CN110944668A - 用于治疗或预防眼部症状、障碍或疾病的包含mTOR抑制剂的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的药物及方法。本发明提供用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的包含mTOR抑制剂的组合物。在一些实施方式中,本发明的组合物可治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾病,尤其,由转化生长因子‑β(TGF‑β)信号和/或细胞外基质(ECM)的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防眼部症状、障碍或疾病的、包含mTOR(又称mechanistic target of rapamycin mammalian target of rapamycin)抑制剂的药物及其应用。
背景技术
从眼球最前面的透明组织即角膜进入的光到达视网膜并激发视网膜的神经细胞,所产生的电信号经过视神经传递至大脑的视觉中枢,由此视觉信息得以识别。为了获得良好的视力,角膜需要是透明的。角膜的透明性是通过使含水量通过角膜内皮细胞的泵功能和屏障功能保持恒定来保持。
人的角膜内皮细胞在出生时的密度为每平方毫米约3000个,但一旦受损,其再生能力将非常有限。Fuchs角膜内皮营养不良是指角膜的内侧内皮细胞异常且角膜内皮细胞的密度明显降低,最终导致角膜的浮肿的疾病,其原因尚不明确。并且,在Fuchs角膜内皮营养不良中,诸如胶原蛋白、纤连蛋白等的细胞外基质沉积在位于角膜后部的后弹力膜的后部面的一部分中,导致角膜滴状物(Corneal guttae)及后弹力膜的增厚。角膜滴状物(Corneal guttae)及后弹力膜的增厚为Fuchs角膜内皮营养不良患者中的畏光、视力模糊的原因,并严重损害患者的QOL。像这样,诸如纤连蛋白等的细胞外基质还与导致视力下降的症状相关,如角膜内皮面的滴状物(guttae)或后弹力膜的混浊角膜滴状物等,并且有可能是混浊、角膜混浊或白斑等与角膜的混浊相关的角膜内皮障碍的主要原因。据闻,Fuchs角膜内皮营养不良除了角膜移植以外没有有效治疗方法,但在日本的角膜捐献不足,相对于约2600名等待角膜移植的患者,每年在国内进行的角膜移植为1700例左右。
关于Fuchs角膜内皮营养不良,存在来自Fuchs角膜患者的角膜内皮细胞的培养(非专利文献1及3)或永生化(非专利文献2)的报道,但是针对适合于筛选维持伴随细胞外基质过度生成等的疾病特征的治疗药、进展预防药物的细胞,尚无报道,因此其治疗药的研究受限,目前临床上没有使用的治疗药,不得不依赖于角膜移植。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Zaniolo K,et al.Exp Eye Res.;94(1):22-31.2012
非专利文献2:Azizi B,et al.Invest Ophthalmol Vis Sci.2;52(13):9291-9297.2011
非专利文献3:Kelliher C.et al.Exp Eye Res Vo1.93(6),880-888,2011
发明内容
发明所要解决的课题
本发明人发现,通过抑制mTOR,可抑制眼部、特别是角膜内皮细胞的细胞死亡(细胞凋亡),可用于治疗或预防由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮障碍(尤其,Fuchs角膜内皮营养不良的角膜内皮障碍)等的眼科障碍。并且,本发明人意外发现,可通过抑制mTOR来抑制纤连蛋白等的细胞外基质(ECM)的过度表达。由此,本发明人发现,还可将mTOR抑制剂适用于由细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮障碍(例如,角膜滴状物、后弹力层的增厚、角膜混浊、白斑等的混浊的症状等)的改善、治疗或预防。由于细胞死亡与细胞外基质是独立的事件,因此优选能够抑制两者。
因此,本发明提供例如以下的项目。
项目1:
一种用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的组合物,其包含mTOR抑制剂。
项目2:
根据项目1所述的组合物,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目3:
根据项目1或2所述的组合物,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目4:
根据项目1至3中任一项所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的组。
项目5:
根据项目1至4中任一项所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病由细胞外基质(ECM)的过度表达所引起。
项目6:
根据项目5所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、混浊、疤痕、角膜薄翳(corneal nebula)、角膜斑(corneal macula)、角膜白斑(corneal leucoma)、畏光(photophobia)及视力模糊(blurred vision)组成的组。
项目7:
根据项目1至6中任一项所述的组合物,其中,所述症状、障碍或疾病包括Fuchs角膜内皮营养不良。
项目8:
根据项目1至7中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂选自由雷帕霉素(Rapamycin)、替西罗莫司(Temsirolimus)、依维莫司(Everolimus)、PI-103、CC-223、INK128、AZD8055、KU 0063794、Voxtalisib、Ridaforolimus、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib、Torin 1、Omipalisib、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib、WYE-354、Vistusertib、Torin2、他克莫司(Tacrolimus)、GSK1059615、Gedatolisib、WYE-125132、BGT226、Palomid 529、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、咗他莫司(Zotarolimus)及大黄根酸(Chrysophanic Acid)组成的组。
项目9:
根据项目1至7中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为抑制mTOR基因表达的物质。
项目10:
根据项目9所述的组合物,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA、反义核酸或核酶。
项目11:
根据项目9或10所述的组合物,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA,所述siRNA包括有义链及反义链,所述有义链由序列号1表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成,所述反义链由序列号2表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成。
项目12:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂选自由由雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司组成的组。
项目13:
根据项目1至12中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂。
项目14:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1nM存在于所述组合物中。
项目15:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目16:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司、并以至少约0.01nM存在于所述组合物中。
项目17:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司、并以至少约0.01mM存在于所述滴眼剂中。
项目18:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1nM存在于所述组合物中。
项目19:
根据项目1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目1A:
一种用于预防或治疗受试者的眼部症状、障碍或疾病的方法,其中,所述方法包括向所述受试者给与有效量的mTOR抑制剂的工序。
项目2A:
根据项目1A所述的方法,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目3A:
根据项目1A或2A所述的方法,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目4A:
根据项目1A至3A中任一项所述的方法,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的组。
项目5A:
根据项目1A至4A中任一项所述的方法,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病由细胞外基质(ECM)的过度表达所引起。
项目6A:
根据项目5A所述的方法,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、混浊、疤痕、角膜薄翳、角膜斑、角膜白斑、畏光及视力模糊组成的组。
项目7A:
根据项目1A至6A中任一项所述的方法,其中,所述症状、障碍或疾病包括Fuchs角膜内皮营养不良。
项目8A:
根据项目1A至7A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂选自由雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、PI-103、CC-223、INK128、AZD8055、KU 0063794、Voxtalisib、Ridaforolimus、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib、Torin 1、Omipalisib、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib、WYE-354、Vistusertib、Torin 2、他克莫司、GSK1059615、Gedatolisib、WYE-125132、BGT226、Palomid 529、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、咗他莫司及大黄根酸组成的组。
项目9A:
根据项目1A至7A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂为抑制mTOR基因表达的物质。
项目10A:
根据项目9A所述的方法,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA、反义核酸或核酶。
项目11A:
根据项目9A或10A所述的方法,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA,所述siRNA包括有义链及反义链,所述有义链由序列号1表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列组成,所述反义链由序列号2表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成。
项目12A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂选自由由雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司组成的组。
项目13A:
根据项目1A至12A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂以滴眼剂的形式进行给药。
项目14A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1nM的浓度进行给药。
项目15A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂以滴眼剂的形式进行给药,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目16A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司、并以至少约0.1nM的浓度进行给药。
项目17A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂以滴眼剂的形式进行给药,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司并以至少约0.01mM存在于所述滴眼剂中。
项目18A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1nM的浓度进行给药。
项目19A:
根据项目1A至8A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂以滴眼剂的形式进行给药,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目20A:
根据项目1A至19A中任一项所述的方法,其中,局部给药所述mTOR抑制剂。
项目21A:
根据项目1A至20A中任一项所述的方法,其中,向眼部局部给药所述mTOR抑制剂。
项目22A:
根据项目1A至21A中任一项所述的方法,其中,所述mTOR抑制剂以与角膜相接触的方式进行给药。
项目1B:
mTOR抑制剂在制备用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的药物中的用途。
项目2B:
根据项目1B所述的用途,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目3B:
根据项目1B或2B所述的用途,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。
项目4B:
根据项目1B至3B中任一项所述的用途,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的组。
项目5B:
根据项目1B至4B中任一项所述的用途,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病由细胞外基质(ECM)的过度表达所引起。
项目6B:
根据项目5B所述的用途,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、混浊、疤痕、角膜薄翳、角膜斑、角膜白斑、畏光及视力模糊组成的组。
项目7B:
根据项目1B至6B中任一项所述的用途,其中,所述症状、障碍或疾病包括Fuchs角膜内皮营养不良。
项目8B:
根据项目1B至7B中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂选自由雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、PI-103、CC-223、INK128、AZD8055、KU0063794、Voxtalisib、Ridaforolimus、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib、Torin 1、Omipalisib、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib、WYE-354、Vistusertib、Torin 2、他克莫司、GSK1059615、Gedatolisib、WYE-125132、BGT226、Palomid 529、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、咗他莫司及大黄根酸组成的组。
项目9B:
根据项目1B至7B中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂为抑制mTOR基因表达的物质。
项目10B:
根据项目9B所述的用途,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA、反义核酸或核酶。
项目11B:
根据项目9B或10B所述的用途,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA,所述siRNA包括有义链及反义链,所述有义链由序列号1表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成,所述反义链由序列号2表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成。
项目12B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂选自由由雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司组成的组。
项目13B:
根据项目1B至12B中任一项所述的用途,其中,所述药物为滴眼剂。
项目14B:
根据项目1至8中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素并以至少约0.1nM存在于所述药物中。
项目15B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述药物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目16B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司并以至少约0.01nM存在于所述药物中。
项目17B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述药物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司并以至少约0.01mM存在于所述滴眼剂中。
项目18B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1nM存在于所述药物中。
项目19B:
根据项目1B至8B中任一项所述的用途,其中,所述药物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
项目1C:
一种mTOR抑制剂,其用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病。
项目2C:
根据项目1所述的mTOR抑制剂,其中,包括上述项目中的一个或多个特征。
项目1D:
一种用于保存角膜内皮细胞的组合物,其中,包含mTOR抑制剂。
项目2D:
根据项目1D所述的组合物,其中,包括上述项目中的一个或多个特征。
项目1E:
一种用于保存角膜内皮细胞的方法,其中,包括使有效量的mTOR抑制剂与角膜内皮细胞相接触的工序。
项目2E:
根据项目1E所述的方法,其中,包括上述项目中的一个或多个特征。
项目1F:
一种用于使角膜内皮细胞增殖或促进角膜内皮细胞的增殖的方法,其中,包括使有效量的mTOR抑制剂与角膜内皮细胞相接触的工序。
项目2F:
根据项目1E所述的方法,其中,包括上述项目中的一个或多个特征。
在本发明中,除了明确示出的组合之外,还可组合上述的一个或多个特征来进行提供。本领域技术人员根据需要阅读并理解下文中的详细说明,即可认识到本发明的进一步的实施方式及优点。
发明的效果
本发明意外地发现,mTOR抑制剂可治疗或预防下述疾病,该疾病为由Fuchs角膜内皮营养不良等中的由转化生长因子-β(TGF-β)引起的障碍或疾病所致,并且可提供可治疗或预防包含这种疾病的眼部症状、障碍或疾病的药物。并且,还提供了可治疗或预防由角膜内皮障碍引起的疾病的药物,该角膜内皮障碍由细胞外基质(例如,纤连蛋白)的过度生成引起,例如角膜滴状物或后弹力层的增厚、角膜混浊、白斑等的混浊的症状等。进而,本发明提供包含mTOR抑制剂的用于保存角膜内皮细胞的组合物、用于促进角膜内皮细胞的增殖的组合物、以及保存角膜内皮细胞和/或增殖或促进增殖的方法。
附图说明
图1示出iFECD的显微镜图像。图1的左上图示出未添加TGF-β2的对照组,右上图示出添加有TGF-β2的组,左下图示出添加有TGF-β2及雷帕霉素的组,右下图示出添加有TGF-β2及为半胱天冬酶抑制剂的Z-VD-FMK的组。
图2示出全长半胱天冬酶3(total caspase 3)、切割型半胱天冬酶3(cleavedcaspase 3)、PARP及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从左侧开始示出未添加TGF-β2的对照组、添加有TGF-β2的组、添加有TGF-β2及雷帕霉素的组、添加有TGF-β2及为半胱天冬酶抑制剂的Z-VD-FMK的组。
图3示出Akt、p-Akt、S6K、p-S6K及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从左侧开始示出未添加TGF-β2的对照组、添加有TGF-β2的组、添加有TGF-β2及雷帕霉素的组、添加有TGF-β2及为半胱天冬酶抑制剂的Z-VD-FMK的组。
图4示出Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从左侧开始示出未添加TGF-β2的对照组、添加有TGF-β2的组、添加有TGF-β2及雷帕霉素的组、添加有TGF-β2及为半胱天冬酶抑制剂的Z-VD-FMK的组。
图5示出纤连蛋白及GAPDH的蛋白质印迹的结果(n=3)。从左侧开始示出未添加TGF-β2的对照组、添加有TGF-β2的组、添加有TGF-β2及雷帕霉素的组、添加有TGF-β2及为半胱天冬酶抑制剂的Z-VD-FMK的组。
图6示出琼脂糖凝胶电泳及蛋白质印迹的结果。上侧图示出mTOR及GAPDH的琼脂糖凝胶电泳的结果,下侧图示出mTOR、S6K、p-S6K及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从各图的左侧开始示出随机siRNA添加组、TGF-β2+随机siRNA添加组、mTOR siRNA添加组、TGF-β2+mTORsiRNA添加组。
图7示出iFECD的显微镜图像。左上图示出随机siRNA添加组,右上图示出mTORsiRNA添加组,左下图示出TGF-β2+随机siRNA添加组,右下图示出TGF-β2+mTOR siRNA添加组。
图8示出全长半胱天冬酶3(total caspase 3)、切割型半胱天冬酶3(cleavedcaspase 3)、PARP及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从左侧开始示出随机siRNA添加组、TGF-β2+随机siRNA添加组、mTOR siRNA添加组、TGF-β2+mTOR siRNA添加组。
图9示出纤连蛋白及GAPDH的蛋白质印迹的结果。从左侧开始示出随机siRNA添加组、TGF-β2+随机siRNA添加组、mTOR siRNA添加组、TGF-β2+mTOR siRNA添加组。
图10示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+雷帕霉素(0.00001nM、0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图11示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+依维莫司(0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图12示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+替西罗莫司(0.000001μM、0.00001μM、0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)、TGF-β2+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图13示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+PI-103(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图14示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+CC-223(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图15示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+INK128(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图16示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+AZD8055(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM)、TGF-β(10ng/ml)2+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图17示出半胱天冬酶3/7活性的图表。从左侧开始示出TGF-β2非添加组、对照组、TGF-β2(10ng/ml)+KU 0063794(0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM)、TGF-β2(10ng/ml)+Z-VD-FMK(10μM)。对于统计学的显著性,通过Dunnett-t检验进行(*表示p<0.05,**表示p<0.01;n=5)。
图18示出视力与角膜内皮细胞及ECM沉积之间的关系的简图。其表明随着角膜内皮细胞及ECM沉积增加,视力下降。在Fuchs角膜内皮营养不良患者中,因ECM沉积导致的角膜滴状物或后弹力层的增厚一般在30多岁至40多岁开始产生,通过一生而不断进展。因病情进展而导致视力障碍,例如视力模糊、晕圈、眩光、视力下降等。并且,同时进行角膜内皮细胞死亡,但剩下的角膜内皮补偿泵功能直到角膜内皮细胞密度低于约1000个/mm2为止,由此保持角膜的透明性。另一方面,当低于约1000个/mm2时,角膜中进入前房水,由此导致角膜浮肿,并产生严重的视力障碍。本技术可通过抑制ECM沉积及角膜内皮细胞死亡来保持视觉功能。
图19示出在FECD模型小鼠中通过接触式角膜内皮镜观察的角膜内皮细胞像的代表性示例,上述FECD模型小鼠每天早晚2次将mTOR抑制剂滴眼剂(1mM)向左右眼各滴入2μl,持续2个月。作为对照,给出眼睛中滴入生理盐水(基剂)的例子。
图20示出将mTOR抑制剂滴眼剂滴入眼睛中的FECD模型小鼠的角膜内皮细胞密度(个/mm2)的图表。作为对照,给出眼睛中滴入生理盐水(基剂)的例子。对于统计学的显著性,通过学生t检验进行(*表示p<0.05;n=3)。
图21示出将mTOR抑制剂滴眼剂滴入眼睛中的FECD模型小鼠中的角膜滴状物的面积(%)的图表。作为对照,给出眼睛中滴入生理盐水(基剂)的例子。对于统计学的显著性,通过学生t检验进行(**表示p<0.01;n=3)。
具体实施方式
以下,对本发明进行说明。应理解的是,在本说明书全文中,除非另有说明,单数形式的表示包括复数形式的概念。因此,应理解的是,除非另有说明,单数形式的冠词(例如,英语中的“a”、“an”、“the”等)包括其复数形式的概念。并且,应理解的是,除非另有说明,本说明书中所使用的术语以本领域中通常使用的含义使用。因此,除非另有定义,本说明书中使用的所有专业术语及科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在有冲突的情况下,以本说明书(包括定义)为准。
定义
本说明书中数值前的“约”是指其后的数值的±10%。
在本说明书中,“mTOR抑制剂”是指抑制mTOR的信号传导的任何药剂。mTOR抑制剂优选为水溶性。其原因在于,若不是水溶性,则可能需要使用难以适合于人体的溶剂作为溶剂。水溶性可基于药典的溶解度的定义来进行分类。即,定义为如下:作为溶解溶质1g或1mL所需的溶剂量,极易溶解:小于1mL;易溶:1mL以上且小于10mL;稍微易溶:10mL以上且小于30mL;稍微难溶:30mL以上且小于100mL;难溶:100mL以上且小于1000mL;极难溶解:1000mL以上且小于10000mL;几乎不溶:10000mL以上,本说明书中也进行相同地评价。应当理解,所谓水溶性是指,当将水作为溶剂时,若可溶解这些当中的有效量,则可利用任意的溶解性的物质。若为上述水溶性的成分,则可有利地用作滴眼剂。
mTOR(mammalian target of rapamycin)为被鉴定为雷帕霉素的靶标分子的丝氨酸苏氨酸激酶,被认为在调节细胞分裂或存活等中起到核心作用,还已知为SKS、FRAP、FRAP1、FRAP2、RAFT1、RAPT1,且NCBI的基因ID为2475,本领域技术人员可基于此信息来设计制备各种mTOR抑制剂。
本发明中可使用的mTOR抑制剂没有特别的限制,只要是具有mTOR抑制活性的化合物即可,例如可例举雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、PI-103、CC-223、INK128、AZD8055、KU0063794、Voxtalisib(XL765、SAR245409)、Ridaforolimus(Deforolimus、MK-8669)、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib(PP242)、Torin 1、Omipalisib(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib(GDC-0980、RG7422)、WYE-354、Vistusertib(AZD2014)、Torin 2、他克莫司(FK506)、GSK1059615、Gedatolisib(PF-05212384、PKI-587)、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、Palomid 529(P529)、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、咗他莫司(ABT-578)、大黄根酸(Chrysophanic Acid)。
作为优选的mTOR抑制剂,可例举雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司,但不限定于此。虽然不希望受到理论束缚,但这些药物已获得FDA或PMDA等的批准,在安全性或毒性方面最大限度地减少了问题。其他优选的mTOR抑制剂为雷帕霉素。另一种优选的mTOR抑制剂为替西罗莫司。另一种优选的mTOR抑制剂为依维莫司,但不限定于此。
并且,作为可在本发明中使用的mTOR抑制剂,例如,可例举针对mTOR的中和抗体、抑制mTOR的活性的化合物、抑制编码mTOR的基因转录的化合物(例如,反义核酸、siRNA、核酶)、肽、植物成分、中药等的经典药物成分等化合物等。
本发明中使用的反义核酸可通过上述任意作用来抑制编码mTOR信号传导途径的成员等的基因(核酸)表达和/或功能。作为一个实施方式,认为如果设计出与上述的编码mTOR的基因的mRNA的5’末端附近的未翻译区域互补的反义序列,则对抑制基因的翻译是有效的。并且,也可以使用与编码区域或3’的未翻译区域互补的序列。像这样,不仅是上述的编码mTOR等的基因的翻译区域,包含未翻译区域的序列的反义序列的核酸也包含在本发明所使用的反义核酸中。所使用的反义核酸连接在适当的启动子的下游,优选地,含有转录终止信号的序列连接在3’侧。可通过利用公知的方法来将由此制备的核酸转化为所需的动物(细胞)。反义核酸的序列优选为转化的动物(细胞)所具有的编码mTOR的基因或与其一部分互补的序列,但只要可有效抑制基因表达,就可无需完全互补。相对于靶基因的转录产物,所转录的RNA优选具有90%以上的互补性,最优选具有95%以上的互补性。就利用反义核酸来有效抑制靶基因表达而言,优选反义核酸的长度为至少12碱基以上且小于25碱基,但本发明的反义核酸不一定限定于该长度,例如,可以为11碱基以下、100碱基以上或500碱基以上。反义核酸可仅由DNA组成,但也可包含DNA以外的核酸,例如,锁核酸(LNA)。作为一实施方式,在本发明中使用的反义核酸可以为含LNA的反义核酸,其在5’末端包含LNA,在3’末端包含LNA。并且,就本发明而言,在利用反义核酸的实施方式中,例如,可利用“平岛及井上,新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达,日本生化学会编,东京化学同人,1993,319-347.”中所记载的方法,并基于mTOR的核酸序列来设计反义序列。
mTOR的表达抑制还可利用核酶或编码核酶的DNA来进行。所谓核酶,是指具有催化活性的RNA分子。核酶中存在具有各种活性的物质,但通过其中对作为切割RNA的酶的核酶的重点研究,使得设计以位点特异性的方式切割RNA的核酶成为可能。核酶中具有400核苷酸以上的大小,例如,I组内含子型或RNase P中包含的M1 RNA,还具有被称为锤型或发夹型的约40核苷酸的活性域(小泉诚及大塚荣子,蛋白质核酸酶,1990,35,2191.)。
例如,锤型核酶的自切割结构域切割所谓G13U14C15的序列的C15的3’侧,但其活性中U14与A9之间的碱基对形成尤为重要,也可替代C15在A15或U15切割(Koizumi,M.etal.,FEBS Lett,1988,228,228.)。可通过设计底物结合位点与靶位点附近的RNA序列互补的核酶,来创建识别靶RNA中的UC、UU或UA的序列的限制性酶的RNA切核酶(Koizumi,M.etal.,FEBS Lett,1988,239,285.、小泉诚及大塚荣子,蛋白质核酸酶,1990,35,2191.、Koizumi,M.et al.,Nucl.Acids Res.,1989,17,7059.)。
并且,发夹型核酶对本发明的目的也是有用的。在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中发现了这种核酶(Buzayan,JM.,Nature,1986,323,349.)。从发夹型核酶也可创建靶特异性的RNA切核酶(Kikuchi,Y.&Sasaki,N.,Nucl.Acids Res,1991,19,6751.、菊池洋,化学与生物,1992,30,112.)。像这样,可利用核酶来特异性地切割编码mTOR等的基因的转录产物,以抑制所述基因表达。
mTOR的内源性基因表达抑制还可通过利用双链RNA(具有与靶基因序列相同或类似的序列)的RNA干扰(RNA interference,以下简称为“RNAi”)来进行。RNAi是一种目前引人瞩目的技术,当双链RNA(dsRNA)直接引入细胞中时具有与该dsRNA相同的序列的基因表达受到抑制。在哺乳动物细胞中,通过使用短链dsRNA(siRNA)来诱导RNAi,与敲除小鼠相比,RNAi的效果更稳定,更易于实验,成本更低等诸多有点。关于siRNA在本说明书中的其他部分有详细描述。
在本说明书中,“siRNA”是指具有由15~40碱基组成的双链RNA部分的RNA分子,其具有如下功能,即,切割具有与所述siRNA的反义链互补的序列的靶基因的mRNA,抑制靶基因的表达。具体而言,本发明中的siRNA为包含由有义RNA链和反义RNA链形成的双链RNA部分的RNA,所述有义RNA链由与mTOR的mRNA中的连续RNA序列相同的序列组成,所述反义RNA链由与所述有义RNA序列互补的序列组成。此类siRNA及后述的突变型siRNA的设计及制备为本领域技术人员的技术水平的范围内。本领域的普通技术人员通过公知的方法能够适当地选择作为mTOR的序列的转录产物的mRNA的任意连续的RNA区域,并制备对应于该区域的双链RNA。并且,本领域技术人员可通过公知的方法适当地从作为所述序列的转录产物的mRNA序列选择具有更强的RNAi效果的siRNA序列。并且,当判断一侧的链时,本领域技术人员可容易地知道另一侧的链(互补链)的碱基序列。本领域技术人员可利用市售的核酸合成仪来适当制备。并且,对于所需的RNA的合成可利用一般的合成委托服务。
对于双链RNA部分的长度,以碱基计为15~40碱基,优选为15~30碱基,更优选为15~25碱基,进一步优选为18~23碱基,最优选为19~21碱基。应当理解,这些上限及下限不限定于这些特定的值,而可以是所列出的数值的任意组合。siRNA的有义链或反义链的末端结构无特别限定,可根据目的适当选择,例如,可以具有平滑末端,也可以具有突出末端(突出端),优选为3’端突出的类型。对于有义RNA链及反义RNA链的3’末端具有由数个碱基、优选1~3个碱基、进一步优选2个碱基构成的突出端的siRNA,在抑制靶基因表达的效果好的情况较多,为优选。突出端的碱基的种类无特别限定,并可以为构成RNA的碱基或构成DNA的碱基中的任一种。作为优选的突出端序列,可在3’末端例举dTdT(2bp的脱氧T)等。例如,作为优选的siRNA,可以举出在所有的siRNA的有义·反义链的3’末端附有dTdT(2bp的脱氧T)的siRNA,但不限定于此。
并且,还可利用在上述siRNA的有义链或反义链的一侧或两侧缺失、取代、插入和/或添加1~数个核苷酸而成的siRNA。其中,所谓1~数个碱基,虽然无特别限定,但优选为1~4碱基,进一步优选为1~3碱基,最优选为1~2碱基。作为此类突变的具体例,可例举将3’突出端部分的碱基数设为0~3个的例子、将3’-突出端部分的碱基序列变更为其他碱基序列的例子、或者通过碱基的插入、添加或缺失而使上述有义RNA链和反义RNA链的长度为1~3碱基不同的例子、有义链和/或反义链中碱基被其他碱基取代的例子等,但不限定于此。然而,这些突变型siRNA中有义链和反义链之间必须可进行杂交、以及这些突变型siRNA必须具有与未突变的siRNA同等的基因表达抑制能力。
进而,siRNA可以为一端封闭的结构的分子,例如,可以为具有发夹结构的siRNA(短发夹RNA;shRNA)。shRNA为靶基因的特定序列的有义链RNA、由与该有义链序列互补的序列组成的反义链RNA、以及包含连接其两链的连接子序列的RNA,有义链部分和反义链部分杂交,形成双链RNA部分。
在临床上使用siRNA时,优选不表现出所谓的脱靶(off-target)效应。脱靶效应是指:除了靶基因以外,抑制与使用的siRNA部分同源的另一基因表达的作用。为了避免脱靶效应,可使用DNA微阵列等预先确认候选siRNA没有交叉反应。并且,利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information;NCBI)等提供的公知的数据库,确认是否存在包含与靶基因以外的候选siRNA的序列具有高度同源性的部分的基因,由此可避免脱靶效应。
为了制备本发明的siRNA,可适当地利用公知方法,例如,利用化学合成的方法及利用基因重组技术的方法等。在合成方法中,可基于序列信息通过常规方法来合成双链RNA。并且,在利用基因重组技术的方法中,构建编码有义链序列、反义链序列的表达载体,并将所述载体导入宿主细胞中之后,可通过分别获取因转录而生成的有义链RNA、反义链RNA来制备。另外,也可以通过表达shRNA(包含靶基因的特定序列的有义链、由与该有义链序列互补的序列组成的反义链及连接其两链的连接子序列,并形成发夹结构),来制备所期望的双链RNA。
只要siRNA具有靶基因表达抑制活性,则构成siRNA的核酸的全部或其一部分可以为天然的核酸,也可以为修饰的核酸。
本发明中的siRNA并不一定必须是对于靶序列的一组双链RNA,也可以为对包含靶序列的区域的多个组(该“多个”不做特别限定,但优选指约2~5个的少数)的双链RNA的混合物。其中,本领域技术人员可利用市售的核酸合成仪及DICER酶来适当制备作为与靶序列对应的核酸混合物的siRNA,另外,对于所期望的RNA的合成,可利用普通合成委托服务。此外,本发明的siRNA中包含所谓“鸡尾酒siRNA”。并且,本发明中的siRNA不一定所有的核苷酸都必须是核糖核苷酸(RNA)。即,在本发明中,构成siRNA的一个或多个核糖核苷酸可以为对应的脱氧核糖核苷酸。该“对应的”是指虽然糖部分的结构不同、但为相同的碱基类型(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶(尿嘧啶))。例如,与具有腺嘌呤的核糖核苷酸对应的脱氧核糖核苷酸是指具有腺嘌呤的脱氧核糖核苷酸。
进而,本发明的可表达上述RNA的DNA(载体)同样包括在可抑制mTOR等表达的核酸的优选实施方式中。例如,可表达本发明的上述双链RNA的DNA(载体)为具有与启动子相连的结构的DNA,使得编码所述双链RNA的一侧链的DNA及编码所述双链RNA的另一侧链的DNA分别表达。本领域技术人员可通过普通的基因工学技术来适当制备本发明的上述DNA。更具体地,可通过向公知的各种表达载体适当插入编码靶RNA的DNA来制备本发明的表达载体。
在本发明中,抑制靶基因表达的核酸可利用修饰的核酸。修饰的核酸是指:对核苷(碱基位点、糖位点)和/或核苷间结合点施加修饰、具有不同于天然核酸的结构的核酸。作为构成修饰的核酸的“修饰的核苷”,可例举例如无碱基(abasic)核苷;阿拉伯糖核苷、2’-脱氧尿苷、α-脱氧核糖核苷、β-L-脱氧核糖核苷、具有其他糖修饰的核苷;肽核酸(PNA)、结合有磷酸基的肽核酸(PHONA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核酸等。具有上述糖修饰的核苷包含2’-O-甲基核糖、2’-脱氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖等经取代的五糖;1’,2’-脱氧核糖;阿拉伯糖;经取代的阿拉伯糖;六糖及具有α-端基异构体的糖修饰的核苷。这些核苷可以为碱基位点修饰的修饰碱基。这种修饰碱基可例举例如5-羟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫脲嘧啶等嘧啶;6-甲基腺嘌呤、6-硫鸟苷等嘌呤;以及其他杂环碱基等。
作为构成修饰的核酸的“修饰的核苷间键”,可例举例如烷基连接子、甘油基连接子、氨基连接子、聚(乙二醇)键、甲基膦酸酯核苷间键;硫代磷酸甲酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前药、砜类、磺酰胺、氨基磺酸盐、甲缩醛、N-甲基羟胺、碳酸盐、氨基甲酸酯、吗啉代、硼酸膦酸酯、磷酸氨基甲酸酯等非天然核苷间键。
作为本发明的双链siRNA中包含的核酸序列,可例举针对mTOR或其他mTOR的信号传导成员的siRNA等。
另外,还可将本发明的核酸或药剂引入脂质体等的磷脂囊泡中,并给与其囊泡。可通过脂质转染方法将保持siRNA或shRNA的囊泡引入规定的细胞中。并且,将获得的细胞全身给与至例如静脉内、动脉内等。还可局部给与眼部的必要位点等。siRNA在体外(invitro)表现出非常优秀的特异性转录后抑制效果,但在体内(in vivo)因血清中的核酸酶活性而迅速分解,因此持续时间受限,需要开发出最佳且有效的递送系统。作为一例,据“Ochiya,T et al.,Nature Med.,5:707-710,1999、Curr.Gene Ther.,1:31-52,2001”报道,作为生物相容性材料的去端肽胶原与核酸混合形成复合物时,具有保护核酸免受活体内的分解酶影响的作用,并且非常适合作为siRNA的运载体,本发明的引入核酸、治疗剂或预防剂的方法可利用这种形式,但不限定于此。以此方式,在活体内,通过血清中的核酸分解酶的作用来迅速分解,因此可实现长时间的持续效果。例如,据“Takeshita F.PNAS.(2003)102(34)12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004)32(13)e109”报道,可利用如下的技术,即,来自牛皮肤的去端肽胶原与核酸形成复合物,具有保护核酸免受活体内的分解酶影响的作用,并且非常适合作为siRNA的运载体。
在本说明书中,“iFECD”(immortalized Fuchs’endothelial cornealdystrophy)为Fuchs角膜内皮营养不良的永生化细胞的简称。iFECD的制备方法记载于例如WO2015/015655中。
在本说明书中,“HCEC”(human corneal endothelial cells)是指人角膜内皮细胞的简称。“iHCEC”为永生化(immortalized)人角膜内皮细胞的简称。
在本说明书中,“程序性细胞死亡”是指细胞在确定的时间或环境下自发死亡的现象,如预先编程一样。程序性细胞死亡以包含例如“细胞凋亡”的含义来使用。
在本说明书中,所谓“转化生长因子-β(转化生长因子-β;又以简称TGF-β表示)”,以与该领域中使用的含义相同的含义进行使用,是表示多种生物活性的分子量25kD的同二聚体多功能性细胞因子,转化生长因子-β担当各种硬化症或类风湿关节炎、增生性玻璃体视网膜病变的发病机理,深入参与脱发,抑制免疫感受态细胞的功能,另一方面,通过抑制蛋白酶的过度生成来分解肺组织以防止陷入肺气肿,抑制癌细胞的增殖等。“TGF-β信号”是指由TGF-β介导的信号,由TGF-β引起。TGF-β信号包括例如由TGF-β2介导的信号,此外还例示由TGF-β1、TGF-β3等介导的信号。对于TGF-β,在人类中存在3种异构体,即,TGF-β1~β3,它们同源性约70%且作用相似。TGF-β以无法与受体结合的分子量约300kD的非活性潜伏型形式产生,靶细胞表面或其周围被激活,成为可与受体结合的活性形式,并发挥其作用。
虽然不希望受到理论束缚,但靶细胞中的TGF-β的作用是通过担当所谓Smad的信息传递的一系列蛋白质的磷酸化途径而传递的。首先,活性形式TGF-β与存在于靶细胞表面的II型TGF-β受体相结合时,形成由II型受体2分子和I型TGF-β受体2分子组成的受体复合物,II型受体使I型受体磷酸化。接着,当磷酸化I型受体使Smad2或Smad3磷酸化时,磷酸化的Smad2及Smad3与Smad4形成复合物并易位至核,并与存在于靶基因启动子区域的被称为CAGAbox的靶序列相结合,与共同激活剂一同诱导靶基因的转录表达。
转化生长因子-β(TGF-β)信号传导途径可通过其靶基因的调节来对多个细胞活性进行调节,如细胞增殖及分化、增殖停止、程序性细胞死亡以及上皮细胞-间充质转化(EMT;又称上皮-间充质转化)。包含TGF-β自体(例如,TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3)、激活素及骨形态发生蛋白(BMP)的TGF-β家族的成员是细胞增殖、分化、迁移及程序性细胞死亡等的有效调节剂。
TGF-β包含B淋巴细胞、T淋巴细胞及激活巨噬细胞,为由多个细胞以及由多个其他细胞类型产生的约24Kd的蛋白质。TGF-β对免疫系统的效果中包括IL-2受体诱导、IL-1诱导的胸腺细胞增殖的抑制以及IFN-γ诱导的巨噬细胞激活的阻断。TGF-β被认为与多种病理状态相关(Border et al.(1992)J.Clin.Invest.90:1),并且充分证明其可作为肿瘤抑制物质或肿瘤启动子发挥功能。
TGF-β通过两个丝氨酸/苏氨酸激酶细胞表面受体TGF-βRII及ALK5来介导其信号传导。TGF-β信号传导由可使TGF-βRII磷酸化ALK5受体的配体诱导性受体二聚化引发。其磷酸化激活ALK5激酶活性,继而激活ALK5使下游效应子Smad蛋白质(MAD的脊椎动物同系物或“Mothers against DPP(Decapentapresic)”蛋白质)、Smad2或3磷酸化。与Smad4的p-Smad2/3复合物进入核中并激活靶基因的转录。
Smad3是Smad的R-Smad(受体-激活Smad)亚组的成员,并且是由TGF-β受体转录激活的直接介体。TGF-β刺激引起Smad2及Smad3的磷酸化及激活,这与Smad4(脊椎动物中的“共通(common)Smad”或“co-Smad”)形成复合物,其与核一同积累来调节靶基因的转录。R-Smad位于细胞质中,在由TGF-β受体引起的配体诱导性磷酸化中与co-Smad形成复合物,并向核迁移,其中,它们调节与染色质及协同转录因子相关的基因表达。Smad6及Smad7为抑制性Smad(“I-Smad”),即,由TGF-β转录触发并用作TGF-β信号传导的抑制剂(Feng et al.(2005)Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.21:659)。Smad6/7通过阻止R-Smad的受体介导的激活来发挥其抑制效果;它们与用于竞争性地阻止R-Smad募集及磷酸化的I型受体相关。已知Smad6及Smad7用于补充导致Smad6/7相互作用蛋白质的泛素化及分解的E3泛素连接酶。
TGF-β信号传导途径还存在通过BMP-7等传递的途径,这经由ALK-1/2/3/6,并通过Smad1/5/8表达功能。关于TGF-β信号传导途径,请参考“J.Massagu’e,Annu.Rev.Biochem.1998.67:753-91;Vilar JMG,Jansen R,Sander C(2006)PLoS ComputBiol 2(1):e3;Leask,A.,Abraham,D.J.FASEB J.18,816-827(2004);Coert Margadant&Arnoud Sonnenberg EMBO reports(2010)11,97-105;Joel Rosenbloom et al.,AnnIntern Med.2010;152:159-166”等。
在本说明书中,“眼部症状、障碍或疾病”是指眼部中的任意症状、障碍或疾病。眼部症状、障碍或疾病为例如视网膜、玻璃体液、晶状体、角膜、巩膜或眼部的其他部分的症状、障碍或疾病。本发明中的mTOR抑制剂可特别对角膜内皮的症状、障碍或疾病有效。
在本说明书中,“由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病”是指角膜内皮细胞中的由TGF-β诱导的任意的角膜内皮的症状、障碍或疾病。在本发明中,使角膜内皮细胞、例如Fuchs角膜内皮营养不良的模型细胞(例如,iFECD)暴露在TGF-β2时,令人惊讶地产生了各种障碍(例如,程序性细胞死亡)。这种现象为以往未弄清的现象。并且,本发明人在进一步分析了由该TGF-β信号引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病时,意外地发现可通过mTOR抑制剂来抑制该障碍。由TGF-β信号引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病与mTOR的信号传导途径不同,作为由TGF-β信号引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病,例如可举出在Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术后的障碍、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD:posterior polymorphousdystrophy)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED:congenital hereditaryendothelial dystrophy)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎等中,能够看出TGF-β的表达的示例,但不限定于此。尤其,在TGF-β2的表达高于通常水平的角膜内皮细胞或角膜内皮组织中,认为本发明中发现的障碍或与其相关的障碍被表达或增强,因此发现这种角膜内皮细胞或角膜内皮组织的任意的角膜内皮的症状、障碍或疾病被特别地作为本发明的对象。
在本说明书中,“角膜内皮细胞中的细胞外基质(ECM)的过度表达”是指与正常的角膜内皮细胞中的细胞外基质的表达水平相比以异常水平表达细胞外基质的情况。“以异常的水平表达细胞外基质”是指:纤连蛋白等的细胞外基质蛋白质的产生量大于正常形态中的细胞外基质中产生的量。对于产生状态,除了无刺激之外,根据需要,还包括通过对转化生长因子(TGF)β的响应来增加表达量。例如,就人角膜内皮细胞而言,可以为正常的细胞外基质的量的约1.1倍以上、约1.2倍以上、约1.3倍以上、约1.4倍以上、约1.5倍以上、约1.6倍以上、约1.7倍以上、约1.8倍以上、约1.9倍以上、约2.0倍以上。相对于正常的差异优选在统计学上具有显著性,但并非一定是显著性,只要是医学上显著性的差异即可。
在本说明书中,“由细胞外基质(ECM)的过度表达引起的角膜内皮障碍”或其“症状”是指与主要由细胞外基质引起的混浊或沉积、增厚等相关的障碍或其症状,并产生角膜内皮面的滴状物(guttae)、后弹力膜的混浊角膜滴状物等的后弹力膜的增厚等,并且与成为视力下降的原因的症状相关。在Fuchs角膜营养不良等的角膜内皮障碍中,不同于角膜内皮细胞的细胞死亡(尤其为细胞凋亡)引起的症状恶化,该细胞外基质的过度生成即使未引起细胞数量的减少,也使视力、视觉感觉恶化,即使可以抑制细胞死亡,也必须配合。“由细胞外基质(ECM)的过度生成引起的角膜内皮障碍”或其“症状”中可例举混浊、疤痕、角膜薄翳、角膜斑、角膜白斑等,但不限定于此。
在优选实施方式中,作为本发明对象的症状、障碍或疾病为与Fuchs角膜内皮营养不良相关的障碍。关于Fuchs角膜内皮营养不良,表明与角膜内皮细胞中的TGF-β诱导有关,还表明可与FECD中的细胞丢失有关。因此,理所当然地预期TGF-β信号传导途径的抑制可成为FECD的有效治疗。但是,本发明人出乎意料地发现mTOR抑制剂可抑制由TGF-β信号引起的障碍。
可以理解的是,本发明的药物可以治疗由TGF-β2(在Fuchs角膜内皮营养不良中为一个重要的异常或障碍的原因)所诱导的细胞障碍等,因此对于治疗或预防Fuchs角膜内皮营养不良是有用的。尤其,在本发明的实施例中,可抑制Fuchs角膜内皮营养不良模型中由TGF-β2诱导的细胞障碍或者程序性细胞死亡,因此认为本发明可用于与Fuchs角膜内皮营养不良模型中的TGF-β2相关的重症患者的治疗。并且,本发明的药物可出乎意料地抑制细胞外基质(ECM)的过度表达,并且可治疗或预防角膜内皮中的障碍等,例如向ECM的后弹力层的沉积等。因此,本发明可治疗或预防Fuchs角膜内皮营养不良中的角膜内皮细胞的障碍或角膜内皮密度下降、角膜滴状物(guttae)的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、角膜上皮障碍、混浊、疤痕、角膜基质混浊、畏光、视力模糊、视力障碍、眼痛、流泪、充血、疼痛、大疱性角化病、眼部不适、对比度降低、晕圈、眩光及角膜基质的浮肿等。
一般技术
在本说明书中所利用的分子生物学技术、生化学技术、微生物学技术为在本领域中众所周知且常规使用的技术,例如记载于:Sambrook J.et al.(1989).MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor及其3rd Ed.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications,Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates;Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,AcademicPress;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press、Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,IRL Press;Adams,R.L.etal.(1992).The Biochemistry of theNucleic Acids,Chapman&Hall;Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids,Weinheim;Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acidsin Chemistry and Biology,Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Press、增刊实验医学“基因转移&表达分析实验法”羊土社、1997等。关于角膜内皮细胞,Nancy Joyce等报告{Joyce,2004#161}{Joyce,2003#7}是众所周知的,但如上所述,通过长期培养、继代培养来产生类成纤维细胞的转化的有效的培养方法的研究至今仍在进行中。这些在本说明书中相关部分(也可以为全部)作为参考引入本文。
优选实施方式的说明
以下,描述优选实施方式的说明,但应理解,该实施方式为本发明的示例,并且本发明的范围并不限定于这些优选实施方式。应当理解,本领域技术人员可通过参考以下的优选实施例来在本发明的范围内容易地进行修改、变更等。对于这些实施方式,本领域技术人员可适当地组合任意实施方式。
药物
一方面,本发明提供用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的包含mTOR抑制剂的组合物。尤其,mTOR抑制剂对角膜内皮中的症状、障碍或疾病有效。
mTOR参与细胞内的信号传导,并被认为负责调解细胞分裂、细胞的存活等,但其在角膜内皮中的机制尚未被阐明。因此,令人惊讶的是,mTOR抑制剂出乎意料地在眼科、尤其在治愈或预防角膜内皮、疾病、障碍或症状方面有效。
在一实施方式中,角膜内皮细胞中的转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术后的障碍、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD:posteriorpolymorphous dystrophy)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED:congenitalhereditary endothelial dystrophy)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的组。
在另一个优选的实施方式中,本发明提供具有治疗或预防由Fuchs角膜内皮营养不良中的细胞外基质的过度表达引起的症状的作用效果的、用于治疗或预防这种症状的药物或治疗方法或预防方法。作为这种症状,可例举角膜内皮表面的滴状物(guttata)、后弹力膜的混浊角膜滴状物、后弹力膜的增厚、视力模糊、晕圈、眩光、视力下降、角膜混浊、白斑及视觉感觉的异常等。以下进一步描述由细胞外基质的过度生成引起的症状。
在另一方面,本发明提供一种包含mTOR抑制剂的药物,用于治疗或预防由角膜内皮细胞中的细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。如上所述,mTOR抑制剂可治疗或预防由TGF-β信号引起的角膜内皮障碍等,但令人惊讶的是,mTOR抑制剂还可抑制角膜内皮细胞中的细胞外基质的过度表达。这表明,mTOR抑制剂可同时治疗角膜内皮细胞中的由TGF-β信号及细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮障碍。尤其,Fuchs角膜内皮营养不良是一种由TGF-β信号引起而使角膜内皮细胞的密度明显降低且细胞外基质沉积在后弹力膜上、产生角膜滴状物(Corneal guttae)及后弹力膜增厚的疾病,因此,抑制细胞外基质的过度表达意味着Fuchs角膜内皮营养不良的治疗及预防中的显著改善,并且根据情况,可完全治愈。并且,可改善、治疗或预防因Fuchs角膜内皮营养不良等的角膜内皮障碍中的细胞外基质过度生成而导致的角膜滴状物(Corneal guttae)以及后弹力膜的增厚或其他混浊或沉积相关症状(因拖延的角膜浮肿而导致的不可逆的角膜基质混浊等)。
在一实施方式中,由角膜内皮细胞中的细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病可以为由角膜内皮细胞中的纤连蛋白的过度表达引起的。
在一实施方式中,由角膜内皮细胞中的细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、混浊、疤痕、角膜基质混浊、角膜上皮浮肿、角膜上皮障碍、畏光及视力模糊组成的组。
在另一方面,本发明提供一种包含mTOR抑制剂的药物,用于治疗或预防由角膜内皮细胞中的TGF-β信号及细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。mTOR抑制剂可同时治疗或预防由角膜内皮细胞中的TGF-β信号及细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮障碍。
在一实施方式中,由角膜内皮细胞中的TGF-β信号及细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、其他角膜内皮营养不良,以及因药物、手术、创伤、感染症、葡萄膜炎等引起的角膜内皮障碍组成的组。
在一实施方式中,由角膜内皮细胞中的TGF-β信号及细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病包括Fuchs角膜内皮营养不良。Fuchs角膜内皮营养不良是一种由TGF-β信号引起而使角膜内皮细胞的密度明显降低且细胞外基质沉积在后弹力膜上产生角膜滴状物(Corneal guttae)及后弹力膜的增厚等的障碍等的疾病,因此抑制细胞外基质的过度表达意味着可显著改善Fuchs角膜内皮营养不良,并且根据情况,可完全治愈。因mTOR抑制剂带来的、Fuchs角膜内皮营养不良等的疾病中的角膜滴状物(Cornealguttae)及后弹力膜的增厚等的障碍等的改善带来眼科疾病中的质的改善,并且对无法治愈的Fuchs角膜内皮营养不良等的疾病赋予前所未有的治疗效果。
在一实施方式中,作为本发明的利用方法,例如可例举滴眼剂,但不限定于此,还可例举向前房内注射、浸入缓释剂、结膜下注射、全身给药(口服、静脉注射)等的给药方法。
在一实施方式中,本发明中使用的mTOR抑制剂可以为任何类型,只要对治疗或预防眼部(例如,角膜内皮)的症状、障碍或疾病有效即可。作为具体的mTOR抑制剂,包含选自由雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、PI-103、CC-223、INK128、AZD8055、KU0063794、Voxtalisib(Voxtalisib(XL765、SAR245409))、Ridaforolimus(Ridaforolimus(Deforolimus、MK-8669))、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib(PP242)、Torin 1、Omipalisib(Omipalisib(GSK2126458、GSK458))、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib(Apitolisib(GDC-0980、RG7422))、WYE-354、Vistusertib(Vistusertib(AZD2014))、Torin2、他克莫司(FK506)、GSK1059615、Gedatolisib(PF-05212384、PKI-587)、WYE-125132(WYE-132)、BGT226(NVP-BGT226)、Palomid 529(P529)、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、咗他莫司(ABT-578)、大黄根酸(Chrysophanic Acid)组成的组的至少一种。
在本发明的药物中,上述mTOR抑制剂可单独使用,也可组合使用。本发明中使用的mTOR抑制剂的浓度可根据mTOR抑制剂的种类适当变更,但例如,可以至少约0.0001nM(nmol/L)、至少约0.001nM、至少约0.01nM、至少约0.1nM、至少约1nM、至少约10nM、至少约100nM、或至少约1000nM,但不限定于此。作为本发明中使用的mTOR抑制剂的浓度的上限,可例举约100μM(μmol/L)、约10μM、约1μM、或约0.5μM,但不限定于此。作为本发明中使用的mTOR抑制剂的浓度范围,可例举例如约0.01nM~约100μM、约0.1nM~约100μM、约1nM~约100μM、约10nM~约100μM、约100nM~约100μM、约1μM~约100μM、约0.01nM~约10μM、约0.1nM~约10μM、约1nM~约10μM、约10nM~约10μM、约100nM~约10μM、约1μM~约10μM、约0.01nM~约1μM、约0.1nM~约1μM、约1nM~约1μM、约10nM~约1μM、约100nM~约1μM、约0.01nM~约100nM、约0.1nM~约100nM、约1nM~约100nM、约10nM~约100nM,但不限定于此。在组合两种以上的mTOR抑制剂时,可适当变更各个mTOR抑制剂的浓度。
在优选实施方式中,mTOR抑制剂选自例如雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司以及它们的盐。虽然不希望受到理论束缚,但通过雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司等mTOR抑制剂的治疗,与其他mTOR抑制剂相比,表现出显著的治疗效果,尤其,与Fuchs内皮营养不良等的转化生长因子-β2(TGF-β2)相关的角膜内皮的疾病或障碍、或者与细胞外基质(ECM)的过度表达相关的角膜内皮的疾病或障碍的治愈效果得以显著改善。并且,这些mTOR抑制剂已经被FDA、PMDA等批准,因为即使考虑到安全性等方面作为药物也能够预期作为眼科用药物来进行给药。
在本发明的药物中,上述化合物可单独使用,也可组合使用。本发明中使用的化合物的浓度为约0.01nM~100μM(μmol/l),或为约0.1nM~100μM,通常为约1nM~100μM、约10nM~100μM,优选为约0.1~30μM,更优选为约1~10μM,这些上限下限可适当组合设定,组合两种以上的化合物使用时可适当变更,作为其他浓度范围,例如,通常可例举约0.01nM~100μM、约0.1nM~100μM,或者约0.001~100μM,优选为约0.01~75μM、约0.05~50μM、约1~10μM、约0.01~10μM、约0.05~10μM、约0.075~10μM、约0.1~10μM、约0.5~10μM、约0.75~10μM、约1.0~10μM、约1.25~10μM、约1.5~10μM、约1.75~10μM、约2.0~10μM、约2.5~10μM、约3.0~10μM、约4.0~10μM、约5.0~10μM、约6.0~10μM、约7.0~10μM、约8.0~10μM、约9.0~10μM、约0.01~50μM、约0.05~5.0μM、约0.075~5.0μM、约0.1~5.0μM、约0.5~5.0μM、约0.75~5.0μM、约1.0~5.0μM、约1.25~5.0μM、约1.5~5.0μM、约1.75~5.0μM、约2.0~5.0μM、约2.5~5.0μM、约3.0~5.0μM、约4.0~5.0μM、约0.01~3.0μM、约0.05~3.0μM、约0.075~3.0μM、约0.1~3.0μM、约0.5~3.0μM、约0.75~3.0μM、约1.0~3.0μM、约1.25~3.0μM、约1.5~3.0μM、约1.75~3.0μM、约2.0~3.0μM、约0.01~1.0μM、约0.05~1.0μM、约0.075~1.0μM、约0.1~1.0μM、约0.5~1.0μM、约0.75~1.0μM、约0.09~35μM、约0.09~3.2μM,更优选为约0.05~1.0μM、约0.075~1.0μM、约0.1~1.0μM、约0.5~1.0μM、约0.75~1.0μM,但不限定于此。
用作滴眼剂时,同时还考虑到眼泪等稀释并注意毒性,以上述有效浓度的约1~10000倍、优选为约100~10000倍、例如以约1000倍为标准来确定制剂浓度。还可设定比其高的浓度。例如,可以为约0.01μM(μmol/l)~1000mM(mmol/l)、约0.1μM~100mM、约1μM~100mM、约10μM~100mM、或者约0.1μM~30mM、约1μM~30mM,更优选可以为约1μM~10mM、约10μM~10mM、约100μM~10mM、约10μM~100mM、约100μM~100mM,约¥mM~10mM、约1mM~100mM,这些上限下限可适当组合设定,组合两种以上的化合物来使用时可适当变更。
在另一实施方式中,mTOR抑制剂为雷帕霉素。使用的雷帕霉素的浓度为至少约0.1nM,为至少约1nM,为至少约10nM,优选为约100nM。在优选实施方式中,雷帕霉素用作滴眼剂时,其中使用的雷帕霉素的浓度为至少约0.1mM,为至少约1mM,为至少约10mM,优选为至少约100mM。作为浓度的上限,可以举出饱和量或1000mM。
在另一实施方式中,mTOR抑制剂为替西罗莫司。使用的替西罗莫司的浓度为至少约0.01nM,为至少约0.1nM,优选为约1nM,优选为约10nM,更优选为约100nM,更优选为约1μM,更优选为约10μM。替西罗莫司用作滴眼剂的情况下,所使用的替西罗莫司的浓度为为至少约0.01mM、为至少约0.1mM,为至少约1mM,优选为至少约10mM。作为浓度的上限,可例举饱和量或1000mM。在另一实施方式中,mTOR抑制剂为依维莫司。作为使用的依维莫司的浓度,为至少约0.1nM,为至少约1nM,为至少约10nM,优选为约100nM。依维莫司用作滴眼剂的情况下使用的依维莫司的浓度为至少约0.1mM,为至少约1mM,为至少约10mM,优选为至少约100mM。作为浓度的上限,可例举饱和量或1000mM。
在一实施方式中,本发明的用于治疗或预防的药物能够以具有角膜内皮的任意动物、例如哺乳动物为对象,优选以治疗或预防灵长类的角膜内皮作为目的。优选该治疗或预防的对象为人的角膜内皮。
在另一个实施方案中,mTOR抑制剂可以为抑制mTOR基因表达的物质。作为抑制mTOR基因表达的物质,可例举例如siRNA、反义核酸或核酶,但不限定于此。
在特定的实施方式中,mTOR抑制剂为针对mTOR基因的siRNA。本发明中使用的siRNA的代表例包括下述有义链和反义链:
CAUUCGCAUUCAGUCCAUAtt(序列号1)所示的有义链;
UAUGGACUGAAUGCGAAUGat(序列号2)所示的反义链;
但不限定于此,可以为对mTOR基因存在反义效果或者RNAi效果的任意序列。这些有义链及反义链可缺失、取代、插入和/或添加1~3碱基的核苷酸。
在另一方面,本发明提供一种包括向所需的受试者给与有效量的mTOR抑制剂的工序的方法,用于治疗或预防由眼部(例如,角膜内皮)症状、障碍或疾病(角膜内皮细胞中的TGF-β信号和/或细胞外基质的过度表达引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病)。
在本说明书中,“受试者”是指本发明的用于治疗及预防的药物或方法的给药(移植)对象,作为受试者,可例举哺乳动物(例如,人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、马、羊、猴子等),优选为灵长类,尤其优选为人。
对特定的疾病、障碍或状态的治疗有效的本发明的药物的有效量可根据障碍或状态的性质变动,但本领域技术人员基于本说明书的记载可根据标准的临床技术来确定。进而,根据需要,可利用体外测试来辅助确定最佳剂量范围。另外,复合物中需要使用的准确用量也可根据给药途径及疾病或障碍的严重性而变动,因此应根据责任医师的判断及各患者的情况来确定。但是,给药量不做特别限定,例如,每次0.001、1、5、10、15、100、或1000mg/kg体重,并且可在任意两个值的范围内。给药间隔无特别限定,例如,可每1天、每7天、每14天、每21天或每28天给药1次或2次,每任意两个值的范围给药1次或2次。给药量、给药次数、给药间隔、给药方法可根据患者的年龄或体重、症状、给药形式、对象器官等适当选择。例如,本发明可用作滴眼剂。并且,本发明的药物可注入前房中。另外,对于治疗药,优选包含治疗有效量、或发挥所需作用的有效量的有效成分。当给药后治疗标记显著性减少时,可判断为具有治疗效果。有效剂量可从由体外或动物模型试验系统获得的剂量-反应曲线推断。
角膜内皮细胞的保存及增殖
在另一方面,本发明提供用于保存角膜内皮细胞的包含mTOR抑制剂的组合物。本发明还提供包括使有效量的mTOR抑制剂与角膜内皮细胞相接触的工序的、用于保存角膜内皮细胞的方法。应理解的是,用于保存角膜内皮细胞的mTOR抑制剂等的实施方式可利用本说明书中“药物”中所记载的任意实施方式。向角膜内皮细胞的接触可以为体内的或离体的或体外的,并可用于细胞制剂的制备。
在另一方面,本发明提供用于使角膜内皮细胞增殖或促进增殖的、包含mTOR抑制剂的组合物。本发明还提供包括使有效量的mTOR抑制剂与角膜内皮细胞相接触的工序的、用于使角膜内皮细胞增殖或促进增殖的方法。应理解的是,用于使角膜内皮细胞增殖或促进增殖的mTOR抑制剂等的实施方式可利用本说明书中“药物”中所记载的任意实施方式。向角膜内皮细胞的接触可以为体内的或离体的或体外的,并可用于细胞制剂的制备。
对于本说明书中所引用的科学文献、专利、专利申请等的参考文献,它们以与分别具体地记载时相同程度作为参考引入本说明书。
以上,为了便于理解本发明,示出优选实施方式来进行了说明。在下文中,基于实施例来说明本发明,但上述的说明及下文的实施例仅以示例为目的而提供,并不以限定本发明为目的而提供。因此,本发明的范围仅限定于发明要求保护范围,而不限定于本说明书中具体描述的实施方式及实施例。
实施例
以下,将描述本发明的示例。在适用的情况下,生物样品等的处理符合厚生劳动省、文部科学省等规定的标准,在适用的情况下,基于赫尔辛基宣言或基于该宣言制定的道德规范进行。用于研究的眼部的捐赠均从已故捐赠人的家属获得同意。本研究获得了埃尔兰根大学大学(德国)、SightLifeTM(Seattle,WA)Eye Bank的伦理委员会或等效的批准。
制备例:来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞系(iFECD)模型的制备
在本实施例中,由来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞制备了永生化角膜内皮细胞系(iFECD)。
培养方法
从研究用角膜(购自西雅图Eye Bank)将角膜内皮细胞与基底膜一同机械剥离,利用胶原酶从基底膜剥离收集之后,进行了原代培养。对于培养基,使用向Opti-MEM IReduced-Serum Medium,Liquid(INVITROGEN目录号:31985-070)中添加了8%FBS(BIOWEST、目录号:S1820-500)、200mg/ml CaCl2·2H2O(SIGMA目录号:C7902-500G)、0.08%硫酸软骨素(SIGMA目录号:C9819-5G)、20μg/ml抗坏血酸(SIGMA目录号:A4544-25G)、50μg/ml庆大霉素(INVITROGEN目录号:15710-064)及5ng/ml的EGF(INVITROGEN目录号:PHG0311)的3T3饲养细胞用的改良的培养基作为基础培养基。并且,在向基础培养基中添加了SB431542(1μmol/l)及SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5(4-吡啶基)咪唑<4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶)(1μmol/l)而成的培养基(在本说明书中称为“SB203580+SB431542+3T3改良培养基”)中进行培养。
获取方法
从Fuchs角膜内皮营养不良的临床诊断直至大疱性角化病并实施了角膜内皮移植(后弹力膜内皮角膜移植=DMEK)的患者3名获得了文件上的同意书及伦理委员会的批准,在此基础上获得了角膜内皮细胞。在DMEK时,将病理性角膜内细胞与作为基底膜的后弹力膜一同进行机械性剥离,并浸渍于作为角膜保存液的Optisol-GS(Bausch&Lomb公司)中。之后,进行胶原酶处理以酶促的方式收集角膜内皮细胞,并在SB203580+SB431542+3T3改良培养基中培养。所培养的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞将SV40大T抗原及hTERT基因通过PCR扩增,导入慢病毒载体(pLenti6.3_V5-TOPO;Life Technologies Inc)中。之后,使慢病毒载体与3种辅助质粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG;Life Technologies Inc.)一同利用转染试剂(Fugene HD;Promega Corp.,Madison,WI)来感染293T细胞(RCB2202;Riken Bioresource Center,Ibaraki,Japan)。感染48小时之后,收集包含病毒的培养上清液,并利用5μg/ml的聚乙烯,添加至所培养的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞的培养液中,并导入了SV40大T抗原及hTERT基因。确认了来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞系(iFECD)的相差显微镜图像。作为对照,以相同的方法使由从西雅图Eye Bank进口的研究用角膜培养的角膜内皮细胞永生化,制备正常角膜内皮细胞的永生化细胞系(iHCEC)。当观察来自健康捐赠人的永生化角膜内皮细胞系(iHCEC)及永生化角膜内皮细胞系(iFECD)的相差显微镜图像时,iHCEC及iFECD均具有与正常的角膜内皮细胞相同的一层多边形形状。iHCEC及iFECD利用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)+10%胎牛血清(FBS)进行了维持培养。
实施例1:雷帕霉素对TGF-β2诱导的细胞障碍的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的代表性示例的雷帕霉素对眼细胞障碍的效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中并以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔1×105个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基使用了DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入雷帕霉素并培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入包含10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及雷帕霉素的培养基,培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
结果
雷帕霉素抑制由TGF-β2诱导的细胞障碍。
图1中示出结果。在不存在雷帕霉素的情况下,用重组人TGF-β2刺激iFECD时,发现细胞受到了明显破坏。另一方面,当用雷帕霉素预处理时,观察到了角膜内皮细胞的障碍受到抑制。因此,发现雷帕霉素抑制由重组人TGF-β2诱导的细胞障碍。
实施例2:雷帕霉素对TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的代表性示例的雷帕霉素对半胱天冬酶活性的效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔1×105个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基使用DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入雷帕霉素并培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入包含10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及雷帕霉素的培养基,培养了24小时(培养基使用DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,以获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40),提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,回收蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离8μg上述所提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,利用了兔抗Caspase 3抗体(Cell Signaling,9662)、兔抗PARP抗体(Cell Signaling,9542)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。二抗利用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE Healthcare Biosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔抗Caspase 3抗体:稀释1000倍,兔抗PARP抗体:稀释2000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,对于二抗,稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
雷帕霉素抑制由TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性。
图2示出对半胱天冬酶的蛋白质印迹的结果。在不存在雷帕霉素的情况下,用重组人TGF-β2刺激iFECD时,观察到作为活性形式的约17kDa的切割半胱天冬酶3(约17kDa)。另一方面,在雷帕霉素添加组中,几乎未确认到活性形式的切割半胱天冬酶3。因此,通过分析证实,雷帕霉素抑制由重组人TGF-β2诱导的半胱天冬酶的活化。mTOR无关于半胱天冬酶的信号,并且,还未明确mTOR抑制剂抑制半胱天冬酶的活化,因此,雷帕霉素可抑制半胱天冬酶的活化是令人惊讶的。
实施例3:雷帕霉素对重组人TGF-β2诱导的S6K的磷酸化活性的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的代表性示例的雷帕霉素对TGF-β2诱导的S6K的磷酸化活性的效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中并以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔7×104个比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基使用了DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入雷帕霉素并培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入包含10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及雷帕霉素的培养基,培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物一并悬浮提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,回收蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离5μg上述所提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用兔抗Akt1抗体(Cell Signaling,2938)、小鼠抗Phospho-Akt抗体(CellSignaling,4051)、兔抗S6K抗体(Cell Signaling,9202)、兔抗Phospho-S6K抗体(CellSignaling,9204)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。二抗利用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE Healthcare Biosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔抗Akt抗体:稀释1000倍,小鼠抗Phospho-Akt抗体:稀释1000倍,兔抗S6K抗体:稀释1000倍,兔抗Phospho-S6K抗体:稀释1000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,对于二抗,稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
雷帕霉素抑制由TGF-β2诱导的S6K的磷酸化活性。
图3示出结果。在不存在雷帕霉素的情况下,用重组人TGF-β2刺激iFECD时,发现了Akt的磷酸化活性。另一方面,在雷帕霉素添加组中S6K的磷酸化活性受到抑制。通过蛋白质印迹的分析确认了雷帕霉素具有抑制mTOR信号途径的作用。Akt存在于mTOR的上游,S6K存在于mTOR的下游。因此,已确认通过mTOR抑制剂,上游的Akt被磷酸化,在另一侧下游的S6K的磷酸化受到抑制,故而雷帕霉素抑制mTOR途径。
实施例4:雷帕霉素对TGF-β2诱导的Smad2/3的磷酸化活性的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的代表性示例的雷帕霉素对TGF-β2诱导的Smad2/3的磷酸化活性的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔8×104个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基使用了DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入雷帕霉素并培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入包含10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及雷帕霉素的培养基,培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的收集
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,以获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮进行提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,回收蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离8μg上述所提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用兔抗Smad2抗体(Cell Signaling,5339)、小鼠抗Phospho-Smad2抗体(CellSignaling,3108)、兔抗Smad3抗体(Cell Signaling,9523)、兔抗Phospho-Smad3抗体(CellSignaling,9520)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。作为二抗,使用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE Healthcare Biosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔抗Smad2抗体:稀释1000倍,小鼠抗Phospho-Smad2抗体:稀释1000倍,兔抗Smad3抗体:稀释1000倍,兔抗Phospho-Smad3抗体:稀释1000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,二抗稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
雷帕霉素不抑制由TGF-β2诱导的Smad2/3的磷酸化活性。
图4示出结果。在雷帕霉素存在的情况下,用重组人TGF-β2刺激时,发现了Smad2及Smad3的磷酸化活性。因此,通过蛋白质印迹分析表明雷帕霉素不抑制重组人TGF-β2诱导的Smad2/3的磷酸化活性。TGF-β的作用是通过Smad的磷酸化途径传递的,因此明确了雷帕霉素的细胞障碍抑制作用不是由TGF-β信号的抑制所导致的。这表明雷帕霉素不直接抑制TGF-β信号而是抑制由TGF-β信号引起的角膜内皮的障碍等,这是出乎意料的。
实施例5:雷帕霉素对由TGF-β2诱导的纤连蛋白的生成的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的代表性示例的雷帕霉素对TGF-β2诱导的纤连蛋白的生成的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中并以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔2×105个的比例接种于6孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基使用了DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入雷帕霉素并培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入包含10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及雷帕霉素的培养基,培养了24小时(培养基使用了DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,以获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮进行提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,由此回收了蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离5μg上述所提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用了小鼠抗纤连蛋白抗体(BD Bioscience,610077)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。作为二抗,使用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE HealthcareBiosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,小鼠抗纤连蛋白抗体:稀释15000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,二抗稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(NakaraiTesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
雷帕霉素抑制由TGF-β2诱导的纤连蛋白的生成
图5示出结果。在不存在雷帕霉素的情况下,用重组人TGF-β2刺激时,发现了iFECD中生成纤连蛋白。另一方面,在雷帕霉素添加组中几乎未确认到纤连蛋白的生成。因此,通过蛋白质印迹分析,证实了雷帕霉素抑制由重组人TGF-β2诱导的纤连蛋白的表达量。还未明确mTOR参与纤连蛋白等的细胞外基质的生成,因此mTOR抑制剂可抑制细胞外基质生成这一点是出乎意料的。
在Fuchs角膜内皮营养不良中,因纤连蛋白等的细胞外基质的过度生成及后弹力膜上的沉积引起后弹力膜增厚、角膜滴状物(guttae)的形成等的障碍。这些障碍一般在Fuchs角膜内皮营养不良患者中的30多岁至40多岁开始产生,经由一生而进展。因病情进展而导致视力模糊、晕圈、眩光、视力下降等的视力障碍。进而,Fuchs角膜内皮营养不良持续影响角膜内皮细胞,但通过剩下的角膜内皮补偿泵功能直到细胞密度低于约1000个/mm2为止,以保持角膜的透明性。另一方面,当低于约1000个/mm2时,由于角膜中进入前房水,故而导致角膜浮肿,并产生视力障碍(图18)。像这样,Fuchs角膜内皮营养不良患者主要因细胞外基质的过度生成及角膜内皮细胞死亡的两种原因而产生视觉功能障碍。本发明中的半胱天冬酶抑制剂的作用可以说是作用于细胞外基质生成的抑制及角膜内皮细胞死亡抑制两方面,尤其对Fuchs角膜内皮营养不良治疗有用。
实施例6:mTOR siRNA对于mTOR的表达及S6K的磷酸化的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的另一代表性示例的mTOR siRNA的对于mTOR的表达及S6K的磷酸化的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中并以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔3×104个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入Lipofectamine(invitrogen,92008)及3pmol的mTORsiRNA(Ambion,AS026M0L),培养了24小时(培养基:OptiMEM-I(invitrogen,31985-088))。所使用的mTORsiRNA具有序列号1表示的有义链及序列号2表示的反义链。24小时后,除去培养基,在37℃(5%CO2)培养了72小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。72小时后,除去培养基,加入添加有10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)的培养基,培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤通过PCR方法扩增cDNA的碱基序列。
1)总RNA的回收
从培养iFECD的培养皿移除培养基,并添加350μl的RNeasy mini Kit(QIAGEN、M610A)的Buffer RLT裂解缓冲液以洗脱细胞。之后,加入350μl的70%EtOH,并转移至RNeasmini spin column(QIAGEN)之后,以10000rpm离心15秒,并除去Flow-through。此外,向RNeasy mini spin column中添加了30μl的RNeasy free water(QIAGEN)之后,以10000rpm离心1分钟并提取了总RNA。
2)cDNA合成
分别添加450ng的提取的total RNA、Rever Tra Ace(TOYOBO)、10mM的dNTP混合物(TOYOBO)、5×RT Buffer(TOYOBO)、随机引物(invitrogen),并利用T3000热循环仪(Thermocycler,biometra)合成了辅助DNA。反应条件为在30℃下退火反应10分钟,在42℃下逆转录反应60分钟,在99℃下热变性反应5分钟。
3)PCR法
将1μl的合成的辅助DNA、5μl的2×GO Taq GreenMaster Mix(Promega)、1μl的mTOR的正向(Forward)定制引物(invitrogen)、1μl的反向(Reverse)定制引物(invitrogen)、2μl的H2O混合,并利用T3000热循环仪(Thermocycler,biometra)来扩增了辅助DNA的碱基序列。反应条件为在94℃下初期热变性反应2分钟之后,在95℃下热变性反应30秒,在53℃下退火反应20秒,在72℃下延伸反应25秒,进行26个循环,并且在72℃下进行了延伸反应5分钟。扩增后,利用琼脂糖凝胶的电泳及AmershamTM Imager 600(GEHealthcare Japan)通过UV照射进行了检测。
并且,观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上将培养基回收,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟,并弃去上清液以获得沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮进行提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,并回收了蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离5μg上述所提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用兔抗mTOR抗体(Cell Signaling,2972)、兔抗S6K抗体(Cell Signaling,9202)、兔抗Phospho-S6K抗体(Cell Signaling,9204)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。作为二抗,使用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE Healthcare Biosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔抗mTOR抗体:稀释1000倍,兔抗S6K抗体:稀释1000倍,兔抗Phospho-S6K抗体:稀释1000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,二抗稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
mTOR siRNA抑制mTOR的表达及S6K的磷酸化
图6示出结果。当在iFECD中对mTOR进行RNAi时,RNA水平及蛋白质水平均发现mTOR的表达抑制。另外,还发现通过mTOR siRNA在蛋白质水平中S6K的磷酸化受到抑制。因此,通过PCR及基于蛋白质印迹的分析,确认了mTOR siRNA抑制mTOR的表达及S6K的磷酸化。
实施例7:mTOR siRNA对由TGF-β2诱导的细胞障碍的抑制效果
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)中并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,以1500rpm离心3分钟,由此回收了细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔3×104个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入Lipofectamine(invitrogen,92008)及3pmol的mTOR siRNA(Ambion,AS026M0L),进行培养24小时(培养基:OptiMEM-I(invitrogen,31985-088))。所使用的mTOR siRNA具有序列号1表示的有义链及序列号2表示的反义链。24小时后,除去培养基,在37℃(5%CO2)培养了72小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。72小时后,除去培养基,加入添加有10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)的培养基,培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察到了细胞形态及细胞凋亡。
结果
mTOR siRNA抑制由TGF-β2诱导的细胞障碍。
图7示出结果。当不使用mTOR siRNA、而是用重组人TGF-β2刺激iFECD时,发现细胞受到了明显破坏。另一方面,当使用了mTOR siRNA时,观察到了角膜内皮细胞的障碍受到抑制。因此,发现mTOR的表达抑制能够抑制由TGF-β2诱导的细胞障碍。
实施例8:mTOR siRNA对由TGF-β2诱导的半胱天冬酶的活化的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的另一代表性示例的mTOR siRNA的对由TGF-β2诱导的半胱天冬酶的活化的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,以1500rpm离心3分钟以回收了细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔3×104个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入Lipofectamine(invitrogen,92008)及3pmol的mTOR siRNA(Ambion,AS026M0L),培养了24小时(培养基:OptiMEM-I(invitrogen,31985-088))。所使用的mTOR siRNA具有序列号1表示的有义链及序列号2表示的反义链。24小时后,除去培养基,在37℃(5%CO2)培养了72小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。72小时后,除去培养基,加入添加有10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)的培养基,培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察到了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收用1×PBS(-)将细胞洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,以获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮进行提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,并回收了蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离6μg的上述提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用兔抗半胱天冬酶3抗体(Cell Signaling,9662)、兔抗PARP抗体(Cell Signaling,9542)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。作为二抗,使用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE Healthcare Biosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔抗半胱天冬酶3抗体:稀释1000倍,兔抗PARP抗体:稀释2000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,二抗稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONE Ultra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(Fuji Film公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
mTOR siRNA抑制由TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性。
图8示出结果。当不使用mTOR siRNA、而是用重组人TGF-β2刺激时,在iFECD中发现了作为活性形式的约17kDa的切割半胱天冬酶3。另一方面,在mTOR siRNA添加组中几乎未确认到活性形式的切割半胱天冬酶3。因此,通过蛋白质印迹分析表明mTOR的信号抑制能够抑制TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性。
实施例9:mTOR siRNA对由重组人TGF-β2诱导的纤连蛋白的生成的抑制效果
在本实施例中,证实了作为mTOR抑制剂的另一代表性示例的mTOR siRNA对由TGF-β2诱导的纤连蛋白生成的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,以1500rpm离心3分钟,由此回收细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将iFECD以每孔3×104个的比例接种于12孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入Lipofectamine(invitrogen,92008)及3pmol的mTOR siRNA(Ambion,AS026M0L)并培养了24小时(培养基:OptiMEM-I(invitrogen,31985-088))。所使用的mTORsiRNA具有序列号1表示的有义链及序列号2表示的反义链。24小时后,除去培养基,在37℃(5%CO2)下培养细胞48小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。48小时后,除去培养基,添加加入有10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)的培养基,培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察到了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤对蛋白质进行蛋白质印迹。
1)蛋白质的回收
为了回收漂浮细胞及死细胞,在冰上回收培养基,还回收将细胞用1×PBS(-)洗涤两次所得的溶液,在4℃、800g下离心12分钟并弃去上清液,获得了沉淀物。经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取缓冲液(RIPA;50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、1mM的EDTA、0.1%SDS、0.5%DOC、1%NP-40)并提取了蛋白质。之后,上述漂浮细胞及死细胞离心后的沉淀物也一并悬浮进行提取。使用超声波装置(BIORUPTOR,TOSHO DENKI制造)在冷水中将所回收的溶液粉碎30秒、3次之后,在4℃、15000rpm条件下离心10分钟,并回收了蛋白质的上清液。
2)蛋白质印迹法
通过SDS-PAGE分离7μg的上述提取的蛋白质,并转录至硝酸纤维素膜上。作为一抗,使用了小鼠抗纤连蛋白抗体(BDBioscience、610077)、小鼠抗GAPDH抗体(MBL公司,M171-3)。作为二抗,使用了用过氧化物酶标记的抗兔抗体、抗小鼠抗体(GE HealthcareBiosciences,NA931V,NA934V)。对于一抗,兔半胱天冬酶3抗体:稀释1000倍,兔抗PARP抗体:稀释2000倍,小鼠抗GAPDH抗体:稀释5000倍,二抗稀释了5000倍。利用Chemi Lumi ONEUltra(Nakarai Tesque,11644-40)进行了检测。通过发光图像分析仪LAS-4000mini(FujiFilm公司)及ImageQuantTM software(GE Healthcare公司)分析了所检测的带强度。
结果
mTOR siRNA抑制由重组人TGF-β2诱导的纤连蛋白的生成。
图9示出结果。当不使用mTOR siRNA、而是用重组人TGF-β2刺激时,在iFECD中发现纤连蛋白的生成。另一方面,在mTOR siRNA添加组中,几乎未确认到纤连蛋白的生成。因此,通过蛋白质印迹分析,确认了mTOR siRNA抑制由重组人TGF-β2诱导的纤连蛋白的表达。
实施例10:各mTOR抑制剂对由TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性的抑制效果
在本实施例中,证实了各种mTOR抑制剂对由TGF-β2诱导的半胱天冬酶活性的抑制效果。
材料及方法
从培养iFECD的培养皿移除培养基,加入预热至37℃的1×PBS(-)并洗净。此操作重复两次。再次加入1×PBS(-),在37℃(5%CO2)下培养了3分钟。除去PBS(-)之后,加入0.05%Trypsin-EDTA(Nakarai Tesque,32778-34),在37℃(5%CO2)下培养了5分钟。之后,悬浮于培养基中,并以1500rpm离心3分钟,由此回收了细胞。培养基使用了DMEM(NakaraiTesque,08456-36)+10%FBS(Biowest,S1820-500)+1%P/S(Nakarai Tesque,26252-94)。
将来源于永生化FECD患者的角膜内皮细胞(批号:iFECD3-5)以每孔4×103个的比例接种于96孔板中,在37℃(5%CO2)下培养了24小时(培养基:DMEM+10%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,各加入mTOR抑制剂并培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,除去培养基,加入含有10ng/ml的重组人TGF-β2(Wako,200-19911)及各mTOR抑制剂的培养基,并培养了24小时(培养基:DMEM+2%FBS+1%P/S)。24小时后,在相差显微镜下观察到了细胞形态及细胞凋亡。
观察后,按照以下步骤,通过Caspase-Glo(注册商标)3/7测试进行了半胱天冬酶3/7活性的测定。
弃去培养基使每孔为50μl,以50μl/孔加入CaspaseGlo(注册商标)3/7测试试剂(Caspase-Glo(注册商标)3/7测试缓冲液与Caspase-Glo(注册商标)3/7测试底物的混合液)(Promega、G8091)溶液使其与培养基的比例为1:1。从这里开始的操作在遮光下进行。使振荡器以约120分-1均匀混合2分钟,室温下静置40分钟。静置后,向测试板(Corning、3912,测试板96孔,白色聚苯乙烯)转移80μl,并利用GloMax-Multi检测系统(Promega、E7051)测定了吸光度。
本实施例中所使用的mTOR抑制剂如下。
雷帕霉素(Wako,#53123-88-9)
依维莫司(Cayman Chemical,#11597)
替西罗莫司(Tocris Bioscience,#5264)
PI-103(Cayman Chemical,#10009209)
CC-223(Cayman Chemical,#19917)
INK128(Cayman Chemical,#11811)
AZD8055(Cayman Chemical,#16978)
KU 0063794(Tocris Bioscience,#3725)
结果
雷帕霉素
结果示于图10。Caspase-Glo(注册商标)3/7测试可测定伴随着细胞凋亡诱导的半胱天冬酶3/7的活性。随着半胱天冬酶3/7的活性变高,则表示细胞障碍被诱导。从图10可知,当加入0.00001nM、0.0001nM、0.001nM、0.01nM的雷帕霉素时,与对照相比,半胱天冬酶3/7的活性无显著性差异。另一方面,当添加0.1nM、1nM、10nM、100nM的雷帕霉素时,与对照组相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。显然,即使在0.1nM这样的极其低浓度下,雷帕霉素也显著性地抑制半胱天冬酶3/7活性。
依维莫司
结果示于图11。当加入0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM的依维莫司时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。表明即使在0.0001μM这样的极其低浓度下,依维莫司也显著地抑制了半胱天冬酶3/7活性。
替西罗莫司
结果示于图12。当加入0.000001μM的替西罗莫司时,与对照相比,未发现半胱天冬酶3/7的活性存在显著性差异。另一方面,当加入0.00001μM、0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的替西罗莫司时,与对照相比,发现半胱天冬酶3/7的活性显著地受到抑制。表明即使在0.00001μM这样的极低浓度下,替西罗莫司也显著地抑制了半胱天冬酶3/7活性。
PI-103
结果示于图13。当加入1μM的PI-103时,与对照相比,未发现半胱天冬酶3/7的活性存在显著性差异。另一方面,当加入0.001μM、0.01μM、0.1μM的PI-103时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。
CC-223
结果示于图14。当加入0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM的CC-223时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。
INK128
结果示于图15。当加入0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM的INK128时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。
AZD8055
结果示于图16。当加入0.01μM、0.1μM、1μM的AZD8055时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。
KU 0063794
结果示于图17。当加入0.001μM、0.01μM的KU 0063794时,与对照相比,未发现半胱天冬酶3/7的活性存在显著性差异。另一方面,当加入0.1μM、1μM的KU 0063794时,与对照相比,发现显著性地抑制了半胱天冬酶3/7的活性。
实施例11:小鼠模型中的体内(in vivo)评估
在本实施例中,在使用Fuchs角膜内皮营养不良小鼠模型的评估系统中证实了mTOR抑制剂在体内的效果。
具体而言,在本实施例中,将mTOR抑制剂滴入Fuchs角膜内皮营养不良的模型小鼠、即具有8型胶原蛋白的突变的小鼠(Col8a2 Q455K/Q455K),以确认体内效果。
材料及方法
利用Fuchs角膜内皮营养不良的模型小鼠、即Alpha2胶原蛋白VIII(Col8a2)Q455K敲入小鼠(Hum Mol Genet.2012 Jan 15;21(2):384-93.),进行了体内评估。对于该模型小鼠,与人的Fuchs角膜内皮营养不良中所发现的一样,发现被称为滴状物(guttae)的向细胞外基质(胶原蛋白或纤连蛋白等)的角膜内皮基底膜(后弹力膜)的沉积及因角膜内皮障碍引起的细胞密度降低,因此被认为是Fuchs角膜内皮营养不良的优选模型。
对于这种小鼠,将mTOR抑制剂进行眼内给药、前房内给药、玻璃体内给药、结膜下给药、全身给药,或者通过基因治疗来抑制角膜内皮的mTOR途径,由此可治疗Fuchs角膜内皮营养不良或预防发作或延缓疾病的进展,因此在本实施例中用于确认效果。
mTOR抑制剂滴眼剂的制备
作为mTOR抑制剂的滴眼剂,使用了25mg的Toricel(注册商标)静脉滴注溶液(Pfizer Japan Inc)(替西罗莫司)。以2:3的比例混合本产品及添加于本产品的稀释用液,并制备了9.7mM混合液92.78μl。并且,用大塚生理盐水(大塚制药株式会社)(OTSUKANORMAL SALINE)807.22μl稀释,并在1.5ml试验管中制备了1mM混合液900μl。接着,利用所制备的1mM混合液9μl和大塚生理盐水891μl,制备10μM混合液900μl。制备后,将1.5ml管用铝箔覆盖,避光,保存在4℃的冰箱中。
对小鼠的滴眼试验
使用Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)的模型小鼠、即具有8型胶原蛋白的突变的小鼠(Col8a2Q455K/Q455K)(购自Johns Hopkins University)。从滴眼试验前的角膜内皮图像中,对FECD的严重程度进行了分级,并使用了具有相同程度的症状的20~24周龄的FECD模型小鼠。将所制备的mTOR抑制剂滴眼剂(1mM,10μM)每天早晚2次对45只小鼠的左右眼各滴入2μl。对照中使用了大塚生理盐水。滴眼期间为3个月,在此期间,实验负责人针对mTOR抑制剂滴眼剂及对照滴眼剂(大塚生理盐水)以盲态进行了实验。
滴眼剂的有效性评估
在滴眼试验开始之前,利用接触式角膜内皮镜(KSSP slit-scanning wide-fieldcontact specular microscope(Konan medical Inc.,Hyogo,Japan))观察角膜内皮图像,并进行了分级。滴眼试验开始后,每4周间隔利用接触式角膜内皮镜观察小鼠的角膜内皮图像,并评估了mTOR抑制剂滴眼剂的有效性。
结果
在2个月内每天早晚2次向左右眼各滴入2μl的TOR抑制剂滴眼剂(1mM)的FECD模型小鼠中,通过接触式角膜内皮镜观察的角膜内皮细胞像的代表性示例示于图19。将滴入了生理盐水的例子作为对照。与对照相比,滴入mTOR抑制剂滴眼剂的个体中角膜内皮细胞的尺寸较小且细胞密度高。进而,通过接触式角膜内皮镜观察到的黑色部分的被称为角膜滴状物(guttae)的细胞外基质的凸状的沉积图像的产生得以抑制(图19)。
相对于对照的角膜内皮细胞密度为平均1558个/mm2,mTOR抑制剂滴入组中显著增高,平均1957个/mm2,FECD模型小鼠中发现的角膜内皮细胞密度降低受到抑制(图20)。这表明:对于FECD患者而言,通过滴眼给与mTOR抑制剂抑制角膜内皮细胞降低,从而可预防角膜基质浮肿、角膜上皮浮肿等的产生,所述角膜基质浮肿、角膜上皮浮肿等大多在角膜内皮细胞密度通常为约1000个/mm2以下时出现。
另外,对于角膜滴状物(guttae)的范围,对照中平均为3.02%,相对于此在mTOR抑制剂滴入组中显著降低,平均为0.58%,从而FECD模型小鼠中发现的角膜滴状物的产生受到了抑制(图21)。15只小鼠中同样进行分析,关于角膜滴状物(guttae)的范围,表现出统计学的显著性差异。已知在不存在角膜基质浮肿、角膜上皮浮肿的早期FECD患者中,角膜滴状物也会因光的漫反射等而导致视觉功能下降。因此,该结果表明,就FECD患者而言,通过滴眼给与mTOR抑制剂来抑制角膜滴状物的产生,由此可抑制因光的漫反射而引起的视觉功能下降。
实施例12:诊断及治疗例
当被诊断为Fuchs角膜内皮营养不良及类缘的角膜内皮疾病时(作为具体例,(1)通过裂隙灯显微镜检查观察到的角膜滴状物形成、后弹力膜增厚、角膜上皮浮肿、角膜基质浮肿,(2)通过镜面显微镜观察到的角膜滴状物像、角膜内皮障碍像,(3)通过Pentacam、OCT、超声波角膜厚度测量仪等观察到的角膜浮肿,(4)通过基因诊断被判断为高风险时)使用。可将本发明的组合物以滴眼剂、前房内注射、利用缓释剂的给药、玻璃体内注射、结膜下注射的形式使用来进行治疗。
作为有效成分以外的各成分,可利用例如,适合于日本药典或其等同物的市售品。
实施例13:滴眼剂的制备例
在本实施例中,作为制剂例,如下制备含有mTOR抑制剂的滴眼剂。
如下示出各浓度的被测试物质的组成。
浓度可以利用以下组成的基剂稀释。
实施例14:对小鼠的滴眼试验
在本实施例中,将mTOR抑制剂滴入Fuchs角膜内皮营养不良的模型小鼠、即具有8型胶原蛋白的突变的小鼠(Col8a2 Q455K/Q455K)中。该模型小鼠呈现出被认为是Fuchs角膜内皮营养不良的细胞外基质(胶原蛋白或纤连蛋白等)的沉积。
材料及方法
如上所述,利用本发明的优选实施方式例示了本发明,但应当理解的是,本发明应仅由权利要求来解释其范围。应理解,对于在本说明书中所引用的专利、专利申请及文献,与其内容本身具体地记载在说明书中同样地其内容作为对本说明书的参考而引入本文。本申请要求日本专利申请特愿2017-118619号(2017年6月16日申请)的优先权,其全部内容作为参考引入本说明书中。
产业上的可利用性
提供用于治疗或预防由角膜内皮细胞中的转化生长因子-β(TGF-β)信号和/或细胞外基质的过度表达所引起的角膜内皮障碍的药物,尤其,提供了用于治疗或预防Fuchs角膜内皮营养不良的角膜内皮障碍的药物。提供一种在基于这种技术的与制剂等相关的技术所涉及的产业(制药等)中可利用的技术。
序列表
序列号1:mTOR siRNA的有义链
序列号2:mTOR siRNA的反义链。
序列表
<110> 学校法人同志社
<120> 用于治疗或预防眼部症状、障碍或疾病的包含mTOR抑制剂的药物及其应用
<130> DU004
<150> JP 2017-118619
<151> 2017-06-16
<160> 2
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA有义链
<400> 1
cauucgcauu caguccauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA反义链
<400> 2
uauggacuga augcgaauga t 21
Claims (20)
1.一种用于预防或治疗眼部症状、障碍或疾病的组合物,其中,包含mTOR抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为角膜内皮的症状、障碍或疾病。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中,所述眼部症状、障碍或疾病为由转化生长因子-β(TGF-β)引起的角膜内皮的症状、障碍或疾病。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜移植术后障碍、角膜内皮炎、创伤、眼科手术、眼科激光手术后障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病由细胞外基质(ECM)的过度表达所引起。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中,所述角膜内皮的症状、障碍或疾病选自由Fuchs角膜内皮营养不良、滴状物的形成、后弹力膜的增厚、角膜厚度的增厚、混浊、疤痕、角膜薄翳、角膜斑、角膜白斑、畏光及视力模糊组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物,其中,所述症状、障碍或疾病包括Fuchs角膜内皮营养不良。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂选自由雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、PI-103、CC-223、INK128、AZ D8055、KU0063794、Voxtalisib、Ridaforolimus、NVP-BEZ235、CZ415、Torkinib、Torin 1、Omipalisib、OSI-027、PF-04691502、Apitolisib、WYE-354、Vistusertib、T orin
2、他克莫司、GSK1059615、Gedatolisib、WYE-125132、BGT226、Palomid 529、PP121、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、X L388、咗他莫司及大黄根酸组成的组。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为抑制mTOR基因表达的物质。
10.根据权利要求9所述的组合物,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA、反义核酸或核酶。
11.根据权利要求9或10所述的组合物,其中,所述抑制mTOR基因表达的物质为针对mTOR基因的siRNA,所述siRNA包括有义链和反义链,所述有义链由序列号1表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成,所述反义链由序列号2表示的核酸序列、或1~3碱基的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加而成的核酸序列构成。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂选自由由雷帕霉素、替西罗莫司及依维莫司组成的组。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素、并以至少约0.1nM存在于所述组合物中。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为雷帕霉素并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司、并以至少约0.01nM存在于所述组合物中。
17.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为替西罗莫司并以至少约0.01mM存在于所述滴眼剂中。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述mTOR抑制剂为依维莫司、并以至少约0.1nM存在于组合物中。
19.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物,其中,所述组合物为滴眼剂,所述mTOR抑制剂为依维莫司并以至少约0.1mM存在于所述滴眼剂中。
20.一种用于角膜内皮细胞的保存和/或增殖或维持增殖的组合物,其中,包含mTOR抑制剂。
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