JP6218229B2 - 角膜内皮細胞の培養正常化 - Google Patents

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Description

本発明は、角膜内皮細胞を正常な状態で培養するための技術、方法、ならびにそのための薬剤および培地に関する。
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、角膜の上皮、実質および内皮の３層構造のすべてを移植する全層角膜移植術が行われている。しかし、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。
近年、拒絶反応や術後合併症のリスクを軽減し、よりよい視機能を得る目的から、障害を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」の考えが注目されている。角膜移植の中でも、実質組織の移植である深層表層角膜移植術、角膜内皮組織の移植であるデスメ膜角膜内皮移植術（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）などが行われるようになっている。また、生体外で培養した角膜上皮や口腔粘膜を角膜上皮の代わりに移植する培養粘膜上皮移植術は既に臨床応用されており、同様に生体外で培養した角膜内皮を移植する方法も検討されている。角膜内皮の移植用として、コラーゲン層上に培養された角膜内皮層からなる角膜内皮様シートが知られている（特許文献１を参照）。しかし、角膜内皮細胞、特にヒト由来の角膜内皮細胞は、角膜の提供者が限られているとともに、試験管内での培養が難しく、移植に必要な数の培養細胞を得るには時間と費用を要するものである。
ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞は、高い自己複製能と多分化能を併せもち、医学応用の観点から注目されているが、培養過程で細胞を分散する操作によって容易に細胞死を起こすため、細胞数が著しく損なわれてしまうという実用面での問題点を抱えていた。近年、ヒトＥＳ細胞を培養した際に起こる細胞死はＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性化により引き起こされていること、およびＲＯＣＫの阻害により細胞死が大きく抑制されることが見出され、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２等を用いたヒトＥＳ細胞の大量培養や大脳細胞の産生が可能となることが報告された（非特許文献１）。そこで、本発明者らは、Ｙ−２７６３２等を用いた角膜内皮細胞の大量培養の方法を開示した（特許文献２）。
このほか、特許文献３は、角膜内皮前駆細胞を用いたニューロスフェア法を開示する。
特許文献４は、上皮細胞の培養のために、ＴＧＦ−βキナーゼ阻害剤およびｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤を用いることを開示する。
また、非特許文献２および４は、特異な重症角膜内皮疾患におけるＴＧＦ−β、ｐ３８ ＭＡＰＫ、Ｓｍａｄの関与を記載する。非特許文献３は、ＲＯＣＫ阻害剤を用いたヒト角膜内皮細胞の増殖に対する展望を記載する。非特許文献５は、角膜の重度な障害時の線維化がＩＬ−１βにより、途中ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化によるということを示す。非特許文献６は、ウサギでの過剰な冷凍外傷時にみられる線維化がｐ３８ ＭＡＰＫの活性化により、阻害剤で線維化が抑制できることをウサギを用いて示す。非特許文献７は、従来の角膜内皮細胞培養培地では、継代すると正常な状態を維持しつつ増殖させることができないことが記載されている。非特許文献８は、角膜内皮細胞用の培地を開示する。この培地は、ＦＢＳ、ＥＧＦおよびＮＧＦを含むものであるが、この培地では、培養すべき細胞は若年の生物由来のものでないと良好に培養できないことが記載されている。非特許文献９は、塩基性ＦＧＦを用いた角膜内皮細胞用培地を開示する。非特許文献１０は、コラゲナーゼを用いた角膜内皮細胞溶培地を開示する。非特許文献１１は、馴化培地を用いた角膜内皮細胞溶培地を開示する。非特許文献８〜１１のように種々培地は開発されているが、非特許文献７に示されるように、従来の角膜内皮細胞培養培地では、継代すると正常な状態を維持しつつ増殖させることができないことが知られている。非特許文献１２〜１４もまた、培養角膜内皮シートの製造を記載する。非特許文献９〜１２および１５は、ヒト眼組織由来幹細胞および自家角膜内皮移植術を開示する。非特許文献１６および１７もまた、培養角膜内皮シートの製造を記載する。
特開２００５−２２９８６９号公報 国際公開２００９／２８６３１号 特開２００６−１８７２８１号公報 米国特許出願公開第２００６／０２３４９１１号明細書
Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，２５，ｐｐ ６８１ 雑賀、第３２４回関西眼疾患研究会特別講演「上皮−間葉系移行と眼疾患」２０１０年０６月２３日 ｈｔｔｐ：／／ｏｈｐｔｈ．ｋｐｕ−ｍ．ａｃ．ｊｐ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１０／０７／ｔｉｔｌｅ２０１００６２３．ｄｏｃ 小泉、最先端・次世代研究開発支援プログラムｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｐｓ．ｇｏ．ｊｐ／ｊ−ｊｉｓｅｄａｉ／ｄａｔａ／ｌｉｆｅ／ＬＳ１１７＿ｏｕｔｌｉｎｅ．ｐｄｆ Ｓｕｍｉｏｋａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ ２００８；１４：２２７２−２２８１ Ｌｅｅ ＪＧ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００９；５０：２０６７−２０７６ Ｓｏｎｇ ＳＫ．，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０；５１：８２２−８２９） Ｐｅｈ ＧＳ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＲＶＯ ２０１１，５６１ Ｃｏｒｅｎａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ６５９５（Ｍａｙ １−５，２０１１） Ｎａｎｃｙ Ｃ．Ｊｏｙｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ ２００４；２３（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ８−Ｓ１９） ＭｉｙａｔａＫ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ ２０（１）：５９−６３，２００１ Ｗｅｉ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７；４８：６１４−６２０ Ｘｉａｏｙａｎ Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ ２０１０；１６：６１１−６２２ Ｍｉｍｕｒａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００４ Ｓｅｐ；４５（９）：２９９２−２９９７ Ｍｉｍｕｒａ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｎ；７６（６）：７４５−７５１ Ｙｏｋｏｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００５ Ｍａｙ；４６（５）：１６２６−１６３１ Ａｍａｎｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｊｕｎ；２６（６）：３１３−３１８ Ｉｄｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６ Ｆｅｂ；２７（４）：６０７−１４．Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｕｇ １５． Ｓｕｍｉｄｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００６ Ｆｅｂ；２０（２）：３９２−４．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｄｅｃ ９．
本発明者らは、腫瘍壊死因子β（ＴＧＦ−β）経路を阻害することにより、正常な機能を保ったまま角膜内皮細胞を増殖させることができる技術を見出した。これにより、正常な機能を有する角膜内皮細胞を比較的多量に増殖させることができるようになった。すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）線維化抑制剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤。
（２）前記線維化抑制剤はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル阻害剤を含む、項目１に記載の培養正常化剤。
（３）前記培養正常化は、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅからなる群より選択される細胞機能が正常であることを含む、項目１または２に記載の培養正常化剤。
（４）前記培養正常化は角膜移植に適応する移植用細胞を製造するためのものである、項目１〜３のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（５）前記移植用細胞は霊長類の細胞である、項目４に記載の培養正常化剤。
（６）前記移植用細胞はヒトの細胞である、項目４または５に記載の培養正常化剤。
（７）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤である、項目２〜６のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（８）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭ ＴＬＫ インヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目２〜７のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（８Ａ）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭ ＴＬＫ インヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目２〜８のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（９）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）またはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目２〜８または８Ａのいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（９Ａ）前記ＳＢ４３１５４２は、使用時に約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で存在するように含まれる、項目８、８Ａまたは９に記載の培養正常化剤。
（９Ｂ）前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＢＭＰ−７を含む、項目２〜８または８Ａのいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（９Ｃ）前記ＢＭＰ−７は、使用時に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれる、項目８、８Ａまたは９Ｂに記載の培養正常化剤。
（９Ｄ）前記ＢＭＰ−７は、使用時に約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれる、項目８、８Ａまたは９Ｂに記載の培養正常化剤。
（９Ｅ）前記ＢＭＰ−７は、使用時に約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれる、項目８、８Ａまたは９Ｂに記載の培養正常化剤。
（１０）前記線維化抑制剤はさらにＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄまたは９Ｅのいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（１１）前記ＭＡＰキナーゼ阻害剤はＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）またはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目１０に記載の培養正常化剤。
（１２）老化抑制剤をさらに含む、項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（１３）前記老化抑制剤は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、項目１２に記載の培養正常化剤。
（１４）前記老化抑制剤はＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む、項目１３に記載の培養正常化剤。
（１５）ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）と、ＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）またはその薬学的に許容可能な塩とを含む、項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜１４のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（１６）細胞接着促進剤をさらに含む、項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜１５のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（１７）前記細胞接着促進剤は（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸１水和物）を含む、項目１６に記載の培養正常化剤。
（１８）前記線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、前記接着促進剤は、一定期間存在させた後、いったん該接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間存在させることを特徴とする、項目１６または１７に記載の培養正常化剤。
（１９）前記線維化抑制剤および前記細胞接着促進剤の両方を、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることを特徴とする、項目１６または１７に記載の培養正常化剤。
（２０）前記移植用細胞は、角膜内皮障害の予防または治療のためのものである、項目４〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜１９のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
（２１）項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤と角膜内皮の培養成分とを含む、角膜内皮細胞を正常に培養するための培地。
（２２）項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目２１に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法。
（２３）項目２２に記載の方法で培養される角膜内皮細胞。
（２４）項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤を含む、角膜内皮細胞の保存液。
（２５）項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目２１に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬。
（２６）前記処置または予防は、霊長類の角膜内皮のためのものである、項目２５に記載の医薬。
（２７）前記処置または予防は、ヒトの角膜内皮のためのものである、項目２５または２６に記載の医薬。
（２８）前記角膜内皮細胞は霊長類由来である、項目２５〜２７のいずれか１項に記載の医薬。
（２９）前記角膜内皮細胞はヒト由来である、項目２５〜２８のいずれか１項に記載の医薬。
（３０）前記角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症または角膜内皮炎である、項目２５〜２９のいずれか１項に記載の医薬。
（３１）前記医薬は、シート状または懸濁物である、項目２５〜３０のいずれか１項に記載の医薬。
（３２）細胞接着促進剤をさらに含む、項目２４〜３１のいずれか１項に記載の医薬。
（３２Ａ）前記細胞接着促進剤はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む、項目３２に記載の医薬。
（３３）前記細胞接着促進剤は（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸１水和物））である、項目３２または３２Ａに記載の医薬。
（３４）項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目２１に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を用いる工程を包含する、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法。
（３４Ａ）さらに、項目２６〜３２、３２Ａおよび３３のいずれか１項に記載の特徴を少なくとも１つ有する、項目３４に記載の方法。
（３５）細胞接着促進剤を含む、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬。
（３５Ａ）前記細胞接着促進剤はＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む、項目３５に記載の医薬。
（３６）前記細胞接着促進剤は（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸１水和物））である、項目３５または３５Ａに記載の医薬。
（３７）前記医薬は、項目１〜８、８Ａ、９、９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、１０または１１〜２０のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目２１に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞と共に用いられる、項目３５、３５Ａまたは３６に記載の医薬。
（３８）前記角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症または角膜内皮炎である、項目３５、３５Ａ、および３６〜３７のいずれか１項に記載の医薬。
（３９）細胞接着促進剤を処置または予防が必要な被験体に投与する工程を包含する、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法。
（３９Ａ）項目３５Ａ、および３６〜３８のいずれか１項に記載の特徴を少なくとも１つ有する、項目３９に記載の方法。
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
本発明は、従来では達成が困難であった正常な機能を保ったまま角膜内皮細胞を増殖させることができる技術を提供する。正常な機能には、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ等の角膜内皮細胞の生化学的機能、霊長類への移植能などが含まれ、角膜移植を実現するための機能を包含する。
図１は、従来法でのカニクイザルおよびヒトの細胞を培養した場合の、形態変化を示す。上側はカニクイザルのものを示し、下側はヒトのものを示す。カニクイザルはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ、ヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｉｑｕｉｄ＋８％ＦＢＳ＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ＋０．０８％ コンドロイチン硫酸＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦという条件での培養結果である。左は正常角膜内皮の形態を示しているが、長期培養または継代培養により、右の様に容易に形態変化を生じる。 図２は、従来技術で培養した場合に、正常機能を消失することを示す。左パネルは、免疫染色の結果を示す。左側は、正常の形態に培養できたサル角膜内皮細胞（ＭＣＥＣ）を示し、右側は長期培養により線維芽細胞様に形態変化したＭＣＥＣを示す。左パネルの上側にはＺＯ−１での染色を示し、下側には、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅでの染色を示す。右上パネルは、ウェスタンブロットの結果を示す。右下パネルはリアルタイムＰＣＲの分析結果を示す。右上パネルおよび右下パネルとも、左側は正常の形態に培養できたＭＣＥＣを示し、右側は従来の長期培養により線維芽細胞様に形態変化したＭＣＥＣを示す。上からＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１およびＧＡＰＤＨに対する抗体またはプローブでの染色を示す。 図２Ａは、線維芽霊長類角膜内皮細胞（ＣＥＣ）は、異常な細胞外マトリックスを生成することを示し、すなわち、従来技術で培養した場合に、正常機能を消失することを示す。（Ａ）フィブロネクチンおよびコラーゲン１型の線維芽細胞表現型および正常な細胞の表現型における発現を示す。上段はフィブロネクチン、下段はコラーゲン１型を示す。左側は正常な細胞の表現型を示し、右側は、線維芽細胞表現型を示す。線維芽細胞表現型は、フィブロネクチンおよびコラーゲン１型などの過剰の細胞外マトリクスを示した。他方、正常な細胞の表現型は、染色能を完全に喪失した。（Ｂ）フィブロネクチンの線維芽細胞表現型および正常な細胞の表現型におけるタンパク質の発現のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。フィブロネクチンのタンパク質発現レベルは、正常の表現型よりも線維芽細胞の表現型において強くアップレギュレートされていた。（Ｃ）コラーゲン１型、４型、８型フィブロネクチン、インテグリンα５、およびインテグリンβ１（上から順に列挙した。）の線維芽細胞表現型（右）および正常な細胞の表現型（左）における半定量ＰＣＲの結果を示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。半定量ＰＣＲ分析によって、１型コラーゲン転写物（α１（Ｉ）ｍＲＮＡ）は線維芽細胞表現型において豊富に発現されていたが、他方、正常な表現型においては、α１（Ｉ）ｍＲＮＡの発現は減少していた。基底膜コラーゲン表現型である、α１（ＩＶ）ｍＲＮＡおよびα１（ＶＩＩＩ）ｍＲＮＡは、正常表現型および線維芽細胞表現型の表現型の両方で発現されていたが、正常表現型では発現の程度は線維芽細胞表現型よりも少なかった。フィブロネクチンおよびインテグリンα５のｍＲＮＡは線維芽細胞表現型で観察されたが、正常表現型ではこれらの２種のｍＲＮＡは発現されなかった。β１インテグリンのｍＲＮＡは、両方の表現型で同様のレベルで発現がみられた。 図３は、従来法での線維化を示す。３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化培地（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）は線維芽細変化（形質転換）を抑制する（中央）が、しかし継代培養をするとやはり形質転換にいたること（右）を示す。左はヒト角膜内皮細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ＋８％ＦＢＳ＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ＋０．０８％ コンドロイチン硫酸＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン＋５ｎｇ／ｍｌ 上皮増殖因子（ＥＧＦ）という条件で培養したところ線維芽細胞様に形質転換したことを示し、中央は同様の培地をマウス由来線維芽細胞である３Ｔ３を用いた馴化培地としたものでの結果を示す。右は、ヒト角膜内皮細胞を３Ｔ３を用いた馴化培地にて培養して継代培養を行った７日後の位相差顕微鏡写真である。細胞は線維芽細胞様に形質転換して重層化した細胞を拡大したものである。このように従来の培地で継代培養をすると、線維化が生じることが分かる。 図４は、サル角膜内皮細胞の線維化した細胞では、Ｓｍａｄ経路、ｐ３８ ＭＡＰＫ経路およびＪＮＫ経路が活性化されていることを示す図である。各パネルにおいて左は、正常形態のサル角膜内皮細胞（ＭＣＥＣ）を示し、右は、線維芽細胞様に形態変化したＭＣＥＣを示す。左側に上からｐＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ２、ｐＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２に対する抗体でのウェスタンブロットの結果を示し、右側に上からｐｐ３８、ｐ３８、ｐＪＮＫ、ＪＮＫに対する抗体でのウェスタンブロットの結果を示す。なお、ＥＲＫのリン酸化は細胞の線維化による変化のみではなく、細胞増殖による影響があるために、細胞の増殖の状態によっては異なる結果となることがありうることを確認している。 図５は、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することでサル角膜内皮の形質転換を抑制することができたことを示す図である。左はカニクイザルの角膜内皮をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ（本明細書において通常培地ともいう）で培養したところ線維芽細胞様に形態変化したことを示し、右には同じ個体からの角膜内を培地にＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤であるＳＢ４３１５４２を加えてで培養した結果を示す。大小不動が少なく、一層の多角形細胞が認められ、線維芽細胞様に形態変化が抑制されていることが理解される。 図６は、ＴＧＦ−βシグナル阻害によりサル角膜内皮細胞の線維化による機能関連タンパク質の喪失が抑制されることを示す。左側は、カニクイザルの角膜内皮をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ（通常培地）で培養したところ線維芽細胞様に形態変化したＭＣＥＣ、右側はＳＢ４３１５４２で処理して正常な形態に培養できたＭＣＥＣの機能関連マーカーであるＺＯ−１（上側）およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（下側）による免疫染色像を示す。右上パネルは、ウェスタンブロットの結果を示す。右下パネルはリアルタイムＰＣＲの分析結果を示す。右上パネルおよび右下パネルとも、左側はＳＢ４３１５４２で処理して正常な形態に培養できたＭＣＥＣを示し、右側は線維芽細胞様に形態変化したＭＣＥＣを示す。上からＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１およびＧＡＰＤＨに対する抗体またはプローブでの染色を示す。 図７は、ＴＧＦ−βシグナルがサル角膜内皮の形質転換に関与することを確認するために、ＴＧＦ−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することを示した図である。上側はコントロールのＭＣＥＣを示し、下側はＴＧＦ−βで処理した細胞での結果を示す。左には位相差顕微鏡写真による細胞形態を示し、中央には、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体での染色結果を示し、右にはＺＯ−１に対する抗体での染色結果を示す。 図８は、ＴＧＦ−βによりサル角膜内皮細胞が線維化し形態変化して機能関連タンパク質を喪失することを示す図である。ＴＧＦ−βの投与量による変化を示す（左側のパネルでは左から０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌを示す。右側のパネルでは、左から０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌを示す。）。左側上からＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１、およびＧＡＰＤＨに対する抗体でのウェスタンブロットの結果を示し、右側には上からｐＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ２に対する抗体での染色結果を示す。 図９は、ヒト角膜内皮においても、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで形質転換を抑制し、正常な内皮を培養することが可能であることを示す図である。左はコントロール（通常培地）であり、右はＳＢ４３１５４２での染色結果を示す。 図９Ａは、ＳＢ４３１５４２が、ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の機能を維持し、ヒト角膜内皮細胞の線維芽細胞様の変化を抑制することを示す（Ａ、Ｂ）。（Ａ）では左は通常の培地にて培養したヒト角膜内皮細胞を示し、右は通常培地にＳＢ４３１５４２を１μＭの濃度で添加した培地で培養したものを示す。角膜内皮細胞の機能関連マーカーとしてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（ポンプ機能）、ＺＯ−１（バリア機能）をマーカーとして免疫染色したところ、通常の培地では一部の細胞でのみこれらのマーカーの発現が認められた一方で、ＳＢ４３１５４２を加えた培地ではすべての細胞で発現が認められた。（Ｂ）では、ＳＢ４３１５４２を３種類の濃度（右から１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭ）で行ったウェスタンブロットの実験結果を示す。コントロールは何も添加していない培地を示す。上からＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１およびＧＡＰＤＨ（コントロール）の発現を示す。ＳＢ４３１５４２によるＴＧＦレセプターシグナル伝達をブロックすることによって、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が細胞膜での細胞内局在が可能になり、それらのタンパク質発現の維持が可能になった。スケールバーは１００μｍを示す。（Ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＳＢ４３１５４２を加えたときと加えないときのコラーゲン１型の分泌量を細胞上清における濃度を示す。ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＳＢ４３１５４２が、コラーゲン１型の細胞上清への分泌を顕著にダウンレギュレートしたことをが示された。＊＊Ｐ＜０．０５。（Ｄ，Ｅ）定量ＰＣＲを示す。コントロールとして、ＳＢ４３１５４２（１μＭ）を加えたときの、コラーゲン１型の発現量の変化（Ｄ）およびフィブロネクチンの発現量の変化（Ｅ）を、ＧＡＰＤＨの発現のＳＢ４３１５４２による発現量の変化を用いて正規化（すなわち、ＧＡＰＤＨを１００％にする）したグラフである。ＳＢ４３１５４２がコラーゲン１型およびフィブロネクチンの発現をｍＲＮＡレベルで有意に減少させることを示す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５。 図１０は、ＳＢ４３１５４２以外の方法でもＴＧＦ−βシグナルを拮抗させヒト角膜内皮の形質転換を抑制することができたことを示す図である。上側の結果は位相差顕微鏡での結果を示す。下側はファロイジン染色の結果を示す（緑色の染色（細胞の周囲状に網目状となっているものがファロイジンであり、赤色の染色（粒子状）はＰＩである。）。左側はＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ＋８％ＦＢＳ＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ＋０．０８％ コンドロイチン硫酸＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを培地（図中では通常培地と表示する）として培養したヒト角膜内皮細胞であり、右側は培地に１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７を添加して培養した結果を示す。 図１０Ａは、図１０で一部強拡大で示したものをＢＭＰ−７の濃度別に効果を検討したものを示す。ここでは、ＢＭＰ７がヒト角膜内皮細胞の線維芽細胞様への変化を抑制し、その機能を維持することを示す。（Ａ）位相差顕微鏡の写真である。左上はＢＭＰ−７無添加のコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌと表示する。）である。左上が１０ｎｇ／ｍＬ、右下が１００ｎｇ／ｍＬ、左下１０００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７を示す。線維芽細胞の表現型の細長い細胞形は、濃度依存性の様式でＢＭＰ−７の存在下で応答して多角形細胞形態に変換された。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）ファロイジン染色の写真である。左上はＢＭＰ−７無添加のコントロールである。左上が１０ｎｇ／ｍＬ、右下が１００ｎｇ／ｍＬ、左下１０００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７を示す。ＢＭＰ−７は、通常の六角形の細胞形態を可能にし、アクチンの細胞表層における細胞骨格分布を可能にした。スケールバーは１００μｍである。（Ｃ）（Ｄ）それぞれＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１染色の写真である。左上はＢＭＰ−７無添加のコントロールである。左上が１０ｎｇ／ｍＬ、右下が１００ｎｇ／ｍＬ、左下１０００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７を示す。ＢＭＰ−７は、細胞膜におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の細胞内局在を維持した。スケールバーは１００μｍである。（Ｅ）（Ｆ）コントロールおよびＢＭＰ−７の濃度を３種類使用して培養したときのＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ陽性細胞（Ｅ）およびＺＯ−１陽性細胞（Ｆ）の割合を示すグラフである。コントロールは無添加である。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ陽性細胞およびＺＯ−１陽性細胞の両方とも、ＢＭＰ−７で処理した場合に、コントロールに比べて割合が有意に増加していた。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５。 図１１は、ｐ３８ ＭＡＰＫの阻害剤をＳＢ４３１５４２に加えて用いたところｐ３８ ＭＡＰＫ阻害＋ＴＧＦ−βシグナル阻害によりヒト角膜内皮細胞が、継代を繰り返しても高密度で形態保持して培養が可能になることを示す図である。左上は、コントロール（図中では通常培地と表示する）であり、右上はＳＢ４３１５４２のみでの結果である。左下はＳＢ２０３５８０のみでの結果であり、右下はＳＢ４３１５４２およびＳＢ２０３５８０の両方での結果を示す図である。 図１２は、本発明で確立されたヒト角膜内皮細胞の標準的な培養法の一例である。上パネルには継代培養の模式図を示し、実施例８において実施した培養法１〜３の模式図を示す。いずれに方法でも、ＳＢ２０３５８０およびＳＢ４３１４３２を存在させている。培養法１は、Ｙ−２７６３２は４８時間存在させた後、いったん欠失させ、その後再度加える方法である。培養法２では、Ｙ−２７６３２を常に共存させている。培養法３では、Ｙ−２７６３２は存在させない。 最終的に確立されたヒト角膜内皮細胞培養での結果を示す。左側の写真で示すように、線維化が抑えられ、増殖も順調であることが理解される。右の写真にあるように上側に示すＺＯ−１および下側に示すＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅでの染色から明らかなように、正常機能が保持されていたことが理解される。 実施例９において、正常な形態に機能を維持して培養したヒト角膜内皮細胞をコラーゲンシート上に培養してカニクイザル水疱性角膜症モデルに移植することで角膜の透明治癒が得られることを示す。左側は、本発明の培養法で培養した細胞のみを移植した結果であり、右側は本発明の培養法で培養した細胞の移植時にＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を注入した場合の結果を示す。 実施例９において、２．５カ月後に安楽死させ、角膜を摘出して組織を固定した後に、実施例２と同様にファロイジンおよびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１に対して免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて撮影した結果を示す。上段は、細胞＋ＲＯＣＫ阻害剤の結果を示し、下段は細胞のみの結果を示す。左側は、ファロイジン（原色は緑色、グレイスケールでは上側では網目状となっており下側では拡散して見える）およびＤＡＰＩ（原色は青色。グレイスケールでは上側では細胞内部が粒子状に染色され、下側でも粒子状であるが、その数は上側と比べて減少しておりファロイジン染色と重複して見える）の染色を示し、中央はＺＯ−１（原色は緑色。グレイスケールでは上側では網目状となっており下側では左上と右下に一部残存して見える。）およびＤＡＰＩ（原色は青色。グレイスケールでは上側では細胞内部が粒子状に染色され、下側では粒子状の染色は消え薄く全体に染色されている。）の染色を示し、右側はＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（原色は緑色。グレイスケールでは上側では網目状となっており下側では中央に一部残存して見える。）およびＤＡＰＩ（原色は青色。グレイスケールでは上側では細胞内部が粒子状に染色され、下側でも粒子状であるが、その数は上側と比べて減少しておりファロイジン染色と重複して見える）の染色を示す。 図１６は実施例１０で行った抗ＴＧＦ−β中和抗体を用いた場合での培養正常化を示す。左は通常培地での結果を示し、右は抗ＴＧＦ−β中和抗体での結果を示す。 図１７は実施例１１で行ったＳｍａｄ３阻害剤であるＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から販売される６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン（カタログ番号：５６６４０５）を用いた場合での培養正常化を示す。左は通常培地での結果を示し、右は抗ＴＧＦ−β中和抗体での結果を示す。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
本明細書において「線維化抑制剤」とは、線維化を抑制する任意の薬剤を言う。本発明で使用される線維化抑制剤は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βシグナル阻害剤、分裂促進因子（マイトージェン）活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）３８抑制剤、インターロイキン（ＩＬ）−１２、ＩＬ−１０、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、またはＢＭＰ−７（ＯＰ−１）などの、抗線維化作用を有することが知られているサイトカイン等を挙げることができる。このようなサイトカイン類等の情報は、公的データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、雑誌刊行物などから入手することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明では、線維化を抑制することによって、従来は、正常な機能を有する細胞の増殖が困難であった角膜内皮細胞の顕著な増加を達成することができた。したがって、本発明に用いられる線維化抑制剤は、正常な機能を有する細胞の増殖をもたらすものである限り、どのような薬剤でも用いられることが理解される。
例えば、様々な哺乳動物ＩＦＮ−γポリペプチドがヒト疾患の治療に使用されうるが、一般に、ヒトの角膜内皮細胞のためには、ヒトタンパク質が使用される。ヒトＩＦＮ−γコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１５７９およびＣＡＡ００３７５において見出されうる。対応するゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２１９、Ｍ３７２６５、およびＶ００５３６において見出されうる。例えばＧｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ１３２７４）；およびＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６７９０を参照。
あるいは、線維化抑制剤として、ベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬を用いることができる。そのような線維化抑制剤は、コラーゲンＩ型の合成を減らす能力のみならず、コラーゲンＩ型線維の分解の刺激による抗線維化作用を有し得る。線維芽細胞についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、コラーゲンの細胞外輸送が、カルシウムの存在に依存することを示す。カルシウムチャネル遮断薬であるベラパミルは、細胞内カルシウム濃度を低下させて、コラゲナーゼ活性を増加させる。それはまた、線維芽細胞の増殖を阻害する。
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの３つのアイソフォームが存在する。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。
理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、アポトーシス、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびアポトーシス等の強力な調節剤である。
ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。
ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ−Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ−Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ−Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ’ｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：７５３−９１；Ｖｉｌａｒ ＪＭＧ，Ｊａｎｓｅｎ Ｒ，Ｓａｎｄｅｒ Ｃ（２００６）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ２（１）：ｅ３；Ｌｅａｓｋ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８，８１６−８２７（２００４）；Ｃｏｅｒｔ Ｍａｒｇａｄａｎｔ ＆ Ａｒｎｏｕｄ Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１０）１１，９７−１０５；Ｊｏｅｌ Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０；１５２：１５９−１６６等を参照のこと。
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βシグナル阻害剤」とは、ＴＧＦシグナル伝達を阻害する任意の因子をいう。ＴＧＦ−βについて拮抗する場合はアンタゴニストという場合もあるが、本発明についていう場合ＴＧＦ−βアンタゴニストはＴＧＦ−βシグナル阻害剤に包含される。
したがって、代表的には、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明で用いられうる例示的なＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭ ＴＬＫインヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物等を挙げることができるがこれらに限定されない。
このほかのＴＧＦ−βシグナル阻害剤としては、ＴＧＦ−βの１つまたは複数のアイソフォームに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（米国特許第５，５７１，７１４号；国際公開第９７／１３８４４号および国際公開第００／６６６３１号もまた参照）、ＴＧＦ−βレセプター、そのようなレセプターの可溶性形態（例えば、可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター）、またはＴＧＦ−βレセプターに対して向けられる抗体（米国特許第５，６９３，６０７号、米国特許第６，００１，９６９号、米国特許第６，０１０，８７２号、米国特許第６，０８６，８６７号、米国特許第６，２０１，１０８号；国際公開第９８／４８０２４号；国際公開第９５／１０６１０号；国際公開第９３／０９２２８号；国際公開第９２／００３３０号）、潜在性関連ペプチド（国際公開第９１／０８２９１号）、大きな潜在型ＴＧＦ−β（国際公開第９４／０９８１２号）、フェチュイン（米国特許第５，８２１，２２７号）、デコリンならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンなどの他のプロテオグリカン（国際公開第９１／１０７２７号；米国特許第５，６５４，２７０号、米国特許第５，７０５，６０９号、米国特許第５，７２６，１４９号；米国特許第５，８２４，６５５号；国際公開第９１／０４７４８号；米国特許第５，８３０，８４７号、米国特許第６，０１５，６９３号；国際公開第９１／１０７２７号；国際公開第９３／０９８００号；および国際公開第９４／１０１８７号）、ソマトスタチン（国際公開第９８／０８５２９号）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（国際公開第９７／４０８４８号）、インスリン様成長因子ＩＩ（国際公開第９８／１７３０４号）、ＩＰ−１０（国際公開第９７／００６９１号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド（Ｐｆｅｆｆｅｒ、米国特許第５，９５８，４１１号；国際公開第９３／１０８０８号）、植物、菌類、および細菌の抽出物（ＥＰ−Ａ−８１３８７５；特開平８−１１９９８４号；およびＭａｔｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６９３，６１０号）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（米国特許第５，６８３，９８８号；米国特許第５，７７２，９９５号；米国特許第５，８２１，２３４号、米国特許第５，８６９，４６２号；および国際公開第９４／２５５８８号）、ＳｍａｄおよびＭＡＤを含む、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＥＰ−Ａ−８７４０４６；国際公開第９７／３１０２０号；国際公開第９７／３８７２９号；国際公開第９８／０３６６３号；国際公開第９８／０７７３５号；国際公開第９８／０７８４９号；国際公開第９８／４５４６７号；国際公開第９８／５３０６８号；国際公開第９８／５５５１２号；国際公開第９８／５６９１３号；国際公開第９８／５３８３０号；国際公開第９９／５０２９６号；米国特許第５，８３４，２４８号；米国特許第５，８０７，７０８号；および米国特許第５，９４８，６３９号）、ＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｖｏｇｅｌ、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：６６５；およびＳｔｒｏｓｃｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：７７１〜７７４）、その同起源のレセプターへのＴＧＦ−βの結合を阻害するまたはそれに干渉するのに適している、１つまたは複数の一本鎖オリゴヌクレオチドアプタマーまたはそれをコードする発現プラスミド、ならびにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する、上記に同定される分子の任意の変異体、断片、または誘導体を含むが、これらに限定されない。ＴＧＦ−β阻害剤は、ＴＧＦ−βアンタゴニストであり得、そのレセプターへのＴＧＦ−β結合を遮断するヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体（またはＦ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する抗体の他の形態もしくは断片などのその断片）であり得る。ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ある実施形態において、ＴＧＦ−β機能の好ましい阻害剤は、可溶性ＴＧＦ−βレセプター、とりわけ、例えば、ＴＧＦＢＩＩＲまたはＴＧＦＢＩＩＩＲの細胞外ドメイン、好ましくは組換え可溶性ＴＧＦ−βレセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲまたはｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）を含む、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター（ＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター（ＴＧＦＢＩＩＩＲもしくはベータグリカン）である。ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合断片、とりわけ、可溶性断片は、本発明の方法における有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−βレセプターおよびそれらをコードする核酸は、当技術分野において十分に知られている。ＴＧＦ−β１型レセプターをコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１５４３６および米国特許第５，５３８，８９２号（Ｄｏｎａｈｏｅ ｅｔ ａｌ．）において開示される。ＴＧＦ−β２型レセプターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＷ２３６００１、ＡＩ３５７９０、ＡＩ２７９８７２、ＡＩ０７４７０６、およびＡＡ８０８２５５の下で公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型レセプターの核酸配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３２４３、ＡＩ８８７８５２、ＡＩ８１７２９５、およびＡＩ６８１５９９の下で公的に入手可能である。
またさらなる他のＴＧＦ−βシグナル阻害剤またはアンタゴニストおよびそれらの製造方法は、現在開発中のより多くのものと共に、当該分野で十分知られている。有効なＴＧＦ−βアンタゴニストはいずれも、本発明の方法において有用であり得ることから、使用する特異的ＴＧＦ−βシグナル阻害剤またはアンタゴニストは、限定的な特徴のものではない。そのようなアンタゴニストの例には、１つまたはそれより多いアイソタイプのＴＧＦ−βに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（米国特許第５，５７１，７１４号および国際公開９７／１３８４４）、ＴＧＦ−βレセプター、そのフラグメント、その誘導体、およびＴＧＦ−βレセプターに対する抗体（米国特許第５，６９３，６０７号、同第６，００８，０１１号、同第６，００１，９６９号および同第６，０１０，８７２号、ならびに国際公開９２／００３３０、国際公開９３／０９２２８、国際公開９５／１０６１０および国際公開９８／４８０２４）；潜伏関連ペプチド（ｌａｔｅｎｃｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ；国際公開９１／０８２９１）、ｌａｒｇｅ ｌａｃｅｎｔ ＴＧＦ−β（国際公開９４／０９８１２）、フェチュイン（米国特許第５，８２１，２２７号）、デコリン、ならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカンおよびエンドグリンといったような他のプロテオグリカン（米国特許第５，５８３，１０３号、同第５，６５４，２７０号、同第５，７０５，６０９号、同第５，７２６，１４９号、同第５，８２４，６５５号、同第５，８３０，８４７号、同第６，０１５，６９３号、ならびに国際公開９１／０４７４８、国際公開９１／１０７２７、国際公開９３／０９８００および国際公開９４／１０１８７）が含まれる。
そのようなアンタゴニストのさらなる例には、ソマトスタチン（国際公開９８／０８５２９）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（国際公開９７／４０８４８）、インスリン様増殖因子ＩＩ（国際公開９８／１７３０４）、ＩＰ−１０（国際公開９７／００６９１）、アルギニン（ａｒｇ）−グリシン（ｇｌｙ）−アスパラギン酸（ａｓｐ）含有ペプチド（米国特許第５，９５８，４１１号および国際公開９３／１０８０８）、植物、真菌類および細菌類の抽出物（欧州特許出願第８１３８７５号、特開平８−１１９９８４号および米国特許第５，６９３，６１０号）、アンチセンスオレゴヌクレオチド（米国特許第５，６８３，９８８号、同第５，７７２，９９５号、同第５，８２１，２３４号および同第５，８６９，４６２号、ならびに国際公開９４／２５５８８）、ならびにＳｍａｄおよびＭＡＤ（欧州特許出願ＥＰ８７４０４６、国際公開９７／３１０２０、国際公開９７／３８７２９、国際公開９８／０３６６３、国際公開９８／０７７３５、国際公開９８／０７８４９、国際公開９８／４５４６７、国際公開９８／５３０６８、国際公開９８／５５５１２、国際公開９８／５６９１３、国際公開９８／５３８３０および国際公開９９／５０２９６、ならびに米国特許第５，８３４，２４８号、同第５，８０７，７０８号および同第５，９４８，６３９号）、ならびにＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｇ．Ｖｏｇｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：６６５（１９９９）およびＳｔｒｏｓｃｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：７７１−７４（１９９９））、ならびにＴＧＦ−βの活性を阻害する能力を保持する上記分子のいずれかのフラグメントおよび誘導体を含め、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する他のタンパク質の宿主が含まれる。
本発明における使用のための適したＴＧＦ−βアンタゴニストはまた、ＴＧＦ−βの量または活性を阻害するそれらの能力が保持される限り、前述のＴＧＦ−βアンタゴニストの機能的変異体、変異体、誘導体、および類似体をも含む。本明細書において使用される「変異体」、「誘導体」、および「類似体」は、親化合物に対して同様の形または構造を有し、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用する能力を保持する分子を指す。例えば、本明細書において開示されるＴＧＦ−βアンタゴニストのいずれも、結晶化されてもよく、有用な類似体は、（１つまたは複数の）活性部位の形のための担う座標に基づいて合理的に設計され得る。その代わりに、当業者は、不必要な実験を伴うことなく、知られているアンタゴニストの官能基を改変し得、あるいは活性、半減期、生物学的利用能、または他の望ましい特徴の増加についてそのような改変分子をスクリーニングし得る。ＴＧＦ−βアンタゴニストがポリペプチドである場合、ポリペプチドの断片および改変体は、送達の容易さ、活性、半減期などを増加させるために産生され得る（例えば、上記に議論されるようなヒト化抗体または機能的抗体断片）。合成および組換えポリペプチドの産生の当技術分野における技術のレベルを考慮すれば、そのような改変体は、不必要な実験を伴うことなく、達成される可能性がある。当業者らはまた、本明細書において記載されるＴＧＦ−β阻害剤の結晶構造および／または活性部位についての知識に基づいて新規な阻害剤を設計してもよい。可溶性ＴＧＦ−βレセプターなどのポリペプチド阻害剤はまた、遺伝子移入を介して有効に導入され得る。したがって、本発明の方法のある実施形態は、ＴＧＦ−βレセプターまたは結合パートナー、好ましくは可溶性レセプターまたは可溶性結合パートナーの発現のための適したベクターの使用を含む。ある好ましい実施形態において、可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストの投与は、可溶性アンタゴニストをコードするｃＤＮＡ、あるいは、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲ）またはＴＧＦ−βＩＩＩ型レセプター（ｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含むベクターを使用する遺伝子移入によって達成することができ、このベクターは、ベクターを用いて形質移入される細胞中で可溶性ＴＧＦ−βアンタゴニストのｉｎ ｓｉｔｕ発現を引き起こし、ＴＧＦ−βの活性を阻害し、ＴＧＦ−β媒介性の線維形成を抑制する。任意の適したベクターを使用することができる。好ましいベクターは、遺伝子移入の目的で開発されたアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。遺伝子移入の他の非ベクター方法、例えば脂質／ＤＮＡ複合体、タンパク質／ＤＮＡ抱合体、裸のＤＮＡの移入方法などもまた使用することができる。アデノウイルス遺伝子移入を介しての送達のために開発されたさらなる適したＴＧＦ−βアンタゴニストは、Ｉｇ Ｆｃドメインに融合された、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプターの細胞外ドメインをコードするキメラｃＤＮＡ（Ｉｓａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、５５：ｐｐ．４６５〜４７５）、ＴＧＦ−βＩＩ型レセプターのドミナントネガティブ変異体のアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、７２：ｐｐ．８９〜１００）、およびＴＧＦ−β結合プロテオグリカンであるデコリンのアデノウイルス遺伝子移入ベクター（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７７：ｐｐ．Ｌ４１２〜Ｌ４２２）を含むが、これらに限定されない。アデノウイルス媒介性の遺伝子移入は、他の遺伝子送達様式と比較して、効率が非常に高い。
ＴＧＦ−βレセプターおよびＴＧＦ−βレセプターのＴＧＦ−β結合フラグメント、可溶性フラグメント等は、本発明において有用なＴＧＦ−βアンタゴニストである。ＴＧＦ−βレセプターおよびそれらをコードする核酸は、当該分野で十分知られている。ＴＧＦ−β１型レセプターをコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｌ１５４３６およびＤｏｎａｈｏｅらの米国特許第５，５３８，８９２号に開示されている。ＴＧＦ−β２型レセプターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＷ２３６００１；ＡＩ３５７９０；ＡＩ２７９８７２；ＡＩ０７４７０６；およびＡＡ８０８２５５の下、公的に入手可能である。ＴＧＦ−β３型レセプターの核酸配列もまた、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ００３２４３；ＡＩ８８７８５２；ＡＩ８１７２９５；およびＡＩ６８１５９９の下、公的に入手可能である。１つの例示的な実施形態において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、そのレセプター、またはＦ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を保持する他の「抗体」型といったようなそのフラグメントへのＴＧＦ−β結合を遮断する抗体である。その抗体は、キメラ化またはヒト化され得る。本明細書中、キメラ化抗体は、ヒト抗体の定常領域、およびマウス抗体といったような非ヒト抗体の可変領域を含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常領域およびフレームワーク可変領域（すなわち、超可変領域以外の可変領域）、ならびにマウス抗体といったような非ヒト抗体の超可変領域を含む。勿論、その抗体は、ファージ提示システムから選択されるもしくは選抜されるか、またはゼノマウスから産生されるヒト抗体といったような、いずれかの他の種類の抗体誘導体であり得る。
Ｓｍａｄ関連の知見も増大している。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、この分子がタイプＩ（ＴｂＲＩ）およびタイプＩＩ（ＴｂＲＩＩ）のセリン／スレオニンキナーゼ受容体からなるヘテロ二量体細胞表面複合体に結合し、そしてこのヘテロ二量体細胞表面複合体を誘起するときに開始される。ついでこのヘテロ二量体受容体は、前記のシグナルを下流の標的Ｓｍａｄプロテインのリン酸化を通じて前記のシグナルを伝播する。上述のように、Ｓｍａｄタンパク質には三つの機能クラスがあり、それらは、例えばＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３のような、レセプターにより制御されるＳｍａｄ（Ｒ−Ｓｍａｄ）、Ｓｍａｄ４とも呼ばれるコメディエーター（Ｃｏ−Ｓｍａｄ）および阻害Ｓｍａｄ（Ｉ−Ｓｍａｄ）である。このヘテロ二量体受容体複合体によるリン酸化に続いて、このＲ−ＳｍａｄがこのＣｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成し、そして前記の核に移り、他の各タンパク質と連携して、それらは標的遺伝子の転写を調節する（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９５：７３７−７４０）；Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｏｔｔｏｎ，Ｄ．（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ．１９：１７４５）。ヒトＳｍａｄ３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｇｉ：４２４７６２０２に開示されている。ネズミＳｍａｄ３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｇｉ：３１５４３２２１に開示されている。上述のように、ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（「ｃｏｍｍｏｎ Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」とも称する）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。したがって、ＴＧＦ−βシグナル阻害は、Ｓｍａｄ２、３またはｃｏ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ４）の阻害によっても達成されうる。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。したがって、Ｒ−Ｓｍａｄを直接または間接に阻害することによってもＴＧＦ−βシグナル阻害が達成されうる。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（Ｉ−Ｓｍａｄ）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇら（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄの受容体媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する。それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型受容体と関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。したがって、Ｓｍａｄ６および７は、本発明においてＴＧＦ−βシグナル阻害剤として機能しうる。
本発明において使用されうるＳｍａｄ３の阻害剤としては、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、抗体等のほか、低分子化合物として、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから販売される６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において角膜内皮細胞の「培養正常化」とは、角膜内皮細胞が本来有している機能（本明細書では「正常（な）機能」ともいう。）等の特徴を少なくとも１つは維持しながら培養をすることをいう。そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（ＭａｔｓｕｂａｒａＭ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｉｎ ｔｈｅ ｍｏｎｋｅｙ：ａ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９８２，２６：２６４−２７３；ＭａｔｓｕｂａｒａＭ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ：ａｎａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ Ｈｏｒｎ ＤＬ，Ｈｙｎｄｉｕｋ ＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｃｏｒｎｅａ，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ １９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎＨｏｒｎ ＤＬ，Ｓｅｎｄｅｌｅ ＤＤ，Ｓｅｉｄｅｍａｎ Ｓ，Ｂｕｃｏ ＰＪ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ａｎｄ ｃａｔ，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９７７，１６：５９７−６１３）等が挙げられるがそれらに限定されない。すなわち、「正常な機能」は、角膜移植を実現するのに必要な機能または十分であることを示す指標でありうることが理解される。
角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｐｎ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ Ｈｏｒｎ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎ Ｈｏｒｎ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ １９７７，１６：５９７−６１３）。したがって、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
本明細書において「培養正常化剤」とは、培養中に生じうる、角膜内皮細胞等の正常な機能等の特徴の喪失を防止するための薬剤をいう。培養正常化剤がその機能を発揮したというためには、本明細書に記載されるような角膜内皮細胞の正常な機能が維持されているか、あるいは低下幅が減少していることを１つでも試験することによって確認することができる。例えば、正常化の判断方法としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅのような角膜内皮細胞における機能タンパク質を指標としてその発現の変化を見たり、あるいはサル等への移植によって生着し、機能するかどうかを調べることによって実行することができる。移植による判断方法は以下のとおりに行なうことができる。すなわち、Ｉ型コラーゲン上に角膜内皮培養して培養角膜内皮シートを作製する。全身麻酔下でカニクイザルの角膜輪部を１．５ｍｍ切開してシリコン製の手術器具を前房内に挿入して角膜内皮細胞を機械的に掻爬して水疱性角膜症モデルを作製する。続いて角膜輪部を５−６ｍｍ切開して培養角膜内皮シートを前房内に挿入し、前房を空気で置換することでシートを角膜内皮面に接着させる。培養角膜内皮シートの移植による水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性の評価にて行う。
本明細書において「細胞分裂因子（マイトージェン）活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤」とは、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を直接または間接に阻害する任意の阻害剤をいう。したがって、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、マイトージェン活性化タンパク質を標的とし、低下させる、または阻害する化合物に関する。ＭＡＰキナーゼは、様々な 細胞外刺激に応答して活性化され、細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介するタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ群である。それらは、炎症、アポトーシスによる細胞死、発癌性形質転換、腫瘍細胞侵襲、および転移を含む、いくつかの生理的および病理学的細胞現象を制御する。
本発明による有用なＭＡＰキナーゼ阻害剤は、いずれのＭＡＰキナーゼ因子、例えば、限定されるものでないが、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｒａｆ、ＭＯＳ、ｐ２１ｒａｓ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＪＮＫ、ｃ−ｊｕｎ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫＫ、ＰＡＫ、ＲＡＣ、およびｐ３８を阻害するものであり得る。ＭＡＰキナーゼ阻害剤の例は、限定されるものでないが、ＰＤ１８４３５２、ＶＸ−７４５、ＳＢ２０２１９０、アニソマイシン、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｕ０１２６、ＡＧ１２６、アピゲニン、ＨＳＰ２５キナーゼ阻害剤、５−ヨードツベルシジン、ＭＡＰキナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、コントロールＭＡＰキナーゼオリゴヌクレオチド、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット１、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット２、ＭＥＫ阻害剤セット、オロモウシン（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、イソオロモウシン、Ｎ９イソプロピルオロモウシン、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０２４７４、ＳＢ２０２１９０塩酸塩、ＳＢ２０２４７４二塩酸塩、ＳＢ２０３５８０スルホン、Ｉｏｔｏ−ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５、ＳＣ６８３７６、ＳＫＦ−８６００２、チルホスチン（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ １２６、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５、およびＺＭ３３６３７２を含む。ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍカタログのページｉｘｘｖｉｉｉ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｐｈａｒｍ．ｃｏｍ／ｆｒａｍｅ０９．ｈｔｍｌを参照。
ＭＡＰキナーゼはセリン／トレオニンキナーゼのファミリーを記載するために使われる一般名である。ＭＡＰキナーゼはまた、細胞外シグナル調節性プロテインキナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）またはＥＲＫとも呼ばれ、３キナーゼカスケードの末端酵素である。関係するが区切られたシグナル伝達経路に対する３キナーゼカスケードの反復が、一経路内で逐次的に作用するモジュール多機能シグナル伝達要素としてのＭＡＰＫ経路の概念を生み、この経路ではそれぞれの酵素がリン酸化してそれによりシーケンスの次のメンバーを活性化することが特徴である。このようにして、標準的ＭＡＰＫモジュールは３つのプロテインキナーゼからなる。すなわち、あるＭＡＰＫキナーゼ（またはＭＥＫＫ）があるＭＡＰＫキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化し、これが、順に、あるＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎアミノ末端プロテインキナーゼ（またはＳＡＰＫ）））、およびｐ３８カスケードは、それぞれＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＥＲＫ、またはＭＡＰＫスーパーファミリーメンバーを含む３つの酵素モジュールからなる。様々な細胞外シグナルはそれらのそれぞれの細胞表面レセプターと連合すると初期事象をトリガーし、次いでこのシグナルが細胞内部に伝達され、そこで適切なカスケードを活性化する。
ＭＡＰＫはマイトージェン活性化プロテインキナーゼ（またはＥＲＫ）スーパーファミリーであって、ＴＸＹコンセンサス配列を触媒コアに有する。ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＨＯＧ、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路における関係するが別個の末端酵素である。
例えば、ＭＡＰキナーゼの構成的活性化は多数の癌細胞系統（膵臓、大腸、肺、卵巣、および腎臓）および様々なヒト器官（腎臓、大腸、および肺）由来の原発 腫瘍と関連している（Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８（３）：８１３−２２（Ｊａｎ．１９９９））。さらに、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼは、炎症の発症および進行と関連する２つのサイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の産生を調節する。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤はまた、関節リューマチなどの炎症性疾患に加えて、心不全、脳卒中、神経性疾患、およびその他の疾患の治療において将来にある役割を果たしうる。このように、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、癌から炎症まで、多様な病状を治療するのに有用である。
さらに、ＥＲＫはＭＥＫ１に関する限り唯一の基質であるので、この緊密な選択性は、ＭＡＰキナーゼ経路の中心的役割および腫瘍細胞におけるその本質的成分の発現の増強と合体して、この経路の阻害が腫瘍細胞の放射線および化学感作の両方に対する重要なルートでありかつ増殖性疾患における薬理学的介入の可能性のある標的であることを示す。
Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５（７）：８１０−６（Ｊｕｌ，１９９９）は、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の小分子阻害剤を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏカスケードアッセイシステムを記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＥＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫ融合タンパク質を細菌細胞から調製して、これらをこのアッセイシステムにおいてＭＥＫ１のＭＡＰＫへ、ＭＢＰ（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ミエリン塩基性タンパク質））への逐次リン酸化に使用した。ＭＥＫ１を直接阻害するＰＤ１８４３５２［２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド］も見出されている。
ＭＡＰキナーゼ阻害剤の例は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤：ＡＧ１２６、アピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ＨＳＰ２５キナーゼ阻害剤、５−ヨードツベルシジン、ＭＡＰキナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、コントロールＭＡＰキナーゼオリゴヌクレオチド、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット１、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット２、ＭＥＫ阻害剤セット、オロモウシン（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、イソオロモウシン、Ｎ９イソプロピルオロモウシン、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン）、ＰＤ９８０５９溶液、ＰＤ１６９３１６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＳＢ２０２４７４、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェノール；ＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．）、ＳＢ２０２１９０溶液、ＳＢ ２０２１９０塩酸塩、ＳＢ２０２４７４二塩酸塩、ＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン＞；ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（１８）１２１１６−１２１２１，１９９７）、ＳＢ２０３５８０溶液、ＳＢ２０３５８０塩酸塩、ＳＢ２０３５８０スルホン、Ｉｏｔｏ−ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５、ＳＰ６００１２５（１，９−ピラゾロアントロン，アントラピラゾロン）、ＳＢ２３９０６３（トランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール）、ＳＣ６８３７６、ＦＲ１６７６５３（Ｎｉｋｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ＢＩＲＢ７９６ＢＳ（あるいはＢＩＲＢ−７９６；１−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｐ−トリル−２Ｈ−ピラゾール−３−イル）−３（４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）ナフ−タリン−１−イル）尿素、Ｂｌｏｏｄ１０１，４４４６−４４４８，２００３）、ＳＫＦ−８６００２、チルホスチン（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１２６、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５、Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）、４−アザインドール、３−（４−フルオロフェニル）−２−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｂ］ピリジン、ＺＭ３３６３７２、ＣａｌＢｉｏ５０６１２６（２−（４−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−ピリジン−４−イル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン）、ＲＯ３２０１１９５、Ｒ１４８７等を含む。ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍカタログのページｉｘｘｖｉｉｉも参照しうる。このほかの、本発明で用いることができるＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＭＡＰキナーゼに対する中和抗体、ＭＡＰキナーゼの活性を阻害する化合物、ＭＡＰキナーゼをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物（例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、リボザイム）、ペプチド、および植物成分（例えば、ポリフェノール、フラボノイド、配糖体）等の化合物が挙げられる。使用される濃度として、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＰＤ１６９３１６、ＦＲ１６７６５３、ＢＩＲＢ７９６ＢＳ等であれば約５０ｎｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌが例示され、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌであるがこれらに限定されない。
本明細書において、角膜内皮細胞の「老化抑制剤」または「老化防止剤」とは、細胞老化を抑制することができる任意の薬剤をいう。ヒト正常細胞は、一定回数以上の分裂を繰り返すことで分裂能力を失い、老化する（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）。老化細胞は特定の形態学上および生理学的な変化を経て、特定の遺伝子を誘導する。また、正常細胞は様々な処理によって上と同様な現象を示す（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）。このように本明細書では細胞の「老化を抑制する」とは、細胞の密度を上昇させる効果を有することをいう。したがって、より詳細に説明すると、「老化抑制剤」または「老化防止剤」は、細胞の密度を上昇させる任意の薬剤をいう。細胞の老化の程度は、細胞の形態観察（細胞は老化すると扁平化、肥大化が起きる）および老化マーカーとして知られるβ−ガラクトシダーゼの染色像（老化が進むとβ−ガラクトシダーゼの染色像が大きくなる）を観察することにより調べることができる。したがって、本発明において用いられる老化抑制剤としては、上記老化抑制作用を有する限りどのような薬剤であっても使用することができる。老化を抑制する作用としては、老化に伴って引き起こされる正常細胞の機能低下を抑える作用であり、例えば、細胞周期の停止を抑える作用、正常細胞の分裂寿命の短縮を抑える作用、正常細胞の生存率の低下を抑える作用、老化に伴う正常細胞の形態学的変化を抑える作用等が挙げられる。理論に束縛されることを望まないが、Ｆｕｎａｙａｍａ Ｒ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｆ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ（２００７）１１６：４３１−４４０）によれば、角膜内皮細胞ではないものの、線維芽細胞などにおいて種々の細胞ストレスによる老化がｐ３８ ＭＡＰＫの活性化によることを示している。さらにはｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０により細胞ストレスによる細胞老化を阻害できることを報告している。本発明者らの実施例において例示した実験結果においては、ＳＢ２０３５８０により線維化抑制効果のみならず、細胞密度の低下を抑制して高密度の角膜内皮細胞の培養が可能になることを示した。したがって、本発明において用いられる場合、老化抑制剤であれば、どのようなものでも細胞密度の低下を抑制して高密度の角膜内皮細胞の培養を改善することができることが理解される。
本明細書において「老化抑制」の判断は、角膜内皮細胞密度の低下を抑制し高密度を維持できていることによる。生体内においても老化に従って角膜内皮密度が低下することが知られており（大原國俊、水流忠彦、伊野田 繁：角膜内皮細胞形態のパラメーター．日眼会誌９１：１０７３−１０７８，１９８７）臨床的観点からも老化判断の良い指標である。また、一般的な細胞老化の指標として核／細胞質比の低下があるが角膜内皮においても同様に用いることができると考えられる。また、他の老化抑制剤の例としては、他のｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を挙げることができるがこれらに限定されない。
本明細書において「ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤」とは、ｐ３８に関連するＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。したがって、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＡＰＫファミリーメンバーであるｐ３８−ＭＡＰＫを標的とし、低下させる、または阻害する化合物に関する。
ｐ３８は哺乳類動物ＭＡＰＫスーパーファミリーメンバーであって、ストレス、紫外光、および炎症性サイトカインにより活性化される。触媒コアにＴＧＹコンセンサス配列を有する。
異常調節されたキナーゼは多くの疾患、特に増殖性および炎症性障害における主な病因であるということが次第に認識されている。癌領域において最初に同定される発癌遺伝子の１つは、上皮増殖因子レセプターキナーゼ（ＥＧＦＲ）に対するものであったが、その過剰発現は肺、乳、脳、前立腺、ＧＩおよび卵巣癌と関連している。例えば、ＭＡＰキナーゼの構成的活性化は多数の癌細胞系統（膵臓、大腸、肺、卵巣、および腎臓）および様々なヒト器官（腎臓、大腸、および肺）由来の原発腫瘍と関連している（Ｈｏｓｈｉｎｏら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８（３）：８１３−２２（Ｊａｎ．１９９９））。さらに、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼは、炎症の発症および進行と関連する２つのサイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の産生を調節する。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤はまた、関節リューマチなどの炎症性疾患に加えて、心不全、脳卒中、神経性疾患、およびその他の疾患の治療において将来にある役割を果たしうる。このように、ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、癌から炎症まで、多様な病状を治療するのに有用である。
本発明において使用されうるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）の他、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物であれば特に制限されず、例えば特開２００２−９７１８９号公報、特表２０００−５０３３０４号公報、特表２００１−５２２３５７号公報、特表２００３−５３５０２３号、特表２００１−５０６２６６号公報、特表平９−５０８１２３号公報、国際公開第０１／５６５５３号公報、国際公開第９３／１４０８１号公報、国際公開第０１／３５９５９号公報、国際公開第０３／６８２２９号公報、国際公開第０３／８５８５９号公報、特表２００２−５３４４６８号公報、特表２００１−５２６２２２号公報、特表２００１−５２６２２３号公報、米国特許第６３４４４７６号明細書、国際公開第０３／９９８１１号公報、国際公開第０３／９９７９６号公報、特表２００４−５０６０４２号公報、国際公開第０４／６０２８６号公報、特表２００２−３６３１７９号公報、特表２００４−１０７３５８号公報、米国特許第５６７０５２７号明細書、米国特許第６０９６７５３号明細書、国際公開第０１／４２１８９号公報、国際公開第００／３１０６３号公報などの特許公報に記載された化合物が挙げられ、好ましくは４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル）ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、ＳＣＩＯ−４６９、ＶＸ−７０２、ＧＳＫ−６８１３２３、ＰＳ−５４０４４６、ＳＣ−８００３６、ＡＶＥ−９９４０、ＲＯ−３２０−１１９５、ＳＢ−２８１８３２、ＳＣＩＯ−３２３、ＫＣ−７０６、：Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））である。
さらに、Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ社（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／に例示される様々なＭＡＰキナーゼ阻害剤を提供する。例えば、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］フェノール）は、高度に選択的、強力、かつ細胞浸透性のｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤である（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，ｐｌｃ）（Ｊｉａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１７９２０（１９９６）；Ｆｒａｎｔｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１３８−４６（１９９８）；Ｎｅｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１６４１５（１９９８）；およびＤａｖｉｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５１：９５（２０００））。また、アニソマイシン（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−［（４−メトキシフェニル）メチル］−３，４−ピロリジンジオール−３−アセテート）は、タンパク質合成インヒビター（翻訳をブロックする）である。これは、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼの強力なアクチベーターであり、前初期遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、およびｊｕｎＤ）誘導の相同的脱感作を選択的に誘発する強力なシグナル伝達アゴニストとして作用する。ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、マイトージェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）の特異的阻害剤である（Ｐｆｉｚｅｒ＝Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）。ＳＢ２０３５８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）は、ｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの高度に選択的な阻害剤（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ，ｐｌｃ）である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。ＳＢ２０３５８０塩酸塩（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）化合物は、高度に選択的なｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの阻害剤の水溶性塩である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）は、ＭＡＰキナーゼキナーゼの強力かつ選択的な非競合性の阻害剤である。
好ましいｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤としては、ＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）が例示されるがそれに限定されない。
本明細書において使用される、角膜内皮細胞の「細胞接着促進剤」または「接着促進剤」は、細胞の接着性を付与または改善する薬剤をいい、そのような機能を有するものであれば、どのような薬剤を用いてもよい。例示的な角膜内皮細胞の接着促進剤としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において、「Ｒｈｏキナーゼ」とは、Ｒｈｏの活性化に伴い活性化されるセリン／スレオニンキナーゼを意味する。例えば、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ−ＩＩ：Ｌｅｕｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２９０５１−２９０５４，１９９５）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（ＲＯＫβ、ＲＯＣＫ−Ｉ：Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，１５（８），１８８５−１８９３，１９９６）およびその他のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができる。具体例として、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）またはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などがあげられ、これらの化合物は、市販品（和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等）を好適に用いることもできる。
（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンおよびそれらの薬学的に許容される塩等は、角膜内皮細胞の接着促進に特に優れているため、好ましく用いられる。該化合物の塩としては、薬学的に許容される酸付加塩が好ましく、それらの酸とは塩酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、マンデル酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸等の有機酸があげられる。（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）・２塩酸塩（一水和物であってもよい）、および１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン塩酸塩がより好ましい。
本発明において、「角膜内皮細胞の接着促進」としては、例えば、角膜内皮の細胞同士の接着促進、および角膜内皮細胞と培養基材との接着促進の両方があげられる。
本発明において使用されうる（細胞）接着促進剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サルなど）由来の角膜組織から分離された角膜内皮細胞または分離され継代した角膜内皮細胞に対して接着促進作用を奏する。本発明の接着促進剤は、特に培養および継代が困難とされるヒト由来の角膜内皮細胞の接着促進作用に優れていることから、ヒト由来の角膜内皮細胞を対象にすることが好ましい。
角膜内皮細胞は角膜の透明度を維持する役割を担っている。この内皮細胞の密度がある限度を超えて少なくなると角膜にむくみが発生し、角膜の透明性が維持できなくなり、角膜内皮障害が引き起こされる。本発明において使用されうる接着促進剤は、角膜内皮細胞の接着を促進し、良好な細胞形態および高い細胞密度を持った角膜内皮細胞層の形成の改善を可能とする。
本明細書において、「（ＴＧＦ−β等の）発現を抑制する物質（例えば、核酸）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを分解する物質（例えば、核酸）、またはｍＲＮＡからの蛋白質の翻訳を抑制する物質（例えば、核酸）であれば特に限定されるものでない。かかる物質として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはこれらの発現ベクター等の核酸などが例示される。その中でも、ｓｉＲＮＡおよびその発現ベクターが好ましく、特にｓｉＲＮＡが好ましい。「遺伝子の発現を抑制する物質」としては、上記のほか、タンパク質やペプチド、あるいは他の小分子も含まれる。なお、本発明において標的遺伝子は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に関与する任意の遺伝子である。
本発明において標的とされるＴＧＦ−β等の特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上，新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．）。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＴＧＦ−βのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のＴＧＦ−β等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のＴＧＦ−β等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するＴＧＦ−β等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，１９９３，３１９−３４７．に記載される方法を用いて、ＴＧＦ−β等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
ＴＧＦ−β等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２２８，２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８８，２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８９，１７，７０５９．）。
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ． ＆ Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いてＴＧＦ−β等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
ＴＧＦ−β等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＴＧＦ−β等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。ＴＧＦ−β等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ Ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ；ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、ＴＧＦ−β等のの発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、ＴＧＦ−βまたは他のＴＧＦ−βシグナルのメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ｏｃｈｉｙａ，ＴらのＮａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，５：７０７−７１０，１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１：３１−５２，２００１より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸または医薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｆ．ＰＮＡＳ．（２００３）１０２（３４）１２１７７−８２、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ Ｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ（２００４）３２（１３）ｅ１０９では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
本明細書において「培地」とは、角膜内皮細胞を維持または増殖することができる任意の培地を指し、必要に応じ適切な場合、液体培地（培養液）、懸濁培地、固体培地等の任意の形態をとることができる。このような角膜内皮細胞に使用される培地の成分としては、例えば、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））、増殖因子／成長因子（例えば、ｂ−ＦＧＦ）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）等を挙げることができる。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Ｎａｎｃｙ Ｊｏｙｃｅらの報告｛Ｊｏｙｃｅ，２００４ ＃１６１｝｛Ｊｏｙｃｅ，２００３ ＃７｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
（培養正常化剤）
１つの局面において、本発明は、線維化抑制剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤を提供する。本発明が提供される前、角膜内皮細胞は、移植に適した形態を維持しつつ増殖させることは困難であった。特に、継代を重ねると移植が困難になるものであった。移植が困難になる指標としては、機能タンパク質の消失がある。従来、通常の培養法では形態変化が生じることが知られていたが、本発明ではこれが形態的に線維芽細胞様であることから線維性変化であると考え、それがＴＧＦ−βシグナルの活性化を伴うものであることを発見した。ここで、ＴＧＦ−βシグナルの活性化は、限定を意図しないが、実施例で例示されるように、フィブロネクチンおよびコラーゲン１型、４型、８型フィブロネクチン、インテグリンα５、およびインテグリンβ１などの細胞外マトリクスまたはインテグリン等の量、レベル等を調べることによって、判定することができる。限定を意図するものではないが、フィブロネクチンのタンパク質発現レベルは、正常の表現型よりも線維芽細胞の表現型において強くアップレギュレートされる。従来、生体において先天性梅毒などの極めて稀な疾患において角膜内皮細胞の線維化が伴うことは見いだされていたが、線維化を抑制する治療法の開発はない。したがってこのような疾患や培養条件下において線維化を薬物により抑制することで正常な機能を維持することができるかどうか予想できなかった。本発明者らは、他の細胞でＴＧＦ−βシグナル阻害剤を代表例として線維化を抑えることが知られている薬剤を使用したところ、形態変化を抑制した培養が可能になり予想外に正常機能を維持しつつ継代を行なうことができ（すなわち、培養正常化が可能）、角膜内皮細胞の大幅な増殖を可能にすることを見出した。正常な機能を維持しながら角膜内皮細胞を大量培養することは従来不可能であった。したがって、本発明によって達成された効果は、まさに顕著であるというべきである。
本発明においては、線維化抑制剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明で使用される線維化抑制剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明においては、培地等に使用される場合、培養正常化剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもでき、培養正常化剤自体に単独の有効成分を含めることもまた必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
培地等において使用される本発明の培養正常化剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＡＬＫ４，５または７を経由するＳｍａｄ２／３系と、ＡＬＫ１，２，３または６を経由するＳｍａｄ１／５／８系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている（Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ’ｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：７５３−９１；Ｖｉｌａｒ ＪＭＧ，Ｊａｎｓｅｎ Ｒ，Ｓａｎｄｅｒ Ｃ（２００６）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ２（１）：ｅ３；Ｌｅａｓｋ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８，８１６−８２７（２００４）；Ｃｏｅｒｔ Ｍａｒｇａｄａｎｔ ＆ Ａｒｎｏｕｄ Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１０）１１，９７−１０５；Ｊｏｅｌ Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０；１５２：１５９−１６６．）。ＢＭＰ−７はＴＧＦ−βシグナルを抑制し線維化を抑制することができることも知られている（上記文献の他、Ｒａｌｆ Ｗｅｉｓｋｉｒｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １４，４９９２−５０１２，Ｊｕｎｅ １，２００９；Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｍ Ｚｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３，９５２−９６１（２００７）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，９６４−９６８（２００３））。しかしながら、非特許文献２、４では、非常に特殊な疾患である梅毒製角膜実質炎または人工的に作成した重度の障害により実際にコラーゲンなどの細胞外基質からなる膜状組織を伴うような状態についてＴＧＦ−βとの関与が記載されているが、これから正常化の維持を達成しうることは困難である。また、非特許文献５では角膜の重度な障害時の線維化がＩＬ−１βにより、途中ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化によるということを示し、非特許文献６ではウサギでの過剰な冷凍外傷により生体において重度の炎症が生じた時にみられる線維化がｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を伴い、阻害剤で一部線維化が抑制できることをウサギを用いて示している。これらの文献は極めて強い炎症が生体に生じ細胞外基質からなる膜状組織を伴うような状況においてｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を伴うことを示したものであり、通常の培養状態で線維化が生じることには言及しておらず、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤およびｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤が正常化維持に有効であるということを述べたものではなく、正常状態の維持についてなんら示唆を与えるものではない。このように、角膜内皮細胞については、従前は正常機能を保ちつつ培養することは困難であると考えられており、非特許文献７〜１１等で報告された培地は、結局のところ正常化能を維持できなかったことが非特許文献７および本明細書における比較例等で実証されている。ましてや、線維化抑制またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路を抑制することにより、角膜内皮細胞の培養正常化をすることができるとは考えられていなかった。
１つの実施形態では、本発明において用いられる線維化抑制剤はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル阻害剤を含む。したがって、本発明には、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤を提供するという側面もある。本発明で用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのシグナル経路を阻害することができる限り、どのような薬剤（ａｇｅｎｔ）を用いてもよい。また、阻害されるべきＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、周知のように、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β レセプターが直接関連するもののほか、ＢＭＰ−７のように最終的にＴＧＦ−βのシグナル伝達経路と同様（阻害剤・アンタゴニスト等であれば正反対）の効果を発揮するものであれば、どのようなシグナルに関連する因子であってもよい。
本発明においては、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明で使用されるＴＧＦ−βシグナル阻害剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
１つの実施形態において、培養正常化は、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを発現しており、形態的に多角形であり重層化していないものからなる群より選択される細胞機能が正常であることを含む。
１つの実施形態において、培養正常化は角膜移植に適応する移植用細胞を製造するためのものである。好ましい実施形態では、上記移植用細胞は霊長類の細胞である。１つの好ましい実施形態では、上記移植用細胞はヒトの細胞である。
１つの実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、およびＳｍａｄ３の阻害剤は本明細書において他の箇所で説明された任意のものを利用することができる。
１つの実施形態では、本発明において用いられうるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド）、ステモレキュールＴＭ ＴＬＫ インヒビター（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）、ステモレキュールＴＭ ＢＭＰインヒビターＬＤＮ−１９３１８９（６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、本明細書において他に例示される成分、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。理論に束縛されることを望まないが、Ｓｍａｄ２／３（ＡＬＫ４、５および７に関連する）を介して効果を奏するＳＢ４３１５４２、Ｓｍａｄ１／５／８（ＡＬＫ１、２、３および６に関連する）を介して効果を奏するＢＭＰ−７の両方で正常化が観察されていることから、これらのいずれの経路のＴＧＦ−βシグナル阻害剤であっても、本発明の効果を達成することができると理解される。
好ましい実施形態では、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）を含む。線維化が抑制された上に、正常機能を担うタンパク質が保持されていることが示され、また霊長類への移植にも耐えたからである。好ましい実施形態では、ＳＢ４３１５４２は、使用時に約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、好ましくは、使用時に約１μＭ〜約１０μＭの濃度で存在するように含まれ、さらに好ましくは使用時に約１μＭの濃度で存在するように含まれる。
別の好ましい実施形態では、本発明において用いられるＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＢＭＰ−７を含む。線維化が抑制された上に、正常機能を担うタンパク質が保持されていることが示され、また霊長類への移植にも耐え得るからである。好ましい実施形態では、ＢＭＰ−７は、使用時に約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれ、より好ましくは、使用時に約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれる。ＢＭＰ−７は、使用時に約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれていても、約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように含まれていてもよい。
好ましい実施形態では、本発明において用いられる線維化抑制剤はさらにＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む。本発明で標的とされるＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＡＰキナーゼのシグナル経路を阻害することができる限り、どのような薬剤（ａｇｅｎｔ）を用いてもよい。また、阻害されるべきＭＡＰキナーゼシグナルは、ＭＡＰキナーゼをリン酸化することに関与し、その上流または下流へとシグナルが伝達されあるいは、傍流として他の経路から合流する経路があるが、どのようなシグナルであってもよい。
本発明においては、１種類のＭＡＰキナーゼ阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明で使用されるＭＡＰキナーゼ剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
好ましいの実施形態では、本発明において用いられるＭＡＰキナーゼ阻害剤はＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）のほか、本明細書において他に例示される成分を含む。
別の実施形態では、本発明の培養正常化剤は老化抑制剤をさらに含む。ここで、使用されうる老化抑制剤としては、細胞の老化を抑制することが知られている薬剤であればどのようなものでも使用されうることが理解される。
本発明においては、１種類の老化抑制剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明で使用される老化抑制剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、本発明で用いられる老化抑制剤は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む。
本発明においては、１種類のｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明で使用されるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ剤の濃度は、通常約０．１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１〜３０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは約１μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
１つの好ましい実施形態では、本発明で用いられる老化抑制剤はＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）と、ＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）とを含む培養正常化剤を提供する。この２つの薬剤の組合せにより、正常化を維持しつつ、増殖速度を上げ、細胞密度も十分な培養がより改善されている。
別の実施形態では、本発明の培養正常化剤は、細胞接着促進剤をさらに含む。本発明において用いられる細胞接着促進剤は、細胞接着を促進することができる薬剤であれば、どのような薬剤を用いてもよい。
１つの好ましい実施形態では、本発明で用いられる細胞接着促進剤としては１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などのＲｈｏキナーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明において使用されうる接着促進剤は、角膜内皮細胞を試験管内で培養する場合に、培養正常化剤または培養液等の培地に添加することもできる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を当培養正常化剤または培地に添加して培養を続けることにより、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤と角膜内皮細胞とが生体外で接触し、角膜内皮細胞の接着が促進される。
本発明において使用されうる培地には、内皮細胞の培養に通常用いられる培地（例えば、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））、成長因子（例えば、塩基性（ｂ−）ＦＧＦ）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）などを含むことができる。
本発明の培養成分にＲｈｏキナーゼ阻害剤を含めることにより、角膜内皮細胞の接着を亢進することによって細胞の脱落を防止し、良好な細胞形態および高い細胞密度を持った角膜内皮細胞層の形成を可能とするため、本明細書に記載される本発明の角膜内皮製剤の製造方法に好適に用いられる。また、本発明の培養液は、角膜内皮細胞を維持するためにも用いられる。
本発明の培養正常化剤は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含有していてもよい。本発明に含まれるＲｈｏキナーゼ阻害剤は、前記した通りである。本明細書において「角膜保存液」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための液剤である。
本発明の培養正常化剤は、角膜保存液として使用されてもよい。本発明の培養正常化剤が加えられうるそのような角膜保存液としては、角膜移植時に通常用いられる保存液（強角膜片保存液（Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ：登録商標）、角膜移植用眼球保存液（ＥＰＩＩ：登録商標））、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などがあげられる。
本発明においては、１種類のＲｈｏキナーゼ阻害剤を単独で含めることも、また必要に応じて数種類を併用して含めることもできる。
本発明中のＲｈｏキナーゼ阻害剤の濃度は、通常１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜２０μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０μｍｏｌ／ｌであり、数種類使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌを挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明は、角膜の形質転換を防止し、正常化された培養を可能とし、あるいは角膜内皮細胞の接着を亢進することによって細胞の脱落を防止し、良好な細胞形態および高い細胞密度を持った角膜内皮細胞層の形成を可能とするため、臓器移植などに用いられる角膜の保存液として用いられる。また、本発明の培養正常化剤は、角膜内皮細胞を凍結保存するための保存液またはその成分としても用いられる。凍結保存のためには、本発明の保存液にグリセロール、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド等をさらに添加してもよい。
１つの実施形態では、本発明の培養正常化剤を使用する際、培養正常化剤は、複数の薬剤が別々に使用されうる。そのような実施形態では、例えば、線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、接着促進剤は、一定期間存在させた後、いったん該接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間存在させることができる。
別の実施形態では、本発明の培養正常化剤を使用する際、線維化抑制剤および前記細胞接着促進剤の両方を、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることができる。
１つの実施形態では、本発明の培養正常化剤で培養される角膜内皮細胞は霊長類由来である。好ましい実施形態では、本発明の培養正常化剤で培養される角膜内皮細胞はヒト由来である。
好ましい実施形態では、本発明が目的とする培養は、角膜内皮障害の予防または治療のための細胞培養である。
（角膜内皮細胞を正常に培養するための培地）
別の局面において、本発明は、本発明の培養正常化剤と角膜内皮の培養成分とを含む、角膜内皮細胞を正常に培養するための培地を提供する。本発明の培地において用いられる培養正常化剤は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、従来販売され使用されている培地成分であってもよく、あるいは、別途角膜内皮用に開発された成分であってもよい。そのような培地成分の例としては、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ，Ｍ１９９、ＭＥＭ等（これらは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ等から入手可能）を挙げることができるがこれらに限定されない。
（角膜内皮細胞を正常に培養する方法）
別の局面において、本発明は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法を提供する。本発明の方法において用いられる培養正常化剤は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明の方法において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、（角膜内皮細胞を正常に培養するための培地）において説明されたものを例示することができる。
１つの例示的な培養法は、図１２に示している。例えば、１つの例示的な培養法において。本発明の培養正常化剤は、複数の薬剤が別々に使用され得、例えば、線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、接着促進剤は、一定期間（例えば、２４時間〜７２時間、あるいは４８時間等）存在させた後、いったん該接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間（例えば、２４時間〜７２時間、あるいは４８時間等、この期間は毎回変動してもよく同じであってもよい）存在させることができる。あるいは、これらの培養法において、接着促進剤を使用しないパターンもあり得る。すなわち、この例示的な培養法は、図１２下に示している。例えば、この例示的な培養法において。本発明の培養正常化剤はとして線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることができる。
別の実施形態では、本発明の方法において、使用される培養正常化剤は線維化抑制剤および前記細胞接着促進剤の両方を含み、これらを前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることができる。
１つの実施形態では、本発明の培養正常化剤で培養される角膜内皮細胞は霊長類由来である。好ましい実施形態では、本発明の培養正常化剤で培養される角膜内皮細胞はヒト由来である。
好ましい実施形態では、本発明の方法が目的とする培養は、角膜内皮障害の予防または治療のための細胞培養であり、特に移植用の細胞または組織等を生産するために用いることができる。
（角膜内皮細胞および角膜内皮製剤）
本発明は、本発明の方法で培養される角膜内皮細胞を提供する。本発明は、通常の培養を行い継代しても、線維化せず、正常機能を喪失しないという細胞である点従来の細胞に無い性質を有するということができる。そして、最も重要な性質は、機能としては正常な角膜内皮の性質を有しているという点である。したがって、本発明が提供する角膜内皮細胞は、製剤として提供されうることから、本発明は、角膜内皮製剤を提供するということになる。
したがって、本発明は、本発明の培養正常化剤を含む培養液を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を含む、角膜内皮製剤の製造方法を提供する。
１つの局面において、本発明の角膜内皮製剤は、基材と、その基材上の試験管内で培養した角膜内皮細胞層とを含有する。
本発明において使用される基材とは、培養角膜内皮細胞層を担持し、移植後一定期間好ましくは少なくとも３日間は生体内でもその形状を維持しうるものであれば特に限定されるものではない。また、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞を試験管内で培養する場合のスキャフォールドとしての役割を有するものであってもよく、培養後の角膜内皮細胞層を担持させる役割のみを有するものであってもよい。好ましくは、本発明において使用される基材は、角膜内皮細胞の培養に用いられ、培養完了後にそのまま移植に供することが可能なスキャフォールドとしての役割を有するものである。
本発明において使用される基材としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜などがあげられる。
本発明において使用される基材の形状は、角膜内皮細胞層を担持し、移植に適する形状であれば特に限定されるものではないが、シート状であることが好ましい。本発明の製剤がシート状の場合、移植時に適用部位に合わせた大きさに切断して用いることができる。また、シートを小さく丸めた後、創口から挿入することも可能である。好ましい具体例として、障害した角膜内皮の面積の約８割を覆う円形の形状が例示される。また、適用部位に密着可能なように、この円形の周辺部に切り込みを入れることも好ましい。
好ましい実施形態において、本発明において使用される基材の例はコラーゲンである。コラーゲンとしては、特開２００４−２４８５２号公報に記載のコラーゲンシートが好適に使用できる。かかるコラーゲンシートは、特開２００４−２４８５２号公報に記載の方法に従って、例えば、羊膜から調製することができる。
以下に角膜内皮製剤の一例として角膜内皮細胞層の調製を記載する。
本発明で使用される角膜内皮細胞層は、以下の特徴を少なくとも１つ備えるものであることが好ましい。より好ましくは、以下の特徴を２つ以上、さらにより好ましくは全て備えるものである。
（１）細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
（２）細胞層における細胞密度は約１，０００〜約４，０００細胞／ｍｍ２である。特に、成人をレシピエント（移植者）とする場合には約２，０００〜約３，０００細胞／ｍｍ２であることが好ましい。
（３）細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
（４）細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
本発明の製造方法は、本発明の培養正常化剤または培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を含み、例えば以下の方法により実施され得る。
＜１＞角膜内皮細胞の採取および試験管内での培養
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、本発明の培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０等を）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらに本発明の培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。培養容器（培養皿）にはその表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をＦＮＣ ｃｏａｔｉｎｇ ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。かかるコーティングと本発明の培養液とを併用することにより、角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。
角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５〜１０％のＣＯ２濃度の環境下で行われる。
＜２＞継代培養
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約１〜２×１０６個／ｍＬである。尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができる。
細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代時の希釈倍率は細胞の状態によっても異なるが、約１：２〜１：４、好ましくは約１：３である。継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７〜３０日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。本発明の培養正常化剤または培地において、細胞接着促進剤を用いれば、培養初期の細胞接着を亢進させることにより、培養期間の短縮が可能となる。
＜３＞角膜内皮細胞層の調製
細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約１，０００〜約４，０００細胞／ｍｍ２の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば３〜３０日間である。
以上のようにして培養を行うことにより、基材上に試験管内で培養した角膜内皮細胞層が形成された角膜内皮製剤が得られる。
本発明において、角膜内皮製剤は、角膜内皮細胞を維持するために、本発明の培養正常化剤またはそれを含む培地を含んでもよい。また、角膜内皮製剤は、移植に供されるまでに本発明の培養正常化剤またはそれを含む培地を含んでもよい。本発明は、角膜内皮製剤と本発明の培養正常化剤またはそれを含む培地との組合せも提供する。
本発明の製造方法により得られた角膜内皮製剤は、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィ、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害によって生じる水疱性角膜症の治療における移植片として用いることができる。このような水疱性角膜症、角膜内皮障害などの原因としては、手術のほかフックス角膜内皮ジストロフィ、偽落屑症候群、角膜内皮炎等を挙げることができる。
本発明の角膜内皮製剤の投与対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）があげられ、好ましくは霊長類（例えば、ヒト）である。
（角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防）
本発明は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬を提供する。本発明の培地または培養正常化剤は本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解され、例えば、（培養正常化剤）、（角膜内皮細胞を正常に培養するための培地）、（角膜内皮細胞を正常に培養する方法）に記載された事項を参酌することができる。また、医薬として使用される角膜内皮細胞は、本明細書において使用される任意の形態をとり得ることが理解され、例えば、（角膜内皮細胞および角膜内皮製剤）に記載された事項を参酌することができる。
１つの実施形態では、本発明の医薬は、霊長類の角膜内皮の処置または予防を目的とする。好ましくは、この処置または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
１つの実施形態では、本発明の医薬において使用される角膜内皮細胞は霊長類由来である。好ましくは、本発明の医薬において使用される角膜内皮細胞はヒト由来である。
１つの実施形態では、本発明の医薬が対象とする角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症、角膜内皮炎、角膜浮腫、角膜白斑等である。
１つの実施形態では、本発明の医薬は、シート状または懸濁物で提供される。
１つの実施形態では、本発明の医薬は、細胞接着促進剤をさらに含む。細胞接着促進剤は、角膜組織から分離された角膜内皮細胞または分離され継代した角膜内皮細胞に対して接着促進作用を奏する。この細胞接着促進剤は、医薬として提供される角膜内皮細胞と一緒にまたは別々に提供されることができる。具体的な実施形態では、本発明の医薬において使用される細胞接着促進剤としては、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を挙げることができる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができ、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などを挙げることができる。
本発明の医薬または方法の投与（移植）対象は、晴乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を用いる工程を包含する、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法を提供する。
別の局面において、本発明は、細胞接着促進剤を含む、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬を提供する。この局面では、細胞接着促進剤のもつ、角膜組織から分離された角膜内皮細胞または分離され継代した角膜内皮細胞に対して有する接着促進作用を利用する。この局面の１つの具体的な実施形態では、本発明の医薬において使用される細胞接着促進剤はＲｈｏキナーゼ阻害剤を挙げることができる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。かかる化合物は、それぞれ開示された文献に記載の方法により製造することができ、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジンまたはその塩（たとえば、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン））、（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサンカルボキサミドまたはその塩（たとえば、Ｙ−２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド２塩酸塩１水和物）など）などを挙げることができる。特に、霊長類モデルおよびヒト細胞を用いた症例で細胞接着促進剤を用いて良好な治療成績を上げたのは本発明が初めてである。
本発明の細胞接着促進剤を含む医薬は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞と共に用いられる。ここで、本発明の細胞接着促進剤を含む医薬は、この角膜内皮細胞と一緒に投与または移植されてもよく、別々に投与または移植されてもよい。
１つの具体的な実施形態では、本発明の細胞接着促進剤を含む医薬が標的とする角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症、角膜内皮炎、角膜浮腫、角膜白斑等である。
別の局面では、本発明は、細胞接着促進剤を処置または予防が必要な被験体に投与する工程を包含する、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法を提供する。
細胞接着促進剤を含む医薬についても、本発明の医薬または方法の投与（移植）対象は、晴乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
本発明の細胞接着促進剤を含む医薬または、本発明の方法を用いて生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬において使用される細胞接着促進剤またはＲｈｏキナーゼ阻害剤が使用される濃度は限定されないが、例えば、通常、約０．００００１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは、約０．００００１〜０．１ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０００１〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００１〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００２〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００３〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００４〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００５〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００６〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００７〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００８〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００９〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．０１〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．０３〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．０４〜０．０５ｗ／ｖ％、約０．００３〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００４〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００５〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００６〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００７〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００８〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００９〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．０１〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．０２〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．０３〜０．０４ｗ／ｖ％、約０．００３〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００４〜０．０３ｗ／ｖ％、約０００５〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００６〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００７〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００８〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００９〜０．０３ｗ／ｖ％、約００１〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．０２〜０．０３ｗ／ｖ％、約０．００３〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００４〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００５〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００６〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００７〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００８〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００９〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．０１〜０．０２ｗ／ｖ％、約０．００３〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００４〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００５〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００６〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００７〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００８〜０．０１ｗ／ｖ％、約０．００９〜０．０１ｗ／ｖ％である。投与量、投与回数は、症状、年齢、体重、投与形態により異なるが、通常成人に対し、例えば点眼剤として使用する場合には、有効成分を約０．０００１〜０．１ｗ／ｖ％、好ましくは約０．００３〜０．０３ｗ／ｖ％含有する製剤を、１日あたり１〜１０回、好ましくは１〜６回、より好ましくは１〜３回、１回当たり約０．０１〜０．１ｍＬ投与することができる。本発明の医薬を前房内に注入する場合には、上記濃度の１０分の１〜１０００分の１の濃度のものが使用され得る。当業者は疾患の状態によって、細胞接着促進剤の種類および濃度を適宜選択することができる。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に、本発明の角膜内皮細胞の細胞を正常に培養する例を記載する。実験動物の使用にあたっては、動物を用いる生物医学研究に関する原則（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ａｎｉｍａｌｓ）ならびに、動物の愛護および管理に関する法律、実験動物の飼養および保管等に関する基準に従った。また、本実験はＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って行った。組織の単離は、それぞれ、日精バイリス株式会社滋賀研究所（Ｓｈｉｇａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｉｓｓｅｉ Ｂｉｌｉｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（滋賀県大津市）（Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）の動物実験倫理委員会および株式会社イブバイオサイエンス（Ｅｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）（和歌山県橋本市）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）の動物実験委員会による承認を受けた。また、該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの治験審査委員会による承認を受けた。
（実験手法：サルの角膜組織および研究グレードのヒト角膜組織）
それぞれ、日精バイリス株式会社滋賀研究所および株式会社イブバイオサイエンスで飼われた４匹のカニクイザル（３〜５歳齢；ヒト年齢では５〜２０歳に等しいと推定される）からの８個の角膜を、サル角膜内皮細胞（ＭＣＥＣ）培養に使用した。１２個のヒトドナー角膜は、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭアイバンクから入手し、全ての角膜を、初代培養前に１４日未満の期間にわたり、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。
（統計解析）
２サンプルの比較の平均値における統計的有意差（Ｐ値）は、スチューデントのｔ検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±ＳＥを表す。
（比較例１）
本例では、従来法で培養したカニクイザルおよびヒトの角膜内皮細胞の様子を示す。以下にその詳細を示す。
（材料および方法）
・カニクイザル角膜内皮細胞（ＭＣＥＣ；入手先および培養方法）：ＭＣＥＣは、以前に記載された改良型プロトコールで培養した［Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８：４５１９−４５２６］、［Ｌｉ Ｗ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８：６１４−６２０］。簡単に述べると、別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、（Ｎｉｓｓｅｉ Ｂｉｌｉｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｈｔｓｕ，ＪａｐａｎおよびＫｅａｒｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）（方法は上述）、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、ディスパーゼあるいはコラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥ カタログ番号：１０ １０３ ５８６ ００１）を用いて処理後に初代培養を行った。代表的には、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３７℃にて２時間処理した。培地は１０％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）と２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）を添加したＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号１２３２０）を用いた。培養には、ＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ ＭＩＸ（登録商標）（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）でコーティングした６ウェルプレート等を用いた。次いで、ＭＣＥＣを５％ＣＯ２中３７℃の加湿雰囲気下で培養し、２日おきに培養培地を交換した。ＭＣＥＣが１０〜１４日でコンフルエントに達すると、これらを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中でリンスし、３７℃にて５分間０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理し、そして、１：２〜４の比で継代した。トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の選択的インヒビターであるＳＢ４３１５４２（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を、抗線維芽細胞様作用について調べた。
・ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ、入手先および培養方法）：ＨＣＥＣは、ＭＣＥＣについて用いたプロトコールの改良バージョンで培養した。簡単に述べると、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥ カタログ番号：１０ １０３ ５８６ ００１）を用いて基底膜よりはがして（代表的には、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃にて２時間処理した。）回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。具体的には、３７℃での消化後、個々の角膜から得られたＨＣＥＣを培養培地中に再懸濁させ、ＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘ（登録商標）でコーティングした１２ウェルプレートの１ウェルにプレーティングした。培養培地は、一部の改変を加えた公開されたプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、８％ ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ 上皮増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｍｇ／Ｌ 塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０８％ コンドロイチン硫酸（和光純薬工業株式会社、大阪市）および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する基本培養培地を準備し、次いで、不活性化３Ｔ３線維芽細胞の培養後に馴化培地を回収した。３Ｔ３線維芽細胞の不活性化は、以前に記載されたとおりに実施した。簡単に述べると、コンフルエントな３Ｔ３線維芽細胞を４μｇ／ｍＬ マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（協和発酵キリン株式会社、東京都）とともに、５％ＣＯ２下で３７℃にて２時間インキュベートし、次いでトリプシン処理し、そして、２×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプラスチック皿にプレーティングした。ＨＣＥＣは、５％ＣＯ２中３７℃にて加湿雰囲気下で培養し、２日おきに培養培地を交換した。ＨＣＥＣが１４〜２８日でコンフルエントに達すると、これらを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有ＰＢＳ中でリンスし、３７℃にて５分間０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、そして、１：２の比で継代した。ＳＢ４３１５４２（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−βに対する中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｓｍａｄ３インヒビター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗線維芽細胞様作用について調べた。
・染色等の細胞観察方法（組織学的試験）：細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養したＭＣＥＣまたはＨＣＥＣをＬａｂ−ＴｅｋＴＭ Ｃｈａｍｂｅｒ ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れ、４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。具体的には、Ｌａｂ−ＴｅｋＴＭＣｈａｍｂｅｒ ＳｌｉｄｅｓＴＭ（ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上の培養ＭＣＥＣまたはＨＣＥＣを室温で１０分間４％ホルムアルデヒド中で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。ＣＥＣの表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ポンプ機能に関連するタンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、フィブロネクチン（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）およびアクチンの免疫組織化学分析を行った。ＣＥＣの機能に関連するマーカーとしてＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを使用し、線維芽細胞様の変化を評価するためにフィブロネクチンおよび１型コラーゲンを使用し、そして、細胞の形態を評価するためにアクチンの染色を使用した。ＺＯ−１、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、１型コラーゲンおよびフィブロネクチンの染色は、それぞれ、ＺＯ−１ポリクローナル抗体、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅモノクローナル抗体、およびフィブロネクチンモノクローナル抗体の１：２００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識、または、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：２０００希釈を使用した。アクチンの染色は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ファロイジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：４００希釈を用いて実施した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
（結果）
図１にカニクイザルおよびヒトにおける従来の細胞培養法での培養結果を示す。培養結果から明らかなように、サル、ヒトの角膜内皮において通常の培養法では形質転換し、すなわち、いずれの細胞でも線維化が生じており、多角形の一層の細胞である正常細胞とは異なった形態であり移植には適さない状態となっていることが分かる。
（比較例２）
本例では、従来技術で培養した場合に、正常機能を消失することを示す実験を行った。本例では、サル角膜内皮が機能関連タンパク質の発現を消失するかどうかを、免疫染色およびウェスタンブロット法ならびにリアルタイムＰＣＲ法にて実証した。以下にその詳細を示す。
（材料および方法）
以下に使用した材料のうち比較例１と同じものは比較例１と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞：比較例１と同じである。
・ヒト角膜内皮細胞：比較例１と同じである。
・Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ カタログ番号：０５−３６９）のものを用いた。
・ＺＯ−１に対する抗体：マウスＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３３９１００）、ウサギＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製（ＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ カタログ番号：６１−７３００）のものを用いた。・フィブロネクチンに対する抗体：：ＢＤＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社製（カタログ番号：６１００７７）
・コラーゲン１型に対する抗体：（ＡＢＣＡＭ社製）（カタログ番号：ａｂ２９２）
・ＧＡＰＤＨに対する抗体：ＡＢＣＡＭ社製（カタログ番号：ａｂ３６８４０）のものを用いた。
・二次抗体（ＨＰＲ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（カタログ番号：７０７４）
・二次抗体（抗ウサギＩｇＧ二次抗体）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（カタログ番号：７０７６）
・細胞画分抽出・調製法：コンフルエントに達した細胞をＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ、ニッスイ、カタログ番号：５９１３）で３回洗浄後、ＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ナカライテスク、カタログ番号：２３６４０−９４）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク、カタログ番号：１０７１２−１２）、０．１％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム、ナカライテスク、カタログ番号：３１６０７−６５））で溶解した。前述のＲＩＰＡバッファー中には、ホスファターゼインヒビターカクテル２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびプロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク株式会社、京都市）を添加した。得られた細胞溶解液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を回収し、タンパク質をＢＣＡ ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（ＰＩＥＲＣＥ社製（カタログ番号：２３２２７））により定量した。５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製（カタログ番号：２１４１８−４２））を含む１００μｌの溶解バッファー（レムリサンプルバッファー）で溶解した。
・免疫染色：コンフルエントに達した細胞をＰＢＳ（ニッスイ、カタログ番号：５９１３）洗浄後、氷冷したエタノール（ナカライテスク、カタログ番号：１４７１３−９５）と酢酸（ＷＡＫＯ カタログ番号：０１７−００２５６）（９５：５）にて１０分間固定した。
０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と１０％ウシ胎仔血清を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭＮａＣｌ）で１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。ウサギ抗ヒトＺＯ−１抗体（１：２００）、マウス抗ヒトＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体（１：２００）を一次抗体として使用し、室温にて１時間反応させた。フィブロネクチンに対する抗体、コラーゲン１型に対する抗体についても、同様に使用した。希釈率は、１：２００または１：１０００を適宜使用した。
次いでＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５９４（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社（カタログ番号：Ａ２１２０３））とＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社（カタログ番号：Ａ２１２０６））で室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＷＩＴＨ ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社（カタログ番号：９４０１０））とともにスライドに封入し、共焦点顕微鏡（ライカ社製）で観察した。
・ウェスタンブロット法：ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ社製（カタログ番号：ＥＨ−２２２２））に転写した。５％無脂肪乾燥乳（５％ＮＯＮ ＦＡＴ ＤＲＹ ＭＩＬＫ、ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社 カタログ番号：９９９９）を補った０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）を含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ）（ＴＢＳ−Ｔ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、ＺＯ−１抗体とＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体を５％無脂肪乾燥乳を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。ＴＢＳーＴで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社（カタログ番号：７０７４Ｐ２））とインキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ ヘルスケア・ジャパン社（カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ））で発光させたバンドを検出した。フィブロネクチンに対する抗体、コラーゲン１型に対する抗体についても、同様に使用した。次いで、以下の一次抗体：Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＺＯ−１、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、フィブロネクチンおよびＳｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、リン酸化Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＲＫ１／２（ＢＤ）、リン酸化ＥＲＫ１／２（ＢＤ）、ｐ３８ＭＡＰＫ（ＢＤ）、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ＢＤ）、ＪＮＫ（ＢＤ）またはリン酸化ＪＮＫ（ＢＤ）（１：１０００希釈）、および、ＨＲＰ標識抗ウサギまたは抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１：５０００希釈）とともにインキュベーションを行った。メンブレンを、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって感光させ、次いで、ＬＡＳ４０００Ｓ画像化システム（富士フィルム株式会社、東京都）を用いて調べた。
・リアルタイムＰＣＲ（半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））：また、以下の方法にてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１、ＧＡＰＤＨに対するＰＣＲ法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから購入し、脱塩処理したものを用いた。自然に線維様形態に変化した角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞を試料とし、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１のｍＲＮＡ量を半定量的ＰＣＲ法により調べた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはＲＮＥａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号：７４１０６）を用いた。抽出したＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社（カタログ番号：ＴＲＴ−１０１））により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社、カタログ番号：ＲＲ００１Ａ）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１を増幅した。同量のｃＤＮＡを、ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、下記のプライマーペアによって増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプライマーを用いた。フィブロネクチンに対する抗体、コラーゲン１型、４型、インテグリンα５、インテグリンベータ１に対するＰＣＲ反応についても、同様に下記プライマーを使用した。
増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲル（ナカライテスク、カタログ番号：０１１４９−７６）で電気泳動し、エチジウムブロマイド（ナカライテスク、カタログ番号：１４６０３−５１）での染色により検出した。
・定量ＰＣＲは、以下のＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プライマーを用いて実施した。コラーゲン１型：Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１；フィブロネクチン：Ｈｓ０１５４９９７６＿ｍ１；ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ００２６６７０５＿ｇ１。ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）リアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。ＧＡＰＤＨは内部標準として用いた。
（結果）
図２で示されるように、従来技術で培養した場合に、線維芽細胞様に形態変化したサル角膜内皮細胞においては正常機能を消失することが示された。正常の形態に培養できたサル角膜内皮細胞と比較すると、線維芽細胞様（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ）に形態変化することで、サル角膜内皮が機能関連マーカーの発現を消失することを免疫染色、ウェスタンブロット法およびリアルタイムＰＣＲ法にて示された。
より詳細に述べると、細胞培養中の霊長類ＣＥＣの２つの異なる表現型が示された。最も興味深いことに、培養中の霊長類ＣＥＣは、細胞の形態および特徴的な接触阻害型の表現型によって決定した場合に、２つの異なる表現型を示した。およそ６０％の細胞は、特徴的な多角形の細胞形態と接触阻害型の表現型を維持しており、これらの細胞を正常表現型と称した。他方で、４０％の細胞は多層を持つ線維芽細胞様の形状を示し、これらの細胞を、線維芽細胞様表現型と称した（図１）。次に、これらの２つの表現型を、内皮細胞性の特徴について検討した；原形質膜におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の染色パターンは、正常表現型においてよく保存されていたが、線維芽細胞様表現型は、原形質膜におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の特徴的な染色プロフィールを完全に喪失した（図２左）。２つの機能的タンパク質の発現は、タンパク質レベル（図２右上）およびｍＲＮＡレベル（図２右下）の両方で、正常表現型において、線維芽細胞様表現型よりもかなり多く見られた。
（細胞外マトリクスの挙動）
さらに、線維芽霊長類ＣＥＣは、細胞外マトリックス等の状況がどうなっているかを調べた。その結果を図２Ａに示す。
図２Ａは、線維芽霊長類ＣＥＣは、異常な細胞外マトリックスを生成することを示し、すなわち、従来技術で培養した場合に、正常機能を消失することを示す。（Ａ）フィブロネクチンおよびコラーゲン１型の線維芽細胞表現型および正常な細胞の表現型における発現を示す。上段はフィブロネクチン、下段はコラーゲン１型を示す。左側は正常な細胞の表現型を示し、右側は、線維芽細胞表現型を示す。線維芽細胞表現型は、フィブロネクチンおよびコラーゲン１型などの過剰の細胞外マトリクスを示した。他方、正常な細胞の表現型は、染色能を完全に喪失した。（Ｂ）フィブロネクチンの線維芽細胞表現型および正常な細胞の表現型におけるタンパク質の発現のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。フィブロネクチンのタンパク質発現レベルは、正常の表現型よりも線維芽細胞の表現型において強くアップレギュレートされていた。（Ｃ）コラーゲン１型、４型、８型フィブロネクチン、インテグリンα５、およびインテグリンβ１（上から順に列挙した。）の線維芽細胞表現型（右）および正常な細胞の表現型（左）における半定量ＰＣＲの結果を示す。ＧＡＰＤＨはコントロールである。半定量ＰＣＲ分析によって、１型コラーゲン転写物（α１（Ｉ）ｍＲＮＡ）は線維芽細胞表現型において豊富に発現されていたが、他方、正常な表現型においては、α１（Ｉ）ｍＲＮＡの発現は減少していた。基底膜コラーゲン表現型である、α１（ＩＶ）ｍＲＮＡおよびα１（ＶＩＩＩ）ｍＲＮＡは、正常表現型および線維芽細胞表現型の表現型の両方で発現されていたが、正常表現型では発現の程度は線維芽細胞表現型よりも少なかった。フィブロネクチンおよびインテグリンα５のｍＲＮＡは線維芽細胞表現型で観察されたが、正常表現型ではこれらの２種のｍＲＮＡは発現されなかった。β１インテグリンのｍＲＮＡは、両方の表現型で同様のレベルで発現がみられた。
真の線維性細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質の比較により、線維芽細胞表現型のものは、フィブロネクチンの線維性ＥＣＭ染色パターンを示したが、他方、正常な表現型は、フィブロネクチンの染色能を完全に失っていた（図２ＡのＡ）。フィブロネクチンのタンパク質レベルは、正常表現型よりも線維芽細胞表現型においてより強くアップレギュレートされていた（図２ＡのＢ）。線維芽細胞表現型によって産生されるコラーゲン１型は、二重の部位での発現を示し、ＥＣＭおよび細胞質の両方で見られた。興味深いことに、コラーゲン１型の細胞質の部位は、ゴルジ複合体にあるようであり、その細胞内局在は、分泌に必須である。これらの知見は、既知のデータ（Ｋｏ ＭＫ，Ｋａｙ ＥＰ．Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｐｒｏｌｙｌ ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００１；２６４：３６３−７１）に類似する。他方、正常表現型におけるコラーゲン１型染色は、明確には観察されなかった（図２Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて主要なＥＣＭタンパク質の発現を測定した。コラーゲン１型転写物（α１（Ｉ）ｍＲＮＡ）は、線維芽細胞表現型において豊富に発現されていることが見出された。他方、α１（Ｉ）ｍＲＮＡの発現は、正常な表現型において無視しうるものであった（図２Ｃ）。コラーゲンＩ型の転写物とは異なり、基底膜コラーゲン表現型であるα１（ＩＶ）ｍＲＮＡおよびαＩ（ＶＩＩＩ）のｍＲＮＡは、正常表現型および線維芽細胞表現型の両方において発現していたが、その発現の程度は、正常表現型において、線維芽細胞表現型に比べて少なかった。フィブロネクチンおよびインテグリンα５の発現は、線維芽細胞表現型において観察された。反対に、正常表現型では、これらの２つの転写物は、発現していなかった（図２ＡのＣ）。他方、β１インテグリンのｍＲＮＡは、正常表現型および線維芽細胞表現型の両方において同様のレベルで発現していた（図２ＡのＣ）。
（比較例３：従来法の別法での正常機能喪失）
本比較例では、従来の培養法では角膜内皮細胞の線維化が生じることを確認した（図３）。３Ｔ３フィーダー細胞由来の馴化培地は線維芽変化（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｈａｎｇｅ）を抑制する。しかし３Ｔ３フィーダー細胞由来の馴化培地のみでは継代培養を行うとやはり形質転換にいたることを示す（図３右）。
（材料および方法）
使用した材料のうち比較例１および２と同じものは比較例１および２と同様に入手し培養等を行った。
・コントロール：コントロールのヒト角膜内皮細胞の培養に用いた培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）である。
・３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化培地：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を０．１％ゼラチンコート（ＳＩＧＭＡ社、カタログ番号：Ｇ１８９０−５００Ｇ）した１５０ｍｍ ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ、カタログ番号：３０２５）に１０％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）／ＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）で播種し、サブコンフルエントまで培養しておく。続いて終濃度０．０４ｍｇ／ｍＬ マイトマイシンＣ溶液（協和発酵キリン、カタログ番号 ８７４２３１）にて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間インキュベートする。１０％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）／ＤＭＥＭ培地に置換して一晩培養する。このように作成したＮＩＨ３Ｔ３細胞にＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１５７１０−０６４）＋ ５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えて１晩培養してヒト角膜内皮培養用馴化培地とする。
・培養方法：比較例１と同様の方法で、それぞれの培地を用いて培養した。
・染色等の細胞観察方法：位相差顕微鏡にて細胞の形態を観察した。
（結果）
図３に示すように、従来法の別法として３Ｔ３フィーダー細胞を用いた馴化培地での培養でも、線維化が生じ移植には適しない状態になってしまったことが示された。
比較例１および３での結果は、非特許文献７で示されたように、従来の角膜内皮細胞培養培地では、継代すると正常な状態を維持しつつ増殖させることができないことを確認するものである。
（実施例１）
本実施例では、形質転換が線維芽細胞様の形態であることに着目して、一般的な細胞種で知られている線維化誘導の際に活性化される経路の活性化についてウエスタンブロット法にて検討した。
（材料および方法）
使用した材料のうち比較例１〜３と同じものは比較例１〜３と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞：別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、（Ｎｉｓｓｅｉ Ｂｉｌｉｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎおよび Ｋｅａｒｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、ディスパーゼあるいはコラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地は１０％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）と２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）を添加したＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）を用いた。この際、サル角膜内皮細胞は図１に示したように正常の形態に培養されることもあるが、同様の培養法、長期培養、継代培養により線維芽細胞様に形態変化することが多い。そこで、正常の形態に培養できた細胞と線維芽細胞様に形態変化した細胞を回収してウエスタンブロット法に用いた。
・ｐＳｍａｄ２に対する抗体：ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社から入手したもの（カタログ番号：３１０８Ｐ）を用いた。
・ｐＳｍａｄに対する抗体：ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社から入手したもの（カタログ番号：５３３９Ｐ）を用いた。
・ｐｐ３８に対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（ｐ３８ａ／ＳＡＰＫ２ａと同じ。カタログ番号：６１２１６８）を用いた。
・ｐ３８に対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（カタログ番号：６１２２８０）を用いた。
・ｐＥＲＫ１／２に対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（カタログ番号：６１２３５８）を用いた。
・ＥＲＫ１／２に対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（カタログ番号：６１００３０）を用いた。
・ｐＪＮＫに対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（カタログ番号：６１０６２７）を用いた。
・ＪＮＫに対する抗体：ＢＤ ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社から入手したもの（カタログ番号：６１２５４０）を用いた。
（実験方法）
・細胞画分抽出・調製法：コンフルエントに達した細胞をＰＢＳで３回洗浄後、ＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ（ニッスイ、カタログ番号：５９１３）、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ
Ｐ−４０（ナカライテスク、カタログ番号：２３６４０−９４）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク、カタログ番号：１０７１２−１２）、０．１％ ＳＤＳ（ナカライテスク、カタログ番号：３１６０７−６５））で溶解した。得られた細胞溶解液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を回収し、タンパク質をＢＣＡ ＰＲＯＴＥＩＮ ＡＳＳＡＹ ＫＩＴ（ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号：２３２２７）により定量した。５ｍＭ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製、カタログ番号：２１４１８−４２）を含む１００μｌの溶解バッファー（レムリサンプルバッファー）で溶解した。
・ウェスタンブロット法：ＲＩＰＡバッファーで抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ社製、カタログ番号：ＥＨ−２２２２）に転写した。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ナカライテスク、カタログ番号：２８３５３−８５）（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳（ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭＮａＣｌ）と、ブロットした膜を１時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、Ｓｍａｄ２抗体、ｐＳｍａｄ２抗体、ｐ３８抗体、ｐｐ３８抗体、ＥＲＫ抗体、ｐＥＲＫ抗体、ＪＮＫ抗体、およびｐＪＮＫ抗体を５％ＮＯＮ ＦＡＴ ＤＲＹ ＭＩＬＫ（ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：９９９９）を補ったＴＢＳ−Ｔにて１０００倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、マウス−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社、カタログ番号：７０７４Ｐ２）とウサギ−ＩｇＧ抗体ＨＲＰ複合体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：ＮＡ９３４）インキュベートし、洗浄後、ＥＣＬ−ＡＤＶＡＶＣＥ（ＧＥ ヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号：ＲＰＮ２１３５Ｖ）で発光させたバンドを検出した。
（結果）
図４に、線維化の形質転換の原因となりうる主たる経路の活性をサル角膜内皮を用いてウェスタンブロットで検討した結果を示す。線維芽細胞においてＳｍａｄ２のリン酸化（ＴＧＦ−β経路の活性化）、ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化、ＪＮＫ経路の活性化が認められた。一方で、ＥＲＫ１／２のリン酸化は抑制されていた。Ｓｍａｄ２、ｐ３８、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫは報告によればすべてＥＭＴ経路に関与している［Ｃｈｅｎ ＫＨ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４０：２５１３−２５１９］、［Ｋｉｍ ＴＹ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４２：３１４２−３１４９］、［Ｎａｕｍａｎｎ ＧＯ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １０７：１１１１−１１２４］、［Ｐａｒｓｏｎｓ ＣＪ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２２ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ７９−８４］、［Ｍａ ＦＹ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｓｃｈｏｌ Ｅｄ）１：１７１−１８７］ので、本発明者らは、Ｓｍａｄ２およびＭＡＰＫが、上皮細胞において観察されるＥＭＴと同様の内皮間葉転換に関与するかどうかを検討した。Ｓｍａｄ２のリン酸化は、正常表現型のものと比較した場合に、線維芽細胞様表現型において大いに促進されることが分かった（図４）。ｐ３８およびＥＲＫ１／２のリン酸化は、線維芽細胞様表現型において大いに増強されたが、ＪＮＫの活性化は無視しうるものであった。ただし、ＥＲＫのリン酸化は細胞の線維化による変化のみではなく、細胞増殖による影響があるために、細胞の増殖の状態によっては異なる結果となることがありうることを確認している。これらの知見は、ＴＧＦ−βシグナル伝達が、ＣＥＣの線維芽細胞様転換にとって重要な役割を発揮し得ることを示す。
（実施例２：角膜内皮の形質転換の抑制例）
本例では、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することでサル角膜内皮の形質転換を抑制することができた例を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち比較例１〜３および実施例１と同じものは比較例１〜３および実施例１と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞：別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、（Ｎｉｓｓｅｉ Ｂｉｌｉｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎおよび Ｋｅａｒｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。この際同一角膜を２分して、サル角膜内皮培養用基本培地（１０％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）と２ｎｇ／ｍｌ 塩基性ＦＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）を添加したＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０））および基本培地に１μｍｏｌ／ｌＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社、カタログ番号：１６１４）を添加したものを用いた。
（結果）
図５に示すように、位相差像は、ＳＢ４３１５４２の存在下で培養した霊長類ＣＥＣが真の多角形細胞形状と接触阻害型の単層を示す一方で、コントロールのＣＥＣは、線維芽細胞様の形態を示すことを実証した（図４Ａ）。コントロールの基本培地で培養したものは線維芽細胞様に形質転換して重層化を認める一方で、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで多角形の大小不動の小さい一層の生体同様の形態を示し、サル角膜内皮の形質転換を抑制することができた。
（実施例３：角膜内皮の正常機能の維持の実証）
本実施例では、本発明により、培養の正常化の実証として、角膜内皮の機能関連タンパク質が維持されることを実証した。以下に詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。特に実施例２と同様のものを用いた。
・ＳＢ４３１５４２：ＴＯＣＲＩＳ社から得た（カタログ番号：１６１４）。
・Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製のもの（カタログ番号：０５−３６９）を用いた。
・ＺＯ−１に対する抗体：マウスＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（カタログ番号：３３９１００）、ウサギＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製（カタログ番号：６１−７３００）のものを用いた。
・ＧＡＰＤＨに対する抗体：ＡＢＣＡＭ社のもの（カタログ番号：ａｂ３６８４０）を用いた。
・免疫染色等：実施例２と同様に培養した細胞を固定してＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１に対して免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて撮影した。
・ウエスタンブロット法：実施例１と同様にＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１、ＧＡＰＤＨに対するウエスタンブロット法を行った。
・リアルタイムＰＣＲ法：また、以下の方法にてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１、ＧＡＰＤＨに対するＰＣＲ法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮから購入し、脱塩処理したものを用いた。自然に線維様形態に変化した角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞を試料とし、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１のｍＲＮＡ量を半定量的ＰＣＲ法により調べた。細胞からの総ＲＮＡの抽出にはＲＮＥａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログ番号：７４１０６）を用いた。抽出したＲＮＡはＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社、カタログ番号：ＴＲＴ−１０１）により逆転写反応（４２℃、６０分間）を行い、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社、カタログ番号：ＲＲ００１Ａ）によりＧＡＰＤＨを内部標準としてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１を増幅した。ＰＣＲ反応には下記に示すプライマーを用いた。
増幅されたＤＮＡ断片は１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した。
（結果）
図６に示すように、培養により線維芽細胞様に形質転換したサル角膜内皮細胞においては機能関連マーカーであるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＺＯ−１の発現が免疫染色、ウェスタンブロット、ＰＣＲにて示された。一方で、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することでサル角膜内皮の機能関連タンパク質が維持されることが示された。すなわち、ＳＢ４３１５４２処理したＣＥＣがＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の特徴的な原形質膜染色を示した一方で、コントロールのＣＥＣはその染色を失っており、ＳＢ４３１５４２処理した細胞では内皮機能が維持されることが示唆された（図６左）。また、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現は、タンパク質（図６右上）およびｍＲＮＡレベル（図６右下）の両方で、ＳＢ４３１５４２処理した線維芽細胞様表現型において強力に亢進された。これらのデータは、ＴＧＦ−βが霊長類ＣＥＣ培養において観察された内皮間葉転換の直接媒介因子であり得ることをさらに確認した。
（実施例４：ＴＧＦ−βの正常化喪失能）
本実施例では、ＴＧＦ−βシグナルがサル角膜内皮の形質転換に関与することを確認するために、ＴＧＦ−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することを示した（免疫染色）。また、ウェスタンブロットにより、ＴＧＦ−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することを示した。以下に詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・ＴＧＦ−β：Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のもの（カタログ番号：２４０−Ｂ）を用いた。
・Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに対する抗体：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製のもの（カタログ番号：０５−３６９）を用いた。
・ＺＯ−１に対する抗体：マウスＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製（カタログ番号：３３９１００）、ウサギＺＹＭＥＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製（カタログ番号：６１−７３００）のものを用いた。
・ＧＡＰＤＨに対する抗体：ＡＢＣＡＭ社のもの（カタログ番号：ａｂ３６８４０）を用いた。
・ｐＳｍａｄ２に対する抗体：ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社のもの（カタログ番号：３１０８Ｐ）を用いた。
・ｐＳｍａｄに対する抗体：ＣＥＬＬ ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ社のもの（カタログ番号：５３３９Ｐ）を用いた。
・培養方法：サル角膜内皮細胞をサブコンフルエントまで培養し、培地中に終濃度０、１、１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＧＦ−β１を添加し、３７℃で形態に変化が現れるまで培養した。
・染色方法：上記実施例のとおりである。
・細胞画分抽出法：上記実施例のとおりである。
・ウェスタンブロット法：上記実施例のとおりである。
（結果）
図７に示すように、ＴＧＦ−βシグナルがサル角膜内皮の形質転換に関与することを確認するために免疫染色を行ったところ、ＴＧＦ−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することが示された。すなわち、図７に示すように、正常表現型が、外来性ＴＧＦ−βに曝露された際に、線維芽細胞様の細胞へと転換することが示された。正常表現型の原形質膜におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の染色パターンは、ＴＧＦ−βに暴露されることにより完全に消失した（図７中列、右列）。
また、図８に示すように、ＴＧＦ−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することがウェスタンブロットにおいても示された。また、Ｓｍａｄ２のリン酸化がＴＧＦ−βの添加により誘導されており、ＴＧＦ−βの添加により下流シグナルの活性化が生じていることが確認できる。この結果から、ＴＧＦ−βとその下流シグナルの活性化が正常機能の喪失の直接的な原因であり、その経路を阻害することによって正常化を維持することができることが理解される。すなわち、増殖因子もまた、タンパク質レベルにおいて、これら２つのタンパク質の発現を、濃度依存性の様式で著しく低減させたが（図８左欄）、Ｓｍａｄ２のリン酸化は、濃度依存性の様式で大きく増大した（図８右欄）。これらのデータは、霊長類ＣＥＣの正常表現型でさえ、ＴＧＦ−β刺激に応答して線維芽細胞様表現型を獲得する傾向にあることを示す。
（実施例５：ヒト細胞での実証）
本実施例では、ヒト角膜内皮においても、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで形質転換を抑制し、正常な内皮を培養することを確認した。以下に詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。回収したヒト角膜内皮細胞は二分して、一方は基本培地で培養してコントロールとして、他方は基本培地に最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社、カタログ番号：１６１４）を添加して培養した。
・酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：ＨＣＥＣの培養上清中の１型コラーゲンを、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ Ａｌｐｈａ ２（ＣＯＬ１ａ２）（Ｕｓｃｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）を製造元の説明書に従って使用して測定した。ＳＢ４３１５４２と共に、または、ＳＢ４３１５４２なしで培養したＨＣＥＣ由来の培養上清を各群（ｎ＝５）について使用した。
（結果）
図９に示すように、ＳＢ４３１５４２を含まない基本培地で培養すると線維芽細胞様に形質転換して、重層化するのに対して、ＳＢ４３１５４２を培地に添加したものでは多角形の大小不動の少ない一層の細胞が培養される。このことより、サルのみならずヒト角膜内皮においても、ＴＧＦ−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで形質転換を抑制し、正常な内皮を培養することが確認された。すなわち、霊長類ＣＥＣにおいて観察された興味深い知見から、ＨＣＥＣが、内皮間葉転換に至る同様の望ましくない細胞の不可避の変化に供されたかどうかをさらに検討した。最も興味深いことに、培養ＨＣＥＣは、特徴的な接触阻害型の単層構造と、多角形表現型を失い、そして、霊長類ＣＥＣのような線維芽細胞様の細胞形態を獲得した（図９）。
（ＳＢ４３１５４２のさらなる解析）
次に、本発明者らは、ＳＢ４３１５４２が内皮細胞の機能を維持することができるかどうか試験した。ここでは、ＳＢ４３１５４２が、ＨＣＥＣの機能を維持し、ＨＣＥＣの線維芽細胞様の変化を抑制することを種々の実験を用いて実証した。結果を図９Ａに示す。
図９ＡのＡおよびＢに示されるように、ＳＢ４３１５４２によるＴＧＦレセプターシグナル伝達をブロックすることによって、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が細胞膜での細胞内局在が可能になり、それらのタンパク質発現の維持が可能になった。スケールバーは１００μｍを示す。図９ＡのＣに示されるように、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＳＢ４３１５４２が、コラーゲン１型の細胞上清への分泌を顕著にダウンレギュレートしたことをが示された。＊＊Ｐ＜０．０５。図９ＡのＤおよびＥに示されるように、ＳＢ４３１５４２がコラーゲン１型およびフィブロネクチンの発現をｍＲＮＡレベルで有意に減少させることが示された。
以上のように、図９ＡのＡおよびＢに示す知見により、ＴＧＦレセプターシグナル伝達のブロックによって、細胞膜（原形質膜）におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の細胞内局在が可能になり、そのタンパク質の発現の維持が可能になったことが実証された。非常に重要なことに、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＳＢ４３１５４２は、コラーゲン１型の培養上清への分泌を顕著にダウンレギュレートしていたことが明らかになった（図９ＡのＣ）。また、ＳＢ４３１５４２は、ｍＲＮＡレベルでコラーゲンＩ型およびフィブロネクチンの発現を顕著に減少させた（図９ＡのＤおよびＥ）。
（実施例６：別法での角膜内皮の培養正常化例）
本実施例では、上述の実施例で用いたＳＢ４３１５４２以外の方法としてＢＭＰ−７を用いてもＴＧＦ−βシグナルを拮抗させヒト角膜内皮の形質転換を抑制することができることを実証した。以下にその詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・ＢＭＰ−７：Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のもの（カタログ番号：３５４−ＢＰ）を用いた。
・ファロイジン：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：Ａ１２３７９）を用いた。
・培養方法：図３と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を馴化培地にて培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、同様の馴化培地にＢＭＰ−７（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養したものと、コントロールとして同様の馴化培地にて培養したものを比較した。
・位相差顕微鏡およびファロイジンによる細胞骨格の染色による形態観察において、コントールでは線維芽細胞様に形質転換して重層化する一方で、ＢＭＰ−７添加培地では一層の多角形細胞の形態を維持できた。
（結果）
図１０に示すように、ＳＢ４３１５４２以外の方法としてＢＭＰ−７を用いてもＴＧＦ−βシグナルを拮抗させサル角膜内皮の形質転換を抑制することができた。ＢＭＰ−７はＳＢ４３１５４２とは他の詳細な伝達経路は異なるもののＴＧＦ−βシグナルに関連する因子としては共通することが知られている。すなわち、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＡＬＫ４，５または７を経由するＳｍａｄ２／３系と、ＡＬＫ１，２，３または６を経由するＳｍａｄ１／５／８系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている。したがって、実質的にＴＧＦ−βシグナル全般を抑制することにより、角膜内皮の形質転換を抑制することができることが理解される。理論に束縛されることを望まないが、Ｓｍａｄ２／３（ＡＬＫ４、５および７に関連する）を介して効果を奏するＳＢ４３１５４２、Ｓｍａｄ１／５／８（ＡＬＫ１、２、３および６に関連する）を介して効果を奏するＢＭＰ−７の両方で正常化が観察されていることから、これらのいずれの経路のＴＧＦ−βシグナル阻害剤であっても、本発明の効果を達成することができると理解される。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＡＬＫ４／５／７を経由するＳｍａｄ２／３系と、ＡＬＫ１／２／３／６を経由するＳｍａｄ１／５／８系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている（Ｊ．Ｍａｓｓａｇｕ’ｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：７５３−９１；Ｖｉｌａｒ ＪＭＧ，Ｊａｎｓｅｎ Ｒ，Ｓａｎｄｅｒ Ｃ（２００６）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ２（１）：ｅ３；Ｌｅａｓｋ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｄ．Ｊ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８，８１６−８２７（２００４）；Ｃｏｅｒｔ Ｍａｒｇａｄａｎｔ ＆ Ａｒｎｏｕｄ Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１０）１１，９７−１０５；Ｊｏｅｌ Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０；１５２：１５９−１６６．）。したがって、２種類の代表的なＴＧＦ−βシグナル阻害剤のいずれによっても培養正常化が達成し得たことから、これらの結果から、Ｓｍａｄ経路を問わず、どのようなＴＧＦ−βシグナル阻害剤であっても、培養正常化剤として機能しうることが理解される。
（ＢＭＰ−７の濃度依存性の確認）
次に、３種類の濃度を用いて、ＢＭＰ７がＨＣＥＣ線維芽細胞様への変化を抑制し、その機能を維持することを示した。ＢＭＰ−７はＭＥＴを促進し、ＴＧＦ−β媒介性の上皮間葉転換を特異的に阻害する。したがって、この分子は、ＥＭＴプロセスをアンタゴナイズするために使用されている［ＺｅｉｓｂｅｒｇＭ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：９６４−９６８］、［Ｓｉｍｉｃ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２００７）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ８：３２７−３３１］、［ＢｕｉｊｓＪＴ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７１：１０４７−１０５７］、［Ｚｅｉｓｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ ２８２：２３３３７−２３３４７］。それゆえ、本発明者らは、ＢＭＰ−７がＨＣＥＣの不可避の変化をアンタゴナイズできたかどうかを検討した。線維芽細胞様ＨＣＥＣを、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のＢＭＰ−７で処理した。
結果を図１０Ａに示す。図１０ＡのＡに示されるように、線維芽細胞の表現型の細長い細胞形は、濃度依存性の様式でＢＭＰ−７の存在下で応答して多角形細胞形態に変換された。スケールバーは１００μｍである。図１０ＡのＢに示されるように、ＢＭＰ−７は、正常なＣＥＣで観察されたもの［ＢａｒｒｙＰＡ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３６：１１１５−１１２４］と同様に、通常の六角形の細胞形態を可能にし、アクチンの細胞表層における細胞骨格分布を可能にした。スケールバーは１００μｍである。図１０ＡのＣおよびＤに示されるように、ＢＭＰ−７は、細胞膜（原形質膜）におけるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の細胞内局在を維持した。スケールバーは１００μｍである。図１０ＡのＥおよびＦに示されるように、ＢＭＰ−７は、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度において、ＣＥＣを、機能関連マーカーの陽性発現をともなう、多角形の接触阻害型表現型に維持することができた。なお、コントロールは無添加である。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ陽性細胞およびＺＯ−１陽性細胞の両方とも、ＢＭＰ−７で処理した場合に、コントロールに比べて割合が有意に増加していた。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５。
ＢＭＰ−７を用いて繊維芽細胞様への変化を抑制し、内皮細胞機能を維持することが証明された。
本発明者らは、骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）がＨＣＥＣの先行変化を阻害することができるかどうかを調べた。線維芽細胞様ＨＣＥＣをＢＭＰ−７で１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で処理した。重要なことに、線維芽細胞様の表現型の細長い細胞形状は、濃度依存的にＢＭＰ−７の存在下に応答して、多角形細胞形態へと変換した（図１０ＡのＡ）。ＢＭＰ−７によって、六角形の細胞形態が可能となり、アクチンの細胞表層への細胞骨格分布の維持が可能になった（図１０ＡのＢ）。これは、正常のＣＥＣにおいて観察されるのと同様の状態である（Ｂａｒｒｙ ＰＡ，Ｐｅｔｒｏｌｌ ＷＭ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＰＭ，Ｃａｖａｎａｇｈ ＨＤ，Ｊｅｓｔｅｒ ＪＶ．Ｔｈｅ ｓｐａｔｉａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５；３６：１１１５−２４）。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ陽性細胞（図１０ＡのＣ）およびＺＯ−１陽性細胞（図１０ＡのＤ）の細胞膜への細胞内局在も維持されていた。したがって、ＢＭＰ−７は、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＣＥＣを多角形の形態に維持し、機能関連マーカーの陽性発現を伴う接触阻害による表現型の維持を行うことができることが示された（図１０ＡのＥおよびＦ）。この傾向は、１０ｎｇ／ｍｌでも見られ、１００ｎｇ／ｍｌでその傾向が増大しており、１０００ｎｇ／ｍｌでより顕著であった。
（実施例７：追加的効果の確認）
本実施例では、ＴＧＦ−βシグナル伝達においてｐ３８ ＭＡＰＫの阻害剤でもあるＳＢ２０３５８０を、ＳＢ４３１５４２に加えて用いることによって、培養正常化が強化されることを示す。以下に詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋ ２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ、ＴＯＣＲＩＳ、カタログ番号：１６１４）を添加したもの、ＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ、カタログ番号：５５９３８９）を添加したもの、ＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもので培養した。
回収したヒト角膜内皮細胞は二分して、一方は基本培地で培養してコントロールとして、他方は基本培地に最終濃度１μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ４３１５４２（ＴＯＣＲＩＳ社）を添加して培養した。
（結果）
図１１に示すように、ＴＧＦ−βシグナル伝達においてｐ３８ ＭＡＰＫの阻害剤でもあるＳＢ２０３５８０を、ＳＢ４３１５４２に加えて用いることによって、培養正常化が強化されることが実証され、さらに老化により活性化することが知られているｐ３８ ＭＡＰＫの阻害剤であるＳＢ２０３５８０を添加することで、老化することで低下することが知られている角膜内皮密度が上昇した。このことからＳＢ２０３５８０の老化抑制（未分化維持）の効果も追加的に発揮されることにより、効果が増強されることが理解される。このように、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害に加えてＴＧＦ−βシグナル阻害によりヒト角膜内皮細胞が、継代を繰り返しても高密度で形態保持したヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の培養が可能になり、培養の正常化がより強化されることが分かった（継代を繰り返しても高密度で形態保持したＨＣＥＣができることを示す）。
非特許文献７では、従来の角膜内皮細胞培養培地では、継代すると正常な状態を維持しつつ増殖させることができないことが記載されている。また、非特許文献８〜１１には、それぞれ、ＦＢＳ、ＥＧＦおよびＮＧＦを含む培地、ｂ−ＦＧＦを用いた培地、コラゲナーゼを用いた培地、および馴化培地を用いた培地が記載されているが、非特許文献７および比較例で示されたように、いずれの従来培地も、正常な機能を維持しつつ角膜内皮細胞を増殖することはできない。この文献を参考にして、本発明の培地または培養正常化剤の効果を評価すると、従来技術の培地に比べて格段に正常化維持能があることが理解される。
（実施例８：好ましい培養法の確立）
以上の実施例等の結果から、ヒト角膜内皮細胞の好ましい培養法の確立を試みた。以下にその詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地としてＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもので培養した。
プロトコールは図１２に例示される。詳細には以下のとおりである。
（培養法１）
初代培養および継代培養時には接着促進作用をもつＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（ＷＡＫＯあるいはＴＯＣＲＩＳ）を最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとして４８時間添加した。
（培養法２）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２（ＷＡＫＯ、カタログ番号：２５３−００５１３）を最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとして培養中は常に添加した。
（培養法３）
Ｙ−２７６３２を添加しないで基本培地としてＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもので培養した。
（結果）
図１３に示すのは最終的に確立されたヒト角膜内皮細胞培養の１例であり、この図および図１２で示されるように、培養法１〜培養法３のいずれにおいても、ヒト角膜内皮細胞をその正常な機能を維持しつつ多角形の一層の正常の形態を示す細胞として高密度で増幅させることが確認され、標準培養法の例を確立することができた。
（実施例９：培養ヒト角膜内皮移植例）
実施例８で確立された培養法のうち培養法３により培養したヒト角膜内皮細胞を、霊長類であるカニクイザルを用いた角膜内皮不全モデル（水疱性角膜症モデル）に移植した結果を示す。接着促進作用を有するＲＯＣＫ阻害剤とともに培養したヒト角膜内皮細胞を移植することにより角膜の透明治癒が得られることを示す。これは本発明において培養したヒト角膜内皮細胞が生体においても正常な機能を発現して、再生医療に応用できることを示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル：滋賀医科大学動物生命科学研究センターにおいて倫理審査を得たのちに、可能な限り動物愛護的に以下の検討を行った。
全身麻酔下でカニクイザルの角膜輪部を１．５ｍｍ切開してシリコン製の手術器具を前房内に挿入して角膜内皮細胞を機械的に掻爬して水疱性角膜症モデルを作製する。続いて生体外で本発明による方法により培養したヒト角膜内皮細胞を２．０×１０５個を基礎培地に懸濁して、接着促進効果を有するＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２を最終濃度１００μｍｏｌ／ｌとなるように添加して前房内に注入した。コントロールとしてヒト角膜内皮細胞を２．０×１０５個を基礎培地に懸濁したものをＲＯＣＫ阻害剤を併用せずに注入した。注入後、眼球が下向きになるようにうつむき姿勢で３時間維持して、角膜内皮面への細胞接着を促した。培養角膜内皮シートの移植による水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性評価、超音波パキメーターによる角膜厚測定にて行った（図１４）。図１４に示すように、霊長類モデル角膜内皮不全モデルにおいて、本発明の方法で培養した細胞は、細胞のみでも良好な治療成績を示し、ＲＯＣＫ阻害剤を加えるとさらに治療成績が改善した。
２．５カ月後に安楽死させ、角膜を摘出して組織を固定した後に、実施例２と同様にファロイジンおよびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１に対して免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて撮影した（図１５）。結果を図１５に示す。図１５でも示すように、霊長類モデル角膜内皮不全モデルにおいて、本発明の方法で培養した細胞は、細胞のみでも良好な治療成績を示し、ＲＯＣＫ阻害剤を加えるとさらに治療成績が改善し、特に、これまで実現できなかった、ヒト被験体において初めて、角膜内皮の正常な機能を維持する治療法が本発明によって提供された。
（実施例１０：抗ＴＧＦ−β中和抗体での例）
本実施例では、抗ＴＧＦ−β中和抗体でも同様に培養正常化が達成されるか確認した。薬剤を交換すること以外は、上記比較例および実施例に準じて実験をした。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・抗ＴＧＦ−β中和抗体：Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のもの（カタログ番号：ＭＡＢ２４０）を用いた。
・培養方法：図３の結果を示した方法（比較例３等を参照）と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、通常培地としてＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）で培養したものと、これにＴＧＦ−β中和抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養したものを比較した。
・位相差顕微鏡による形態観察において、図１６に示されるように、通常培地では形質転換して多角形細胞の形態を喪失し、大小不動の細胞が多く認められる一方で、ＴＧＦ−β中和抗体添加培地では高密度の一層の多角形細胞の形態を維持できた。霊長類ＣＥＣと一致して、ＣＥＣを、ＴＧＦ−β受容体に対する特異的インヒビター（ＳＢ４３１５４２）とともに培養した場合、このインヒビターは、細胞の形状が線維芽細胞様表現型に変化することをブロックすることができた。線維芽細胞様表現型に対するＳＢ４３１５４２の阻害作用と同様に、ＴＧＦ−βに対する中和抗体（図１６Ｂ）もまた、細胞が線維芽細胞様表現型を獲得するのをブロックした。
このように、抗ＴＧＦ−β中和抗体を用いても、ＳＢ４３１５４２およびＢＭＰ−７に代えて用いて同様の実験を行い、培養正常化を確認することができた。
本実施例においても、ＴＧＦ−β自体を中和することによってＴＧＦ−βシグナル伝達をを阻害しても、線維化が抑制され、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性を保持することが示され、継代培養しても「正常化」活性を維持しつつ増殖させることができることが証明された。
（実施例１１：別法での角膜内皮の培養正常化例）
本実施例では、上述の実施例で用いたＳＢ４３１５４２以外の方法としてＳｍａｄ３阻害剤を用いてＴＧＦ−βシグナルを阻害させヒト角膜内皮の形質転換を抑制することができることを実証した。以下にその詳細を示す。
（材料および方法）
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・Ｓｍａｄ３阻害剤：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社の６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン（カタログ番号：５６６４０５）を用いた。Ｓｍａｄ３阻害剤は、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからも入手可能である。
・培養方法：図３の結果を示した方法（比較例３等を参照）と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、通常培地としてＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）で培養したものと、これにＳｍａｄ３阻害剤（０．３ｍＭおよび３ｍＭ）を添加した培地で培養したものを比較した。
その結果を図１７に示す。位相差顕微鏡による形態観察において、通常培地では形質転換して多角形細胞の形態を喪失し、大小不動の細胞が多く認められる一方で、Ｓｍａｄ３阻害剤添加培地では０．３ｍＭおよび３ｍＭともに高密度の一層の多角形細胞の形態を維持できた。すなわち、霊長類ＣＥＣと一致して、ＣＥＣを、ＴＧＦ−β受容体に対する特異的インヒビター（ＳＢ４３１５４２）とともに培養した場合、このインヒビターは、細胞の形状が線維芽細胞様表現型に変化することをブロックすることができた。線維芽細胞様表現型に対するＳＢ４３１５４２の阻害作用と同様に、Ｓｍａｄ３インヒビター（図１７）もまた、細胞が線維芽細胞様表現型を獲得するのをブロックした。
（考察）
視覚障害をともなう角膜内皮機能不全は、角膜移植手術の主要な適応症である［Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１３：２１７１−２１７５］、［Ｐｒｉｃｅ ＭＯ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ３８：１２８−１４０］。角膜移植は角膜内皮機能不全について広く行われているが、研究者らは現在、健康な角膜内皮を回復させるための代替的な方法を探究している。角膜内皮が、若いドナーから培養され、「マスター細胞」としてストックすることにより、高い機能的能力を持つ細胞の移植が可能となる。加えて、拒絶のリスクを低下させるためのＨＬＡ適合移植［Ｋｈａｉｒｅｄｄｉｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２４１：１０２０−１０２８］、［Ｃｏｓｔｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １４０：１１１２−１１２２］が可能となる。組織生体工学は、視力を失った患者のための治療を開発するための新たなアプローチである［Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ７８：５７３−５７８］。今日までに、生体工学的アプローチを利用する２つの方法が存在する：１）生体工学コンストラクト上に接着させた培養ドナーＨＣＥＣの使用［Ｉｓｈｉｎｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５：８００−８０６］、［Ｍｉｍｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５：２９９２−２９９７］、［Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８：４５１９−４５２６］、［Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ９５：６０−６７］、そして、２）前眼房内への培養ＨＣＥＣの移植［Ｏｋｕｍｕｒａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １８１：２６８−２７７］、［Ｍｉｍｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ７６：７４５−７５１］、［Ｍｉｍｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４６：３１２８−３１３５］、［Ｐａｔｅｌ ＳＶ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５０：２１２３−２１３１］。臨床の状況に対してこれら２つの方法のいずれを応用するかに関わらず、ＨＣＥＣのための効率的な培養技術の確立は、必須かつ不可避である［Ｐｅｈ ＧＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ９１：８１１−８１９］。多くの研究者が、ＨＣＥＣの不変で長期の培養を確立することが非常に難しいことを認めている［Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ７８：５７３−５７８］。ＨＣＥＣの首尾よい培養がいくつかのグループによって報告されているが、単離およびその後の培養プロトコールにともなう手順は、研究室間で非常に多様である［Ｐｅｈ ＧＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ９１：８１１−８１９］。最も困難な問題の１つは、ＨＣＥＣが、各継代ごとに甚だしい線維芽細胞様の変化を受けやすいことである［Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ７８：５７３−５７８］。それゆえ、移植の目的での後の使用のために生理学的表現型を維持するためには、ＣＥＣの自発的な転換を回避する手段を見出すことが必須である。
内皮細胞から線維芽細胞様の細胞への転換は、内皮間葉転換と呼ばれる。こうした転換は、Ｓｍａｄ２／３経路を介してＴＧＦ−βによって誘発される［Ｓａｉｋａ Ｓ（２００６）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８６：１０６−１１５］。内皮間葉転換は、接触阻害型の単層の喪失、および、原形質膜における頂端結合タンパク質の喪失といった、特徴的な内皮表現型の喪失を引き起こす。さらに、これは、１型コラーゲンおよびフィブロネクチンといった繊維性タンパク質の誘導を引き起こす。本研究において、本発明者らは、培養ＣＥＣの線維芽細胞様表現型が、内皮様の特徴を大きく失うことを実証した；Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現は、著しく低減し、その細胞内局在化は、真の細胞膜ではなくサイトゾル内となった。さらに、線維芽細胞様表現型は、基底膜表現型（ＩＶ型およびＶＩＩＩ型コラーゲン）ではなく、線維性ＥＣＭタンパク質（１型コラーゲン、フィブロネクチンおよびインテグリンα５）の産生を著しく増強する。このような望ましくない細胞の存在は、臨床の状況における培養細胞の移植の成功を大きく妨げるであろう。それゆえ、何が表現型の変化を引き起こし、培養ＣＥＣのこのような内皮間葉転換プロセスにおいてどのように干渉するかを決定することが重要である。Ｓｍａｄ２／３のリン酸化が線維芽細胞様表現型において大いに増強されたという事実から、本発明者らは、線維芽細胞様表現型が、霊長類およびヒトの両方のＣＥＣにおいて、ＴＧＦ−βシグナル伝達によって媒介されると結論付けるに至った。それゆえ、本発明者らは、線維芽細胞様表現型において観察される内皮間葉転換プロセスをブロックするためにＴＧＦ−β受容体に対する特異的インヒビター（ＳＢ４３１５４２）［Ｉｎｍａｎ ＧＪ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６２：６５−７４］を用いた。ＳＢ４３１５４２は、望ましくない細胞の変化を完全に無効にし、霊長類またはヒトのいずれかのＣＥＣ培養をＳＢ４３１５４２で処理した場合、線維芽細胞様表現型への細胞の不可避の変化は、完全に無効にされた。同時に、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの特徴的な細胞内位置が原形質膜に戻り、そして、これら２つのタンパク質の発現はｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルにおいて大きく増大し、これらの培養におけるバリアおよびポンプの機能がインタクトであることが示唆される。さらに、本発明者らは、線維性ＥＣＭタンパク質の産生が大きく減少したことも見出した。本発明者らはさらに、周知の抗ＥＭＴ因子であるＢＭＰ−７［Ｚｅｉｓｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｍｅｄ ９：９６４−９６８］、［Ｚｅｉｓｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：２３３３７−２３３４７］が、ＨＣＥＣの線維芽細胞様表現型を逆転させる作用について検討した。ＢＭＰ−７はまた、線維芽細胞様表現型を、単層の特徴的な内皮接着を持つ正常な角膜内皮細胞へと逆転させた。まとめると、ＳＢ４３１５４２およびＢＭＰ−７はともに、培養ＣＥＣの正常な内皮表現型を維持するための強力なツールとなり得、したがって、その後の移植の成功につながる。
結論として、本発明者らの知見は、ＴＧＦ−β受容体に対するインヒビター（ＳＢ４３１５４２）および／または、抗ＥＭＴ分子（ＢＭＰ−７）の使用が、ＨＣＥＣを正常な生理学的機能（すなわち、バリアおよびポンプの機能）を維持したまま増殖させることを可能にすることを示した。より徹底的な将来の研究が有益であるが、本発明者らは、数回の継代の後でさえ、形態および機能に関して、連続的なＳＢ４３１５４２またはＢＭＰ−７での処置の何らかの明白な有害作用を認めていない。本研究は、再生医療に用いるためのＨＣＥＣの効率的な生体外での培養法に関するプロトコールを提供するものであることを証明し得る。加えて、培養中の線維芽細胞様の変化の阻害のこの新たな戦略は、最終的に、臨床医に対して、角膜内皮機能不全の治療のためならず、様々な病理学的疾患全般のための再生医療における新たな治療様式を提供することができる。
（実施例１２：他の阻害剤での例）
本実施例では、他のＴＧＦ−βシグナル阻害剤でも同様に培養正常化が達成されるか確認する。薬剤を交換すること以外は、上記実施例に準じて実験をすることができる。
（材料および方法）
・Ａ８３−０１（ＴＯＣＲＩＳ社またはミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社から入手可能）：Ａ８３−０１はＩ型ＴＧＦ−ｂ受容体ＡＬＫ５、Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ４、Ｎｏｄａｌ受容体ＡＬＫ７の選択的阻害物質である。
・ＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅＴＭ ＡＬＫ５インヒビター（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社から入手可能）：Ｉ型ＴＧＦ−ｂ受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ）（ＡＬＫ５）の選択的なＡＴＰ競合的阻害物質である。
・ＬＤＮ−１９３１８９（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）社から入手可能）：ＢＭＰ Ｔｙｐｅ Ｉ受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３を阻害する。
・ＳｍａｄのｓｉＲＮＡ（標準的な方法で合成する。）
これらを上記実施例で使用されたＳＢ４３１５４２またはＢＭＰ−７に代えて用いて同様の実験を行い、培養正常化を確認する。
本実施例においても、いずれのＴＧＦ−βシグナル阻害剤であっても、線維化が抑制され、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性を保持することが示され、継代培養しても「正常化」活性を維持しつつ増殖させることができることが証明される。
（実施例１２：製剤例：角膜内皮シート調製用培養液）
本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜内皮シート調製用培養液を以下のようにして製造する。
常法により下に示す培養液を調製する。
ＳＢ４３１５４２ ３．８４３９ｍｇ
ＳＢ２０３５８０ ３．７７４３ｍｇ
ＦＢＳ １０ｍＬ
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 １ｍＬ
ＦＧＦ ｂａｓｉｃ ２００ｎｇ
ＤＭＥＭ 適量
全量 １００ｍＬ
ＦＢＳは例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ（カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）またはインビトロジェン製、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液はナカライテスク製（ペニシリン ５０００ｕ／ｍＬ，ストレプトマイシン ５０００μｇ／ｍＬ含有）、ＦＧＦ ｂａｓｉｃは例えば、インビトロジェン製（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、ＳＢ４３１５４２はＴＯＣＲＩＳ社製、ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、ＤＭＥＭはインビトロジェン製を用いることができる。
（実施例１３：製剤例：培養正常化剤を含有する角膜保存液）
本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。
常法により下に示す保存液を調製する。
ＳＢ４３１５４２ ３．８４３９ｍｇ
ＳＢ２０３５８０ ３．７７４３ｍｇ
Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ
各成分は、実施例１２と同様に入手することができる。
（実施例１４：移植用培養角膜内皮細胞シートの作製）
本実施例では、実施例８で確立した手法または同等の方法により調製したウサギ角膜内皮細胞を使用する。また、本実施例では、実施例９と同様の方法により調製した細胞接着促進剤としてのＲｈｏキナーゼ阻害剤または対照物質を使用する。
移植用培養角膜内皮細胞シートの作製時にＲｈｏキナーゼ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２を添加し、上述の実施例と同様の手法を用いて、角膜内皮細胞の機能タンパクであるＺＯ−ｌおよびＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの蛍光免疫細胞染色を行い、発現を確認する。
角膜内皮シートを、９５％エタノール（−３０℃）で１０分間固定する。ＰＢＳ洗浄の後、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで５分間処理する。その後、ｌ％ＢＳＡ／ＰＢＳを１時間処理する。その後、抗ＺＯ−ｌ抗体または抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ抗体を一晩処理する。ＰＢＳ洗浄後、Ａｌｅｘａ−４８８標識２次抗体を１時間処理する。ＰＢＳ洗浄後、ＤＡＰＩ含有の封入剤を滴下し、カバーガラスで封入する。蛍光顕微鏡で写真を撮影し、ＺＯ一１および、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅの発現を確認する。
（実施例１５：注入剤の調製例）
点眼剤の調製例
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
Ｙ−２７６３２（ＷＡＫＯ、カタログ番号：２５３−００５１３）または他のＲｈｏキナーゼ阻害剤 ０．００３ｇ、０．０１ｇ、０．０３ｇ、０．０５ｇまたは０．１ｇ（脱塩酸体としての用量）
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
点眼剤は、基剤で希釈することも出来る。
基材の組成は以下のとおり。
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
角膜内皮細胞の正常化培養方法が提供され、角膜移植に関連する技術に関与する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
［配列表］

Claims (19)

  1. 線維化抑制剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤であって、該線維化抑制剤はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル阻害剤および／またはｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含み、該培養正常化は、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅからなる群より選択される細胞機能が正常であることを含む、培養正常化剤。
  2. 前記線維化抑制剤はトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル阻害剤を含む、請求項１に記載の培養正常化剤。
  3. 前記培養正常化は角膜移植に適応する移植用細胞を製造するためのものである、請求項１に記載の培養正常化剤。
  4. 前記移植用細胞は霊長類の細胞である、請求項３に記載の培養正常化剤。
  5. 前記移植用細胞はヒトの細胞である、請求項３に記載の培養正常化剤。
  6. 前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、ＴＧＦ−βのアンタゴニスト、ＴＧＦ−βのレセプターのアンタゴニスト、またはＳｍａｄ３の阻害剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  7. 前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド、ＢＭＰ−７、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−βレセプター抗体、ＴＧＦ−βのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βレセプターのｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノロン、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、６−（４−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−［（４−ピリジニル）アミノ］プテリジン、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  8. 前記ＴＧＦ−βシグナル阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  9. 前記線維化抑制剤はｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  10. 前記ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤は４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  11. ４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩と、４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）またはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の培養正常化剤。
  12. Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む細胞接着促進剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  13. 前記細胞接着促進剤は（Ｒ）−（＋）−トランス−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、請求項１２に記載の培養正常化剤。
  14. 前記線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、前記細胞接着促進剤は、一定期間存在させた後、いったん該細胞接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間存在させることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の培養正常化剤。
  15. 前記線維化抑制剤および前記細胞接着促進剤の両方を、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  16. 前記移植用細胞は、角膜内皮障害の予防または治療のためのものである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の培養正常化剤。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養正常化剤と角膜内皮の培養成分とを含む、角膜内皮細胞を正常に培養するための培地。
  18. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養正常化剤を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法。
  19. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養正常化剤を含む、角膜内皮細胞の保存液。
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