JP6273636B2 - カスパーゼ阻害剤を含む、ＴＧＦ−βに起因する障害を治療または予防するための医薬およびその応用 - Google Patents

Description

本発明は、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤、ならびにこの技術を応用した角膜内皮細胞の保存技術に関する。

視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。

ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来し角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、その結果、角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。また、フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。このように、フィブロネクチンなどの細胞外マトリクスはまた、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）や、デスメ膜の混濁グッテー等の視力低下の原因となる症状に関連しており、曇り、角膜混濁や白斑などの角膜の濁りに関連する角膜内皮障害の主な原因となりうる。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。

フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養(非特許文献１および３)や不死化の報告(非特許文献２)があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。

また特許文献１は、角膜の線維症および／または濁りを治療するためのＴＧＦ−β１インヒビターペプチドを開示する。特許文献２はＴＧＦ−β１，２，３に結合する抗体を開示する。特許文献３は、角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ること角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ることを開示する。特許文献４は、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）と結合することができ、かつ、サイトカインとの直接的結合によりＴＧＦ−β１の生物活性の強力な阻害剤となるペプチドを開示する。特許文献５は、ＢＭＰ‐７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤を開示する。特許文献６は、ＴＧＦ−β阻害作用が治療上または予防上有効である疾患として、角膜障害を概括的に記載する。

特表2013-520405公報 国際公開第2012/167143号 国際公開第2012/009171号 特表2007-525204号公報 特表2006-508169号公報 国際公開第2004/018430号

Zaniolo K, et al. Exp Eye Res.;94(1)：22-31. 2012 Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2；52(13)：9291-9297. 2011 Kelliher C. et al. Exp Eye Res Vol.93(6), 880-888, 2011

本発明者らは、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルの細胞において、トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）に代表される薬剤を用いることでＴＧＦ−βシグナルが障害を生じることを見出し、このような障害が、驚くべきことにカスパーゼ阻害剤によって治療可能であることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明者らは、ミトコンドリア異常がカスパーゼ阻害剤により治癒可能であることを見出した。これらにより、本発明は、カスパーゼ阻害剤を、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）および／またはミトコンドリア異常に起因する角膜内皮障害（特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害）の治療または予防に使用することに応用することを見出し、本発明を完成するに至った。フックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮障害では、細胞死（特にアポトーシス）の抑制を主なターゲットとして治療または予防が試みられているが、視機能という点では細胞外マトリクス（ＥＣＭ）（例えば、フィブロネクチン等）の過剰産生が主因とされる濁りにより視機能が良好ではなくなるという点も指摘されている。細胞死と細胞外マトリクスとは独立した事象であるため、両方を抑制することができることは好ましい。本発明では、本発明者らは、カスパーゼを阻害することにより、予想外にフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現を抑制することができることを見出した。これにより、本発明者らは、カスパーゼ阻害剤を、細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害（例えば、グッテー、デスメ層の肥厚、角膜混濁、白斑などの濁りの症状など）の改善、治療または予防にも応用可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、カスパーゼ阻害剤が、角膜内皮細胞の凍結保存による細胞障害を抑制することも見出した。

したがって、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
（項目２）前記症状、障害または疾患はＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に関連するものである、項目１に記載の医薬。
（項目３）前記ミトコンドリア異常が、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、およびミトコンドリア生合成の低下のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目１に記載の医薬。
（項目４）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される、項目１に記載の医薬。
（項目５）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目１〜４のいずれかに記載の医薬。
（項目６）前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞のミトコンドリア膜電位低下を抑制することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの進行を防止するものである、項目５に記載の医薬。
（項目７）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存または保存後の培養のための組成物。
（項目８）前記保存は凍結保存である、項目７に記載の組成物。
（項目９）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物。
（項目１０）ｐ３８ＭＡＰキナーゼをさらに含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ−３阻害剤である、項目１〜１０のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目１１Ａ）前記カスパーゼ阻害剤は、ｐａｎカスパーゼ阻害剤である、項目１〜１１のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目１２）前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、エムリカサンおよびニボカサンからなる群より選択される、項目１〜１１または１１Ａのいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目１３）前記Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約１００μＭである、項目１２に記載の医薬または組成物。
（項目１４）前記Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約３０μＭである、項目１２に記載の医薬または組成物。
（項目１５）前記エムリカサンの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭである、項目１２に記載の医薬または組成物。
（項目１６）前記ニボカサンの濃度は、約３０μＭ〜約３００μＭである、項目１２に記載の医薬または組成物。
（項目１７）前記カスパーゼ阻害剤が水溶性である、項目１〜１１、１１Ａ、または１２〜１６のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目１８）前記カスパーゼ阻害剤が点眼剤として提供される、項目１〜１７に記載の医薬。

別の局面では、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目Ｘ１）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
（項目Ｘ２）前記症状、障害または疾患はＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に関連するものである、項目Ｘ１に記載の医薬。
（項目Ｘ３）前記ミトコンドリア異常が、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、およびミトコンドリア生合成の低下のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目Ｘ１またはＸ２に記載の医薬。
（項目Ｘ４）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される、項目Ｘ１〜Ｘ３のいずれか１項に記載の医薬。
（項目Ｘ５）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目Ｘ１〜Ｘ４のいずれかに記載の医薬。
（項目Ｘ６）前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞のミトコンドリア膜電位低下を抑制することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの進行を防止するものである、項目Ｘ１〜Ｘ５のいずれか１項に記載の医薬。
（項目Ｘ７）前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける細胞外マトリクスの過剰産生に起因する症状を治療または予防するものである、項目Ｘ５に記載の医薬。
（項目Ｘ８）前記症状は、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）、デスメ膜の混濁グッテー、デスメ膜の肥厚、霧視、ハロー、グレア、視力低下、角膜混濁、白斑および視感覚の異常からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目Ｘ７に記載の医薬。
（項目Ｘ９）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
（項目Ｘ１０）前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞におけるフィブロネクチンの過剰発現に起因する、項目Ｘ９に記載の医薬。
（項目Ｘ１１）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される項目Ｘ７またはＸ８に記載の医薬。
（項目Ｘ１２）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目Ｘ９〜Ｘ１１のいずれかに記載の医薬。
（項目Ｘ１３）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける、グッテーの形成およびデスメ膜の肥厚から選択される少なくとも１つを含む、項目Ｘ９〜Ｘ１２のいずれか１項に記載の医薬。
（項目Ｘ１４）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
（項目Ｘ１５）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、その他の角膜内皮ジストロフィ、ならびに、薬物、手術、外傷、感染症、またはぶどう膜炎による角膜内皮障害からなる群より選択される項目Ｘ１４に記載の医薬。
（項目Ｘ１６）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目Ｘ１４またはＸ１５に記載の医薬。
（項目Ｘ１７）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存または保存後の培養のための組成物。
（項目Ｘ１８）前記保存は凍結保存である、項目Ｘ１７に記載の組成物。
（項目Ｘ１９）カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物。
（項目Ｘ２０）ｐ３８ＭＡＰキナーゼをさらに含む、項目Ｘ１９に記載の組成物。
（項目Ｘ２１）前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ−３阻害剤である、項目Ｘ１〜Ｘ２０のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２１Ａ）前記カスパーゼ阻害剤は、ｐａｎカスパーゼ阻害剤である、項目１〜２１のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２２）前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、エムリカサンおよびニボカサンからなる群より選択される、項目Ｘ１〜Ｘ２１またはＸ２１Ａのいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２３）前記Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約１００μＭである、項目Ｘ２２に記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２４）前記Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約３０μＭである、項目Ｘ２２に記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２５）前記エムリカサンの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭである、項目Ｘ２２に記載の医薬または組成物。
（項目Ｘ２６）前記ニボカサンの濃度は、約３０μＭ〜約３００μＭである、項目Ｘ２２に記載の医薬または組成物。

本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィ等におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する障害または疾患、ならびに／またはミトコンドリア異常に起因する疾患を処置または予防しうる医薬を提供する。また、グッテーまたはデスメ層の肥厚、角膜混濁、白斑などの濁りの症状）などの細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン）の過剰産生に起因する角膜内皮細障害に起因する疾患を処置または予防しうる医薬も提供する。さらに、本発明は、角膜内皮細胞の保存のための組成物または角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。

図１は、ＵＶ照射後の角膜内皮細胞の顕微鏡画像およびカスパーゼ３／７活性のグラフを示す。左パネルは、コントロール群、ＵＶ照射群、ＵＶ照射＋エムリカサン添加群、ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群、およびＵＶ照射＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群の位相差顕微鏡像を示す。右のグラフは、縦軸がＵＶ照射群に対するカスパーゼ３／７活性（％）を示し、横軸は、左から、コントロール、ＵＶ照射群、ＵＶ照射＋エムリカサン添加群（１０μＭ）、ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＵＶ照射＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）を示す。＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 図２は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群におけるＵＶ照射後の角膜内皮細胞の顕微鏡画像およびウェスタンブロットの結果を示す。左パネルは、コントロール群、ＵＶ照射群、ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＵＶ照射＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（３、１０、２０、３０、１００μＭ）の位相差顕微鏡像（倍率×２００）を示す。ＵＶの強度は１００Ｊ／ｍ^２を使用した。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。 図３は、エムリカサン添加群におけるＵＶ照射後の角膜内皮細胞の顕微鏡画像およびウェスタンブロットの結果を示す。左パネルは、コントロール群、ＵＶ照射群、ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＵＶ照射＋エムリカサン添加群（１、３、１０、３０、１００μＭ）の位相差顕微鏡（倍率×２００）を示す。ＵＶの強度は１００Ｊ／ｍ^２を使用した。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。 図４は、ニボカサン添加群におけるＵＶ照射後の角膜内皮細胞の顕微鏡画像およびウェスタンブロットの結果を示す。左パネルは、コントロール群、ＵＶ照射群、ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＵＶ照射＋ニボカサン添加群（１、３、１０、３０、１００μＭ）の位相差顕微鏡（倍率×２００）を示す。ＵＶの強度は１００Ｊ／ｍ^２を使用した。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。 図５は、培養サル角膜内皮細胞の過酸化水素による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。左パネルは、角膜内皮細胞のコントロール群、Ｈ_２Ｏ_２添加群（１０００μＭ）、Ｈ_２Ｏ_２＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、Ｈ_２Ｏ_２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、Ｈ_２Ｏ_２＋エムリカサン添加群（１０μＭ）、およびＨ_２Ｏ_２＋ニボカサン添加群（１００μＭ）の位相差顕微鏡像（倍率×２００）を示す。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ＧＡＰＤＨおよびＣＨＯＰのウェスタンブロットの結果を示す。 図６は、培養サル角膜内皮細胞のＭＧ１３２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。左パネルは、角膜内皮細胞のコントロール群、ＭＧ１３２添加群（１０μＭ）、ＭＧ１３２＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＭＧ１３２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＭＧ１３２＋エムリカサン添加群（１０μＭ）、およびＭＧ１３２＋ニボカサン添加群（１００μＭ）の位相差顕微鏡像（倍率×２００）を示す。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ＧＡＰＤＨおよびＣＨＯＰのウェスタンブロットの結果を示す。 図７は、培養サル角膜内皮細胞のタプシガルギン（ＴＧ）による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。左パネルは、角膜内皮細胞のコントロール群、ＴＧ添加群（１０μＭ）、ＴＧ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＴＧ＋エムリカサン添加群（１０μＭ）の位相差顕微鏡像（倍率×２００）を示す。右パネルは、上記群の各々のカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、ＧＡＰＤＨおよびＣＨＯＰのウェスタンブロットの結果を示す。 図８は、培養サル角膜内皮細胞のＣＣＣＰによる細胞障害対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。コントロール群、ＣＣＣＰ添加群（５０μＭ）、ＣＣＣＰ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＣＣＣＰ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＣＣＣＰ＋エムリカサン添加群（１０μＭ）のカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。 図９は、ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの蛍光観察を示す。左パネルは、コントロール群、ＵＶ照射群（２５０Ｊ／ｍ^２）、ＵＶ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＵＶ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＵＶ＋エムリカサン添加群（１０μＭ）、ＵＶ＋ニボカサン添加群（１００μＭ）の共焦点顕微鏡像を示す。右のグラフは、縦軸は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞（％）を示し、横軸は、左から、コントロール群、ＵＶ照射群、ＵＶ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群、ＵＶ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群、ＵＶ＋エムリカサン添加群およびＵＶ＋ニボカサン添加群を示す。＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 図１０は、ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞の機能障害および形態異常の観察を示す。上段はＮ−カドヘリン、中段はＺＯ−１、下段はｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光を示している。画像は、左から、角膜内皮細胞のコントロール群、ＵＶ照射群（２５０Ｊ／ｍ^２）、ＵＶ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群、ＵＶ＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群、およびＵＶ＋エムリカサン添加群を示す。 図１１は、不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）のＴＧＦ−β２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。画像は、それぞれｉＦＥＣＤのコントロール群、ＴＧＦ−β２添加群（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＴＧＦ−β２＋エムリカサン添加群（１０μＭ）を示す。倍率は１００倍を使用した。 図１２は、ＴＧＦ−β２に誘導されるプログラム細胞死を測定するためのフローサイトメトリーの結果を示す。それぞれ、コントロール群、ＴＧＦ−β２添加群、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＴＧＦ−β２＋エムリカサン添加群（１０μＭ）のフローサイトメトリーの結果を示す。 図１３は、フローサイトメトリーにより測定されたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞率のグラフを示す。縦軸は、図１２のＱ１−ＬＲの値（割合）をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞率（％）としてを示し、横軸は、左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２添加群、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２添加群、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群、およびＴＧＦ−β２＋エムリカサン添加群を示す。平均±ＳＥ、ｎ＝３としてデータを示し、Ｄｕｎｎｅｔ検定を使用してｐ値を計算した。＊＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 図１４は、フックス角膜内皮ジストロフィ疾患細胞モデルにおけるＴＧＦ−β２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を示す。カスパーゼ３、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２添加群、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、およびＴＧＦ−β２＋エムリカサン添加群（１０μＭ）を示す。 図１５は、ウサギ角膜を用いたカスパーゼ阻害剤の角膜保存に対する効果を示す。左パネル上段はＮ−カドヘリン、中段はＺＯ−１、下段はＰｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光画像を示し、左列はコントロール群、右列はエムリカサン添加群（１０μＭ）を示す。右のグラフは、縦軸が、アクチンの収縮環の形成を認める細胞の割合（％）を示し、左がコントロール群、右がエムリカサン添加群を示す。＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 図１６は、種々の凍結保存液の使用による細胞生存率の測定を示す。左のグラフは、トリパンブルー陰性細胞（％）を示す。右のグラフは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより測定された細胞生存率（％）を示す。各グラフにおいて、左から、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ、ＣｎＴ−ＣＲＹＯ、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ、および凍結保存を行っていないコントロール群を示す。 図１７は、各種凍結保存液における角膜内皮細胞の凍結後の細胞生着を観察した位相差顕微鏡像を示す。上段は、Ｙ２７６３２非存在下で培養した角膜内皮細胞の位相差顕微鏡像であり、下段は、Ｙ２７６３２存在下で培養した角膜内皮細胞の位相差顕微鏡像である。左から、使用した保存液、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ、ＣｎＴ−ＣＲＹＯ、およびＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを示す。 図１８は、各種凍結保存液における角膜内皮細胞の凍結後の細胞数のグラフを示す。縦軸は、細胞数（個）を示し、左から、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ、ＣｎＴ−ＣＲＹＯ、ＯｐｔｉＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯおよび凍結保存を経ていない継代培養細胞ご確認ください。を示す。 図１９は、角膜内皮凍結保存後の角膜内皮細胞のＺ−ＶＤ−ＦＭＫのカスパーゼ阻害による効果を示す。左の画像が、カスパーゼ阻害剤を添加せずにＤＭＳＯを添加したコントロール（培地としてＫＭ ＢＡＮＫＥＲを使用）の角膜内皮細胞を示し、右の画像が、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加した場合の角膜内皮細胞を示している。 図２０は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫによる角膜内皮凍結保存における細胞障害の減少を示す。左のグラフが、凍結から常温に回復した直後の細胞生存率（％）を示し、左が凍結保存液にＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加していないＦｒｅｅｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、右が凍結保存液にＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加しているＦｒｅｅｚｅ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫを示している。右のグラフは、細胞を解凍してからＤＭＳＯまたはＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加して２４時間後の細胞数を示す。左側４つがＳＢ２０３５８０を添加していない群であり、右側４つがＳＢ２０３５８０を添加している群である。左からＦｒｅｅｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌのＤＭＳＯ添加群、Ｆｒｅｅｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌのＺ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群、Ｆｒｅｅｚｅ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫのＤＭＳＯ添加群、およびＦｒｅｅｚｅ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫのＺ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群を示している。 図２１は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫが複数の保存溶媒への添加における凍結後の細胞培養を促進することを示す。左から、凍結保存液として、培地にＤＭＳＯを添加したもの、Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒ、およびＫＭ Ｂａｎｋｅｒ使用した群を示し、各群中、左から凍結保存後の添加なし（ＤＭＳＯ群）、Ｙ２７６３２添加（５μＭ）、およびＺ−ＶＤ−ＦＭＫ添加（５μＭ）したデータを示す。縦軸は、ＤＭＳＯ群の細胞数に対する倍数変化を示す。 図２２は、不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）におけるＴＧＦ−β２によるフィブロネクチンの過剰発現に対するカスパーゼ阻害剤の抑制効果を示す。 図２３は、不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）における、フィブロネクチン、ｐ−Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２およびＧＡＰＤＨについてのウェスタンブロットの結果を示す。 図２４は、視力と角膜内皮細胞およびＥＣＭ沈着との関係の概略図を示す。角膜内皮細胞およびＥＣＭ沈着が増加するにつれて視力が低下することが示される。ＥＣＭ沈着によるグッテーまたはデスメ層の肥厚は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者において一般的には３０代から４０代に生じ始め、生涯を通じて進行する。進行により霧視、ハロー、グレア、視力低下などの視力障害を生じる。また同時に角膜内皮細胞死が進行するが角膜内皮細胞密度が約１０００個／ｍｍ^２を下回るまではポンプ機能を残された角膜内皮が代償することで角膜の透明性は維持される。一方で、約１０００個／ｍｍ^２を下回ると角膜に前房水が進入することで角膜浮腫をきたし、重篤な視力障害を生じる。本技術はＥＣＭ沈着および角膜内皮細胞死の双方を抑制することで、視機能を維持することができるものである。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（定義）
本明細書において「カスパーゼ」とは、システインを活性中心に持ち、アスパラギン酸のＣ末端側でペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼの総称である。カスパーゼは、サイトカイン（インターロイキン１β等）のプロセッシングに機能しており、プログラム細胞死の実行や炎症反応に関与していることが知られている。すべてのカスパーゼは酵素前駆体として翻訳され、活性化は自分自身、または他のカスパーゼによる分解によって活性化され、カスケードの形式で機能する。カスパーゼは、発見された順に番号が付けられており、現在に至るまで哺乳類においてカスパーゼ１からカスパーゼ１４までが知られている。ヒトの細胞においては１０種類程度発見されている。例えば、カスパーゼ１はサイトカインのプロセシングによる炎症誘導に機能し、カスパーゼ３はプログラム細胞死の実行に直接関与し、カスパーゼ８はカスケードの上流に位置しプログラム細胞死のシグナル伝達を担っている。

本明細書において、「カスパーゼ阻害剤」とは、任意のカスパーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。したがって、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼファミリーのうちのいずれか１つまたは複数を阻害することができる化合物である。カスパーゼ阻害剤は、水溶性のものが好ましい。水溶性でなければ、溶媒として身体に適合しにくいものを使用することが必要となりうるからである。水溶性かどうかについては薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質1gまたは1mLを溶かすのに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：1mL未満；溶けやすい：1mL以上10mL未満；やや溶けやすい：10mL以上30mL未満；やや溶けにくい：30mL以上100mL未満；溶けにくい：100mL以上1000mL未満；極めて溶けにくい：1000mL以上10000mL未満；ほとんど溶けない：10000mL以上と定義されており、本明細書においても同様に評価する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。このような水溶性の成分であれば、点眼剤としても有利に使用される。

本発明において使用され得るカスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ阻害活性を有する化合物であれば、特に限定されず、例えば、特開２０１２−０３６１５０号公報、特開２００７−３０８５０１号公報、特開２００５−０８９３２４号公報、特開２００２−３３８４７４号公報、特開２００１−３０２５１６号公報、特表２００９−５４２６８９号公報、国際公開第２００６／０５４７５７号などに記載された化合物が挙げられ、この他にもＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（汎（［ｐａｎ］カスパーゼ阻害剤）、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１，３，６，７，８および９阻害剤であって実質的に汎カスパーゼ阻害剤である）、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ（エムリカサン）（全カスパーゼ阻害剤）、Ｎｉｖｏｃａｓａｎ（ニボカサン）（カスパーゼ１，３，７および９阻害剤であって実質的に汎カスパーゼ阻害剤である）Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１阻害剤）、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ２阻害剤）、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ３阻害剤）、Ｚ−ＬＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ４阻害剤）、Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ５阻害剤）、Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ６阻害剤）、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ８阻害剤）、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ９阻害剤）、Ｚ−ＡＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１０阻害剤）、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ１３阻害剤）が挙げられるがこれらに限定されない。

好ましいカスパーゼ阻害剤としては、エムリカサンが挙げられるが、これに限定されない。別の好ましいカスパーゼ阻害剤としては、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、ニボカサンが例示されるがこれらに限定されない。カスパーゼ阻害剤は、全カスパーゼを阻害することができるのが好ましいが、選択的なカスパーゼ阻害剤であってもよい。選択的なカスパーゼ阻害剤とは、カスパーゼファミリーのうちの１つのカスパーゼを阻害するか、複数のカスパーゼを阻害するカスパーゼ阻害剤をいう。理論に束縛されることを望まないが、カスパーゼ３はプログラム細胞死に直接的に関与されているとされているため、カスパーゼ３を阻害するものが直接的かつ効果的であるが、カスパーゼカスケードにおける上流のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ２、８、９、１０等）を阻害することにより間接的にカスパーゼ３を阻害するものでもよい。あるいは、カスパーゼ３と同様にプログラム細胞死の実行因子とされているカスパーゼ６やカスパーゼ７を阻害するものでもよいし、カスパーゼカスケードにおける上流のカスパーゼを阻害することにより間接的にカスパーゼ６またはカスパーゼ７を阻害するものでもよい。好ましくは、使用されるカスパーゼ阻害剤は「汎（ｐａｎ）カスパーゼ阻害剤」であることが有利である。一方で、プログラム細胞死の直接的な因子ではないが、プログラム細胞死のシグナル伝達に重要な分子とされているカスパーゼ８を阻害するカスパーゼ阻害剤を直接または間接的に阻害するカスパーゼ阻害剤であってもよい。

このほかの、本発明で用いることができるカスパーゼ阻害剤としては、例えば、カスパーゼに対する中和抗体、カスパーゼの活性を阻害する化合物、カスパーゼをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物（例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、リボザイム）、ペプチド、および植物成分等の化合物が挙げられる。使用される濃度として、約５０ｎｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌが例示され、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌであるがこれらに限定されない。

本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、カスパーゼのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のカスパーゼ等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のカスパーゼ等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するカスパーゼ等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，1993,319-347．に記載される方法を用いて、カスパーゼ等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。

カスパーゼ等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ Ｐに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。

例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al.,FEBS Lett, 1988, 228,228.）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，1990,35,2191.、 Koizumi,M. et al., Nucl. Acids Res., 1989,17, 7059.）。

また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Buzayan,JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi,Y. & Sasaki,N., Nucl. Acids Res,1991, 19, 6751.、菊池洋,化学と生物, 1992, 30,112.）。このように、リボザイムを用いてカスパーゼ等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。

カスパーゼ等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（RNA interference、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。

本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、カスパーゼ等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。カスパーゼ等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。

二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。

さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。

さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Short Hairpin RNA;shRNA）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。

ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。

本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。

ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。

本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。

さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、カスパーゼ等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。

本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。

修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。

本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、カスパーゼまたは他のカスパーゼのシグナル伝達のメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。

また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ochiya，T et al.，Nature Med．，5:707-710，1999、Curr．Gene Ther．，1 :31-52，2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と
混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸、治療または予防薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。

本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｕｃｈｓ’ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。

本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｕｃｈｓ’ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。 本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。

本明細書において、「プログラム細胞死」とは、あらかじめプログラムされているかのように決まった時期や環境で自発的に細胞が死ぬ現象を指す。プログラム細胞死は、例えば「アポトーシス」を含む意味で使用される。

本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。「ＴＧＦ−βシグナル」とは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナルであって、ＴＧＦ−βによって惹起されるものをいう。ＴＧＦ−βシグナル例えば、ＴＧＦ−β２によって媒介されるシグナルが含まれ、このほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３等によって媒介されるシグナルも例示される。ＴＧＦ−βについて、ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの相同性約７０％の３つのアイソフォームが存在し、その作用は類似している。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。

理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。

トランスフォーミング（形質転換）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、プログラム細胞死、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ；上皮間葉転換ともいう）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびプログラム細胞死等の強力な調節剤である。

ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。

ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ ａｇａｉｎｓｔ ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ−Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。

Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ−Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ−Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。

ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、J. Massagu’e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91;Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1):e3; Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J.18, 816-827 (2004); Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010)11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166等を参照のこと。

本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βに誘導される任意の角膜内皮の症状、障害または疾患を指す。本発明では、角膜内皮細胞、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞（例えば、ｉＦＥＣＤ）を、ＴＧＦ−β２に曝露したところ、驚くべきことに種々の障害（例えば、プログラム細胞死）が生じた。このような現象は従来よく解明されていなかった現象である。そして、本発明者らは、このＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をさらに分析したところ、予想外にも、カスパーゼ阻害剤によって、この障害を抑制することができることを見出した。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患はカスパーゼのシグナル伝達経路とは異なるものであり、また、使用したカスパーゼ阻害剤はＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を抑制しているものではないことから、これまでに未解明の疾患・障害の発露の経路およびその治療または予防の態様を見出すことができたといえる。したがって、本発明は、角膜内皮について新たな治療／予防技術を提供するものと位置付けることができると考えられる。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior polymorphous dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital hereditary endothelial dystrophy)、および特発性角膜内皮障害等において、ＴＧＦ−βの発現がみられるものを挙げることができるがそれらに限定されない。特にＴＧＦ−β２の発現が通常より亢進している角膜内皮細胞または角膜内皮組織では、本発明で見出された障害またはそれに関連する障害が発現または亢進していると考えられることから、そのような角膜内皮細胞または角膜内皮組織がみられる任意の角膜内皮の症状、障害または疾患は、特に本発明の対象として意図される。

本明細書において「ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」は、ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をいう。ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior polymorphous dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital hereditary endothelial dystrophy)、および特発性角膜内皮障害において、ミトコンドリア異常がみられる任意のものを挙げることができるがそれらに限定されない。

本明細書において「角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現」とは、正常な角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの発現レベルと比べて、異常なレベルで細胞外マトリックスを発現することをいう。「異常なレベルで細胞外マトリックスを発現する」とは、フィブロネクチン等の細胞外マトリクスタンパク質が、正常形態における細胞外マトリクスにおいて産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常における細胞外マトリクスの量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は統計学的に有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよく、医学的に有意な相違であればよい。

本明細書において、「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰産生に起因する角膜内皮障害」またはその「症状」とは、主に細胞外マトリクスに起因する濁りや沈着、肥厚等に関連する障害またはその症状であり、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）や、デスメ膜の混濁グッテー等の、デスメ膜の肥厚等が生じ、視力低下の原因となる症状に関連するものである。フックス角膜ジストロフィなどの角膜内皮障害においては、角膜内皮細胞の細胞死（特にアポトーシス）が原因による症状悪化とは異なり、この細胞外マトリクスの過剰産生は細胞数の減少が起こらなかったとしても視力、視感覚を悪化させるものであり、細胞死を抑制できたとしても取り組まなければならない点である。本発明では、「混濁」又は「沈着」に起因する角膜内皮障害の原因をカスパーゼ阻害剤が抑制することができることが判明したといえ、このことは、本発明が、「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰産生に起因する角膜内皮障害」および関連する症状を改善、治療または予防することができることを支持するものといえる。「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の過剰産生に起因する角膜内皮障害」またはその「症状」には以下：混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑などを挙げることができるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態では、本発明が対象とする症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である。フックス角膜内皮ジストロフィに関しては、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−β誘導が関与していることが示されており、ＦＥＣＤにおける細胞喪失に関与し得ることも示されている。したがって、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、ＦＥＣＤの有効な治療になり得ることが当然予想される。しかしながら、本発明者らは、予想外にも、カスパーゼ阻害剤が、ＴＧＦ−βシグナルに起因する障害を抑制できることを見出した。

本発明の医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィの中でもひとつの重要な異常または障害の原因となるＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害等を処置しうることから、フックス角膜内皮ジストロフィの治療または予防に有用であることが理解される。特に、本発明では実施例において、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいてＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害あるいはプログラム細胞死を抑制することができたことから本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおけるＴＧＦ−β２に関連する重症患者の治療に使用することができると考えられる。また、本発明の医薬は、予想外にも細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰発現を抑制することが可能であり、ＥＣＭのデスメ層への沈着などの角膜内皮における障害等を処置または予防し得る。したがって、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害や、角膜内皮密度低下、グッテー（guttae）の形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、混濁、瘢痕、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、ハロー、グレアおよび角膜実質の浮腫などを処置しまたは予防し得る。

具体的な実施形態では、本発明はまた、ミトコンドリア異常、例えば、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、ミトコンドリア生合成の低下等を抑制することができる。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harborおよびその3rd Ed.(2001); Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience; Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience; Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press; Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates; Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates; Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press; Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates; Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress; Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press; Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press; Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman&Hall; Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim; Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press; Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques, Academic Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy Joyceらの報告｛Joyce, 2004 #161} {Joyce, 2003 #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。

＜医薬＞
１つの局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。

別の局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。

さらなる局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。

カスパーゼは、種々のシグナル伝達に関与するとされており、炎症に関与するともされているが、角膜内皮では、そのメカニズムのすべては明らかにされておらず、ＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア障害またはその両方に起因する角膜内皮障害の治癒または予防に有効であることは予想できなかった。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior polymorphous dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital hereditary endothelial dystrophy)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior polymorphous dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital hereditary endothelial dystrophy)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される。好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、ＴＧＦ−β２に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である。

１つの実施形態では、ミトコンドリア異常としては、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、ミトコンドリア生合成などが挙げられるが、これらに限定されない。

１つのさらなる好ましい実施形態では、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける細胞外マトリクスの過剰産生に起因する症状を治療または予防する作用効果を有し、このような症状の治療または予防のための医薬または治療法もしくは予防法を提供する。このような症状としては、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）、デスメ膜の混濁グッテー、デスメ膜の肥厚、霧視、ハロー、グレア、視力低下、角膜混濁、白斑および視感覚の異常等を挙げることができる。細胞外マトリクスの過剰産生に起因する症状については、さらに以下に述べる。

さらに別の局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬を提供する。上述のとおり、カスパーゼ阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に起因する角膜内皮障害等を処置または予防し得るものであるが、カスパーゼ阻害剤がさらに角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することが可能であることは驚くべきことであった。これは、カスパーゼ阻害剤が、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常、および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害を同時に処置し得ることを示唆する。特に、フックス角膜内皮ジストロフィは、ＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に起因して角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、さらに細胞外マトリクスがデスメ膜に沈着しグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる疾患であるため、細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの治療および予防における著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。また、フックス角膜内皮ジストロフィ等の角膜内皮障害における細胞外マトリクス過剰産生により発生し得るグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚やこのほか混濁や沈着に関連する症状（遷延化する角膜浮腫による不可逆的な角膜実質混濁など）を改善し、処置しまたは予防することができる。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞におけるフィブロネクチンの過剰発現に起因し得る。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜実質混濁、角膜上皮浮腫、角膜上皮障害、羞明、および霧視からなる群より選択される。

別の局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬を提供する。カスパーゼ阻害剤は、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常、および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害を同時に処置または予防し得る。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、その他の角膜内皮ジストロフィ、ならびに薬物、手術、外傷、感染症、ぶどう膜炎などによる角膜内皮障害からなる群より選択される。

１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常および細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む。フックス角膜内皮ジストロフィは、ＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に起因して角膜内皮細胞の密度が著しく減少し、さらに細胞外マトリクスがデスメ膜に沈着しグッテー（Corneal guttae）およびデスメ膜の肥厚などの障害等を生じる疾患であるため、細胞外マトリックスの過剰発現を抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。

１つの実施形態において、本発明の利用法としては、例えば点眼薬が挙げられるが、これに限定されず、前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与方法も挙げることができる。

１つの実施形態において、本発明において用いられるカスパーゼ阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナルまたはミトコンドリアに起因する任意の角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防に有効である限りどのような種類のものを使用してもよいが、好ましくは、カスパーゼ−３を阻害するもの、さらに好ましくは、汎（ｐａｎ）カスパーゼ阻害剤を用いることが好ましい。具体的なカスパーゼ阻害剤としては、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ（エムリカサン）、Ｎｉｖｏｃａｓａｎ（ニボカサン）、Ｚ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＷＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＡＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＥＤ−ＦＭＫからなる群より選択される少なくとも１つを含む。

本発明の医薬において、上記カスパーゼ阻害剤は、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。本発明で使用されるカスパーゼ阻害剤の濃度は、通常約０．１〜３００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、好ましくは約１〜１５０μＭ、より好ましくは約３〜３０μＭであり、２種以上のカスパーゼ阻害剤を組み合わせて使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜３００μＭ、約０．０１〜１５０μＭ、約０．００１〜１００μＭ、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、約０．０９〜３．２μＭであり、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。

好ましい実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、例えば、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−バリル−ＤＬ−アスパルチル−フルオロメチルケトン（Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ）、｛ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−［（２ｓ）−２−アミノ−３−（メトキシカルボニル）プロピオニル］｝フルオロメタン（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）、３−［２−［（２−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニルアミノオキサリル）−アミノ］−プロピオニルアミノ］−４−オキソ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシ）−ペンタン酸（エムリカサン）および（Ｒ）−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（フルオロメチル）−２−ヒドロキシ−５−オキソテトラヒドロフラン−３−イル）−５−イソプロピルｌ−３−（イソキノリン−１−イル）−４，５−ジヒドロイソキゾール−５−カルボキサミド（ニボカサン）ならびにそれらの塩からなる群より選択される。

別の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫである。使用されるＺ−ＶＤ−ＦＭＫの濃度としては、通常約１μＭ〜約１５０μＭであり、好ましくは約３μＭ〜約１００μＭであり、より好ましくは約１０μＭ〜約５０μＭである。

別の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫである。使用されるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの濃度としては、通常約１μＭ〜約１００μＭであり、好ましくは、約３μＭ〜約３０μＭ、より好ましくは、約１０μＭである。

別の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、エムリカサンである。使用されるエムリカサンの濃度としては、通常約０．３μＭ〜約１５０μＭであり、好ましくは、約１μＭ〜約１００μＭ、より好ましくは、約１０μＭである。

さらに別の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、ニボカサンである。使用されるニボカサンの濃度としては、通常約１μＭ〜約３００μＭであり、好ましくは、約３０μＭ〜約３００μＭであり、より好ましくは、約１００μＭである。

好ましい実施形態では、エムリカサンが使用される。理論に束縛されることを望まないが、エムリカサンによる処置によって、他のカスパーゼ阻害剤に比べても、顕著な治療成績が示され、特に、フックス内皮ジストロフィ等のトランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）に関連する角膜内皮の疾患または障害、あるいはミトコンドリア異常に関連する角膜内皮の疾患または障害の治癒成績が顕著に改善することが見出されているからである。

１つの実施形態では、本発明の治療または予防するための医薬は、角膜内皮を有する任意の動物、例えば哺乳動物を対象とすることができ、好ましくは霊長類の角膜内皮の治療または予防を目的とする。好ましくは、この治療または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。

別の局面では、本発明は、カスパーゼ阻害剤の有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための方法を提供する。

本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。

特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の医薬の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、必要に応じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与回数、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、投与形態、対象臓器等により、適宜選択してもよい。例えば、本発明は点眼剤として使用され得る。また、本発明の医薬を前房内に注入することもできる。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。

＜保存用組成物＞
別の局面において、本発明は、カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物を提供する。好ましい実施形態では、保存は凍結保存である。本発明において用いられるカスパーゼ阻害剤は、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。

本明細書において「保存用組成物」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための組成物である。

１つの実施形態では、本発明の保存用組成物は、従来使用される保存剤または保存液に本発明のカスパーゼ阻害剤を添加して調製され得る。そのような角膜保存液としては、角膜移植時に通常用いられる保存液（強角膜片保存液（Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ：登録商標）、角膜移植用眼球保存液（ＥＰＩＩ：登録商標））、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。

本発明の保存用組成物は、臓器移植などに用いられる角膜の保存用に用いられる。また、本発明の保存用組成物は、角膜内皮細胞を凍結保存するための保存液またはその成分としても用いられる。

凍結保存のために使用される本発明の保存用組成物の別の実施形態では、既存の凍結保存液に本発明のカスパーゼ阻害剤を含む保存用組成物を添加して使用することもできる。凍結保存液としては、例えば、タカラバイオにより提供されるＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）シリーズ（ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ（カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２（カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（カタログ番号：ＣＢ０４３）など）、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ カタログ番号：ＫＯＪ−１６０９２００５）、およびＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ， ＣＲＹＯ Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｃｎｔ−ＣＲＹＯとも記載される）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ カタログ番号：ＣｎＴ−ＣＲＹＯ−５０）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、使用される凍結保存液はＫＭ ＢＡＮＫＥＲであってもよい。また、当業者であれば、上記凍結保存液の構成成分を適宜変更またはさらなる構成成分を添加し、改変された適切な凍結保存液を使用することができることが理解される。凍結保存のためには、例えば、本発明の保存液にグリセロール、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド等をさらに添加してもよい。

＜増殖促進用組成物＞
別の局面において、本発明は、角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。本発明において用いられるカスパーゼ阻害剤は、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。

１つの実施形態では、本発明の増殖促進用組成物は、従来使用される培地に本発明のカスパーゼ阻害剤を添加して調製され得る。また、本発明において使用されうる培養成分は、角膜内皮の培養に用いられうる成分であればどのようなものでも用いることができ、従来販売され使用されている培地成分であってもよく、あるいは、別途角膜内皮用に開発された成分であってもよい。そのような培地成分の例としては、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ，Ｍ１９９、ＭＥＭ等（これらは、ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＣＨＥＲ＝ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ等から入手可能）を挙げることができるがこれらに限定されない。

また、実施例において説明されるように、本発明のカスパーゼ阻害剤を含む増殖促進用組成物を添加した凍結保存液を培地成分として培養すると、角膜内皮細胞の細胞培養を促進することが見出されている。したがって、本発明の角膜内皮細胞の増殖促進用組成物に使用される培地成分として、凍結保存液を使用することも可能である。凍結保存液としては、例えば、タカラバイオにより提供されるＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）シリーズ（ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ（カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２（カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（カタログ番号：ＣＢ０４３）など）、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ カタログ番号：ＫＯＪ−１６０９２００５）、およびＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ， ＣＲＹＯ Ｄｅｆｉｎｅｄ（ＣｎＴ−ＣＲＹＯ）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ カタログ番号：ＣｎＴ−ＣＲＹＯ−５０）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、使用される凍結保存液はＫＭ ＢＡＮＫＥＲがこのましいがこれに限定されない。

他の実施形態において、本発明の角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤をさらに含むことも可能である。「ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（「ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤」ともいう。）」とは、ｐ３８に関連するＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤を指し、例えば、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）、および３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）が挙げられるが、これらに限定されない。含まれるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の濃度については、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば、約０．１〜１００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、好ましくは約０．１〜３０μＭ、より好ましくは約１〜１０μＭであり、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μＭ、好ましくは、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、約０．０９〜３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。

本発明の増殖促進用組成物は、角膜内皮細胞の培養において用いられ得る。角膜内皮細胞の培養は代表的には以下のようになされる。

＜１＞角膜内皮細胞の採取および試験管内での培養
角膜内皮細胞はレシピエント自身または適切なドナーの角膜から常法で採取される。本発明における移植条件を考慮すれば、同種由来の角膜内皮細胞を準備すればよい。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、本発明の培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培地または培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（例えば、ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＣＨＥＲ＝ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０等を）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）（例えば、ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）（例えば、ＴＨＥＲＭＯ−ＦＩＳＣＨＥＲ＝ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１３２５６−０２９）、およびペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加し、さらに本発明の増殖促進用組成物の成分を添加したものを使用することができる。培養容器（培養皿）にはその表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたはウシ角膜内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。あるいは、通常の培養容器をＦＮＣ ｃｏａｔｉｎｇ ｍｉｘ（登録商標）（５０ｍｌ（ＡＥＳ−０４０７）、ＡＴＨＥＮＡ、カタログ番号：０４０７）等の市販のコーティング剤で処理したものを用いてもよい。

角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は、角膜内皮細胞が生育する限りにおいて特に限定されないが、例えば約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３７℃である。培養方法は、通常の細胞培養用インキュベーター内で、加湿下、約５〜１０％のＣＯ_２濃度の環境下で行われる。

＜２＞継代培養
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずトリプシン−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に本発明の増殖促進用組成物を含む培地または培養液を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、あるいは回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心分離処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。好ましい細胞密度は、約１〜２×１０^６個／ｍＬである。尚、ここでの遠心処理の条件としては、例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができる。

細胞浮遊液は上記の初代培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代時の希釈倍率は細胞の状態によっても異なるが、約１：２〜１：４、好ましくは約１：３である。継代培養は上記の初代培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７〜３０日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。本発明の増殖促進用組成物を含む培地または培養液において、増殖促進用組成物を用いることにより、増殖が促進され、培養期間の短縮が可能となる。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅ^ＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。

（調製例：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）モデルの作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。

（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。

（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ； Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて２９３Ｔ 細胞 （ＲＣＢ２２０２； Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｂａｒａｋｉ， Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。

（実施例１：ＵＶ照射後におけるカスパーゼ阻害剤によるカスパーゼ３の活性化の抑制）
本実施例では、ＵＶ照射後におけるカスパーゼ阻害剤によるカスパーゼ３の活性化の抑制を調べた。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした９６ウェルプレートに５×１０^３個播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ，１２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）

次に、各阻害剤を上記の濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて１８時間インキュベートした。なお、コントロール群、ＵＶ照射群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１３４０８−６４）を添加した。培地は、Ｇｉｂｃｏ ＤＭＥＭ＋１％ Ｐ／Ｓ（ペニシリン−ストレプトマイシン）を使用した。

その後、細胞上澄を除去し、細胞にＵＶ（３００Ｊ／ｍ^２）を照射した。照射後、各阻害剤入りの培地を再度細胞に添加し、７時間培養を行った。その後Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ８０９１）を用いてカスパーゼ３／７活性の測定を行った。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤は細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制している）
図１のグラフは、カスパーゼ添加なしでＵＶを照射した場合のカスパーゼ３／７活性に対する、各カスパーゼ阻害剤を添加した場合のカスパーゼ３／７活性の割合を示している。示される通り、各阻害剤を添加した場合は、ＵＶを添加していないコントロール群と同等のカスパーゼ３／７活性を示しており、カスパーゼ阻害剤が細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制していることが示された。

（実施例２：培養サル角膜内皮細胞のアポトーシスに対するカスパーゼ阻害剤の効果の検討）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞のアポトーシスに対するカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫの効果の検討を行った。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした１２ウェルプレートに１×１０^５個播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ，１２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ペニシリン−ストレプトマイシン）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （３、１０、２０、３０、５０μＭ）
エムリカサン （１、３、１０、３０、１００μＭ）
ニボカサン （１、３、１０、３０、１００μＭ）

各阻害剤を上記濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて１８時間インキュベートした。なお、コントロール群、ＵＶ群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ， Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。培地は、Ｇｉｂｃｏ ＤＭＥＭ＋１％ Ｐ／Ｓ（ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液）を使用した。

その後、細胞上澄を除去し、細胞にＵＶ（１００Ｊ／ｍ^２）を照射した。照射後、各阻害剤入りの培地を再度細胞に添加し、９時間培養を行った。

位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０ｓｅｃ、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質８μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体およびウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤は細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制し細胞死を抑える）
結果を図２〜４に示す。位相差顕微鏡像からＵＶ照射群は顕著に細胞障害を受けている様子が観察された。さらに、ウェスタンブロットの結果から、ＵＶ照射群において活性型である切断された約１７ｋＤａのカスパーゼ３が認められた。ＵＶ照射＋Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ添加群では、試験したすべての濃度域において約１７ｋＤａの活性型切断カスパーゼ３は観察されず、非活性型である切断された約１９ｋＤａのカスパーゼ３が観察された（図２）。エムリカサン添加群においては、試験したすべての濃度域において活性型切断カスパーゼ３は観察されず、その上、約１９ｋＤａの非活性型切断カスパーゼ３も、１および３μＭ添加時においてわずかに観察されるだけで、その他の濃度では観察されなかった（図３）。これは、カスパーゼ３の活性化を強く抑制していることを意味している。ニボカサン添加群においては、１００μＭの濃度でカスパーゼ３の抑制効果が観察された（図４）。これらの結果から、カスパーゼ阻害剤は細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制していることが明らかになった。

（実施例３：培養サル角膜内皮細胞の過酸化水素による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞の過酸化水素による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を検討した。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした１２ウェルプレートに１×１０^５個播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ，１２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， ２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）
ニボカサン （１００μＭ）

各阻害剤を上記の濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて１８時間インキュベートした。なお、コントロール群および過酸化水素群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。培地は、Ｇｉｂｃｏ ＤＭＥＭ＋１％ Ｐ／Ｓを使用した。

その後、細胞上澄を除去し、１０００μＭ過酸化水素と各阻害剤入りの培地を細胞に添加し、２４時間培養を行った。コントロール群には過酸化水素の溶媒である滅菌水と各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。過酸化水素群には１０００μＭ過酸化水素とＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した培地を添加した。

位相差顕微鏡下で細胞形態およびアポトーシスを観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％
ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質９．６μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）、マウス抗ＣＨＯＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８９５）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤は過酸化水素による細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制する）
過酸化水素は、その強力な酸化作用に起因して細胞に障害を与えることが知られている。本実施例において、カスパーゼ阻害剤が過酸化水素による細胞障害を抑制することを確認した。結果を図５に示す。示される通り、過酸化水素のみ添加した群では、活性型切断カスパーゼ３が認められるのに対し、過酸化水素＋カスパーゼ阻害剤添加群においては、活性型切断カスパーゼ３は認められず、細胞障害を抑制していた。したがって、カスパーゼ阻害剤は過酸化水素による細胞障害時のカスパーゼ３の活性化を抑制する。

（実施例４：培養サル角膜内皮細胞のＭＧ１３２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞のＭＧ１３２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を検討した。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞を、ＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした１２ウェルプレートに１×１０^５個播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ， １２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， ２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）
ニボカサン （１００μＭ）

次に、各阻害剤を上記の濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて６時間インキュベートした。なお、コントロール群およびＭＧ１３２群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。培地はＧｉｂｃｏ ＤＭＥＭ＋１％ Ｐ／Ｓを使用した。

その後、細胞上澄を除去し、１０μＭ ＭＧ１３２と各阻害剤入りの培地を細胞に添加し、１８時間培養を行った。コントロール群にはＭＧ１３２と各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。

位相差顕微鏡下で細胞形態およびアポトーシスを観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。

２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）、マウス抗ＣＨＯＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８９５）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤はＭＧ１３２により誘導されるｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎによる細胞障害を抑制し、小胞体ストレスによるカスパーゼ３の活性化を抑制する）
ＭＧ１３２はプロテアソーム阻害剤であり、これにより折り畳まれなかったタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）がもたらされ、小胞体ストレスが生じる。小胞体ストレスの蓄積によりカスパーゼ３が活性化され、細胞が障害を受ける。本実施例では、カスパーゼ阻害剤添加群におけるＭＧ１３２により誘導される細胞障害の抑制効果を確認した。結果を図６に示す。ＭＧ１３２群において観察されるカスパーゼ３の活性化は、カスパーゼ阻害剤添加群においては観察されなかった。したがって、カスパーゼ阻害剤はＭＧ１３２により誘導される小胞体ストレスによるカスパーゼ３の活性化を抑制する。

（実施例５：培養サル角膜内皮細胞のタプシガルギン（ＴＧ）による細胞障害対するカスパーゼ阻害剤の効果の検討）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞のＴＧによる細胞障害対するカスパーゼ阻害剤の効果の検討を行った。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした１２ウェルプレートに１×１０^５個播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ， １２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， ２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）

次に、各阻害剤を上記の濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて１８時間インキュベートした。なお、コントロール群およびＴＧ群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。培地は、Ｇｉｂｃｏ ＤＭＥＭ， １％ Ｐ／Ｓを使用した。

その後、細胞上澄を除去し、１０μＭ ＴＧと各阻害剤入りの培地を細胞に添加し、５時間培養を行った。コントロール群にはＴＧと各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。

位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。

２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５．７μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）、マウス抗ＣＨＯＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８９５）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤はタプシガルギン（ＴＧ）により誘導されるｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎによる細胞障害を抑制し小胞体ストレスによるカスパーゼ３の活性化を抑制する）
タプシガルギン（ＴＧ）は、ＭＧ１３２と同様、小胞体ストレスを誘導する。本実施例では、カスパーゼ阻害剤添加群におけるＴＧにより誘導される細胞障害の抑制効果を確認した。結果を図７に示す。ＴＧのみ添加した場合、活性型である切断された約１７ｋＤａのカスパーゼが観察されるのに対し、カスパーゼ阻害剤を添加した場合は、活性型切断カスパーゼは観察されなかった。したがって、カスパーゼ阻害剤はＴＧにより誘導される小胞体ストレスによるカスパーゼ３の活性化を抑制する。

（実施例６：培養サル角膜内皮細胞のＣＣＣＰによる細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果）
本実施例では、培養サル角膜内皮細胞のＣＣＣＰによる細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を検討した。

（材料および方法）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍｉｘをコートした１２ウェルプレートに１×１０^５個播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてコンフルエントに到達するまで培養した。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ， １２３２０−０３２）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， ２６２５２−９４）を使用した。

本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）

各阻害剤を上記濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて１６時間インキュベートした。なお、コントロール群およびＣＣＣＰ群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。培地はＧｉｂｃｏ ＤＭＥＭ＋１％ Ｐ／Ｓを使用した。

その後、細胞上澄を除去し、５０μＭ ＣＣＣＰと各阻害剤入りの培地を細胞に添加し、６時間培養を行った。コントロール群にはＣＣＣＰと各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加した。

位相差顕微鏡下で細胞形態を観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤はＣＣＣＰにより誘導されるミトコンドリア膜電位低下によるミトコンドリア依存性のプログラム細胞死を抑制する）
脱共役剤であるＣＣＣＰを添加した場合、脱共役に起因してミトコンドリア膜電位が低下し、ミトコンドリア障害が誘導される。ミトコンドリア障害はプログラム細胞死を誘導し、すなわちカスパーゼが活性化される。そのため、ＣＣＣＰを添加した場合は、約１７ｋＤａの切断されたカスパーゼ３が観察され、カスパーゼ３の活性化が認められた（図８）。しかしながら、カスパーゼ阻害剤を添加した場合は、カスパーゼ３の活性化が抑制された。これらの結果から、カスパーゼ阻害剤は、ミトコンドリア障害による細胞障害を抑制することができることが明らかになった。

（実施例７：ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの蛍光観察）
本実施例では、ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの蛍光観察を行った。

（材料および方法）
本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）
ニボカサン （１００μＭ）

安楽死後０〜２４時間のウサギ眼球を本実施例で用いた。実体顕微鏡下で角膜輪部に沿ってスプリング剪刃を用いて強膜を切除し、水晶体および虹彩を取り除き強角膜片を作成した。強角膜片を４分割し、コントロール群および各カスパーゼ阻害剤添加群とした。角膜の分割後、コントロール群はＤＭＳＯを添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）を、カスパーゼ阻害剤添加群では各阻害剤を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）にて１６時間のプレトリートを遮光下にて行った。ＰＢＳ（−）にて角膜を２回洗浄後、角膜内皮細胞にＵＶ ２５０Ｊ／ｍ^２を照射し、再び遮光下にて２４時間４℃で保存した。保存液にはコントロール群にはＤＭＳＯを、カスパーゼ阻害剤添加群には各試薬を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）を用いた。

強角膜片をＰＢＳ（−）で洗浄し，ＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ （Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ Ｋｉｔ）（メーカー：ＭＢＬ，Ｃｏｄｅ：４７００）を用い、３７℃で１５分間染色した。その後、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。固定後、ＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（メーカー：ＤＯＪＩＮＤＯ，Ｃｏｄｅ：ＧＡ０９８）で３０分間染色し、退色防止剤を加え封入した。共焦点顕微鏡でＡｎｎｅｘｉｎ Ｖおよび核の観察を蛍光観察により行った。また、フローサイトメトリーよりＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合を測定した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤は細胞障害による角膜内皮細胞のプログラム細胞死を抑制する）
図９に示される通り、ＵＶ照射群では、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性のアポトーシス細胞が観察され、その割合も顕著に高かった。他方で、カスパーゼ阻害剤添加群においては、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖの蛍光はほとんど観察されず、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合に関しても、ＵＶ照射なしのコントロール群よりも低いか、コントロール群と同等のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞の割合を示した。

（実施例８：ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞の機能障害および形態異常の観察）
本実施例では、ＵＶ照射されたウサギ角膜内皮細胞の機能障害および形態異常を共焦点顕微鏡で観察した。

（材料および方法）
本実施例では、以下のカスパーゼ阻害剤を使用した。
Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ （１０μＭ）
エムリカサン （１０μＭ）

安楽死後０〜２４時間のウサギ眼球を本実施例で用いた。実体顕微鏡下で角膜輪部に沿ってスプリング剪刃を用いて強膜を切除し、水晶体および虹彩を取り除き強角膜片を作成した。強角膜片を４分割し、コントロール群および各カスパーゼ阻害剤添加群とした。角膜の分割後、コントロール群はＤＭＳＯを添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）、カスパーゼ阻害剤添加群では各試薬を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）にて１６時間のプレトリートを遮光下にて行った。ＰＢＳ（−）にて角膜を２回洗浄後、角膜内皮細胞にＵＶ ２５０Ｊ／ｍ^２を照射し、再び遮光下にて２４時間４℃で保存した。保存液にはカスパーゼ阻害剤添加群には各阻害剤を添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）を用いた。コントロール群には阻害剤の溶媒であるＤＭＳＯをＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）に添加した。

強角膜片をＰＢＳ（−）で洗浄した後に４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに６０分間インキュベートした。Ｎ−カドヘリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対する抗体を１：３００希釈を用いて実施した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１００９）１：１０００希釈を使用した。アクチンの染色には、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５４６の１：４００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で染色した。その後、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ； Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｅｔｚｌａｒ Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光観察を行った。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤は細胞障害刺激による角膜内皮細胞の機能障害および形態異常を抑制する）
結果を図１０に示す。Ｎ−カドヘリン、ＺＯ−１は、アドへレンスジャンクションやタイトジャンクションに関与するタンパク質であり、これらの蛍光観察により角膜内皮細胞の機能の一つであるバリア機能を評価することができる。ＵＶ照射群では、Ｎ−カドヘリンの蛍光がほとんど観察されず、アドへレンスジャンクションが障害されていることがわかる。また、ＺＯ−１の蛍光観察からは、タイトジャンクションが障害されていることがわかる。ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎは、細胞形態の維持等を含む様々な役割を持つアクチンに結合するため、細胞形態を評価することができる。ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光画像からわかるように、ＵＶ照射群では、コントロールでは細胞の皮質部分に局在するアクチンが細切れになり異常な局在を示している。これらのＵＶ対照群における観察とは対照的に、ＵＶ照射＋カスパーゼ阻害剤添加群においては、コントロール群（ＵＶ照射なし）と同様に細胞の機能・形態が維持されていることが認められる。

（実施例９：不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）のＴＧＦ−β２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果）
本実施例では、不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）のＴＧＦ−β２による細胞障害に対するカスパーゼ阻害剤の効果を検討した。

（材料および方法）
ｉＦＥＣＤをコーティングされていない１２ウェルプレートに１．２×１０^５ずつ播種し、３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）＋１０％ ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ／０４−００１−１Ａ）＋１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ， ２６２５２−９４）を使用した。

播種してから２４時間後、各阻害剤を１０μＭの濃度で添加し３７℃で５％ＣＯ_２の条件下にて２４時間インキュベートした。なお、コントロール群、ＴＧＦ−β２群は培地を交換した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ ＦＢＳ＋１％ Ｐ／Ｓを使用した。
試薬は以下のものを使用した：

ＳＢ４３１５４２（和光純薬工業株式会社／１９２−１６５４１）、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ペプチド研究所／３１８８−ｖ）、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（異性体混合物）（和光純薬工業株式会社／２６２−０２０６１）、エムリカサン（ＣＨＥＭＳＣＥＮＥ，ＬＬＣ／ＣＳ−０５９９）。

次に、ＴＧＦ−β２（製造元：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、販売元：和光純薬工業株式会社／製造元コード３０２−Ｂ２−００２，３０２−Ｂ２−０１０、販売元コード：５５３−６２８８１，５５９−６２８８３）（１０ｎｇ／ｍＬ）のみまたはＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍＬ）と各阻害剤（１０μＭ）の両方を添加し２４時間後に位相差顕微鏡を用いて細胞形態およびプログラム細胞死を観察した。

観察後、以下の手順でフローサイトメトリーを用いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの陽性細胞率を検討した。

浮遊および死細胞も回収するため、細胞をダルベッコＰＢＳ（−）（ニッスイ／０５９１３）１ｍＬで２回洗浄した溶液も回収し、２００μＬ／ウェルのＡｃｃｕｔａｓｅ（ＩＮＮＯＶＡＴ／ＡＴ１０４）を滴下し、５分間インキュベートした。インキュベートした後、ダルベッコ改変イーグル培地（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）１ｍＬで洗浄し、４℃、１５００ｒｐｍ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。沈殿物にダルベッコＰＢＳ（−）を１ｍＬ加えピペッティングしてから４℃、１５００ｒｐｍ、５分遠心し上清を除去した。その後Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ／４７００−３００）９２．５μＬ、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＭＢＬ／４７００−１００）５μＬ／ウェル、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）２．５μＬ／ウェルを滴下し、ピペッティングした後５分間室温で遮光しながらインキュベートした後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ ＴＭ Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（日本ベクトン・ディッキソン株式会社）を用いてＡｎｎｅｘｉｎ Ｖの陽性細胞率を測定した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィ疾患細胞モデルの角膜内皮細胞のアポトーシスを抑制する）
図１１に示される通り、ＴＧＦ−β２群において顕著な細胞死が観察されたが、各カスパーゼ阻害剤が添加された群においては、ＴＧＦ−β２阻害剤であるＳＢ４３１５４２を添加した群と同様に、プログラム細胞死が抑制されていたことが観察された。この結果は、カスパーゼ阻害剤がＴＧＦ−β２刺激による細胞障害を抑制することができることを示している。

フローサイトメトリーの結果を図１２および図１３に示す。カスパーゼ阻害剤添加群は、ＴＧＦ−β２添加群よりもＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性細胞率が低かった。これは、ＴＧＦ−β２により誘導される角膜内皮細胞の障害を、ＴＧＦ−βシグナル阻害とは別の経路にも拘らず同程度にカスパーゼ阻害剤が強く抑制したことを意味する。

（実施例１０：不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）におけるＴＧＦ−β２によるカスパーゼ３の活性化）
本実施例では、不死化フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来細胞（ｉＦＥＣＤ）におけるＴＧＦ−β２によるカスパーゼ３の活性化に対するカスパーゼ阻害剤の抑制効果を調べた。

（材料および方法）
ＩＦＥＣＤの培養は実施例９と同様の手順で行った。

１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞をダルベッコＰＢＳ（−）（ニッスイ／０５９１３）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３分間超音波を当てたのち、４℃、１５００ｒｐｍ、１０分遠心し、タンパク質の上清を回収した。
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質（各ウェルにそれぞれ９μｌ流し、タンパク質量は、Ｃｌｅａｖｅｄ−Ｃａｓｐａｓｅ３およびＧＡＰＤＨは約５．４μｇ、ＰＡＲＰは約６．２μｇであった。）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、Ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ ｍＡｂ（株式会社医学生物学研究所／Ｍ１７１−３）、ＰＡＲＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴジャパン株式会社／９５４２Ｓ）、Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴジャパン株式会社／９６６２Ｓ）を用いた。２次抗体はＥＣＬ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ａｂ （ヒツジ由来）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ ＮＡ９３１Ｖ）、ＥＣＬ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ Ａｂ（ロバ由来）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。１次抗体はＡｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ ｍＡｂを３０００倍希釈、ＰＡＲＰ Ａｎｔｉｂｏｄｙを２０００倍希釈、Ｃａｓｐａｓｅ−３ Ａｎｔｉｂｏｄｙを１０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク株式会社／１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
（カスパーゼ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィ疾患細胞モデルのカスパーゼ３の活性化を抑制する）
ウェスタンブロットの結果を図１４に示す。示される通り、カスパーゼ阻害剤添加群においては、活性化型の切断カスパーゼ３のバンド（約１７ｋＤａ）が観察されず、カスパーゼ阻害剤が、フックス角膜内皮ジストロフィ疾患細胞モデルのカスパーゼ３の活性化を抑制することが示された。

（実施例１１：ウサギ角膜を用いたカスパーゼ阻害剤の角膜保存に対する効果の検討）
本実施例では、ウサギ角膜を用いたカスパーゼ阻害剤の角膜保存に対する効果を検討した。

（材料および方法）
安楽死後０〜２４時間のウサギ眼球を実験に用いた。実体顕微鏡下で角膜輪部に沿ってスプリング剪刃を用いて強膜を切除し、水晶体および虹彩を取り除き強角膜片を作成した。強角膜片を２分割し、コントロール群およびエムリカサン添加群とした。角膜の分割後、コントロール群はＤＭＳＯを添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ）、カスパーゼ阻害剤添加群ではエムリカサンを添加したＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（登録商標）にて２週間４℃で静置した。

その後、強角膜片をＰＢＳ（−）で洗浄した後に４％ホルムアルデヒドで１０分間室温（ＲＴ）で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともに６０分間インキュベートした。Ｎ−カドヘリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対する抗体を１：３００希釈で使用した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１００９）の１：１０００希釈したものを使用した。アクチンの染色には、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５４６の１：４００希釈を使用した。次いで、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で染色した。共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ； Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｅｔｚｌａｒ Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光観察を行った。蛍光顕微鏡像をもとにアクチンの収縮環が認められた細胞をカウントして、割合を測定した。

（結果）
（Ｅｍｒｉｃａｓａｎは角膜保存液への添加により角膜保存中の角膜内皮障害を抑制する）
結果を図１５に示す。４℃で２週間保存後の蛍光画像からわかるように、コントロール群は細胞障害を受けているのに対し、エムリカサン添加群は、４℃で２週間保存してもほとんど細胞障害を受けず、細胞の形態異常が観察されなかった。また、細胞障害に際して認められるアクチンの収縮環の出現をエムリカサンが有意に抑制した。

（実施例１２：凍結保存液の検討）
本実施例では、凍結保存液の検討を行った。

（材料および方法）
市販される凍結保存液、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ＰＬＵＳ（タカラバイオ カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ ２（タカラバイオ カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（タカラバイオ カタログ番号：ＣＢ０４３）、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ カタログ番号：ＫＯＪ−１６０９２００５）、Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｒｅｅ， ＣＲＹＯ Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｃｎｔ−ＣＲＹＯ）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ カタログ番号：ＣｎＴ−ＣＲＹＯ−５０）、およびＯｐｔｉＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に１０％（ｖ／ｖ）となるようにウシ胎児血清とＤＭＳＯ（ナカライテスク）を添加し、凍結保存液として用いた。

試験には培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％ コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）をＭＳＣフィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。上記培地で培養したヒト角膜内皮細胞を用いた。各凍結保存液に上記細胞を細胞濃度１００，０００個／ｍｌとなるように懸濁し、それぞれをクライオチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ カタログ番号：４３０４８８）に１ｍＬずつ入れた。次いで凍結チューブをバイセル（日本フリーザー カタログ番号：ＢＩＣＥＬＬ）に入れ、−８０℃で１０日間保存した後、３７℃水浴にてチューブを浸漬して解凍した。解凍後、培地で洗浄してトリパンブルー色素排除法により、生細胞数と死細胞数を測定した。

下記式により、各凍結保存液についての生存率を算出した。
生存率＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００

また１０，０００細胞ずつ分注してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号：Ｇ７５７０）で、生存率を算出した。

（結果）
（市販される各種凍結保存液においてＫＭ ｂａｎｋｅｒは角膜内皮細胞の細胞障害抑制に優れる）
結果を図１６に示す。トリパンブルー陰性細胞の割合は凍結保存液間で差は認められなかった。しかしながら、より代謝活性のある細胞に由来するＡＴＰを定量することにより算出された細胞生存率は、Ｋｍ ｂａｎｋｅｒが最も高く、コントロールとほとんど変わらなかった。

（実施例１３：各種凍結保存液における角膜内皮細胞の凍結後の細胞生着）
本実施例では、各種凍結保存液における角膜内皮細胞の凍結後の細胞生着を観察した。
（材料および方法）

実施例１２と同様に角膜内皮細胞の凍結保存および解凍を行った。

解凍後、細胞をラミニンＥ８（ベリタス）でコーティングした９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０００細胞播種し、Ｙ２７６３２存在下および非存在下で培養した。培養３日後、位相差顕微鏡像を取得した（倍率：１００倍）。

また、凍結した細胞と同ロットの細胞を用いて検量線を描き、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号：Ｇ７５７０）を実施し、細胞数を測定した（ｎ＝６）。

（結果）
（ＫＭ ｂａｎｋｅｒは角膜内皮細胞の凍結後の細胞生着を促進する）
図１７に示される顕微鏡像からわかるように、ＫＭ ｂａｎｋｅｒを使用した場合、細胞生着が促進されていることが観察された。さらに、図１８に示されるように、ＫＭ ｂａｎｋｅｒを使用した場合、凍結保存を経ていない継代培養細胞と比較してわずかに細胞数が少なかったが、他の凍結保存液を使用した場合と比較して顕著に高い細胞数を示した。これは、ＫＭ ｂａｎｋｅｒは、角膜内皮細胞の凍結保存後の細胞生着を促進していることを示している。

（実施例１４：Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫのカスパーゼ阻害による角膜内皮凍結保存後の角膜内皮細胞培養の促進）
本実施例では、角膜内皮凍結保存後の角膜内皮細胞培養におけるＺ−ＶＤ−ＦＭＫのカスパーゼ阻害の効果を検証した。

（材料および方法）
試験にはＭＳＣ−ＣＭ（ＭＳＣ順化培地）で培養したヒト角膜内皮細胞を用いた。ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（×１０）（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２１７７−０１）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ_２）で１０分インキュベートした。その後、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲで凍結保存した。−８０℃で３日間保存した後、３７℃水浴にてチューブを浸漬して解凍した。また細胞をラミニンＥ８をコーティングした１２ウェルプレートに１００，０００細胞播種し、播種時に最終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるようにＺ−ＶＤ−ＦＭＫ添加した。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫを添加しない群に関してはＤＭＳＯを添加した。

（結果）
（Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫは角膜内皮凍結保存後の角膜内皮細胞培養を促進する）
図１９に示される通り、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した場合は、凍結保存後の角膜内皮細胞培養において細胞増殖を促進した。したがって、カスパーゼ阻害剤は、角膜内皮細胞の増殖に有用であることが明らかになった。

（実施例１５：Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫによる角膜内皮凍結保存における細胞障害の減少）
本実施例では、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫによる角膜内皮凍結保存における細胞障害の減少を調べた。

（材料および方法）
試験にはＭＳＣ−ＣＭで培養したヒト角膜内皮細胞を用いた。ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（×１０）（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２１７７−０１）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ_２）で１０分インキュベートした。その後、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲに最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＺ−ＶＤ−ＦＭＫ（和光純薬工業 カタログ番号：２６２−０２０６１）を加えて凍結保存した。なお、コントロール群には、試薬の溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，１３４０８−６４）を添加して凍結した。

−８０℃で３日間保存した後、３７℃水浴にてチューブを浸漬して解凍した。解凍後、培地で洗浄してトリパンブルー色素排除法により、生細胞数と死細胞数を測定した。また細胞をラミニンＥ８をコーティングした９６ウェルプレートに１０，０００細胞播種し、播種時に最終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるようようにＺ−ＶＤ−ＦＭＫ、または最終濃度１０μｍｏｌ／ｌとなるようにＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）を添加した。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＳＢ２０３５８０を添加しない群に関してはＤＭＳＯを添加した。播種して２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号：Ｇ７５７０）を実施して発光量を測定した。

（結果）
（Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫによるカスパーゼ阻害は角膜内皮凍結保存による細胞障害を減らす）
本実施例では、凍結保存におけるカスパーゼ阻害剤の細胞生存率に対する影響および凍結保存後に添加したカスパーゼ阻害剤の細胞数に対する影響を調べた。凍結から常温に回復した直後の細胞生存率は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫを凍結保存液に添加した場合（Ｆｒｅｅｚｅ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ）、添加していない場合（Ｆｒｅｅｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べ細胞生存率が高かった（図２０左）。Ｆｒｅｅｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群において、凍結保存後にＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した場合、細胞障害が抑制され、細胞数は、凍結保存後にＤＭＳＯを添加した場合と比較しておよそ１．７倍であった。Ｆｒｅｅｚｅ＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ群においては、凍結保存後にＤＭＳＯを添加した場合、細胞数はおよそ２．２倍であり、凍結保存後にさらにＺ−ＶＤ−ＦＭＫを添加した場合は、およそ２．５倍であった。また、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を添加した場合は相乗効果が確認された。

（実施例１６：Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫは複数の凍結保存液への添加において凍結後の細胞培養を促進する）
（材料および方法）
試験にはＭＳＣ−ＣＭで培養したヒト角膜内皮細胞を用いた。ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（×１０）（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２１７７−０１）を添加し、３７℃（５％ ＣＯ_２）で１０分インキュベートした。その後、Ｃｅｌｌ ＢＡＮＫＥＲ、ＫＭ ＢＡＮＫＥＲを凍結保存液として使用して凍結保存した。コントロールにはＤＭＳＯを使用した。−８０℃で３日間保存した後、３７℃水浴にてチューブを浸漬して解凍した。

また細胞をラミニンＥ８をコーティングした９６ウェルプレートに１０，０００細胞播種し、播種時に最終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるようにＺ−ＶＤ−ＦＭＫ、または最終濃度５μｍｏｌ／ｌとなるようにＹ２７６３２（和光純薬工業 カタログ番号：２５３−００５１３）を添加した。Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＹ２７６３２を添加しない群に関してはＤＭＳＯを添加した。播種して２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号：Ｇ７５７０）を実施してＧＲＯＷＭＡＸ（プロメガ）で発光量を測定した。

（結果）
（Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫは複数の凍結保存液への添加における凍結後の細胞培養を促進する）
結果を図２１に示す。示される通り、凍結保存後にＺ−ＶＡＤ−ＭＫを添加した場合、添加していない場合と比べて顕著に細胞数が多いことが認められる。また、Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒを凍結保存液として使用した場合でも、ＫＭ Ｂａｎｋｅｒを凍結保存液として使用した場合でも、Ｚ−ＶＡＤ−ＭＫの効果は同等であることがわかる。したがって、Ｚ−ＶＡＤ−ＭＫは、いずれの凍結保存液において添加しても同様に細胞培養を促進することが示された。

（実施例１７：ＴＧＦβによるフィブロネクチン産生に対するカスパーゼ阻害剤の抑制効果）
本実施例では、カスパーゼ阻害剤がＴＧＦ−β２による角膜内皮細胞の細胞外マトリックス産生を抑制することを確認した。

（蛍光観察）
（材料および方法）
２４ウェルプレートに丸ガラスを置き、エタノールで５分間消毒しラミニン−５１１ Ｅ８ Ｆｒａｇｍｅｎｔでコーティングした。その後、ｉＦＥＣＤを４．０×１０^５ずつ播種し、６割〜７割コンフルエントになるまで３７℃（５％ ＣＯ_２）で培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、２６２５２−９４）を使用した。その後、ＳＢ４３１５４２（和光純薬工業株式会社／１９２−１６５４１）、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（異性体混合物）（和光純薬株式会社／２６２−０２０６１）、エムリカサン（ＣＨＥＭＳＣＥＮＥ、ＬＬＣ／ＣＳ−０５９９）を１０μＭの濃度で添加し２４時間インキュベートした。コントロール群、ＴＧＦ−β２添加群は培地交換を行った。培地はＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを用いた。その後、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍＬ）のみまたはＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍＬ）と各阻害剤（１０μＭ）の両方を添加し２４時間後に下記の方法で免疫染色を行った。

刺激してから２４時間後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、４％ＰＦＡで室温で１０分間固定した。その後０．５％トライトンで５分間透過処理をし、１％ＢＳＡで１時間ブロッキングをした。一次抗体反応を室温で一時間または一晩行った。このとき、フィブロネクチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅ，６１００７７）に対する抗体を１：４００に希釈して用いた。二次抗体にはＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗体マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１１００９）の１：１０００希釈したものを用いた。さらに、細胞核をＤＡＰＩ（Ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ＤＡＰＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を１：２０００で希釈したもので染色した。共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｃＨ Ａｍ Ｆｒｉｅｎｄｅｎｓｐｌａｔｚ ３ ６８１６５ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光観察を行った。

（ウェスタンブロットによる発現の確認）
（材料および方法）
ｉＦＥＣＤを１２ウェルプレートに１．０×１０^５ずつ播種し、６割〜７割コンフルエントになるまで３７℃（５％ＣＯ_２）で培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ１８２０−５００）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、２６２５２−９４）を使用した。その後、ＳＢ４３１５４２（和光純薬工業株式会社／１９２−１６５４１）、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ（異性体混合物）（和光純薬株式会社／２６２−０２０６１）エムリカサン（ＣＨＥＭＳＣＥＮＥ、ＬＬＣ／ＣＳ−０５９９）を１０μＭの濃度で添加し２４時間インキュベートした。コントロール群、ＴＧＦ−β２添加群は培地交換を行った。培地はＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを用いた。その後、ＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍＬ）のみまたはＴＧＦ−β２（１０ｎｇ／ｍＬ）と各阻害剤（１０μＭ）の両方を添加し２４時間後に下記の方法でタンパクを回収した。

（１）タンパク質の回収
浮遊及び死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、１５分遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ ＤＥＮＫＩ製）にて３分粉砕後、１０分遠心し（４℃、１５０００ｒｐｍ）、タンパク質の上清を回収した。

（２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質８μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体にはマウス抗フィブロネクチン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅ，６１００７７）、ウサギ抗Ｓｍａｄ２抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、５３３９Ｐ）、ウサギ抗ｐ−Ｓｍａｄ２抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１０８Ｓ）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１ー３）を用いた。２次抗体はペルオキシターゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ、ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はマウス抗Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ抗体を２００００倍希釈、ウサギ抗Ｓｍａｄ２抗体およびウサギ抗ｐ−Ｓｍａｄ２抗体を１０００倍希釈、ＧＡＰＤＨを３０００倍希釈し、二次抗体は５０００倍希釈した。

検出にはＣｈｅｍｉ Ｌｕｍｉ ＯＮＥ Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度はＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。

（結果）
結果を図２２および２３に示す。本実施例では、ＴＧＦ−β２刺激による細胞外マトリックス産生に対するカスパーゼ阻害剤の効果について検討を行った。ＴＧＦ−β２添加群において、フィブロネクチンの発現がコントロールに比べ増加していた。それに対し、ＴＧＦ−β２＋カスパーゼ阻害剤添加群において発現が減少していた。また、ＴＧＦ−β２添加群、ＴＧＦ−β２＋カスパーゼ阻害剤においてリン酸化Ｓｍａｄ２（ｐ−Ｓｍａｄ２）の発現が認められた。

（考察）
図２２および図２３から明らかなように、ＴＧＦ−β２添加群においてはフィブロネクチンの過剰発現が認められ、ＴＧＦ−β２阻害剤であるＳＢ４３１５４２添加群においては、ＴＧＦ−β２によるフィブロネクチンの過剰発現が抑制されており、またＴＧＦ−β２刺激によりリン酸化されるＳｍａｄ２の存在も認められなかった。他方で、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫまたはエムリカサンを添加した群では、フィブロネクチンの過剰発現が抑制されていたにもかかわらず、ｐ−Ｓｍａｄ２の存在が認められた。これは、カスパーゼ阻害剤が、ＴＧＦ−β２シグナルとは異なる経路でフィブロネクチンの過剰発現を抑制していることが示唆される。実際、カスパーゼは細胞死に関与していることが知られているが、細胞外マトリックスの発現に関与していることは知られていなかった。したがって、カスパーゼ阻害剤が、ＴＧＦ−β２シグナルとは異なる経路でフィブロネクチンの過剰発現を抑制することは予想外であった。

フックス角膜内皮ジストロフィにおいてはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスの過剰産生およびデスメ膜への沈着による、デスメ膜肥厚、グッテー（ｇｕｔｔａｅ）の形成などの障害が生じる。これらの障害は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者において一般的には３０代から４０代に生じ始め、生涯を通じて進行する。進行により霧視、ハロー、グレア、視力低下などの視力障害を生じる。さらに、フックス角膜内皮ジストロフィでは角膜内皮細胞が継続的に障害されるが、細胞密度が約１０００個／ｍｍ^２を下回るまではポンプ機能を残された角膜内皮が代償することで角膜の透明性は維持される。一方で、約１０００個／ｍｍ^２を下回ると角膜に前房水が進入することで、角膜浮腫が生じ視力障害を生じる（図２３）。このように、フックス角膜内皮ジストロフィ患者では、主に細胞外マトリックスの過剰産生と角膜内皮細胞死の２つの原因により視機能障害が生じる。本発明におけるカスパーゼ阻害剤の働きは、細胞外マトリックス産生の抑制および角膜内皮細胞死抑制の双方に働くことで、フックス角膜内皮ジストロフィ治療に特に有用であると言える。

（実施例１８：製剤例：カスパーゼ阻害剤を含有する角膜保存液）
本実施例では、製剤例として、カスパーゼ阻害剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。

常法により下に示す保存液を調製する。
エムリカサン ０．５６９５ｍｇ
Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ

エムリカサンはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を用いることができる。

（実施例１９：点眼剤の調製例）
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
エムリカサン １〜１０ｍＭ（569.5-5695mg）
または、他のカスパーゼ阻害剤の適切な濃度
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）

濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
塩化ナトリウム ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物 ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物 ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム 適量
精製水 適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）

（実施例２０：治療例）
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、1）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、2）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、3)ペンタカム、OCT、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、4）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。想定例としては、点眼薬、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射などがある。

有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１５年１２月２４日に出願された日本国出願特願２０１５−２５１７８７号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参考として援用される。

角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常、および／または細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮障害の治療または予防のための医薬が提供され、特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害を治療または予防するための医薬が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。

Claims (34)

1. カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
2. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬。
3. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、請求項１または２に記載の医薬。
4. 前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける細胞外マトリクスの過剰産生に起因する症状を治療または予防するものである、請求項３に記載の医薬。
5. 前記症状は、角膜内皮面の疣贅（グッタータ）、デスメ膜の混濁グッテー、デスメ膜の肥厚、霧視、ハロー、グレア、視力低下、角膜混濁、白斑および視感覚の異常からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項４に記載の医薬。
6. カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
7. 前記症状、障害または疾患は、角膜内皮細胞におけるフィブロネクチンの過剰発現に起因する、請求項６に記載の医薬。
8. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、瘢痕、角膜片雲、角膜斑、角膜白斑、羞明、および霧視からなる群より選択される請求項６に記載の医薬。
9. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、請求項６〜８のいずれかに記載の医薬。
10. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける、グッテーの形成およびデスメ膜の肥厚から選択される少なくとも１つを含む、請求項９に記載の医薬。
11. カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための医薬。
12. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、その他の角膜内皮ジストロフィ、ならびに、薬物、手術、外傷、感染症、またはぶどう膜炎による角膜内皮障害からなる群より選択される請求項１１に記載の医薬。
13. 前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、請求項１１または１２に記載の医薬。
14. カスパーゼ阻害剤を含む凍結保存液を含む、角膜内皮細胞の凍結保存または凍結保存後の培養のための組成物。
15. カスパーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物。
16. ｐ３８ＭＡＰキナーゼをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ−３阻害剤である、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬または組成物。
18. 前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、エムリカサンおよびニボカサンからなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬。
19. 前記Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約１００μＭである、請求項１８に記載の医薬。
20. 前記Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約３０μＭである、請求項１８に記載の医薬。
21. 前記エムリカサンの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭである、請求項１８に記載の医薬。
22. 前記ニボカサンの濃度は、約３０μＭ〜約３００μＭである、請求項１８に記載の医薬。
23. 前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＡＤＦＭＫ、エムリカサンおよびニボカサンからなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の組成物。
24. 前記Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約１００μＭである、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫの濃度は、約３μＭ〜約３０μＭである、請求項２３に記載の組成物。
26. 前記エムリカサンの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭである、請求項２３に記載の組成物。
27. 前記ニボカサンの濃度は、約３０μＭ〜約３００μＭである、請求項２３に記載の組成物。
28. カスパーゼ阻害剤を含む、フックス角膜内皮ジストロフィを治療または予防するための医薬であって、該カスパーゼ阻害剤はエムリカサンである、医薬。
29. 前記フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルに起因する、請求項２８に記載の医薬。
30. 前記フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜内皮細胞における細胞外マトリックスの過剰発現に起因する、請求項２８に記載の医薬。
31. 前記フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよび細胞外マトリックスの過剰発現に起因する、請求項２８に記載の医薬。
32. 前記エムリカサンの濃度は、約１μＭ〜約１００μＭである、請求項２９〜３１のいずれかに記載の医薬。
33. 前記カスパーゼ阻害剤はＺ−ＶＤ−ＦＭＫであり、前記凍結保存液はＫＭ ＢＡＮＫＥＲ（商標）、ＣＥＬＬ ＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、またはこれらの改変された凍結保存液である、請求項１４に記載の組成物。
34. 前記カスパーゼ阻害剤はＺ−ＶＤ−ＦＭＫである、請求項１５または１６に記載の組成物。