JP2020073483A - 角膜内皮ecm治療薬 - Google Patents
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Abstract
Description
より、フックス角膜内皮ジストロフィ等に見られる、コラーゲン等の細胞外マトリクス(ECM)の沈着を抑えることができることを見出し、ECM関連の障害を処置または予防しうる技術を見出し、本発明を完成した。したがって、本願発明は以下のような発明を提供する。
(1)TGFβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の細胞外マトリクス(ECM)異常に関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬。
(2)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である、項目1に記載の処置または予防薬。
(3)前記疾患、障害または状態は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、角膜実質の浮腫、水疱性角膜症および角膜混濁からなる群より選択される少なくとも1つを含む、項目1または2に記載の処置または予防薬。
(4)前記TGFβシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミド、BMP−7、抗TGF−β抗体、抗TGF−βレセプター抗体、TGF−βのsiRNA、TGF−βレセプターのsiRNA、TGF−βのshRNA、TGF−βレセプターのshRNA、TGF−βのアプタマー、TGF−βレセプターのアプタマー、TGF−βのアンチセンスオリゴヌクレオチド、6,7−ジメトキシ−2−((2E)−3−(1−メチル−2−フェニル−1H−ピロロ[2,3−b]ピリジン−3−イル−プロプ−2−エノイル))−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノロン、3−(6−メチル−2−ピリジニル)−N−フェニル−4−(4−キノリニル)−1H−ピラゾール−1−カルボチオアミド、2−(3−(6−メチルピリジン−2−イル)−1H−ピラゾール−4−イル)−1,5−ナフチリジン、6−(4−(ピペリジン−1−イル)エトキシ)フェニル)−3−(ピリジン−4−イル)ピラゾロ[1,5−a]ピリミジン、2−(5−クロロ−2−フルオロフェニル)−4−[(4−ピリジニル)アミノ]プテリジン、4−[3−(2−ピリジニル)−1H−ピラゾール−4−イル]−キノリン、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも1種含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(5)前記TGF−βシグナル阻害剤は、4−[4−(1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−5−(2−ピリジニル)−1H−イミダゾール−2−イル]ベンズアミドまたはその薬学的に許容可能な塩を含む、項目1〜4のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(6)前記角膜内皮は霊長類のものである、項目1〜5のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(7)前記角膜内皮はヒトのものである、項目1〜6のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(8)さらなる医薬成分を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(9)点眼薬である、項目1〜8のいずれか1項に記載の処置または予防薬。
(10)角膜内皮の細胞外マトリクス(ECM)異常に関連する障害の処置または予防のためのTGFβシグナル阻害物質。
(10A)前記TGFβシグナル阻害物質は、(1)〜(9)のいずれか1項の阻害剤の特徴を有する、(10)に記載のTGFβシグナル阻害物質。
(11)被験体における角膜内皮の細胞外マトリクス(ECM)異常に関連する障害の処置または予防のための方法であって、該方法は該被験体に対して有効量のTGFβシグナル阻害剤を投与する工程を包含する、方法。
眼薬等でも実現可能な技術を提供する。
本明細書において「iFECD」(immobilized Fuchs’ endothelial corneal dystrophy)は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel, F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A.(1990).PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A.et al.(1995).PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J.et al.(1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press、Gait, M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRLPress; Gait, M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F.(1991).Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman&Hall; Shabarova, Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T.(1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入&発現解析実験法」羊土社、1997などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告{Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7}がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分(全部であり得る)が参考として援用される。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
1つの局面において、本発明はTGFβシグナル阻害剤を含む、角膜内皮の細胞外マトリクス(ECM)異常に関連する疾患、障害または状態の処置または予防薬を提供する。本発明では、角膜内皮においてECMが関連する疾患、障害または状態を、TGFβシグナル阻害剤を投与することによって、予想外にECMの異常を低減または消失させることができたことを見出した。したがって、このようなTGFβシグナル阻害剤の角膜内皮の細胞外マトリクス(ECM)異常に関連する疾患、障害または状態の処置または予防のための用途は従来の知見からは予想できなかった用途であるといえる。
含まれる。
00ng/mlの濃度で存在するように含まれていてもよい。
本例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株(iFECD)を作製した。
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はOpti−MEM I Reduced−Serum Medium, Liquid(INVITROGEN カタログ番号:31985-070)に、8%FBS(BIOWEST、カタログ番号:S1820-500)、200mg/ml CaCl2・2H2O(SIGMA カタログ番号:C7902-500G)、0.08% コンドロイチン硫酸(SIGMA カタログ番号:C9819-5G)、20μg/mlアスコルビン酸(SIGMA カタログ番号:A4544-25G)、50μg/mlゲンタマイシン(INVITROGEN カタログ番号:15710-064)および5ng/ml EGF
(INVITROGEN カタログ番号:PHG0311)を加えた3T3フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にSB431542(1μmol/l)およびSB203580(4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルホニルフェニル)−5(4−ピリジル)イミダゾール<4−[4−(4−フルオロフェニル)−2−(4−メチルスルフィニルフェニル)−1H−イミダゾール−5−イル]ピリジン)(1μmol/l)を添加したもの(「SB203580+SB431542+3T3馴化培地」という)で培養した。
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植(デスメ膜内皮角膜移植=DMEK)を実施されたヒト患者3名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。DMEKの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるOptisol−GS(ボシュロム社)に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、SB203580+SB431542+3T3馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はSV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子をPCRにより増幅して、レンチウイルスベクター(pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc)に導入した。その後、レンチウイルスベクターを3種類のヘルパープラスミド(pLP1、pLP2、pLP/VSVG; Life Technologies Inc.)とともにトランスフェクション試薬(Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI)を用いて293T 細胞 (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan)に感染させた。48時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、5μg/mlのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、SV40ラージT抗原およびhTERT遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した(iHCEC)。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株(iHCEC)および不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の位相差顕微鏡像をみると、iHCECおよびiFECDはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。iHCECおよびiFECDはDMEM+10%FBSにより維持培養を行ったSB431542は、TOCRIS社から得た(カタログ番号:1614)。SB203580はCALBIOCHEMから得た(カタログ番号:559389)。
本実施例では、不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の正常機能の確認を行った。
まず、不死化角膜内皮細胞株(iFECD)の正常機能の確認のために、Na+/K+−ATPaseおよびZO−1による免疫染色を行った。角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能を確認するためである。Na+/K+−ATPaseおよびZO−1はそれぞれ、角膜内皮細胞の機能であるポンプ機能、バリア機能の正常性を示す。手法は以下のとおりである。
細胞観察は位相差顕微鏡にて行った。また、細胞を固定した後に機能関連マーカーとしてZO−1、Na+/K+−ATPaseを用いて免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。組織染色検査のために、培養した細胞をLab−TekTM Chamber SlidesTM(NUNC A/S, Roskilde, Denmark)に入れ、4%ホルムアルデヒドで10分間室温(RT)で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。具体的には、Lab−TekTMChamber SlidesTM(NUNC A/S, Roskilde, Denmark)上の培養細胞を室温で10分間4%ホルムアルデヒド中で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。細胞の表現型を調べるために、密着結合関連タンパク質であるZO−1(Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA)、ポンプ機能に関連するタンパク質であるNa+/K+−ATPase(Upstate Biotec, Inc., Lake Placid, NY)の免疫組織化学分析を行った。細胞の機能に関連するマーカーとしてZO−1およびNa+/K+−ATPaseを使用した。ZO−1、Na+/K+−ATPaseの染色は、それぞれ、ZO−1ポリクローナル抗体、Na+/K+−ATPaseモノクローナル抗体の1:200希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488標識、または、Alexa Fluor(登録商標)594標識ヤギ抗マウスIgG(Life Technologies)の1:2000希釈を使用した。次いで、細胞の核をDAPI(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)またはPI(Sigma−Aldrich)で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(TCS SP2 AOBS;Leica Microsystems, Welzlar, Germany)で観察した。
本実施例では、iHCECおよびiFECDについて、細胞外マトリックスの産生に関わる上皮間葉系移行(EMT)にかかわる遺伝子についてリアルタイムPCRを用いて発現量の解析を行った結果を示す。
・リアルタイムPCR法:また、以下の方法にてSnail1、Snail2またはZEB1に対するTaqman法にてPCRを行った。TaqmanプローブはINVITROGENから購入した。I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンのmRNA量をリアルタイムPCR法により調べた。細胞からの総RNAの抽出にはRNEasy(QIAGEN社、カタログ番号:74106)を用いた。抽出したRNAはReverTra Ace(TOYOBO社、カタログ番号:TRT−101)により逆転写反応(42℃、60分間)を行い、反応試薬TaqMan Fast Advanced mastermix(Applied Biosystems)によりGAPDHを内部標準としてI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンを増幅した。PCR反応には下記に示すプローブ (Applied Biosystemsから入手可能な標識プライマーセット)を用いて、StepOneTM (Applied Biosystems) real-time PCR systemにより行った。
Snail1 Hs00195591_ml SNAI1
Snail2 Hs00950344_ml SNAI2
ZEB1 Hs00232783_ml ZEB1
GAPDH TaqMan(R)pre developed Assay Reagents Human GADPH (cat no.: 4333764F)。
結果を図1に示す。図1に示されるように、細胞外マトリックスの産生に関わる上皮間葉系移行(EMT)にかかわる遺伝子についてリアルタイムPCRを用いて発現量の解析を行ったところ、Snail1およびZEB1においてiFECDにおいてiHCECと比較して有意に発現の亢進を認めた。
Snail1およびZEB1の発現亢進が細胞外マトリックスの産生に関わるかどうかを確認するために、Snail1およびZEB1の発現を促進することが知られているTGFβにて刺激を行った。手法は以下のとおりである。iFECDおよびiHCECを10%ウシ胎児血清を含むDMEMで培養し、10%ウシ胎児血清を含まないDMEMにて一晩培養したのちにリアルタイムPCR法にてSnail1、ZEB1、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現を調べた。PCR反応には下記に示すプローブを用いて、StepOneTM (Applied Biosystems) real-time PCR systemにより行った。
Snail1 Hs00195591_ml SNAI1
ZEB1 Hs00232783_ml ZEB1
I型コラーゲン Hs00164004_ml COL1A1
IV型コラーゲン Hs00266327_ml COL4A1
VIII型コラーゲン Hs00697025_ml COL8A2
フィブロネクチン Hs01549976_ml FN1
GAPDH TaqMan(R)pre developed Assay Reagents Human GADPH (cat no.: 4333764F)。
本実施例では、 iFECDが産生する細胞外マトリックスはTGFβにより促進されるかについての検討を行った。
本実施例では、Snail1およびZEB1の発現亢進が細胞外マトリックス産生の原因であることを実証するために、siRNAを用いてSnail1およびZEB1を抑制して、細胞外マトリックス産生に与える影響を検討した。実験の手順は以下のとおりである。
iFECDおよびiHCECを播種してSnail1 Stealth RNAiTM (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)またはZEB1 Stealth RNAiTM (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)およびLipofectamineTM RNAiMAX(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)とともに37°Cにて12時間インキュベートした。ランダムな配列のRNAiをコントロールとして用いた。その後、細胞を継代して実験に用いた。3種類づつのSnail1 Stealth RNAiTMおよびZEB1 Stealth RNAiTMを用いて実験を行い代表例を結果として示した。siRNAにてSnail1またはZEB1をノックダウンした細胞を播種し、リアルタイムPCR法にてSnail1、ZEB1、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現を調べた。PCR反応には下記に示すプローブを用いて、StepOneTM(Applied Biosystems)real-time PCR systemにより行った。
siRNA
Snail1のsiRNA (SNAI1 HSS143995*、SNAI1 HSS143996、SNAI1 HSS143997)
ZEB1のsiRNA (ZEB1 HSS110548*、ZEB1 HSS110549、ZEB1 HSS186235)
ただし、結果に示したsiRNAを*として表記した。
Snail1 Hs00195591_ml SNAI1
ZEB1 Hs00232783_ml ZEB1
I型コラーゲン Hs00164004_ml COL1A1
IV型コラーゲン Hs00266327_ml COL4A1
VIII型コラーゲン Hs00697025_ml COL8A2
フィブロネクチン Hs01549976_ml FN1
GAPDH TaqMan(R)pre developed Assay Reagents Human GADPH (cat no.: 4333764F)。
結果を図4に示す。siRNAによりSnail1およびZEB1の発現が抑制されることを確認した(A, F)。siRNAによるSnail1またはZEB1の発現抑制により、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が有意に抑制された。この結果から、ZEB1またはSnail1は細胞外マトリクス構成タンパク質の遺伝子発現を不に制御することがわかった。
次に、免疫染色によりI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が抑制されていることを確認した。免疫染色の手法は、上記調製例2に準じ、抗体については、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンの抗体に代えて実験を行った。
・I型コラーゲンに対する抗体:Anti collagen type I (Rabbit polyclonal)
(ROCKLLANDTM antibodies and assays、Cat no.: 600-401-103S)
IV型コラーゲンに対する抗体:collagen type IV (Rabbit polyclonal)(Abcam、Cat no.: ab6586)
フィブロネクチンに対する抗体:Anti-fibronectin (mouse monoclonal)(BD Biosciences、Cat no.: 610077)
組織染色検査のために、培養した細胞をLab−TekTM Chamber SlidesTM(NUNC A/S, Roskilde, Denmark)に入れ、4%ホルムアルデヒドで10分間室温(RT)で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。具体的には、Lab−TekTMChamber SlidesTM(NUNC A/S, Roskilde, Denmark)上の培養細胞を室温で10分間4%ホルムアルデヒド中で固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)とともに30分間インキュベートした。細胞の産生する細胞外マトリックの発現を調べるために、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンに対する抗体をそれぞれ1:200希釈を用いて実施した。二次抗体には、Alexa Fluor(登録商標)488標識、または、Alexa Fluor(登録商標)594標識ヤギ抗マウスIgG(Life Technologies)の1:2000希釈を使用した。次いで、細胞の核をDAPI(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)またはPI(Sigma−Aldrich)で染色した。次いで、スライドを蛍光顕微鏡(TCS SP2 AOBS;Leica Microsystems, Welzlar, Germany)で観察した。
結果を図5に示す。図5に示されるように、siRNAによるSnail1またはZEB1の発現抑制により、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現がタンパク質レベルにおいても抑制されることを確認した。
本実施例では、Snail1またはZEB1の発現抑制による、iFECDの細胞外マトリックスの過剰産生が抑制されることを確認した。
結果を図6に示す。図6に示されるように、siRNAによるSnail1またはZEB1の発現抑制により、iFECDの細胞外マトリックスの過剰産生は抑制され正常レベルとなった。したがって、ZEB1またはSnailの抑制によりフックス角膜内皮ジストロフィ細胞の過剰な細胞外マトリクス産生を抑制することができることが見出された。
次に、TGFβシグナル阻害剤であるSB431542を用いてTGFβシグナルを阻害し角膜内皮における細胞外マトリックス異常の調節ができるかを実験した。SB431542は、TOCRIS社から得た(カタログ番号:1614)。
リアルタイムPCRにより遺伝子発現量を確認した。リアルタイムPCRは上記実施例に準じて行った。I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンについては、以下のプローブを用いた。
IV型コラーゲン Hs00266327_ml COL4A1
VIII型コラーゲン Hs00697025_ml COL8A2
フィブロネクチン Hs01549976_ml FN1
GAPDH TaqMan(R)pre developed Assay Reagents Human GADPH (cat no.: 4333764F)
(結果)
結果を図7に示す。図7に示すように、リアルタイムPCR によりSnail1およびZEB1の有意な発現量の低下を認めた。さらに、SB431542によりiFCEDの細胞外マトリックスの構成タンパク質の遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより解析したところ、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現が有意に抑制された。
次に、同様に免疫染色によりI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンの発現を検討した。免疫染色は、上記実施例に準じて行ったがI型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチンについての抗体は以下を用いた。
・I型コラーゲンに対する抗体:Anti collagen type I (Rabbit polyclonal)
(ROCKLLANDTM antibodies and assays、Cat no.: 600-401-103S)
IV型コラーゲンに対する抗体:collagen type IV (Rabbit polyclonal)(Abcam、Cat no.: ab6586)
フィブロネクチンに対する抗体:Anti-fibronectin (mouse monoclonal)(BD Biosciences、Cat no.: 610077)
(結果)
結果を図8に示す。図8に示されるように、SB431542を用いたTGFβシグナル阻害により、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、VIII型コラーゲン、フィブロネクチンの発現がタンパク質レベルにおいても抑制されることを確認した。
本実施例では、1週間後にコンフルエントの状態で固定した場合のTGFβシグナル阻害剤の効果を確認した。
結果を図9に示す。図9に示すように、SB431542を用いたTGFβシグナル阻害により、iFECDの細胞外マトリックスの過剰産生は抑制され正常レベルとなった。
Claims (1)
- 図面に記載の発明。
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