JP2019176870A - 角膜内皮細胞の培養正常化 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)線維化抑制剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤。
(2)前記線維化抑制剤はトランスフォーミング増殖因子(TGF)βシグナル阻害剤を含む、項目1に記載の培養正常化剤。
(3)前記培養正常化は、ZO−1およびNa+/K+−ATPaseからなる群より選択される細胞機能が正常であることを含む、項目1または2に記載の培養正常化剤。
(4)前記培養正常化は角膜移植に適応する移植用細胞を製造するためのものである、項目1〜3のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(5)前記移植用細胞は霊長類の細胞である、項目4に記載の培養正常化剤。
(6)前記移植用細胞はヒトの細胞である、項目4または5に記載の培養正常化剤。
(7)前記TGF−βシグナル阻害剤は、TGF−βのアンタゴニスト、TGF−βのレセプターのアンタゴニスト、またはSmad3の阻害剤である、項目2〜6のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(8)前記TGF−βシグナル阻害剤は、SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)2−ピリジニル)]−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン、A83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、ステモレキュールTM TLK インヒビター(2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン)、ステモレキュールTM BMPインヒビターLDN−193189(6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン)、SD−208(2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン)、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目2〜7のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(8A)前記TGF−βシグナル阻害剤は、SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)2−ピリジニル)]−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、A83−01(3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド)、ステモレキュールTM TLK インヒビター(2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン)、ステモレキュールTM BMPインヒビターLDN−193189(6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン)、SD−208(2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン)、LY364947(4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン)、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目2〜8のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(9)前記TGF−βシグナル阻害剤は、SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)またはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目2〜8または8Aのいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(9A)前記SB431542は、使用時に約0.1μM〜約10μMの濃度で存在するように含まれる、項目8、8Aまたは9に記載の培養正常化剤。
(9B)前記TGF−βシグナル阻害剤は、BMP−7を含む、項目2〜8または8Aのいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(9C)前記BMP−7は、使用時に約10ng/ml〜約1000ng/mlの濃度で存在するように含まれる、項目8、8Aまたは9Bに記載の培養正常化剤。
(9D)前記BMP−7は、使用時に約100ng/ml〜約1000ng/mlの濃度で存在するように含まれる、項目8、8Aまたは9Bに記載の培養正常化剤。
(9E)前記BMP−7は、使用時に約1000ng/mlの濃度で存在するように含まれる、項目8、8Aまたは9Bに記載の培養正常化剤。
(10)前記線維化抑制剤はさらにMAPキナーゼ阻害剤を含む、項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9Dまたは9Eのいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(11)前記MAPキナーゼ阻害剤はSB203580(4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)またはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目10に記載の培養正常化剤。
(12)老化抑制剤をさらに含む、項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(13)前記老化抑制剤は、p38 MAPキナーゼ阻害剤を含む、項目12に記載の培養正常化剤。
(14)前記老化抑制剤はSB203580(4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)を含む、項目13に記載の培養正常化剤。
(15)SB431542(4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド)と、SB203580(4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)またはその薬学的に許容可能な塩とを含む、項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜14のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(16)細胞接着促進剤をさらに含む、項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜15のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(17)前記細胞接着促進剤は(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩(たとえば、Y−27632(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸1水和物)を含む、項目16に記載の培養正常化剤。
(18)前記線維化抑制剤は、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させ、他方、前記接着促進剤は、一定期間存在させた後、いったん該接着促進剤を欠損させ、再度該細胞接着促進剤は、一定期間存在させることを特徴とする、項目16または17に記載の培養正常化剤。
(19)前記線維化抑制剤および前記細胞接着促進剤の両方を、前記角膜内皮細胞の培養の間常に存在させることを特徴とする、項目16または17に記載の培養正常化剤。
(20)前記移植用細胞は、角膜内皮障害の予防または治療のためのものである、項目4〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜19のいずれか1項に記載の培養正常化剤。
(21)項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤と角膜内皮の培養成分とを含む、角膜内皮細胞を正常に培養するための培地。
(22)項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目21に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法。
(23)項目22に記載の方法で培養される角膜内皮細胞。
(24)項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤を含む、角膜内皮細胞の保存液。
(25)項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目21に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬。
(26)前記処置または予防は、霊長類の角膜内皮のためのものである、項目25に記載の医薬。
(27)前記処置または予防は、ヒトの角膜内皮のためのものである、項目25または26に記載の医薬。
(28)前記角膜内皮細胞は霊長類由来である、項目25〜27のいずれか1項に記載の医薬。
(29)前記角膜内皮細胞はヒト由来である、項目25〜28のいずれか1項に記載の医薬。
(30)前記角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症または角膜内皮炎である、項目25〜29のいずれか1項に記載の医薬。
(31)前記医薬は、シート状または懸濁物である、項目25〜30のいずれか1項に記載の医薬。
(32)細胞接着促進剤をさらに含む、項目24〜31のいずれか1項に記載の医薬。
(32A)前記細胞接着促進剤はRhoキナーゼ阻害剤を含む、項目32に記載の医薬。(33)前記細胞接着促進剤は(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩(たとえば、Y−27632(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸1水和物))である、項目32または32Aに記載の医薬。
(34)項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目21に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を用いる工程を包含する、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法。
(34A)さらに、項目26〜32、32Aおよび33のいずれか1項に記載の特徴を少なくとも1つ有する、項目34に記載の方法。
(35)細胞接着促進剤を含む、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬。
(35A)前記細胞接着促進剤はRhoキナーゼ阻害剤を含む、項目35に記載の医薬。(36)前記細胞接着促進剤は(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩(たとえば、Y−27632(R)−(+)−トランス−(4−ピリジル)−4−(1−アミノエチル)−シクロヘキサンカルボキサミド2塩酸1水和物))である、項目35または35Aに記載の医薬。
(37)前記医薬は、項目1〜8、8A、9、9A、9B、9C、9D、9E、10または11〜20のいずれかに記載の培養正常化剤、または項目21に記載の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞と共に用いられる、項目35、35Aまたは36に記載の医薬。
(38)前記角膜内皮疾患、障害または状態が水疱性角膜症または角膜内皮炎である、項目35、35A、および36〜37のいずれか1項に記載の医薬。
(39)細胞接着促進剤を処置または予防が必要な被験体に投与する工程を包含する、ヒトの角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための方法。
(39A)項目35A、および36〜38のいずれか1項に記載の特徴を少なくとも1つ有する、項目39に記載の方法。
本明細書において「線維化抑制剤」とは、線維化を抑制する任意の薬剤を言う。本発明で使用される線維化抑制剤は、トランスフォーミング増殖因子(TGF)−βシグナル阻害剤、分裂促進因子(マイトージェン)活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)38抑制剤、インターロイキン(IL)−12、IL−10、インターフェロン(IFN)−γ、またはBMP−7(OP−1)などの、抗線維化作用を有することが知られているサイトカイン等を挙げることができる。このようなサイトカイン類等の情報は、公的データベース、例えばGenBank、雑誌刊行物などから入手することができる。理論に束縛されることを望まないが、本発明では、線維化を抑制することによって、従来は、正常な機能を有する細胞の増殖が困難であった角膜内皮細胞の顕著な増加を達成することができた。したがって、本発明に用いられる線維化抑制剤は、正常な機能を有する細胞の増殖をもたらすものである限り、どのような薬剤でも用いられることが理解される。
Co.,Ltd.)、BIRB796BS(あるいはBIRB−796;1−(5−tert−ブチル−2−p−トリル−2H−ピラゾール−3−イル)−3(4−(2−モルホリン−4−イル−エトキシ)ナフ−タリン−1−イル)尿素、Blood101,4446−4448,2003)、SKF−86002、チルホスチン(Tyrphostin)AG126、U0124、U0125、U0126(1,4−ジアミノ−2,3−ジシアノ−1,4−ビス[2−アミノフェニルチオ]ブタジエン)、4−アザインドール、3−(4−フルオロフェニル)−2−(ピリジン−4−イル)−1H−ピロロ[3,2−b]ピリジン、ZM336372、CalBio506126(2−(4−クロロフェニル)−4−(4−フルオロフェニル)−5−ピリジン−4−イル−1,2−ジヒドロピラゾール−3−オン)、RO3201195、R1487等を含む。CalBioChemカタログのページixxviiiも参照しうる。このほかの、本発明で用いることができるMAPキナーゼ阻害剤としては、例えば、MAPキナーゼに対する中和抗体、MAPキナーゼの活性を阻害する化合物、MAPキナーゼをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物(例えば、アンチセンス核酸、RNAi、リボザイム)、ペプチド、および植物成分(例えば、ポリフェノール、フラボノイド、配糖体)等の化合物が挙げられる。使用される濃度として、SB203580、SB202190、PD169316、FR167653、BIRB796BS等であれば約50nmol/l〜100μmol/lが例示され、通常、約0.001〜100μmol/l、好ましくは、約0.01〜75μmol/l、約0.05〜50μmol/l、約1〜10μmol/l、約0.01〜10μmol/l、約0.05〜10μmol/l、約0.075〜10μmol/l、約0.1〜10μmol/l、約0.5〜10μmol/l、約0.75〜10μmol/l、約1.0〜10μmol/l、約1.25〜10μmol/l、約1.5〜10μmol/l、約1.75〜10μmol/l、約2.0〜10μmol/l、約2.5〜10μmol/l、約3.0〜10μmol/l、約4.0〜10μmol/l、約5.0〜10μmol/l、約6.0〜10μmol/l、約7.0〜10μmol/l、約8.0〜10μmol/l、約9.0〜10μmol/l、約0.01〜50μmol/l、約0.05〜5.0μmol/l、約0.075〜5.0μmol/l、約0.1〜5.0μmol/l、約0.5〜5.0μmol/l、約0.75〜5.0μmol/l、約1.0〜5.0μmol/l、約1.25〜5.0μmol/l、約1.5〜5.0μmol/l、約1.75〜5.0μmol/l、約2.0〜5.0μmol/l、約2.5〜5.0μmol/l、約3.0〜5.0μmol/l、約4.0〜5.0μmol/l、約0.01〜3.0μmol/l、約0.05〜3.0μmol/l、約0.075〜3.0μmol/l、約0.1〜3.0μmol/l、約0.5〜3.0μmol/l、約0.75〜3.0μmol/l、約1.0〜3.0μmol/l、約1.25〜3.0μmol/l、約1.5〜3.0μmol/l、約1.75〜3.0μmol/l、約2.0〜3.0μmol/l、約0.01〜1.0μmol/l、約0.05〜1.0μmol/l、約0.075〜1.0μmol/l、約0.1〜1.0μmol/l、約0.5〜1.0μmol/l、約0.75〜1.0μmol/l、約0.09〜35μmol/l、約0.09〜3.2μmol/lであり、より好ましくは、約0.05〜1.0μmol/l、約0.075〜1.0μmol/l、約0.1〜1.0μmol/l、約0.5〜1.0μmol/l、約0.75〜1.0μmol/lであるがこれらに限定されない。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press;Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
1つの局面において、本発明は、線維化抑制剤を含む角膜内皮細胞の培養正常化剤を提供する。本発明が提供される前、角膜内皮細胞は、移植に適した形態を維持しつつ増殖させることは困難であった。特に、継代を重ねると移植が困難になるものであった。移植が困難になる指標としては、機能タンパク質の消失がある。従来、通常の培養法では形態変化が生じることが知られていたが、本発明ではこれが形態的に線維芽細胞様であることから線維性変化であると考え、それがTGF−βシグナルの活性化を伴うものであることを発見した。ここで、TGF−βシグナルの活性化は、限定を意図しないが、実施例で例示されるように、フィブロネクチンおよびコラーゲン1型、4型、8型フィブロネクチン、インテグリンα5、およびインテグリンβ1などの細胞外マトリクスまたはインテグリン等の量、レベル等を調べることによって、判定することができる。限定を意図するものではないが、フィブロネクチンのタンパク質発現レベルは、正常の表現型よりも線維芽細胞の表現型において強くアップレギュレートされる。従来、生体において先天性梅毒などの極めて稀な疾患において角膜内皮細胞の線維化が伴うことは見いだされていたが、線維化を抑制する治療法の開発はない。したがってこのような疾患や培養条件下において線維化を薬物により抑制することで正常な機能を維持することができるかどうか予想できなかった。本発明者らは、他の細胞でTGF−βシグナル阻害剤を代表例として線維化を抑えることが知られている薬剤を使用したところ、形態変化を抑制した培養が可能になり予想外に正常機能を維持しつつ継代を行なうことができ(すなわち、培養正常化が可能)、角膜内皮細胞の大幅な増殖を可能にすることを見出した。正常な機能を維持しながら角膜内皮細胞を大量培養することは従来不可能であった。したがって、本発明によって達成された効果は、まさに顕著であるというべきである。
別の局面において、本発明は、本発明の培養正常化剤と角膜内皮の培養成分とを含む、角膜内皮細胞を正常に培養するための培地を提供する。本発明の培地において用いられる培養正常化剤は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、従来販売され使用されている培地成分であってもよく、あるいは、別途角膜内皮用に開発された成分であってもよい。そのような培地成分の例としては、OptiMEM、DMEM,M199、MEM等(これらは、INVITROGEN等から入手可能)を挙げることができるがこれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法を提供する。本発明の方法において用いられる培養正常化剤は、本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解される。また、本発明の方法において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、(角膜内皮細胞を正常に培養するための培地)において説明されたものを例示することができる。
本発明は、本発明の方法で培養される角膜内皮細胞を提供する。本発明は、通常の培養を行い継代しても、線維化せず、正常機能を喪失しないという細胞である点従来の細胞に無い性質を有するということができる。そして、最も重要な性質は、機能としては正常な角膜内皮の性質を有しているという点である。したがって、本発明が提供する角膜内皮細胞は、製剤として提供されうることから、本発明は、角膜内皮製剤を提供するということになる。
(1)細胞層が単層構造である。これは生体の角膜内皮細胞層が備える特徴の一つである。
(2)細胞層における細胞密度は約1,000〜約4,000細胞/mm2である。特に、成人をレシピエント(移植者)とする場合には約2,000〜約3,000細胞/mm2であることが好ましい。
(3)細胞層を構成する細胞の平面視形状が略六角形である。これは生体における角膜内皮細胞層を構成する細胞が備える特徴の一つである。本発明の製剤は生体の角膜内皮細胞層に類似し、生来の角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮するとともに、生体内で増殖能も発揮することができる。
(4)細胞層において細胞が規則正しく整列している。生体の角膜内皮細胞層においてはそれを構成する細胞は規則正しく整列しており、これによって角膜内皮細胞の正常な機能と高い透明性が維持され、また角膜の水分調整機能が適切に発揮されると考えられている。したがって、このような形態的な特徴を備えることにより、本発明の製剤は、生体における角膜内皮細胞層と同様の機能を発揮することが期待される。
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、本発明の培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:12320等を)にFBS(ウシ胎仔血清)(例えば、BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)、b−FGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)(例えば、INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらに本発明の培養正常化剤の成分を添加したものを使用することができる。培養容器(培養皿)にはその表面にI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をFNC coating mix(登録商標)(50ml(AES−0407)、ATHENA、カタログ番号:0407)等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。かかるコーティングと本発明の培養液とを併用することにより、角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−EDTA等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の培養正常化剤または培地を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約1〜2×106個/mLである。尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば、500rpm(30g)〜1000rpm(70g)、1〜10分を挙げることができる。
細胞浮遊液は、コラーゲンシート等の基材上に播種され、培養に供される。この際、最終的に製造される角膜内皮製剤において所望の細胞密度の細胞層が形成されるように播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約1,000〜約4,000細胞/mm2の細胞層が形成されるように細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば3〜30日間である。
本発明は、本発明の培養正常化剤、または本発明の培地を用いて角膜内皮細胞を培養する工程を包含する、角膜内皮細胞を正常に培養する方法によって生産された角膜内皮細胞を含む、角膜内皮疾患、障害または状態の処置または予防のための医薬を提供する。本発明の培地または培養正常化剤は本明細書において説明される任意の形態を用いることができることが理解され、例えば、(培養正常化剤)、(角膜内皮細胞を正常に培養するための培地)、(角膜内皮細胞を正常に培養する方法)に記載された事項を参酌することができる。また、医薬として使用される角膜内皮細胞は、本明細書において使用される任意の形態をとり得ることが理解され、例えば、(角膜内皮細胞および角膜内皮製剤)に記載された事項を参酌することができる。
マ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。霊長類
での角膜内皮治療はこれまで十分な成績が達成されておらず、その意味で本発明は画期的な治療法および医薬を提供する。
それぞれ、日精バイリス株式会社滋賀研究所および株式会社イブバイオサイエンスで飼われた4匹のカニクイザル(3〜5歳齢;ヒト年齢では5〜20歳に等しいと推定される)からの8個の角膜を、サル角膜内皮細胞(MCEC)培養に使用した。12個のヒトドナー角膜は、SightLifeTMアイバンクから入手し、全ての角膜を、初代培養前に14日未満の期間にわたり、保存培地(Optisol;Chiron Vision Corporation,Irvine,CA)中、4℃で保存した。
2サンプルの比較の平均値における統計的有意差(P値)は、スチューデントのt検定を用いて決定した。複数のサンプルセットの比較における統計的有意差は、ダネットの多重比較検定を用いて解析した。グラフに示す値は平均±SEを表す。
本例では、従来法で培養したカニクイザルおよびヒトの角膜内皮細胞の様子を示す。以下にその詳細を示す。
・カニクイザル角膜内皮細胞(MCEC;入手先および培養方法): MCECは、以前に記載された改良型プロトコールで培養した[Koizumi N, et al.(2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 4519-4526]、[Li W, et al.(2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 614-620]。簡単に述べると、別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、(Nissei Bilis Co., Ltd.,Ohtsu, JapanおよびKeari Co., Ltd. , Wakayama, Japan)(方法は上述)、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、ディスパーゼあるいはコラゲナーゼ(ROCHE カタログ番号:10 103 586 001)を用いて処理後に初代培養を行った。代表的には、1mg/mLコラゲナーゼA(Roche Applied Science,Penzberg,Germany)を用いて37℃にて2時間処理した。培地は10%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)と2ng/ml 塩基性FGF(INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)を添加したDMEM(INVITROGEN カタログ番号12320)を用いた。培養には、FNC Coating MIX(登録商標)(Athena Environmental Sciences.,Baltimore,MD)でコーティングした6ウェルプレート等を用いた。次いで、MCECを5%CO2中37℃の加湿雰囲気下で培養し、2日おきに培養培地を交換した。MCECが10〜14日でコンフルエントに達すると、これらを、Ca2+およびMg2+非含有ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中でリンスし、37℃にて5分間0.05%トリプシン−EDTA(Life Technologies)でトリプシン処理し、そして、1:2〜4の比で継代した。トランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)の選択的インヒビターであるSB431542(Merck Millipore,Billerica,MA)を、抗線維芽細胞様作用について調べた。
・ヒト角膜内皮細胞(HCEC、入手先および培養方法):HCECは、MCECについて用いたプロトコールの改良バージョンで培養した。簡単に述べると、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より、角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離して、コラゲナーゼ(ROCHE カタログ番号:10 103 586 001)を用いて基底膜よりはがして(代表的には、1mg/mLコラゲナーゼA(Roche Applied Science)を用いて37℃にて2時間処理した。)回収後、初代培養を行った。培地はヒトはOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)+8%ウシ胎仔血清(FBS)(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)+200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)+0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)+20μg/ml アスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)+50μg/ml ゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)+5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)を3T3フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。具体的には、37℃での消化後、個々の角膜から得られたHCECを培養培地中に再懸濁させ、FNC Coating Mix(登録商標)でコーティングした12ウェルプレートの1ウェルにプレーティングした。培養培地は、一部の改変を加えた公開されたプロトコールに従って調製した。簡単に述べると、OptiMEM−I(Life Technologies)、8% FBS、5ng/mL 上皮増殖因子(EGF)(Sigma−Aldrich Co.,St.Louis,MO)、20μg/mL アスコルビン酸(Sigma−Aldrich)、200mg/L 塩化カルシウム(Sigma−Aldrich)、0.08% コンドロイチン硫酸(和光純薬工業株式会社、大阪市)および50μg/mLのゲンタマイシンを含有する基本培養培地を準備し、次いで、不活性化3T3線維芽細胞の培養後に馴化培地を回収した。3T3線維芽細胞の不活性化は、以前に記載されたとおりに実施した。簡単に述べると、コンフルエントな3T3線維芽細胞を4μg/mL マイトマイシンC(MMC)(協和発酵キリン株式会社、東京都)とともに、5%CO2下で37℃にて2時間インキュベートし、次いでトリプシン処理し、そして、2×104細胞/cm2の密度でプラスチック皿にプレーティングした。HCECは、5%CO2中37℃にて加湿雰囲気下で培養し、2日おきに培養培地を交換した。HCECが14〜28日でコンフルエントに達すると、これらを、Ca2+およびMg2+非含有PBS中でリンスし、37℃にて5分間0.05%トリプシン−EDTAでトリプシン処理し、そして、1:2の比で継代した。SB431542(Merck Millipore)、TGF−βに対する中和抗体(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)、Smad3インヒビター(Merck Millipore)および骨形成タンパク質(BMP)BMP−7(R&D Systems)を、抗線維芽細胞様作用について調べた。
・染色等の細胞観察方法(組織学的試験):細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてZO−1、Na+/K+−ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養したMCECまたはHCECをLab−TekTM Chamber SlidesTM(NUNC A/S,Roskilde,Denmark)に入れ、4%ホルムアルデヒドで10分間室温(RT)で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。具体的には、Lab−TekTMChamber SlidesTM(NUNC A/S,Roskilde,Denmark)上の培養MCECまたはHCECを室温で10分間4%ホルムアルデヒド中で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。CECの表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるZO−1(Zymed Laboratories,Inc.,South San Francisco,CA)、ポンプ機能に関連するタンパク質であるNa+/K+−ATPase(Upstate Biotec,Inc.,Lake Placid,NY)、フィブロネクチン(BD,Franklin Lakes,NJ)およびアクチンの免疫組織化学分析を行った。CECの機能に関連するマーカーとしてZO−1およびNa+/K+−ATPaseを使用し、線維芽細胞様の変化を評価するためにフィブロネクチンおよび1型コラーゲンを使用し、そして、細胞の形態を評価するためにアクチンの染色を使用した。ZO−1、Na+/K+−ATPase、1型コラーゲンおよびフィブロネクチンの染色は、それぞれ、ZO−1ポリクローナル抗体、Na+/K+−ATPaseモノクローナル抗体、およびフィブロネクチンモノクローナル抗体の1:200希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488標識、または、Alexa Fluor(登録商標)594標識ヤギ抗マウスIgG(Life Technologies)の1:2000希釈を使用した。アクチンの染色は、Alexa Fluor(登録商標)488標識ファロイジン(Life Technologies)の1:400希釈を用いて実施した。次いで、細胞の核をDAPI(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)またはPI(Sigma−Aldrich)で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(TCS SP2 AOBS;Leica Microsystems,Welzlar,Germany)で観察した。
図1にカニクイザルおよびヒトにおける従来の細胞培養法での培養結果を示す。培養結果から明らかなように、サル、ヒトの角膜内皮において通常の培養法では形質転換し、すなわち、いずれの細胞でも線維化が生じており、多角形の一層の細胞である正常細胞とは異なった形態であり移植には適さない状態となっていることが分かる。
本例では、従来技術で培養した場合に、正常機能を消失することを示す実験を行った。本例では、サル角膜内皮が機能関連タンパク質の発現を消失するかどうかを、免疫染色およびウェスタンブロット法ならびにリアルタイムPCR法にて実証した。以下にその詳細を示す。
以下に使用した材料のうち比較例1と同じものは比較例1と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞:比較例1と同じである。
・ヒト角膜内皮細胞:比較例1と同じである。
・Na+/K+−ATPaseに対する抗体:MILLIPORE社製(MILLIPORE カタログ番号:05−369)のものを用いた。
・ZO−1に対する抗体:マウスINVITROGEN社製(INVITROGEN カタログ番号:339100)、ウサギZYMED LABORATORIES社製(ZYMED LABORATORIES カタログ番号:61−7300)のものを用いた。・フィブロネクチンに対する抗体::BD BIOSCIENCES社製(カタログ番号:610077)
・コラーゲン1型に対する抗体:(ABCAM社製)(カタログ番号:ab292)
・GAPDHに対する抗体:ABCAM社製(カタログ番号:ab36840)のものを用いた。
・二次抗体(HPR結合抗ウサギIgG二次抗体)Cell Signaling Technology社製(カタログ番号:7074)
・二次抗体(抗ウサギIgG二次抗体)Cell Signaling Technology社製(カタログ番号:7076)
・細胞画分抽出・調製法:コンフルエントに達した細胞をPBS(Dulbecco’s PBS、ニッスイ、カタログ番号:5913)で3回洗浄後、RIPAバッファー(1×PBS、1% Nonidet P−40(ナカライテスク、カタログ番号:23640−94)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク、カタログ番号:10712−12)、0.1%SDS(ラウリル硫酸ナトリウム、ナカライテスク、カタログ番号:31607−65))で溶解した。前述のRIPAバッファー中には、ホスファターゼインヒビターカクテル2(Sigma−Aldrich)およびプロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライテスク株式会社、京都市)を添加した。得られた細胞溶解液を遠心分離(15000rpm、10分間)し、その上清を回収し、タンパク質をBCA PROTEIN ASSAY KIT(PIERCE社製(カタログ番号:23227))により定量した。5mM 2−メルカプトエタノール(ナカライテスク社製(カタログ番号:21418−42))を含む100μlの溶解バッファー(レムリサンプルバッファー)で溶解した。
・免疫染色:コンフルエントに達した細胞をPBS(ニッスイ、カタログ番号:5913)洗浄後、氷冷したエタノール(ナカライテスク、カタログ番号:14713−95)と酢酸(WAKO カタログ番号:017−00256)(95:5)にて10分間固定した。
・ウェスタンブロット法:RIPAバッファーで抽出し得られたタンパク質を7.5%ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はPVDF膜(PALL LIFE SCIENCE社製(カタログ番号:EH−2222))に転写した。5%無脂肪乾燥乳(5%NON FAT DRY MILK、CELL SIGNALING社 カタログ番号:9999)を補った0.1%(vol/vol)ポリエチレンソルビタンモノラウレート(ナカライテスク、カタログ番号:28353−85)を含むTris緩衝化食塩水(10mMTris−HCl、pH7.4;100mM NaCl)(TBS−T)と、ブロットした膜を1時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、ZO−1抗体とNa+/K+−ATPase抗体を5%無脂肪乾燥乳を補ったTBS−Tにて1000倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で1時間反応させた。TBSーTで3回洗浄後、マウス−IgG抗体HRP複合体(CELL SIGNALING社(カタログ番号:7074P2))とインキュベートし、洗浄後、ECL−ADVAVCE Western Blotting Detection Kit(GE ヘルスケア・ジャパン社(カタログ番号:RPN2135V))で発光させたバンドを検出した。フィブロネクチンに対する抗体、コラーゲン1型に対する抗体についても、同様に使用した。次いで、以下の一次抗体:Na+/K+−ATPase(Merck Millipore)、ZO−1、GAPDH(Abcam,Cambridge,UK)、フィブロネクチンおよびSmad2(Cell Signaling Technology)、リン酸化Smad2(Cell Signaling Technology)、ERK1/2(BD)、リン酸化ERK1/2(BD)、p38MAPK(BD)、リン酸化p38MAPK(BD)、JNK(BD)またはリン酸化JNK(BD)(1:1000希釈)、および、HRP標識抗ウサギまたは抗ウサギIgG二次抗体(Cell Signaling Technology)(1:5000希釈)とともにインキュベーションを行った。メンブレンを、ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare,Piscataway,NJ)によって感光させ、次いで、LAS4000S画像化システム(富士フィルム株式会社、東京都)を用いて調べた。
・リアルタイムPCR(半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)):また、以下の方法にてNa+/K+−ATPase、ZO−1、GAPDHに対するPCR法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるINVITROGENから購入し、脱塩処理したものを用いた。自然に線維様形態に変化した角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞を試料とし、Na+/K+−ATPase、ZO−1のmRNA量を半定量的PCR法により調べた。細胞からの総RNAの抽出にはRNEasy(QIAGEN社、カタログ番号:74106)を用いた。抽出したRNAはReverTra Ace(TOYOBO社(カタログ番号:TRT−101))により逆転写反応(42℃、60分間)を行い、TAKARA Taq HotStart Version(タカラバイオ社、カタログ番号:RR001A)によりGAPDHを内部標準としてNa+/K+−ATPase、ZO−1を増幅した。同量のcDNAを、PCR機(GeneAmp 9700;Applied Biosystems)と、下記のプライマーペアによって増幅した。PCR反応には下記に示すプライマーを用いた。フィブロネクチンに対する抗体、コラーゲン1型、4型、インテグリンα5、インテグリンベータ1に対するPCR反応についても、同様に下記プライマーを使用した。
・Na+/K+−ATPase−F−CTTCCTCCGCATTTATGCTCATTTTCTCACCC(配列番号1)
・Na+/K+−ATPase−R:GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC(配列番号2)
・ZO−1-F:GGACGAGGCATCATCCCTAA(配列番号3)
・ZO−1-R:CCAGCTTCTCGAAGAACCAC(配列番号4)
・GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT(配列番号5)
・GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG(配列番号6)
・Collagen 1−F:TCGGCGAGAGCATGACCGATGGAT(配列番号7)
・Collagen 1−R:GACGCTGTAGGT GAAGCGGCTGTT(配列番号8)
・Collagen 4−F:AGCAAGGTGTTACAGGATTGGT(配列番号9)
・Collagen 4−R:AGAAGGACACTGTGGGTCATCT(配列番号10)
・Collagen 8−F:ATGTGATGGCTGTGCTGCTGCTGCCT(配列番号11)
・Collagen 8−R:CTCTTGGGCCAGGCTCTCCA(配列番号12)
・Fibronectin−F:AGATGAGTGGGAACGAATGTCT(配列番号13)
・Fibronectin−R:GAGGGTCACACTTGAATTCTCC(配列番号14)
・integrin α5−F:TCCTCAGCAAGAATCTCAACAA(配列番号15)
・integrin α5−R:GTTGAGTCCCGTAACTCTGGTC(配列番号16)
・ integrin β1−F:GCTGAAGACTATCCCATTGACC (配列番号17)
・ integrin β1−R:ATTTCCAGATATGCGCTGTTTT (配列番号18)
増幅されたDNA断片は1.5%アガロースゲル(ナカライテスク、カタログ番号:01149−76)で電気泳動し、エチジウムブロマイド(ナカライテスク、カタログ番号:14603−51)での染色により検出した。
・定量PCRは、以下のTaqMan(登録商標)(Invitrogen) プライマーを用いて実施した。コラーゲン1型:Hs00164004_m1;フィブロネクチン:Hs01549976_m1; GAPDH:Hs00266705_g1。PCRは、StepOneTM(Applied Biosystems)リアルタイムPCRシステムを用いて行った。GAPDHは内部標準として用いた。
図2で示されるように、従来技術で培養した場合に、線維芽細胞様に形態変化したサル角膜内皮細胞においては正常機能を消失することが示された。正常の形態に培養できたサル角膜内皮細胞と比較すると、線維芽細胞様(fibroblastic)に形態変化することで、サル角膜内皮が機能関連マーカーの発現を消失することを免疫染色、ウェスタンブロット法およびリアルタイムPCR法にて示された。
さらに、線維芽霊長類CECは、細胞外マトリックス等の状況がどうなっているかを調べた。その結果を図2Aに示す。
本比較例では、従来の培養法では角膜内皮細胞の線維化が生じることを確認した(図3)。3T3フィーダー細胞由来の馴化培地は線維芽変化(fibroblastic change)を抑制する。しかし3T3フィーダー細胞由来の馴化培地のみでは継代培養を行うとやはり形質転換にいたることを示す(図3右)。
使用した材料のうち比較例1および2と同じものは比較例1および2と同様に入手し培養等を行った。
・コントロール:コントロールのヒト角膜内皮細胞の培養に用いた培地はOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)+8%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)+200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)+0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)+20μg/ml アスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)+50μg/ml ゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)+5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)である。
・3T3フィーダー細胞用の馴化培地:NIH3T3細胞を0.1%ゼラチンコート(SIGMA社、カタログ番号:G1890−500G)した150mm ディッシュ(FALCON、カタログ番号:3025)に10%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)/DMEM(INVITROGEN、カタログ番号:12320)で播種し、サブコンフルエントまで培養しておく。続いて終濃度0.04mg/mL マイトマイシンC溶液(協和発酵キリン、カタログ番号 874231)にて37℃、5%CO2インキュベーター内で2時間インキュベートする。10%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)/DMEM培地に置換して一晩培養する。このように作成したNIH3T3細胞にOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN、カタログ番号:31985−070)+8%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)+200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA、カタログ番号:C7902−500G)+0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA、カタログ番号:C9819−5G)+20μg/ml アスコルビン酸(SIGMA、カタログ番号:A4544−25G)+50μg/ml ゲンタマイシン(INVITROGEN、カタログ番号:15710−064)+ 5ng/ml EGF(INVITROGEN、カタログ番号:PHG0311)を加えて1晩培養してヒト角膜内皮培養用馴化培地とする。
・培養方法:比較例1と同様の方法で、それぞれの培地を用いて培養した。
・染色等の細胞観察方法:位相差顕微鏡にて細胞の形態を観察した。
図3に示すように、従来法の別法として3T3フィーダー細胞を用いた馴化培地での培養でも、線維化が生じ移植には適しない状態になってしまったことが示された。
本実施例では、形質転換が線維芽細胞様の形態であることに着目して、一般的な細胞種で知られている線維化誘導の際に活性化される経路の活性化についてウエスタンブロット法にて検討した。
使用した材料のうち比較例1〜3と同じものは比較例1〜3と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞:別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、(Nissei Bilis Co., Ltd.,Ohtsu, Japanおよび Keari Co., Ltd. , Wakayama, Japan)角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、ディスパーゼあるいはコラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地は10%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)と2ng/ml 塩基性FGF(INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)を添加したDMEM(INVITROGEN、カタログ番号:12320)を用いた。この際、サル角膜内皮細胞は図1に示したように正常の形態に培養されることもあるが、同様の培養法、長期培養、継代培養により線維芽細胞様に形態変化することが多い。そこで、正常の形態に培養できた細胞と線維芽細胞様に形態変化した細胞を回収してウエスタンブロット法に用いた。
・pSmad2に対する抗体:CELL SIGNALING社から入手したもの(カタログ番号:3108P)を用いた。
・pSmadに対する抗体:CELL SIGNALING社から入手したもの(カタログ番号:5339P)を用いた。
・pp38に対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(p38a/SAPK2aと同じ。カタログ番号:612168)を用いた。
・p38に対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(カタログ番号:612280)を用いた。
・pERK1/2に対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(カタログ番号:612358)を用いた。
・ERK1/2に対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(カタログ番号:610030)を用いた。
・pJNKに対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(カタログ番号:610627)を用いた。
・JNKに対する抗体:BD TRANSDUCTIONL LABORATORIES社から入手したもの(カタログ番号:612540)を用いた。
・細胞画分抽出・調製法:コンフルエントに達した細胞をPBSで3回洗浄後、RIPAバッファー(1×PBS(ニッスイ、カタログ番号:5913)、1% Nonidet P−40(ナカライテスク、カタログ番号:23640−94)、0.5% デオキシコール酸ナトリウム(ナカライテスク、カタログ番号:10712−12)、0.1% SDS(ナカライテスク、カタログ番号:31607−65))で溶解した。得られた細胞溶解液を遠心分離(15000rpm、10分間)し、その上清を回収し、タンパク質をBCA PROTEIN ASSAY KIT(PIERCE社製、カタログ番号:23227)により定量した。5mM2−メルカプトエタノール(ナカライテスク社製、カタログ番号:21418−42)を含む100 μlの溶解バッファー(レムリサンプルバッファー)で溶解した。
・ウェスタンブロット法:RIPAバッファーで抽出し得られたタンパク質を7.5%ポリアクリルアミドで電気泳動した。分離されたタンパク質はPVDF膜(PALL LIFE SCIENCE社製、カタログ番号:EH−2222)に転写した。0.1%(vol/vol)ポリエチレンソルビタンモノラウレート(ナカライテスク、カタログ番号:28353−85)(TBS−T)と5%無脂肪乾燥乳(CELL SIGNALING社、カタログ番号:9999)を補ったTris緩衝化食塩水(10mMTris−HCl、pH7.4;100mMNaCl)と、ブロットした膜を1時間インキュベートすることによりブロッキング操作を行った。この後、Smad2抗体、pSmad2抗体、p38抗体、pp38抗体、ERK抗体、pERK抗体、JNK抗体、およびpJNK抗体を5%NON FAT DRY MILK(CELL SIGNALING社、カタログ番号:9999)を補ったTBS−Tにて1000倍に希釈したものをメンブレンに浸し、室温で1時間反応させた。T−TBSで3回洗浄後、マウス−IgG抗体HRP複合体(CELL SIGNALING社、カタログ番号:7074P2)とウサギ−IgG抗体HRP複合体(GE Healthcare、カタログ番号:NA934)インキュベートし、洗浄後、ECL−ADVAVCE(GE ヘルスケア・ジャパン社、カタログ番号:RPN2135V)で発光させたバンドを検出した。
図4に、線維化の形質転換の原因となりうる主たる経路の活性をサル角膜内皮を用いてウェスタンブロットで検討した結果を示す。線維芽細胞においてSmad2のリン酸化(TGF−β経路の活性化)、p38 MAPKの活性化、JNK経路の活性化が認められた。一方で、ERK1/2のリン酸化は抑制されていた。Smad2、p38、ERK1/2およびJNKは報告によればすべてEMT経路に関与している[Chen KH, et al.(1999) Invest Ophthalmol Vis Sci 40: 2513-2519]、[Kim TY, et al.(2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42: 3142-3149]、[Naumann GO, et al.(2000) Ophthalmology 107: 1111-1124]、[Parsons CJ, et al.(2007) J Gastroenterol Hepatol 22 Suppl 1: S79-84]、[Ma FY, et al.(2009) Front Biosci (Schol Ed) 1: 171-187]ので、本発明者らは、Smad2およびMAPKが、上皮細胞において観察されるEMTと同様の内皮間葉転換に関与するかどうかを検討した。Smad2のリン酸化は、正常表現型のものと比較した場合に、線維芽細胞様表現型において大いに促進されることが分かった(図4)。p38およびERK1/2のリン酸化は、線維芽細胞様表現型において大いに増強されたが、JNKの活性化は無視しうるものであった。ただし、ERKのリン酸化は細胞の線維化による変化のみではなく、細胞増殖による影響があるために、細胞の増殖の状態によっては異なる結果となることがありうることを確認している。これらの知見は、TGF−βシグナル伝達が、CECの線維芽細胞様転換にとって重要な役割を発揮し得ることを示す。
本例では、TGF−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することでサル角膜内皮の形質転換を抑制することができた例を示す。
使用した材料のうち比較例1〜3および実施例1と同じものは比較例1〜3および実施例1と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル角膜内皮細胞:別の目的で安楽死させたカニクイザルの眼球を購入して、(Nissei Bilis Co.,Ltd.,Ohtsu,Japanおよび Keari Co.,Ltd., Wakayama,Japan)角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。この際同一角膜を2分して、サル角膜内皮培養用基本培地(10%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)と2ng/ml 塩基性FGF(INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)を添加したDMEM(INVITROGEN、カタログ番号:12320))および基本培地に1μmol/l SB431542(TOCRIS社、カタログ番号:1614)を添加したものを用いた。
図5に示すように、位相差像は、SB431542の存在下で培養した霊長類CECが真の多角形細胞形状と接触阻害型の単層を示す一方で、コントロールのCECは、線維芽細胞様の形態を示すことを実証した(図4A)。コントロールの基本培地で培養したものは線維芽細胞様に形質転換して重層化を認める一方で、TGF−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで多角形の大小不動の小さい一層の生体同様の形態を示し、サル角膜内皮の形質転換を抑制することができた。
本実施例では、本発明により、培養の正常化の実証として、角膜内皮の機能関連タンパク質が維持されることを実証した。以下に詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。特に実施例2と同様のものを用いた。
・SB431542:TOCRIS社から得た(カタログ番号:1614)。
・Na+/K+−ATPaseに対する抗体:MILLIPORE社製のもの(カタログ番号:05−369)を用いた。
・ZO−1に対する抗体:マウスINVITROGEN社製(カタログ番号:339100)、ウサギZYMED LABORATORIES社製(カタログ番号:61−7300)のものを用いた。
・GAPDHに対する抗体:ABCAM社のもの(カタログ番号:ab36840)を用いた。
・免疫染色等:実施例2と同様に培養した細胞を固定してNa+/K+−ATPaseおよびZO−1に対して免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて撮影した。
・ウエスタンブロット法:実施例1と同様にNa+/K+−ATPase、ZO−1、GAPDHに対するウエスタンブロット法を行った。
・リアルタイムPCR法:また、以下の方法にてNa+/K+−ATPase、ZO−1、GAPDHに対するPCR法を行った。プライマーは、オリゴヌクレオチド合成会社であるINVITROGENから購入し、脱塩処理したものを用いた。自然に線維様形態に変化した角膜内皮細胞および正常角膜内皮細胞を試料とし、Na+/K+−ATPase、ZO−1のmRNA量を半定量的PCR法により調べた。細胞からの総RNAの抽出にはRNEasy(QIAGEN社、カタログ番号:74106)を用いた。抽出したRNAはReverTra Ace(TOYOBO社、カタログ番号:TRT−101)により逆転写反応(42℃、60分間)を行い、TAKARA Taq HotStart Version(タカラバイオ社、カタログ番号:RR001A)によりGAPDHを内部標準としてNa+/K+−ATPase、ZO−1を増幅した。PCR反応には下記に示すプライマーを用いた。
・Na+/K+−ATPase−F−CTTCCTCCGCATTTATGCTCATTTTCTCACCC(配列番号1)
・Na+/K+−ATPase−R−GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC(配列番号2)
・ZO−1-F−GGACGAGGCATCATCCCTAA(配列番号3)
・ZO−1-R−CCAGCTTCTCGAAGAACCAC(配列番号4)
・GAPDH-F−GAGTCAACGGATTTGGTCGT(配列番号5)
・GAPDH-R−TTGATTTTGGAGGGATCTCG(配列番号6)
増幅されたDNA断片は1.5%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した。
図6に示すように、培養により線維芽細胞様に形質転換したサル角膜内皮細胞においては機能関連マーカーであるNa+/K+−ATPase、ZO−1の発現が免疫染色、ウェスタンブロット、PCRにて示された。一方で、TGF−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することでサル角膜内皮の機能関連タンパク質が維持されることが示された。すなわち、SB431542処理したCECがNa+/K+−ATPaseおよびZO−1の特徴的な原形質膜染色を示した一方で、コントロールのCECはその染色を失っており、SB431542処理した細胞では内皮機能が維持されることが示唆された(図6左)。また、Na+/K+−ATPaseおよびZO−1の発現は、タンパク質(図6右上)およびmRNAレベル(図6右下)の両方で、SB431542処理した線維芽細胞様表現型において強力に亢進された。これらのデータは、TGF−βが霊長類CEC培養において観察された内皮間葉転換の直接媒介因子であり得ることをさらに確認した。
本実施例では、TGF−βシグナルがサル角膜内皮の形質転換に関与することを確認するために、TGF−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することを示した(免疫染色)。また、ウェスタンブロットにより、TGF−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することを示した。以下に詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・TGF−β:R&D SYSTEMS社のもの(カタログ番号:240−B)を用いた。
・Na+/K+−ATPaseに対する抗体:MILLIPORE社製のもの(カタログ番号:05−369)を用いた。
・ZO−1に対する抗体:マウスINVITROGEN社製(カタログ番号:339100)、ウサギZYMED LABORATORIES社製(カタログ番号:61−7300)のものを用いた。
・GAPDHに対する抗体:ABCAM社のもの(カタログ番号:ab36840)を用いた。
・pSmad2に対する抗体:CELL SIGNALING社のもの(カタログ番号:3108P)を用いた。
・pSmadに対する抗体:CELL SIGNALING社のもの(カタログ番号:5339P)を用いた。
・培養方法:サル角膜内皮細胞をサブコンフルエントまで培養し、培地中に終濃度0、1、10 ng/mLとなるようにTGF−β1を添加し、37℃で形態に変化が現れるまで培養した。
・染色方法:上記実施例のとおりである。
・細胞画分抽出法:上記実施例のとおりである。
・ウェスタンブロット法:上記実施例のとおりである。
図7に示すように、TGF−βシグナルがサル角膜内皮の形質転換に関与することを確認するために免疫染色を行ったところ、TGF−βを添加して形質転換を誘導し機能関連タンパクが喪失することが示された。すなわち、図7に示すように、正常表現型が、外来性TGF−βに曝露された際に、線維芽細胞様の細胞へと転換することが示された。正常表現型の原形質膜におけるNa+/K+−ATPaseおよびZO−1の染色パターンは、TGF−βに暴露されることにより完全に消失した(図7中列、右列)。
本実施例では、ヒト角膜内皮においても、TGF−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで形質転換を抑制し、正常な内皮を培養することを確認した。以下に詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・酵素結合免疫吸着測定法(ELISA):HCECの培養上清中の1型コラーゲンを、ELISA kits for Collagen Type I Alpha 2(COL1a2)(Uscn Life Science Inc.,Wuhan,China)を製造元の説明書に従って使用して測定した。SB431542と共に、または、SB431542なしで培養したHCEC由来の培養上清を各群(n=5)について使用した。
(結果)
図9に示すように、SB431542を含まない基本培地で培養すると線維芽細胞様に形質転換して、重層化するのに対して、SB431542を培地に添加したものでは多角形の大小不動の少ない一層の細胞が培養される。このことより、サルのみならずヒト角膜内皮においても、TGF−βシグナルをレセプターのリン酸化阻害剤により阻害することで形質転換を抑制し、正常な内皮を培養することが確認された。すなわち、霊長類CECにおいて観察された興味深い知見から、HCECが、内皮間葉転換に至る同様の望ましくない細胞の不可避の変化に供されたかどうかをさらに検討した。最も興味深いことに、培養HCECは、特徴的な接触阻害型の単層構造と、多角形表現型を失い、そして、霊長類CECのような線維芽細胞様の細胞形態を獲得した(図9)。
次に、本発明者らは、SB431542が内皮細胞の機能を維持することができるかどうか試験した。ここでは、SB431542が、HCECの機能を維持し、HCECの線維芽細胞様の変化を抑制することを種々の実験を用いて実証した。結果を図9Aに示す。
本実施例では、上述の実施例で用いたSB431542以外の方法としてBMP−7を用いてもTGF−βシグナルを拮抗させヒト角膜内皮の形質転換を抑制することができることを実証した。以下にその詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・BMP−7:R&D SYSTEMS社のもの(カタログ番号:354−BP)を用いた。
・ファロイジン:Alexa Fluor(登録商標)488(INVITROGEN、カタログ番号:A12379)を用いた。
・培養方法:図3と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を馴化培地にて培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、同様の馴化培地にBMP−7(100ng/ml)を添加した培地で培養したものと、コントロールとして同様の馴化培地にて培養したものを比較した。
・位相差顕微鏡およびファロイジンによる細胞骨格の染色による形態観察において、コントールでは線維芽細胞様に形質転換して重層化する一方で、BMP−7添加培地では一層の多角形細胞の形態を維持できた。
図10に示すように、SB431542以外の方法としてBMP−7を用いてもTGF−βシグナルを拮抗させサル角膜内皮の形質転換を抑制することができた。BMP−7はSB431542とは他の詳細な伝達経路は異なるもののTGF−βシグナルに関連する因子としては共通することが知られている。すなわち、TGF−βシグナル伝達経路は、ALK4,5または7を経由するSmad2/3系と、ALK1,2,3または6を経由するSmad1/5/8系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている。したがって、実質的にTGF−βシグナル全般を抑制することにより、角膜内皮の形質転換を抑制することができることが理解される。理論に束縛されることを望まないが、Smad2/3(ALK4、5および7に関連する)を介して効果を奏するSB431542、Smad1/5/8(ALK1、2、3および6に関連する)を介して効果を奏するBMP−7の両方で正常化が観察されていることから、これらのいずれの経路のTGF−βシグナル阻害剤であっても、本発明の効果を達成することができると理解される。TGF−βシグナル伝達経路は、ALK4/5/7を経由するSmad2/3系と、ALK1/2/3/6を経由するSmad1/5/8系とに大きく分類され、いずれも線維化に関連していることがよく知られている(J.Massagu’e, Annu.Rev.Biochem. 1998. 67:753-91;Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1):e3; Leask,A., Abraham,D.J. FASEB J.18,816-827 (2004); Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010) 11, 97-105; Joel Rosenbloom et al.,Ann Intern Med.2010;152:159-166.)。したがって、2種類の代表的なTGF−βシグナル阻害剤のいずれによっても培養正常化が達成し得たことから、これらの結果から、Smad経路を問わず、どのようなTGF−βシグナル阻害剤であっても、培養正常化剤として機能しうることが理解される。
次に、3種類の濃度を用いて、BMP7がHCEC線維芽細胞様への変化を抑制し、その機能を維持することを示した。BMP−7はMETを促進し、TGF−β媒介性の上皮間葉転換を特異的に阻害する。したがって、この分子は、EMTプロセスをアンタゴナイズするために使用されている[ZeisbergM,et al.(2003) Nat Med 9: 964-968]、[Simic P, et al.(2007)EMBO Rep 8:327-331]、[BuijsJT,et al.(2007) Am J Pathol 171: 1047-1057]、[ZeisbergM, et al.(2007) J BiolChem282: 23337-23347]。それゆえ、本発明者らは、BMP−7がHCECの不可避の変化をアンタゴナイズできたかどうかを検討した。線維芽細胞様HCECを、10〜1000ng/mlの範囲の濃度のBMP−7で処理した。
本実施例では、TGF−βシグナル伝達においてp38 MAPKの阻害剤でもあるSB203580を、SB431542に加えて用いることによって、培養正常化が強化されることを示す。以下に詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
図11に示すように、TGF−βシグナル伝達においてp38 MAPKの阻害剤でもあるSB203580を、SB431542に加えて用いることによって、培養正常化が強化されることが実証され、さらに老化により活性化することが知られているp38 MAPKの阻害剤であるSB203580を添加することで、老化することで低下することが知られている角膜内皮密度が上昇した。このことからSB203580の老化抑制(未分化維持)の効果も追加的に発揮されることにより、効果が増強されることが理解される。このように、p38 MAPK阻害に加えてTGF−βシグナル阻害によりヒト角膜内皮細胞が、継代を繰り返しても高密度で形態保持したヒト角膜内皮細胞(HCEC)の培養が可能になり、培養の正常化がより強化されることが分かった(継代を繰り返しても高密度で形態保持したHCECができることを示す)。
以上の実施例等の結果から、ヒト角膜内皮細胞の好ましい培養法の確立を試みた。以下にその詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
初代培養および継代培養時には接着促進作用をもつRhoキナーゼ阻害剤であるY−27632(WAKOあるいはTOCRIS)を最終濃度10μmol/lとして48時間添加した。
Rhoキナーゼ阻害剤であるY−27632(WAKO、カタログ番号:253−00513)を最終濃度10μmol/lとして培養中は常に添加した。
Y−27632を添加しないで基本培地としてSB431542(1μmol/l)およびSB203580(1μmol/l)を添加したもので培養した。
図13に示すのは最終的に確立されたヒト角膜内皮細胞培養の1例であり、この図および図12で示されるように、培養法1〜培養法3のいずれにおいても、ヒト角膜内皮細胞をその正常な機能を維持しつつ多角形の一層の正常の形態を示す細胞として高密度で増幅させることが確認され、標準培養法の例を確立することができた。
実施例8で確立された培養法のうち培養法3により培養したヒト角膜内皮細胞を、霊長類であるカニクイザルを用いた角膜内皮不全モデル(水疱性角膜症モデル)に移植した結果を示す。接着促進作用を有するROCK阻害剤とともに培養したヒト角膜内皮細胞を移植することにより角膜の透明治癒が得られることを示す。これは本発明において培養したヒト角膜内皮細胞が生体においても正常な機能を発現して、再生医療に応用できることを示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・カニクイザル:滋賀医科大学動物生命科学研究センターにおいて倫理審査を得たのちに、可能な限り動物愛護的に以下の検討を行った。
本実施例では、抗TGF−β中和抗体でも同様に培養正常化が達成されるか確認した。薬剤を交換すること以外は、上記比較例および実施例に準じて実験をした。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・抗TGF−β中和抗体:R&D SYSTEMS社のもの(カタログ番号:MAB240)を用いた。
・培養方法:図3の結果を示した方法(比較例3等を参照)と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、通常培地としてOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)+8%ウシ胎仔血清(FBS)(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)+200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)+0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)+20μg アスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)+50μg/ml ゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)+5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)で培養したものと、これにTGF−β中和抗体(500ng/ml)を添加した培地で培養したものを比較した。
・位相差顕微鏡による形態観察において、図16に示されるように、通常培地では形質転換して多角形細胞の形態を喪失し、大小不動の細胞が多く認められる一方で、TGF−β中和抗体添加培地では高密度の一層の多角形細胞の形態を維持できた。霊長類CECと一致して、CECを、TGF−β受容体に対する特異的インヒビター(SB431542)とともに培養した場合、このインヒビターは、細胞の形状が線維芽細胞様表現型に変化することをブロックすることができた。線維芽細胞様表現型に対するSB431542の阻害作用と同様に、TGF−βに対する中和抗体(図16B)もまた、細胞が線維芽細胞様表現型を獲得するのをブロックした。
本実施例では、上述の実施例で用いたSB431542以外の方法としてSmad3阻害剤を用いてTGF−βシグナルを阻害させヒト角膜内皮の形質転換を抑制することができることを実証した。以下にその詳細を示す。
使用した材料のうち上記比較例および実施例と同じものは上記比較例および実施例と同様に入手し培養等を行った。
・Smad3阻害剤:Calbiochem社の6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン(カタログ番号:566405)を用いた。Smad3阻害剤は、Merck Milliporeからも入手可能である。
・培養方法:図3の結果を示した方法(比較例3等を参照)と同様の方法でヒト角膜内皮細胞を培養した。続いてトリプシンにて継代培養を行ったが、通常培地としてOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985−070)+8%ウシ胎仔血清(FBS)(BIOWEST、カタログ番号:S1820−500)+200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902−500G)+0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819−5G)+20μg アスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544−25G)+50μg/ml ゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710−064)+5ng/ml EGF(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)で培養したものと、これにSmad3阻害剤(0.3mMおよび3mM)を添加した培地で培養したものを比較した。
視覚障害をともなう角膜内皮機能不全は、角膜移植手術の主要な適応症である[Darlington JK, et al.(2006) Ophthalmology 113: 2171-2175]、[Price MO, et al.(2010) Clin Experiment Ophthalmol 38: 128-140]。角膜移植は角膜内皮機能不全について広く行われているが、研究者らは現在、健康な角膜内皮を回復させるための代替的な方法を探究している。角膜内皮が、若いドナーから培養され、「マスター細胞」としてストックすることにより、高い機能的能力を持つ細胞の移植が可能となる。加えて、拒絶のリスクを低下させるためのHLA適合移植[Khaireddin R, et al.(2003) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 241: 1020-1028]、[Coster DJ, et al.(2005) Am J Ophthalmol 140: 1112-1122]が可能となる。組織生体工学は、視力を失った患者のための治療を開発するための新たなアプローチである[Engelmann K, et al.(2004) Exp Eye Res 78: 573-578]。今日までに、生体工学的アプローチを利用する2つの方法が存在する:1)生体工学コンストラクト上に接着させた培養ドナーHCECの使用[Ishino Y, et al.(2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 800-806]、[Mimura T, et al.(2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45: 2992-2997]、[Koizumi N, et al.(2007) Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 4519-4526]、[Koizumi N, et al.(2012) Exp Eye Res 95: 60-67]、そして、2)前眼房内への培養HCECの移植[Okumura N, et al.(2012) Am J Pathol 181: 268-277]、[Mimura T, et al.(2003) Exp Eye Res 76: 745-751]、[Mimura T, et al.(2005) Invest Ophthalmol Vis Sci 46: 3128-3135]、[Patel SV, et al.(2009) Invest Ophthalmol Vis Sci 50: 2123-2131]。臨床の状況に対してこれら2つの方法のいずれを応用するかに関わらず、HCECのための効率的な培養技術の確立は、必須かつ不可避である[Peh GS, et al.(2011) Transplantation 91: 811-819]。多くの研究者が、HCECの不変で長期の培養を確立することが非常に難しいことを認めている[Engelmann K, et al.(2004) Exp Eye Res 78: 573-578]。HCECの首尾よい培養がいくつかのグループによって報告されているが、単離およびその後の培養プロトコールにともなう手順は、研究室間で非常に多様である[Peh GS, et al.(2011) Transplantation 91: 811-819]。最も困難な問題の1つは、HCECが、各継代ごとに甚だしい線維芽細胞様の変化を受けやすいことである[Engelmann K, et al.(2004) Exp Eye Res 78: 573-578]。それゆえ、移植の目的での後の使用のために生理学的表現型を維持するためには、CECの自発的な転換を回避する手段を見出すことが必須である。
本実施例では、他のTGF−βシグナル阻害剤でも同様に培養正常化が達成されるか確認する。薬剤を交換すること以外は、上記実施例に準じて実験をすることができる。
・A83−01(TOCRIS社またはミルテニーバイオテク(Miltenyi Biotec)社から入手可能):A83−01はI型TGF−b受容体ALK5、Activin/Nodal受容体ALK4、Nodal受容体ALK7の選択的阻害物質である。
・StemoleculeTM ALK5インヒビター(ミルテニーバイオテク(Miltenyi Biotec)社から入手可能):I型TGF−b受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ(activin receptor−like kinase)(ALK5)の選択的なATP競合的阻害物質である。
・LDN−193189(ミルテニーバイオテク(Miltenyi Biotec)社から入手可能):BMP Type I受容体ALK2およびALK3を阻害する。
・SmadのsiRNA(標準的な方法で合成する。)
これらを上記実施例で使用されたSB431542またはBMP−7に代えて用いて同様の実験を行い、培養正常化を確認する。
本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜内皮シート調製用培養液を以下のようにして製造する。
SB431542 3.8439mg
SB203580 3.7743mg
FBS 10mL
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 1mL
FGF basic 200ng
DMEM 適量
全量 100mL
FBSは例えば、BIOWEST(カタログ番号:S1820−500)またはインビトロジェン製、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液はナカライテスク製(ペニシリン 5000u/mL,ストレプトマイシン 5000μg/mL含有)、FGF basicは例えば、インビトロジェン製(INVITROGEN、カタログ番号:13256−029)、SB431542はTOCRIS社製、SB203580はCALBIOCHEM社製、DMEMはインビトロジェン製を用いることができる。
本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。
SB431542 3.8439mg
SB203580 3.7743mg
Optisol−GS(Bausch−Lomb) 適量
全量 100mL
各成分は、実施例12と同様に入手することができる。
本実施例では、実施例8で確立した手法または同等の方法により調製したウサギ角膜内皮細胞を使用する。また、本実施例では、実施例9と同様の方法により調製した細胞接着促進剤としてのRhoキナーゼ阻害剤または対照物質を使用する。
点眼剤の調製例
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
塩化ナトリウム 0.85g
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mg(pH7.0)。
リン酸二水素ナトリウム二水和物 0.1g
ベンザルコニウム塩化物 0.005g
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量100mg(pH7.0)。
配列番号2:Na+/K+−ATPaseのリバースプライマー;GGATGATCATAAACTTAGCCTTGATGAACTC
配列番号3:ZO−1のフォワードプライマー;GGACGAGGCATCATCCCTAA
配列番号4:ZO−1のリバースプライマー;CCAGCTTCTCGAAGAACCAC
配列番号5:GAPDHのフォワードプライマー:GAGTCAACGGATTTGGTCGT
配列番号6:GAPDHのリバースプライマー:TTGATTTTGGAGGGATCTCG
配列番号7:Collagen 1のフォワードプライマー:TCGGCGAGAGCATGACCGATGGAT
配列番号8:Collagen 1のリバースプライマー:GACGCTGTAGGT GAAGCGGCTGTT
配列番号9:Collagen 4のフォワードプライマー:AGCAAGGTGTTACAGGATTGGT
配列番号10:Collagen 4のリバースプライマー:AGAAGGACACTGTGGGTCATCT
配列番号11:Collagen 8のフォワードプライマー:ATGTGATGGCTGTGCTGCTGCTGCCT
配列番号12:Collagen 8のリバースプライマー:CTCTTGGGCCAGGCTCTCCA
配列番号13:Fibronectinのフォワードプライマー:AGATGAGTGGGAACGAATGTCT
配列番号14:Fibronectinのリバースプライマー:GAGGGTCACACTTGAATTCTCC
配列番号15:integrin α5のフォワードプライマー:TCCTCAGCAAGAATCTCAACAA
配列番号16:integrin α5のリバースプライマー:GTTGAGTCCCGTAACTCTGGTC
配列番号17:integrin β1のフォワードプライマー:GCTGAAGACTATCCCATTGACC
配列番号18:integrin β1のリバースプライマー:ATTTCCAGATATGCGCTGTTTT
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- 図面に記載の発明。
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