再形成速度に及ぼすＣＡＴ１９２およびＴＧＦβ₁の効果 処置 上皮再形成の速度 ｎ （％ｈ^-1） 培地１９９（１００μL） １.５６±０.０７ ８ 媒質（１００μL） １.５７±０.０８ ８ ヌル抗体ＩｇＧ４（１０μL） １.４８±０.０９ ８ ＴＧＦβ₁（１ng） １.０１±０.０９τ ８ ＣＡＴ１９２（１０μL） ２.１１±０.０９* ８ 第３表の説明：牛角膜を、創傷後直ちに、そしてその後１２時間の間隔で、無血
清培地１９９（対照）または媒質（抗体およびＴＧＦβ₁について）、ヌルＩｇ
Ｇ４アイソトープ合致抗体、ＴＧＦβ₁もしくはＣＡＴ１９２を含有する培地の
いずれか１００μLで処置した。２〜４８時間の間のデータの点について線形回
帰を実施し（図８を参照されたい）、上皮再形成の速度を決定した。ＣＡＴ１９
２は牛角膜創傷の上皮再形成速度の著明な増大を惹起し、一方ＴＧＦβ₁はこの
変数において有意な低下を惹起した。表示の数値は平均値およびs.e.平均である
。異なる処置の効果を、Tukey試験による一元ＡＮＯＶＡを用いて比較した。*ヌ
ル抗体処置群と比較してＰ＜０.０１；τ媒質処置群と比較してＰ０.０１。

【０１８３】 これらの結果は、角膜上皮修復における内因性ＴＧＦβ₁の重要な役割を確認
するものであり、そして、抗ＴＧＦβ₁ ｍＡｂ ＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４（ＣＡＴ−
１９２）の局所投与がインビボでの創傷治癒の改善の促進に使用できるという指
摘を提供するものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＴＦ１細胞を使用する増殖検定における、ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖによ
るＴＧＦβ₁（ＴＧＦβ₂またはβ₃ではなく）の中和。ＴＦ１の増殖の、ＴＧＦ
β₁、β₂またはβ₃により誘導される阻害の、Genzyme ｍＡｂ（Ｍａｂ１Ｄ.１１
.１６−正方形）またはＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ（菱形）による中和を示す。

【図２】 図２は、抗ＴＧＦβ₁ｓｃＦｖによる、Ａ５４９細胞への[¹²⁵Ｉ]ＴＧＦβ₁の
結合の阻害。ＳＬ１５Ｓ、ＪＴ１８３およびＣＳ３７のｓｃＦｖ調製物を２倍に
滴定し、Ａ５４９細胞への[¹²⁵Ｉ]ＴＧＦβ₁の結合を阻害するそれらの能力につ
いて試験した。ＳＬ１５ＳおよびＪＴ１８２はｈｉｓ−ｐｒｅｐｓとして使用し
、ＣＳ３７はｆｐｌｃ精製した。

【図３】 図３は、抗ＴＧＦβ₁抗体による、Ａ５４９細胞への[¹²⁵Ｉ]ＴＧＦβ₁の結合
の阻害。ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖ、ＳＬ１５Ｓ ＩｇＧ４およびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ
４を、Ａ５４９細胞への[¹²⁵Ｉ]ＴＧＦβ₁の結合を阻害する能力についてGenzym
e ｍＡｂと比較した。データは、３倍希釈系列を使用する３回の実験の平均であ
る。

【図４】 図４は、潜在性ＴＧＦβ₁の存在下でのｓｃＦｖによる、Ａ５４９細胞への[^{12 5} Ｉ]ＴＧＦβ₁の結合の阻害。ＳＬ１５Ｓ ｓｃＦｖおよびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４
を、Ａ５４９細胞への[¹²⁵Ｉ]ＴＧＦβ₁の結合を阻害する能力について試験した
。ＳＬ１５Ｓが潜在性ＴＧＦβ₁を認識するかどうかを調べるため、０.１nMの潜
在性ＴＧＦβ₁、活性ＴＧＦβ₁または酸活性化した潜在性ＴＧＦβ₁の存在下で
標準実験を実施した。データは条件の各組について％最大値として表す。

【図５】 図５は、潜在性ＴＧＦβ₁の存在下での、ｓｃＦｖおよびＩｇＧによるＴＦ１
細胞増殖の、ＴＧＦβ₁により誘導される阻害の中和。潜在性ＴＧＦβ₁、活性Ｔ
ＧＦβ₁または酸活性化ＴＧＦβ₁により誘導される増殖阻害を中和する、ＳＬ１
５Ｓ ｓｃＦｖおよびＳＬ１５Ａ ＩｇＧ４の能力を、ＴＦ１検定で比較した。（
ａ）では異なる濃度のＴＧＦβ₁フォーマットを比較し、（ｂ）ではｓｃＦｖお
よびＩｇＧを２０pMのＴＧＦβ₁フォーマットに対して比較した。データは％対
照（ＴＧＦβ₁の不在下での増殖）として表した。潜在性ＴＧＦβ₁により誘導さ
れる阻害は、潜在性調製物中に存在する少量の活性ＴＧＦβ₁によるものである
。

【図６】 図６は、キメラＴＧＦβを使用する、ファージ上に展示されたＣＳ３７ ｓｃ
Ｆｖの、ＴＧＦβ₁への結合の阻害。ファージ上に展示されたＣＳ３７ ｓｃＦｖ
の、ＴＧＦβ₁への結合を、ＴＧＦβ₁イソ型（ＴＧＦβ₁）；ＴＧＦβ₂イソ型（
ＴＧＦβ₂）；ＴＧＦβ₁／β₂（８３−１１２）（１−１−２）；ＴＧＦβ₂／β ₁ ８３−１１２（２−２−１）；ＴＧＦβ₁−β₂（４０−１１２）（１−２−
２）；またはＴＧＦβ₁−β₂（９２−９８）（９２−９８）の存在下でＥＬＩＳ
Ａによって検定した。

【図７】 図７は、キメラＴＧＦβを使用する、ファージ上に展示されたＳＬ１５Ｓ（Ky
lie ｓｃＦｖ）の、ＴＧＦβ₁への結合の阻害。ファージ上に展示されたＳＬ１
５Ｓ（Kylie）ｓｃＦｖの、ＴＧＦβ₁への結合を、ＴＧＦβ₁イソ型（ＴＧＦβ₁ ）；ＴＧＦβ₂イソ型（ＴＧＦβ₂）；ＴＧＦβ₁／β₂（８３−１１２）（１−１
−２）；ＴＧＦβ₂／β₁ ８３−１１２（２−２−１）；ＴＧＦβ₁−β₂（４０
−１１２）（１−２−２）；またはＴＧＦβ₁−β₂（９２−９８）（９２−９８
）の存在下でＥＬＩＳＡによって検定した。

【図８】 図８は、角膜上皮再形成に及ぼすＣＡＴ１９２の効果を、空気界面組織培養モ
デルにおいて、ウシ単離角膜より切除した穿孔創傷に従って研究した。ウシ角膜
は、１００μLの無血清培地１９９（対照）または媒質を含有する培地（抗体お
よびＴＧＦβ₁のため）のいずれかで処理した。ヌルアイソタイプ合致抗体（１
０μg）、ＴＧＦβ₁（１ng）またはＣＡＴ１９２（１０μｇ）を、創傷後直ちに
、そしてその後１２時間の間隔で投与した。ＣＡＴ１９２は、傷つけたウシ角膜
の上皮再形成速度の著しい増大を惹起し、一方ＴＧＦβ₁は、この変数の著しい
低下を惹起した。データは角膜創傷の上皮再形成のパーセントとして表す。各々
の点は平均値を表し、垂直線は各点につき８個の角膜のs.e.平均を示す。異なる
処置の効果を、Bonferroni試験を用いる反復測定ＡＮＯＶＡを用いて各時点で比
較した。*Ｐ＜０.０１（ヌル抗体処置群との比較）；ｔＰ＜０.０１（媒質処置
群との比較）。

【図９】 図９は、角膜上皮再形成に及ぼすＣＡＴ１９２の効果を、空気界面組織培養モ
デルにおいて、ウシ単離角膜より切除した穿孔創傷に従って研究した。ＣＡＴ１
９２（０.００１−１０μｇ）を、創傷後直ちに、そしてその後１２時間の間隔
で投与した。ＣＡＴ１９２は、傷つけたウシ角膜の上皮再形成において、用量に
相関する有意な増加を惹起した。ＣＡＴ１９２のＥＣ５０は０.０１および０.１
μｇの間であった。データは、媒質で処置した対照群の上皮再形成における変化
パーセントとして表現する。点線は媒質対照群のs.e.平均値を示す。各々の点は
平均値を表し、垂直線は各点につき６個の角膜のs.e.平均を示す。異なる用量の
ＣＡＴ１９２の効果を一元ＡＮＯＶＡおよびDunnett試験を用いて対照処置と比
較した。*Ｐ＜０.０１。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月６日（２００１．３．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 27/06 27/06 27/12 27/12 29/00 29/00 35/00 35/00 35/02 35/02 35/04 35/04 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レナード，サイモン ニコラス イギリス国，サフォーク シービー９ ７ エイチエヌ，ヘイバーヒル，ハンチェット ビレッジ，ホレシャム クロース 58 (72)発明者 ウィルトン，アリソン ジェーン イギリス国，ケンブリッジ シービー３ ０エイチエヌ，ハンティンドン ロード 46，フィッツウィリアム コテイジ (72)発明者 ブラッドドック，ペタ サリー ヘレナ イギリス国，ケンブリッジシャー ピーイ ー19 １ユーイー，ハンティンドン，セン ト ネオツ，ウッドランヅ ６ (72)発明者 ドゥ フゥ，サラー レイラ イギリス国，ハートフォードシャー エス ジー５ １ティーエル，ヒッチン，アイク ルフォード ロード 76 (72)発明者 マクカファーティ，ジョン ジェラルド イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー２ ４エーピー，ブラブラハム，ソース トン ロード，チャーチ ファーム コテ ージ (72)発明者 コンロイ，ルイーズ アン イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー１ ３エイチエル，ケンブリッジ，ブラ ムプトン ロード 35 (72)発明者 テンペスト，フィリップ ロナルド イギリス国，ケンブリッジシャー シービ ー１ ５エルユー，ウエスト ウラッティ ング，ハイ ストリート 43 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA55 CA04 DA02 EA04 GA14 HA15 4B064 AG26 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4C085 AA14 BB36 CC23 EE05 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 EA22 EA28 EA50 EA51 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特異的結合成員が、ＳＬ１５のＶＨ ＣＤＲ３（配列番号１
   ３）またはＪＴ１８２のＶＨ ＣＤＲ３（配列番号１５）として実質上開示され
   るアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを含む、ＴＧＦ
   β₁に結合することのできる単離された前記特異的結合成員。
2. 【請求項２】 ＣＳ３７ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１１）およびＣＳ３７
   ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１２）の一方または両方として実質上開示されるアミ
   ノ酸配列を有する、ＶＨ ＣＤＲ１またはＶＨ ＣＤＲ２をさらに含む、請求項１
   に記載の特異的結合成員。
3. 【請求項３】 ＣＳ３７ ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号１１）およびＣＳ３７
   ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号１２）として実質上開示されるＣＤＲ１配列を含む、
   請求項１または２に記載の特異的結合成員。
4. 【請求項４】 当該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がヒト抗体フレ
   ームワークに存在する、請求項３に記載の特異的結合成員。
5. 【請求項５】 特異的結合成員が配列番号４に実質上開示されるＳＬ１５
   ＶＨドメインを含む、ＴＧＦβ₁に結合することのできる単離された前記特異的
   結合成員。
6. 【請求項６】 特異的結合成員が配列番号１０に実質上開示されるＪＴ１８
   ２ ＶＨドメインを含む、ＴＧＦβ₁に結合することのできる単離された前記特異
   的結合成員。
7. 【請求項７】 特異的結合成員が配列番号８に実質上開示されるＳＬ１５Ｓ ＶＬドメインを含む、ＴＧＦβ₁に結合することのできる単離された前記特異的
   結合成員。
8. 【請求項８】 特異的結合成員が、 （ｉ）配列番号４に実質上開示されるＳＬ１５ ＶＨドメインおよび配列番号１
   ０に実質上開示されるＪＴ１８２ ＶＨドメインの群から選ばれるＶＨドメイン
   ；および、 （ii）配列番号８に実質上開示されるＳＬ１５Ｓ ＶＬドメインおよび配列番号
   ６に実質上開示されるＳＬ１５Ａ ＶＬドメインの群から選ばれるＶＬドメイン
   、 を含む、ＴＧＦβ₁に結合することのできる単離された前記特異的結合成員。
9. 【請求項９】 ＶＨドメインが配列番号４に実質上開示されるＳＬ１５ Ｖ
   Ｈドメインである、請求項８に記載の単離された特異的結合成員。
10. 【請求項１０】 一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の形態である、前記請求項のいず
    れか１項に記載の単離された特異的結合成員。
11. 【請求項１１】 ＩｇＧの形態の、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単
    離された特異的結合成員。
12. 【請求項１２】 ＩｇＧがＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１１に記
    載の単離された特異的結合成員。
13. 【請求項１３】 薬学上許容し得る賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤と合
    した、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の特異的結合成員を含む医薬組成物
    。
14. 【請求項１４】 ヒトまたは動物の治療方法における使用のための、請求項
    １〜１２のいずれか１項に記載の特異的結合成員または請求項１３に記載の組成
    物。
15. 【請求項１５】 当該治療が、糸球体腎炎、ケロイドおよび過形成性瘢痕形
    成、増殖性硝子体網膜症、緑内障ドレナージ手術、角膜損傷および白内障を包含
    する、患者の細胞外マトリックス沈着に伴う状態を治療することである、請求項
    １４に記載の使用のための、特異的結合成員または組成物。
16. 【請求項１６】 免疫または炎症反応を調節する方法における、請求項１４
    に記載の使用のための、特異的結合成員または組成物。
17. 【請求項１７】 腫瘍の治療方法における、請求項１４に記載の使用のため
    の、特異的結合成員または組成物。
18. 【請求項１８】 当該腫瘍が血管新生または転移を伴う、請求項１７に記載
    の使用のための、特異的結合成員または組成物。
19. 【請求項１９】 当該腫瘍が、乳房、前立腺、卵巣、胃、結腸直腸、皮膚、
    肺、子宮頸部および膀胱腫瘍、または白血病もしくは肉腫である、請求項１７ま
    たは１８に記載の使用のための、特異的結合成員または組成物。
20. 【請求項２０】 喘息の治療方法における、請求項１４に記載の使用のため
    の、特異的結合成員または組成物。
21. 【請求項２１】 当該病気がＴＧＦβ₁の発現に付随する、患者の病気を治
    療する方法であって、患者に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の特異的結
    合成員または請求項１３に記載の組成物を投与することを含む方法。
22. 【請求項２２】 当該病気が、糸球体腎炎、ケロイドおよび過形成性瘢痕形
    成、増殖性硝子体網膜症、緑内障ドレナージ手術、角膜損傷および白内障；血管
    新生または転移を伴う腫瘍を包含する腫瘍、および／または乳房、前立腺、卵巣
    、胃、結腸直腸、皮膚、肺、子宮頸部および膀胱腫瘍、または白血病もしくは肉
    腫の群から選ばれる腫瘍；または喘息を包含する、患者における細胞外マトリッ
    クスの沈着を伴う、請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 試料を請求項１〜１２のいずれか１項に記載の特異的結合
    成員と接触させ、当該試料中のＴＧＦβ₁への該特異的結合成員の結合量を決定
    することを含む、試料中のＴＧＦβ₁の量を決定する方法。
24. 【請求項２４】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の特異的結合成員を
    コードしている配列を含む、単離された核酸。
25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の核酸を、宿主細胞中で、当該核酸の発
    現をさせる条件の下で発現させ、その後当該特異的結合成員を回収することを含
    む、ＴＧＦβ₁に結合することのできる特異的結合成員を製造する方法。