KR101258166B1 - Ｔｇｆｂｉ 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리튬을 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 억제하고, 오토파지 경로를 활성화하여 변이형 TGFBI 단백질을 선별적으로 분해 제거할 뿐만 아니라, 각막 세포의 산화적 스트레스를 조절하므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.

Description

ＴＧＦＢＩ 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법{Pharmaceutical Composition for Preventing and/or Treating of Corneal Dystrophy Associated with TGFBI Gene Mutation and Its Screening Method}

본 발명은 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

βig-h3으로 알려진 형질전환성장인자-β-유도성 유전자 단백질(TGFBIp)은 TGF-β(transforming growth factor-β)에 반응하여 인간 선암종세포 및 기타 다른 세포형에서 분비되는 단백질로서¹ 종양 억제 활성을 가진다고 것으로 알려져 있다.^2-3 최근 보고에 의하면 마우스 내 TGFBIp 결핍은 세포 증식 및 자연적 종양 성장을 유도한다고 한다.⁴ TGFBI 유전자는 잘 보존된 683개의 아미노산(aa) 단백질을 인코딩하며, 이는 인테그린의 리간드 인식 부위로 작용하는 Arg-Gly-Asp 모티프 및 분비 신호 서열을 포함한다.¹ TGFBIp는 세포외 기질(ECM)의 한 구성요소로서, 인테그린과의 상호작용으로 세포 부착 및 이동을 매개한다.^5-7

제2형 과립형 각막이상증(Granular Corneal Dystrophy Type 2; GCD2, 또는 아벨리노 각막이상증)은 염색체 5q31상의 TGFBI 유전자내 점 변이(R124H)에 의해 발생하는 상염색체 우성 질환이다.¹ 연령 의존적으로 진행되는 각막 기질 내 하이알린 및 아밀로이드 축적은 제2형 과립형 각막이상증의 대표적 증상으로서, 제2형 과립형 각막이상증은 각막 상피세포 및 기질 내 TGFBIp 생산 및 이로 인한 각막 투명도 저하를 그 특징으로 한다.^{1, 8-9} 지금까지 각막이상증과 관련하여, 38 개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 보고되었다. 흥미롭게도, 각각의 다른 변이는 독특한 각막이상증 표현형을 나타내는데, 예를 들면 R124H 변이는 제2형 과립형 각막이상증, R124C 변이는 격자형 각막이상증 제1형을, R555W 변이는 과립형 각막이상증 제1형을, 그리고 R555Q 변이는 티엘-벵케(Thiel-Behnke) 각막이상증을 나타낸다.¹⁰

글라이코겐 신타아제 키나아제-3(GSK-3)는 세포 내 여러 작용에 관여하는 세포 내 효소이다.¹¹ 특히 GSK-3는 Wnt 신호 경로의 구성요소로서 잘 알려져 있다. Wnt는 그 수용체에 결합하여 GSK-3를 억제하고 그에 따른 β-카테닌 레벨 상승을 야기한다.^12-13 또한 GSK-3는 AKT와 관계있는 것들을 포함하는 다른 신호 경로에 의해 조절되며 다른 전사 인자 및 세포 단백질의 업스트림 조절자로서도 작용한다.^{11, 14-15}

GSK-3의 불활성화는 일반적으로 항-아폽토시스를 유발한다. 리튬이 GSK-3를 억제한다는 사실은 많은 연구 결과들에 의해 보고되고 있으며,^16-21 리튬이 직접적으로 GSK-3 활성을 억제한다는 사실은 증명되었다.^18-19 GSK-3는 일반적으로 호-아폽토시스적 역할을 하는 것으로 여겨지며, 이를 억제하는 경우 세포 보호 효과가 있다.²² 리튬은 또한 GSK-3의 Ser21/Ser9 부위 인산화를 촉발함으로써 간접적으로도 GSK-3를 억제한다.^23-25 리튬은 주로 GSK-3을 억제하여 신경보호 효과를 가진다는 사실을 입증하는 증거들이 제시되고 있다.²⁷ 이러한 직접적인 억제뿐만 아니라, PKA,²⁸ 포스패티딜이노시톨 3-키나아제(PI3-K)-의존성 AKT,²³ 단백질 키나아제 C(PKC),²⁹ 및 GSK-3 자동조절^{25 ,30}의 활성화를 포함하는 여러 단계의 메카니즘을 통한 GSK-3α Ser21 부위 인산화 및 GSK-3β Ser9 부위 인산화를 통하여 리튬은 간접적으로 GSK-3를 억제할 수도 있다.²⁸

최근 보고서는 전사인자 Smad3/4를 신경세포에 있어서 GSK-3의 신규한 타겟으로 기술하였다.³¹

Smad3/4는 TGF-β-매개 신호 경로의 다운스트림 매개자이다.³² 세린/트레오닌 키나아제 수용체에 대한 TGF-β의 결합은 Smad2 및 Smad3의 인산화를 일으킨다. 인산화된 Smad(p-Smad) 단백질은 Smad4와 복합체를 형성하고, 핵으로 이동하여 다른 유전자-특이적 전사 인자들과 결합하여 유전자 발현을 조절한다.^32-33 Smad3/4는 신경세포의 생존/사멸, 분화 및 유연성과 관련된 단백질 발현을 조절하는 데 있어 현저한 역할을 한다.^34-35

연구결과에 따르면 TGF-β는 Smad3의 Thr-179, Ser-204 및 Ser-208에 인산화를 유도할 수 있다고 한다. 또한, GSK-3는 직접적으로 Smad3의 Ser-204에 인산화를 일으킨다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 안과적 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 리튬이 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 보다 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 오토파지 경로를 활성화하여 변이형 TGFBI 단백질을 선별적으로 분해 제거하고, 각막 세포의 산화적 스트레스를 조절한다는 것을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 리튬(lithium)을 포함하는 TGFBI(TGF beta induced) 유전자 변이 각막이상증(corneal dystrophy)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 안과적 난치성 질환인 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 리튬이 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 보다 효과적으로 억제할 뿐만 아니라, 오토파지 경로를 활성화하여 변이형 TGFBI 단백질을 선별적으로 분해 제거하고, 각막 세포의 산화적 스트레스를 조절한다는 것을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

TGFBI 유전자는, 분비 신호 및 인테그린의 리간드 인식 부위로서 작용하는 Arg-Gly-Asp(RGD) 모티브를 포함하는 683개의 아미노산으로 구성된 단백질을 인코딩하는 유전자인데, 이 유전자에 변이가 생겨 변이 TGFBI 단백질이 생성되는 경우 다양한 타입의 각막 이상증이 발병하게 된다. TGFBI 단백질은 인테그린과 상호작용하여 세포 부착 및 이동을 매개하는 세포 외 기질(ECM) 요소이며 정상 TGFBI 단백질은 서열목록 제 1 서열에 해당하는 아미노산 시퀀스를 갖는다.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증은 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되어 발생하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막 이상증은 유전자 변이 종류에 따라 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 및 그로에노우브(Groenouw type) 각막이상증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 각막 이상증은 TGFBI 단백질의 아미노산 서열 중 변이가 생긴 위치에 따라 다양한 표현형을 나타내는 관계로 상기와 같이 분류된 것이지만, 단백질의 컨포메이션 변화로 인해 변이 TGFBI 단백질이 정상적으로 분비 또는 분해되지 못하여 각막에 축적되어 발생하는 질병이라는 점에서 그 발병 원인이 동일하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, TGFBI 유전자 변이 각막 이상증을 일으키는 상기 변이 TGFBI 단백질은 정상 TGFBI 단백질과 비교하여 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 상기에 있어서, R124H는 정상 TGFBI 단백질을 구성하는 아미노산 중 124번째 아르기닌이 히스티딘으로 변이가 일어난 것을 의미하고, R124C는 124번째 아르기닌이 시스티딘으로 변이가 일어난 것을 말하며, R555W는 555번째 아르기닌이 트립토판으로 변이된 것을 말한다. 나머지도 상기 설명한 것과 동일한 규칙으로 각 아미노산의 변이를 나타낸다. 또한 상기에 있어서, H572del는 572번째 히스티딘이 결여된 것을, T125del는 125번째 트레오닌이 결여된 것을 의미한다. 상기 열거한 아미노산의 변이 이외에도 지금까지 총 38개의 다른 TGFBI 유전자 변이가 보고되고 있으며, 이들 모두는 변이 TGFBI 단백질이 각막에 축적되는 유전적 소인의 안과적 난치성 질환이라는 점에서 발병원인이 공통된다.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 전사 수준에서 효과적으로 억제하고, 오토파지 활성화를 통해 변이형 TGFBI 단백질만을 효과적으로 제거하여 GFBI 유전자 변이 각막 이상증을 예방 또는 치료한다는 점에 그 특징이 있다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은, TGFBI 유전자 변이 각막 이상증의 표현형 또는 유전자 내 변이가 발생한 위치를 불문하고, 변이형 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것이라면 제한 없이 그 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 지금까지 보고된 총 38개의 TGFBI 유전자 변이 이외에 장래에 보고될 새로운 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막 이상증이라고 하여도, 그것이 변이 TGFBI 단백질이 발현되고 각막에 축적되어 발병하는 것인 한, 본 발명의 대상 질병의 범위에 속한다고 할 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 사용되는 리튬은 전사 수준에서의 조절을 통하여 TGFBIp 발현을 억제하는 역할을 한다. 본 발명자들은 리튬이 정상 TGFBIp의 발현도 억제하지만 변이형 TGFBIp의 발현을 더욱 크게 억제하는 장점이 있음을 밝혀내었다. 다양한 생리학적 조건 하에서 수용체의 상향조절로 인한 TGFBIp의 발현은 정상 각막세포에서보다 유전자 변이 각막이상증 환자의 각막 세포 내에서 더 크게 나타난다. 반면 리튬은 정상 TGFBIp보다 변이형 TGFBIp의 발현을 더욱 크게 억제하기 때문에 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 치료용 약물로서 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 리튬이 오토파지 경로를 활성화시켜 변이 TGFBI 단백질을 제거하고, 각막세포의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시킨다는 사실도 밝혀내었다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 리튬(lithium)은 리튬이온, 약제학적으로 허용가능한 리튬염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물의 형태로 상기 조성물에 포함될 수 있다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 투여대상 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 제형을 의미하며, 예컨대, 리튬 카보네이트(Li₂CO₃), 리튬 시트레이트(lithium citrate), 리튬 설페이트(Li₂SO₄), 리튬 아스파테이트(lithium aspartate), 리튬 오로테이트(lithium orotate), 염화리튬(LiCl) 및 리튬 아세테이트(lithium acetate) 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 형태를 의미한다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 형태를 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 상세하게 설명한 유효성분으로 포함되는 리튬 이외에도 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다. 바람직하게는 안구에 직접 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.

상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(Suspensions), 침제 (Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pills)등으로 제조할 수 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우되며, 안구에 직접투여하는 경우 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(Suspensions) 등으로 제조하는 것이 바람직하다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 좋으며, 상기 리튬을 기준으로 하였을 때 0.0001 ng/㎏(체중) 내지 10 ㎎/㎏(체중)으로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 각막세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 (b) 세포 내 GSK-3α(glycogen synthase kinase-3 alpha) 및 GSK-3β(glycogen synthase kinase-3 beta)의 활성을 분석하는 단계를 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 시험물질이 GSK-3α 및 GSK-3β의 활성을 억제하면 TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제로 판단한다.

본 발명의 TGFBI 유전자 변이 각막 이상증 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 상술한 약제학적 조성물과 대상 질병을 공통으로 하기 때문에, 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명자들은 TGFBIp의 발현을 억제하는 경로 중 하나로서, 리튬이 GSK-3α/β의 활성을 음성적으로 조절한다는 것을 밝혀내었다. 각막 세포에 리튬을 처리하였더니 GSK-3α/β의 인산화가 매우 현저하게 증가했던 것이다. 이는 리튬 이외의 다른 GSK-3α/β 억제제 또한 TGF-β 신호 경로의 억제를 유도하여 TGFBIp의 발현을 감소시키는 경우, TGFBI 유전자 변이 각막이상증 예방 또는 치료제의 후보물질로서의 가능성이 있음을 제안한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 상기 세포 내 GSK-3α(glycogen synthase kinase-3 alpha) 및 GSK-3β(glycogen synthase kinase-3 beta)의 활성을 분석하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 분광분석법, 색도분석법, MTT 분석법, 커플 분석법, 형광분석법, 열량측정법, 화학발광법, 웨스턴 블롯팅, 광산란법, 방사능 분석법 및 크로마토그래피 분석법 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, GSK-3α(glycogen synthase kinase-3 alpha) 및 GSK-3β(glycogen synthase kinase-3 beta)의 활성을 분석하는 방법은 문헌(Bergmeyer, H. U. "Methods of Enzymatic Analysis", Vol. 4, Academic Press(New York), 2066-2072(1974); Passonneau, J. V., and Lowry, O. H. "Enzymatic Analysis. A Practical Guide", Humana Press(Totowa, NJ), 85-110(1993); Todd MJ et al, Enzyme kinetics determined using calorimetry: a general assay for enzyme activity, Anal Biochem . 296(2):179-87(2001); Churchwella M et al, Improving Sensitivity In Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, Journal of Chromatography B 825(2) 134-143(2005); Daniel RM, Peterson ME, Danson MJ, et al . "The molecular basis of the effect of temperature on enzyme activity". Biochem . J. 425(2): 35360(2010); Cowan DA "Thermophilic proteins: stability and function in aqueous and organic solvents". Comp . Biochem . Physiol. A Physiol. 118(3): 42938(1997); Minton AP, "The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media". J. Biol . Chem . 276(14): 10577-80(2001))에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 리튬을 포함하는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 억제하고, 오토파지 경로를 활성화하여 변이형 TGFBI 단백질을 선별적으로 분해 제거할 뿐만 아니라, 각막 세포의 산화적 스트레스를 조절하므로 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.

도 1. LiCl는 일차 배양된 각막 섬유 모세포 내 TGFBIp 발현을 감소시킨다.
(A) 정상 각막 섬유 모세포주를 LiCl 또는 KCl의 지시된 양으로 12시간 동안 처리하였다. KCl은 대조군으로 사용하였다. TGFBIp의 레벨을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (B) 정상 각막 섬유 모세포주를 10 mM LiCl으로 지시된 시간 동안 처리하였다. TGFBIp의 레벨은 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (C) LiCl를 지시된 농도로 12시간 동안 처리한 정상 각막 섬유 모세포 내 TGFBI mRNA의 레벨을 RT-PCR로 측정하였다. (D) (C)에 나타난 데이터를 정량화 한 것이다. (E) 야생형(WT) 및 동형접합자(HO) 일차 각막 섬유 모세포를 지시된 양의 LiCl로 12시간 도안 처리하였다. TGFBIp의 레벨은 웨스턴 블롯으로 측정하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (F) (E)에 나타난 데이터를 정량화 한 것이다. 모든 신호는 NIH 이미지 J를 사용하여 정량화하였다. 값은 적어도 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 일원 분산 분석법을 사용하여 통계적 분석을 수행한 후 뉴만-쿨스 다중 비교 분석을 수행하였다. **P<0.01 LiCl 처리 vs LiCl 미처리.
도 2. TGF-β1-유도성 TGFBIp의 발현은 LiCl 처리에 의해 억제된다.
(A) 정상 각막 섬유 모세포를 TGF-β1의 지시된 양으로 12시간 동안 처리하였다. 세포 용출액 및 배지의 TGFBIp를 웨스턴 블롯으로 분석하였다. (B) 정상 각막 섬유 모세포주를 5 ng/ml TGF-β1로 지시된 시간 동안 처리하였다. (C) 5 ng/ml TGF-β1으로 2시간 동인 전처리한 정상 각막 섬유 모세포를 1050 mM LiCl와 함께 12시간 동안 배양하였다. TGFBIp의 레벨은 웨스턴 블롯으로 측정하였다. (D)(C)에 나타난 데이터를 정량화 한 것이다. TGFBIp의 레벨은 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고 β-액틴에 대해 표준화하였다. 값은 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 일원 분산 분석법을 사용하여 통계적 분석을 수행한 후 뉴만-쿨스 다중 비교 분석을 수행하였다. *P<0.05; **P<0.01 LiCl 처리 vs LiCl 미처리.
도 3. LiCl은 Smad3의 탈인산화를 촉진함으로써 TGF-β 신호를 억제한다.
(A) 정상 각막 섬유 모세포를 지시된 양의 LiCl으로 12시간 동안 처리하였다. p-Smad3(S423/425), Smad3, p-GSK-3α/β, p-β-카테닌 및 β-카테닌의 레벨은 웨스턴 블롯으로 분석하였다. (B) p-Smad3 (S423/425) 레벨은 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고 총 Smad3에 대해 표준화하였다. (C) 정상 각막 섬유 모세포를 LiCl의 지시된 양으로 12시간 동안 처리하였다. p-GSK-3α의 레벨은 웨스턴 블롯으로 분석하고, NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고 총 GSK-3α에 대해 표준화하였다. (D) 정상 각막 섬유 모세포를 지시된 양의 LiCl으로 12시간 동안 처리하였다. p-GSK-3β의 레벨을 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고 총 GSK-3α/β에 대해 표준화하였다. 값은 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 일원 분산 분석법을 사용하여 통계적 분석을 수행한 후 뉴만-쿨스 다중 비교 분석을 수행하였다. **P <0.01; ***P<0.001 LiCl 처리 vs LiCl 미처리.
도 4. 리튬은 각막 섬유 모세포 내 오토파지를 유도한다.
(A) 정상 각막 섬유 모세포를 지시된 양의 LiCl으로 12시간 동안 처리하였다. LC3 단백질 레벨은 웨스턴 블롯으로 분석하였다. (B) LC3-II 레벨은 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였고 LC3-I에 대해 표준화하였다. 값은 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 일원 분산 분석법을 사용하여 통계적 분석을 수행한 후 뉴만-쿨스 다중 비교 분석을 수행하였다. **P <0.01 LiCl 처리 vs LiCl 미처리.
도 5. 리튬은 각막 섬유 모세포에 대한 독성이 없다.
야생형 (A) 및 HO (B) 각막 섬유 모세포를 다른 농도(0-100 mM)의 LiCl로 지시된 시간(12-36 h) 동안 처리하였다. 세포 생존능력은 MTT 분석법으로 측정하였다. 세포 생존능력은 공식을 사용하여 계산하였다: 샘플의 MTS 광학 밀도(OD)값 / 대조군(PBS로 처리한 세포)의 MTS OD값.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

LiCl 및 KCl은 시그마-알드리치(St Louis, MO)로부터, 재조합 TGF-β1는 R&D 시스템(Minneapolis, MI)으로부터 취득하였다. 수퍼시그날 웨스트 피코 화학발광 기질은 피어스(Rockford, IL)로부터 구입하였다.

1. 일차 각막 섬유모세포의 분리 및 배양

일차 정상 각막 섬유 모세포 및 일차 이형접합자 각막 섬유 모세포의 정제 및 배양은 종전 문헌에 기술된 방법에 따라 준비하였다.³⁶ 헬싱키 선언에 따라 공여자 비밀을 보호하고 연세대학교 세브란스 병원 IRB 위원회(CR04124)의 승인을 받았다. TGFBI 유전자 변이의 DNA 시퀀싱 분석법으로 제2형 과립형 각막이상증을 진단하였다. 전층각막이식을 위해 각막 반구피를 제거한 후 남아있는 각막 둘레를 정상 각막 섬유모세포 배양을 위해 취득하였다. 연세 대학교 세브란스 병원 안은행(eye bank)으로부터 취득한 공여자의 의료기록에는 그 어떠한 유전적 또는 시스템적 대사 장애도 없었다. 각막 테두리 단편으로부터 자란 섬유모세포를 정상 대조군으로 하고, 정상 일차 배양 각막 섬유모세포 내 BIGH3 유전자를 DNA 시퀀싱 분석법으로 분석하여 정상 유전자를 확인하였다. 정상 인간 각막 섬유 모 세포주³⁷는 제임스 제스터 박사가 제공해 주었고, 상기 세포는 95% 공기 및 5% CO₂를 포함하는 습한 배양기 안에서 10% 우태아 혈청을 보충한 DMEM을 사용하여 37℃에서 배양하였다.

2. 세포에 리튬 처리

리튬은 사용에 앞서 상온에서 포스페이트-완충 염수액(PBS; Gibco-BRL, Carlsbad, CA)에 녹여 신선하게 준비하였다. 리튬의 TGFBIp 단백질 발현에 대한 영향을 시험하기 위하여, 각막 섬유 모세포를 10-100 mM의 LiCl와 배양하고 이뮤노 블롯 분석법을 사용하여 분석하였다.

3. RNA 정제 및 역전사 - PCR ( RT - PCR )

TGFBI 및 β-액틴의 증폭을 위하여, TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용한 추출법으로 각막 섬유 모세포로부터 총 RNA 를 분리하였다. cDNA 합성 및 DNA 증폭은 Superscript^TM 일단계 RT-PCR 시스템(Invitrogen Life Technologies), TGFBI에 특이적인 프라이머(정방향 프라이머: 5’GTGTGTGCTGTGCAGAAGGT-3’및 역방향 프리이머: 5’TTGAGAGTGGTAGGGCTGCT-3’)와 β-액틴에 특이적인 프라이머(정방향 프라이머: 5’GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’ 및 역방향 프라이머: 5’AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’)를 사용하여 수행하였다. 에티디움 브로마이드를 포함하는 1.2% 아가로스 젤을 사용한 전기 영동법으로 증폭산물을 시각화하였다.

4. 세포 용출액의 준비 및 이뮤노 블롯 분석법

각막 섬유 모세포의 세포 용출액은 프로테아제 억제제(Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet, Roche #1836170, Indianapolis, IN) 및 포스파타제 억제제(PhosSTOP, Roche #04906845001)를 포함하는 방사능-면역침전 분석 완충액(RIPA 완충액; 150 mM/L NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM/L Tris-HCl 및 pH 7.4) 내에 준비하였다. 크루드 세포 용출액을 4℃에서 10,000 × g으로 10분간 원심분리하여 핵 조각 및 조직 잔해를 제거하였다. BCA(Bicinchoninic Acid) 키트(Pierce)로 총 단백질 농도를 측정하기 위하여 상등액 일부를 사용하였다. 총 세포 단백질을 10% 트리스-글리신 SDS 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하였다. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Millipore Corp., Bedford, MA)으로 이전시키고, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Millipore Corp., Bedford, MA)으로 이전시키고, TBS-T(0.02 mol/L Tris/0.15 mol/L NaCl, pH 7.5, 0.1% Tween 20) 내 5% 건조유로 상온에서 한 시간 동안 블록시키고, TBS-T로 3회 세척하고, 그 후 TGFBIp(0.2 /ml; Cat. No. AF2935; R&D Systems), β-액틴(1:5000 희석; Cat. No. A-5441; Sigma), GSK-3α/β, p-GSK-3α/β, Smad3 및 p-Smad3(1:1000 희석; Cell Signaling Technology, Beverly, MA)에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시켰다.

TBS-T로 세 번 세척 후, 블롯을 HRP-접합 이차 항체[항-마우스 IgG (1:5000 희석; Cat. No. NA931V) 또는 항-래빗 IgG(1:5000 희석; Cat. No. NA934V) Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ]와 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 향상된 화학발광시스템(Pierce)을 사용하여 웨스턴 블롯을 시각화하였다. 면역반응성 단백질 밴드의 두가지 강도를 이미지 스캔하고, 상기 밴드의 시각적 밀도를 컴퓨터 소프트웨어(ImageJ software, version 1.37, Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 정량화하고, 이를 배경 분리로 보정하고, β-액틴 단백질 밴드 강도를 사용하여 표준화하였다.

5. 세포 생존능력

제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유모세포를 웰당 10,000 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 넣고 이를 밤새 배양하였다. 테트라졸리움 화합물(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium; inner salt MTS; Cat. No. G3580; Promega, Madison, WI) 및 CellTiter 96 아쿠아 원 솔루션 시약 세포 증식 분석 키트를 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 즉, 배양배지를 제거하고 20 ㎕의 MTS 용액을 100 ㎕의 배양배지를 포함하는 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 배양액을 37℃, 95% 습도 및 5% CO₂ 조건 하에서 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 시각적 밀도를 측정하였다.

6. 통계적 분석법

일원 분산 분석법을 사용하여 상기 결과들의 통계학적 중요성을 평가하고(P<0.05), 뉴만-쿨스 다중 비교 분석을 수행하였다. 결과를 평균±SD로 표시하였다. 모든 데이터는 그래프 패드 프리즘 버전 4.0(Graph Pad Software Inc, San Diego, CA) 통계 패키지를 사용하여 처리하였다.

실험결과

1. 리튬에 의해 각막 섬유 모세포 내 TGFBIp 발현이 감소된다 .

최근 연구는 GSK-3 억제제가 TGF-β 신호 전달을 차단함으로써 TGFBIp 발현을 하향 조정할 수 있음을 보고하였다. 상기 가설을 검증하기 위하여 GSK-3 억제제로 알려진 리튬을 일차 각막 섬유 모세포에 처리한 후, 세포 내 TGFBIp을 분석하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과는 리튬이 양 의존적(도 1A) 및 시간 의존적 방식(도 1B)으로 TGFBIp 레벨을 감소시킴을 보여주었다. 다음으로 리튬의 TGFBI mRNA 발현에 대한 영향을 시험하였다. 정량적 RT-PCR 분석 결과 30 mM 및 50 mM의 LiCl을 12시간 동안 처리하는 경우 TGFBI mRNA 발현이 대조군으로 사용한 β-액틴과 비교하여 각각 대략 69.12±5.868% 및 34.80±6.138%으로 감소함을 확인 할 수 있었다(P<0.01)(도 1C 및 D). 상기 결과들은 종합적으로 TGFBIp의 조절이 전사 수준에서 일어남을 제안한다.

또한, 본 발명자들은 GSK-3 억제제가 제2형 과립형 각막이상증-관련 변이형 TGFBIp의 발현도 차단할 수 있는 지 여부를 시험하기 위하여 제2형 과립형 각막이상증 동형접합자(HO) 각막 섬유 모세포에 리튬을 처리한 후, 세포 내 변이형(mut)-TGFBIp 발현을 분석하였다. 야생형 각막 섬유 모세포에 LiCl 10, 30 및 50 mM을 12시간 동안 처리한 결과 미처리 각막 섬유 모세포와 비교하여 TGFBIp 레벨이 각각 78.37 ± 10.00%, 41.43 ± 4.25% 및 24.33 ± 4.14%로 감소하였다(P<0.01)(도 1E 및 F). 또한, 제2형 과립형 각막이상증 동형접합자(HO) 각막 섬유 모세포에 대한 같은 농도의 LiCl 처리는 세포 내 TGFBIp 발현을 대략적으로 각각 61.96 ± 3.51%, 30.21 ± 3.63% 및 16.75 ± 2.74%로 감소시켰다(P<0.01)(도 1E 및 F). 그러나, TGFBIp 발현은 정상 섬유 모세포 및 제2형 과립형 각막이상증 동형접합자(HO) 각막 섬유 모세포 간에 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(도 1D 및 E).

2. TGF -β1에 의한 TGFBIp 발현 유도는 리튬 처리에 의해 억제된다.

TGFBIp는 인간 선암종세포주 내에서 최초로 발견된 것으로, TGF-β 처리에 의해 상향 조절된다. 따라서, 본 발명자들은 각막 섬유 모세포 내에서도 TGF-β 처리에 의해 TGFBIp 발현이 유도될 수 있는 지를 실험해 보았다. 실험 결과 TGF-β1는 양 의존적(도 2A) 및 시간 의존적(도 2B) 방식으로 TGFBIp의 발현을 유도하였다. TGFBIp 발현 유도에 대한 리튬의 효능을 시험하기 위하여 2시간 동안 TGF-β1로 전처리한 각막 섬유 모세포에 LiCl 10, 30 및 50 mM를 12 시간 동안 추가 처리하였다. 도 2C 및 D에서 알 수 있듯이 10, 30 및 50 mM의 리튬은 오직 TGF-β1만으로 처리한 샘플과 비교하여 TGF-β-유도 TGFBIp의 레벨을 각각 41.89 ± 9.06%, 67.54 ± 5.79% 및 85.20 ± 3.946%로 감소시켰다.

3. 리튬은 Smad3 의 인산화를 억제하여 TGF -β 신호전달을 억제한다.

LiCl가 TGFBIp 단백질 레벨을 감소시키는 방법에 관해서 최소 두 가지의 메카니즘을 고려할 수 있다: (1) LiCl가 TGFBIp 분해를 촉진하거나 또는 (2) LiCl가 TGFBIp 생합성을 감소시킬 수 있다. Guo 등은 Smad3/GSK-3 복합체를 동정한 후에 GSK-3가 Smad3를 활성화시킬 수 있음을 제안하였다.³⁸ 또한, 리튬은 GSK-3 억제제로서 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 TGF-β 신호 경로 연구를 통해 LiCl의 TGFBIp 발현에 대한 영향을 조사하였다. 각막 섬유 모세포에 LiCl 10, 30 및 50 mM를 처리하자 Smad3 인산화가 각각 46.09 ± 5.53%, 31.29 ± 6.70% 및 20.37 ± 6.29%로 감소하였다(도 3A 및 B). 또한, LiCl는 GSK-3α/β와 반응하여 그 활성을 음성적으로 조절하였다(도 3C 및 D). 각막 섬유 모세포에 LiCl 10, 30 및 50 mM을 12시간 동안 처리하였더니 GSK-3α 인산화가 각각 317.3 ± 38.00%, 401.0 ± 43.86% 및 512.0 ± 23.90%로 현저하게 증가하였고(P<0.01), GSK-3β인산화 또한 현저하게 증가하였다(도 3C 및 D). 상기 결과들은 종합적으로, 관찰된 리튬-유도성 TGFBIp 레벨 감소가 TGF-β 신호 경로의 억제에서 비롯된 것임을 제안한다.

4. 리튬은 오토파지를 유도한다.

리튬이 PI3K 신호 경로를 통하여 오토파지를 유도한다는 사실은 보고된 바 있다.³⁹ 본 발명자들은 이전 연구에서 오토파지의 활성화가 일차 배양된 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 사이토졸 내 축적된 변이형-TGFBIp의 정화를 촉진함을 밝힌 바 있다(Choi et al., 현재 논문 심사 중, 미공개). 따라서, 본 발명자들은 리튬이 각막 섬유 모세포 내 오토파지를 활성화시키는지 조사하였다. 10, 30 및 50 mM의 LiCl을 각막 섬유 모세포에 처리하자 대조군과 비교하여 LC3-II/LC3-I 비율이 각각 1.09 ± 0.16%, 1.60 ± 0.19% 및 2.56 ± 0.24%로 증가하였다(P<0.01)(도 4A 및 B). 이러한 결과는 리튬이 TGFBIp 발현을 억제할 뿐만 아니라, 각막 섬유 모세포 사이토졸 내 축적된 변이형-TGFBIp의 정화를 촉진함을 의미한다.

5. 리튬은 일차 배양된 각막 섬유 모세포에 대한 독성이 없다.

LiCl의 세포독성을 시험하기 위하여, 일차 각막 섬유 모세포를 LiCl와 함께 배양하고 MTT 분석법으로 세포 생존능력을 측정하였다. 도 5에서 보이는 바와 같이 LiCl 4가지 다른 투여량 모두에 대해 세포 생존능력은 98%를 초과하였으며, 이는 LiCl이 시험 대상 농도에서 그 어떠한 심각한 세포 사멸도 일으키지 않음을 의미한다. 종합적으로 LiCl의 TGFBIp 발현을 감소시키는 효능은 각막 섬유 모세포 사멸로 인한 것이 아니었다.

추가논의

현재 TGFBI-관련 각막이상증에 대한 별다른 예방법 또는 치료법은 없으며 따라서 신규한 치료요법에 대한 기대가 크다. 본 발명은 TGFBI-관련 각막이상증 환자로부터 유래한 표본에 작용하는 리튬의 효과를 최초로 기술한 것으로서, 리튬이 세포독성없이 TGFBIp 발현을 효과적으로 감소시킴을 밝혀내었다. 또한 각막 섬유 모세포 내 오토파지를 자극하는 리튬의 역할을 확인하였다. 이러한 발견은 리튬이 TGFBI-관련 각막이상증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 강하게 시사한다.

TGFBI는 TGF-β에 반응하여 인간 선암종세포 및 다른 인간 세포형에서도 분비되는 단백질이며,¹ 암 억제 기능을 나타낸다.^2-3 본 발명자들은 TGF-β에 의해 TGFBIp의 발현이 양 의존적 방식으로 유도될 수 있으며, 리튬은 각막 섬유 모세포 내 이러한 유도를 억제한다는 사실을 밝혀내었다. 따라서, 이러한 결과는 리튬이 TGF-β 신호 경로를 억제하는 역할을 할 수 있음을 제시한다. 리튬은 1996년 켈빈 및 멜튼에 의하여 가역적인 GSK-3 억제제로 밝혀졌다.¹⁹ 여러 연구 결과 리튬은 GSK-3 활성을 두가지 방법으로 감소시키는 것으로 확립되었다.⁴¹ 리튬은 직접적인 억제제로서 GSK-3 결합에 대해 마그네슘과 경쟁한다. 또는 간접적 억제제로서 GSK-3 N-말단의 세린 인산화를 증가시켜 효소 기능을 불활성화시킨다. 보다 최근에 밀레 등은 GSK-3 활성이 TGF-β 신호 경로를 음성적으로 조절함을 제안하였다.⁴² 상기 결과들은 리튬이 TGF-β 신호 전달에 의해 조절되는 유전자에 영향을 미칠 수 있음을 의미한다. 상기 결과에 기초하여 본 발명자들은 GSK-3 억제제가 TGFBI-관련 각막이상증의 잠재적인 치료제로서 사용될 수 있다는 가설을 세우고, 정상 및 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내 TGFBIp 발현에 대한 리튬의 역할을 시험하였다. 본 명세서에서, 리튬이 TGF-β 신호경로를 억제함으로써 TGFBI-관련 각막이상증을 예방 또는 치료할 수 있음을 보였다.

TGF-β 신호 경로는 ECM 항상성을 포함하는 수많은 세포 과정 및 생리학적 과정의 조절자로서 알려져왔다.¹⁶ 상기 경로는 TGF-β의 타입 I(TβRI) 및 타입 II TGF-β 수용체(TβRII)에의 결합에 의해 개시되며, 두 타입 모두 세린/트레오닌 키나아제이다. 활성화된 수용체 복합체는 다운스트림 전사 인자인 Smad2 및 Smad3를 인산화시켜 이들이 Smad4와 결합하도록 한다. 그 다음 상기 Smad 복합체는 핵 안으로 밀집되어 타겟 유전자의 발현을 조절한다.³³ 이러한 단계들은 Smad2/3에 의해 이루어지는 세포막으로부터 핵으로의 신호 전달을 확실하게 하기 위하여 엄격하게 통제된다. 그러므로, 리튬 처리에 의한 TGFBIp 발현의 감소는 억제자 존재 하에 Smad3 인산화가 감소되는 현상과도 일치한다(도 3A).

그러나, Smad 활성화의 통제가 적절한 TGF-β 신호전달 및 관련된 요소를 위해 필수적인 반면 리튬-유도성 Smad3 인산화의 감소와 관련된 특정 메카니즘은 알려지지 않은 상태이다. 더 최근에, 구오(Guo) 등은 활성화되지 않은 Smad3가 골격 단백질 액신(Axin) 및 관련 키나아제 GSK-3β의 협력된 작용 때문에 프로테아좀-의존적 분해를 겪게 되지만 Smad2는 그렇지 않다는 것을 입증하였다.³⁸ Smad3는 TGF-β의 부존재 하에서 물리적으로 오직 액신 및 GSK-3β와 상호작용한다.

액신/GSK-3β 활성의 감소 또는 발현의 감소는 Smad3의 안정의 증가 및 TGF-β 수용체 또는 Smad2에 영향 없는 전사 활성 증가를 유발한다. 반면에, 상기 단백질들의 과발현은 Smad3 기저 분해를 촉진하고 세포가 TGF-β에 대해 덜 민감하도록 한다. 그러나, 리튬에 대한 반응에서 TGFBIp 감소의 메카니즘은 총 Smad3 단백질의 감소 없이 감소된 Smad3 인산화를 통해 이루어지는 TGF-β 신호전달의 억제를 통해 매개될 수 있다. 또한, 밀레 등은 TGF-β가 Smad3의 C-말단 잔기의 2 사이트에 더하여 Smad3 링커 영역 내 3 사이트에 인산화를 유도함을 보였다. GSK-3는 이들 사이트 중의 하나인 Ser-204에 인산화를 일으킨다. 비록 Smad3(Ser-204) 인산화를 분석하지는 않았지만, 본 발명의 실험 결과는 리튬-처리 세포 내 S423/425에의 Smad3 인산화 감소를 나타내었다. 즉, TGF-β에 대한 세포 반응뿐만 아니라 TGFBI 발현의 최종 크기를 조절하는 Smad3 신호전달의 신규한 국면을 보여준다.

비록 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내 TβR 발현의 증가를 일으키는 특정 메카니즘은 알려지지 않았지만, 본 발명자들의 종전 연구는 정상형과 비교하여 이형접합자 및 동형접합자 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내 TβRI, TβRII, 및 TβRIII가 상향 조절되었음을 나타내었다.⁴³

이러한 결과들은 TGFBIp 발현의 증가가 다양한 생리학적 조건 하 수용체의 상향조절로 인해 정상 각막 섬유 모세포보다 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내에서 더 클 수 있음을 제안한다. 이러한 증가는 TGFBIp 축적을 가속화하여 제2형 과립형 각막이상증 질병을 야기할 수 있다. 반면 리튬은 TGFBIp 발현을 정상 각막 섬유 모세포보다 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내에서 더 크게 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 리튬 치료가 제2형 과립형 각막이상증 질병에서 변이형 TGFBIp 축적을 감소시키는 장점이 있음을 제안한다.

프로테아좀 및 오토파지/리소좀 경로는 사이토졸 단백질을 정화하는 주된 경로이다. 좁은 프로테아좀 장벽은 뭉치기 쉬운 세포 내 단백질의 올리고머/집괴의 진입을 막으며, 그 동안 상기와 같은 기질들은 오토파지에 의해 분해될 수 있다. 본 발명자들은 종전 연구에서 TGFBIp가 리소좀/오토파지 분해 경로에 의해 분해되며 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내에서는 그 분해가 지연됨을 밝힌 바 있다. 또한 오토파지 유도제인 라파마이신은 사이토졸 내 변이형 TGFBIp 레벨을 감소시켜고 제2형 과립형 각막이상증 동형접합자 각막 섬유 모세포 내 변이형 TGFBIp의 독성을 감소시켰다. 게다가 이러한 결과들은 정상 단백질과는 달리 뭉치기 쉬운 변이형 TGFBIp가 오토파지 정화에 매우 강하게 의존함을 보였다. 또한, 본 발명자들은 제2형 과립형 각막이상증 각막 섬유 모세포 내 리소좀 또는 오토리소좀 안의 변이형 TGFBIp는 오토파지 결함 때문에 축적된다는 사실을 알아내었다(Choi et al., 논문 심사 중, 미공개). 그러므로, 이러한 결과들은 오토파지 유도제들 또한 TGFBI-관련 각막이상증의 치료 약물로서 장래에 사용될 수 있음을 나타낸다.

오토파지 경로는 IP3 레벨에 의해 강하게 조절되는데 이는 내인성 오토파지 억제제로서 작용한다. 반면에, 리튬은 IP3 활성을 차단함으로서 오토파지를 촉진한다.^{39, 44-45} 본 발명의 연구에서 본 발명자들은 리튬이 각막 섬유 모세포 내 오토파지를 유도함을 발견하였다. 비록 리튬에 의해 오토파지가 활성화 된 후에 감소된 TGFBIp 레벨을 측정하지는 않았지만 상기 결과들은 리튬의 TGFBI-관련 각막이상증에 대한 치료적 장점을 제안한다. 사실 리튬은 심지어 매우 고 농도(100 mM)에서도 각막 섬유 모세포의 심각한 사멸을 유도하지 않았으므로 리튬이 제2형 과립형 각막이상증 치료를 위한 치료제로서 사용될 가능성은 매우 높다.

또한 종전 연구들은 리튬의 산화적 스트레스에 대항하는 세포 보호적 효능이 사이토크롬 c의 분비 및 카스파제(caspase)-3 활성화에 의존적임을 보였다.⁴⁶ 종전 연구에서, 본 발명자들은 산화적 스트레스가 제2형 과립형 각막이상증의 발병과 관련 있음을 입증한 바 있다.³⁶ GSK-3β 활성 및 산화적 스트레스 사이의 관계는 잘 알려져 있다.⁴⁷ 산화적 스트레스는 퇴화를 촉진하여 궁극적으로는 DNA 절편화, 지질 과산화 및 카스파제(caspase) 및 GSK-3β와 관련된 미토콘드리아 호-아폽토시스성 경로의 유도에 따른 세포 사멸을 야기할 수 있다.⁴⁸ 또한, 과산화수소-유도성 산화적 스트레스에 대한 세포 저항에 내재되어 있는 분자 메카니즘을 이해하기 위한 노력은 감소된 GSK-3β 활성이 세포 생존에 필수적일 수 있다. GSK-3β 억제제로서의 리튬으로 세포에 처리하면 과산화수소-유도성 산화적 스트레스에 대한 저항성이 증가되었다.⁴⁹ 흥미롭게도, GSK-3β의 억제가 내재적 산화 스트레스로부터 세포를 특이적으로 보호함을 보여주는 증거가 존재한다.⁵⁰ 즉, GSK-3β은 PI3K- 및 Akt-매개 세포 생존 경로에 있어 중요한 역할을 한다. 리튬은 p53, Bax 및 카스파제와 같은 다양한 아폽토시스성 단백질의 발현을 감소시키며 또한 Bcl-2 레벨을 증가시켜서 항-아폽토시스 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.^{23, 51, 52} 그러므로 본 발명자는 또한 TGFBI-관련 각막이상증의 리튬 치료가 다기능적인 장점을 가질 수 있음을 제안한다. 종합하면 리튬 치료제는 다양한 질병들의 TGF-β 신호전달, 오토파지 및 산화적 스트레스를 조절하는 데 효과적일 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA Cell Biol 1992;11:511-522.

2. Zhao Y, Shao G, Piao CQ, Berenguer J, Hei TK. Down-regulation of Betaig-h3 gene is involved in the tumorigenesis in human bronchial epithelial cells induced by heavy-ion radiation. Radiat Res 2004;162:655-659.

3. Zhao YL, Piao CQ, Hei TK. Downregulation of Betaig-h3 gene is causally linked to tumorigenic phenotype in asbestos treated immortalized human bronchial epithelial cells. Oncogene 2002;21:7471-7477.

4. Zhang Y, Wen G, Shao G, et al. TGFBI deficiency predisposes mice to spontaneous tumor development. Cancer Res 2009;69:37-44.

5. LeBaron RG, Bezverkov KI, Zimber MP, Pavelec R, Skonier J, Purchio AF. Beta IG-H3, a novel secretory protein inducible by transforming growth factor-beta, is present in normal skin and promotes the adhesion and spreading of dermal fibroblasts in vitro. J Invest Dermatol 1995;104:844-849.

6. Billings PC, Herrick DJ, Kucich U, et al. Extracellular matrix and nuclear localization of beta ig-h3 in human bladder smooth muscle and fibroblast cells. J Cell Biochem 2000;79:261-273.

7. Kim JE, Jeong HW, Nam JO, et al. Identification of motifs in the fasciclin domains of the transforming growth factor-beta-induced matrix protein betaig-h3 that interact with the alphavbeta5 integrin. J Biol Chem 2002;277:46159-46165.

8. Klintworth GK. Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies. Am J Ophthalmol 1999;128:747-754.

9. Korvatska E, Henry H, Mashima Y, et al. Amyloid and non-amyloid forms of 5q31-linked corneal dystrophy resulting from kerato-epithelin mutations at Arg-124 are associated with abnormal turnover of the protein. J Biol Chem 2000;275:11465-11469.

10. Moon JW, Kim SW, Kim TI, Cristol SM, Chung ES, Kim EK. Homozygous granular corneal dystrophy type II (Avellino corneal dystrophy): natural history and progression after treatment. Cornea 2007;26:1095-1100.

11. Woodgett JR. Judging a protein by more than its name: GSK-3. Sci STKE 2001;2001:re12.

12. Cadigan KM, Nusse R. Wnt signaling: a common theme in animal development. Genes Dev 1997;11:3286-3305.

13. Wodarz A, Nusse R. Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu Rev Cell Dev Biol 1998;14:59-88.

14. Frame S, Cohen P. GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery. Biochem J 2001;359:1-16.

15. Grimes CA, Jope RS. The multifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling. Prog Neurobiol 2001;65:391-426.

16. Hedgepeth CM, Conrad LJ, Zhang J, Huang HC, Lee VM, Klein PS. Activation of the Wnt signaling pathway: a molecular mechanism for lithium action. Dev Biol 1997;185:82-91.

17. Phiel CJ, Klein PS. Molecular targets of lithium action. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001;41:789-813.

18. Stambolic V, Ruel L, Woodgett JR. Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 activity and mimics wingless signalling in intact cells. Curr Biol 1996;6:1664-1668.

19. Klein PS, Melton DA. A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:8455-8459.

20. Fukumoto T, Morinobu S, Okamoto Y, Kagaya A, Yamawaki S. Chronic lithium treatment increases the expression of brain-derived neurotrophic factor in the rat brain. Psychopharmacology ( Berl ) 2001;158:100-106.

21. Gould TD, Manji HK. The Wnt signaling pathway in bipolar disorder. Neuroscientist 2002;8:497-511.

22. Doble BW, Woodgett JR. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J Cell Sci 2003;116:1175-1186.

23. Chalecka-Franaszek E, Chuang DM. Lithium activates the serine/threonine kinase Akt-1 and suppresses glutamate-induced inhibition of Akt-1 activity in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:8745-8750.

24. De Sarno P, Li X, Jope RS. Regulation of Akt and glycogen synthase kinase-3 beta phosphorylation by sodium valproate and lithium. Neuropharmacology 2002;43:1158-1164.

25. Zhang F, Phiel CJ, Spece L, Gurvich N, Klein PS. Inhibitory phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) in response to lithium. Evidence for autoregulation of GSK-3. J Biol Chem 2003;278:33067-33077.

26. Rowe MK, Wiest C, Chuang DM. GSK-3 is a viable potential target for therapeutic intervention in bipolar disorder. Neurosci Biobehav Rev 2007;31:920-931.

27. Gould TD, Quiroz JA, Singh J, Zarate CA, Manji HK. Emerging experimental therapeutics for bipolar disorder: insights from the molecular and cellular actions of current mood stabilizers. Mol Psychiatry 2004;9:734-755.

28. Jope RS. Anti-bipolar therapy: mechanism of action of lithium. Mol Psychiatry 1999;4:117-128.

29. Kirshenboim N, Plotkin B, Shlomo SB, Kaidanovich-Beilin O, Eldar-Finkelman H. Lithium-mediated phosphorylation of glycogen synthase kinase-3beta involves PI3 kinase-dependent activation of protein kinase C-alpha. J Mol Neurosci 2004;24:237-245.

30. Liang MH, Chuang DM. Regulation and function of glycogen synthase kinase-3 isoforms in neuronal survival. J Biol Chem 2007;282:3904-3917.

31. Liang MH, Chuang DM. Differential roles of glycogen synthase kinase-3 isoforms in the regulation of transcriptional activation. J Biol Chem 2006;281:30479-30484.

32. Derynck R, Zhang YE. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature 2003;425:577-584.

33. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 2003;113:685-700.

34. Sanyal S, Kim SM, Ramaswami M. Retrograde regulation in the CNS; neuron-specific interpretations of TGF-beta signaling. Neuron 2004;41:845-848.

35. Gomes FC, Sousa Vde O, Romao L. Emerging roles for TGF-beta1 in nervous system development. Int J Dev Neurosci 2005;23:413-424.

36. Choi SI, Kim TI, Kim KS, et al. Decreased catalase expression and increased susceptibility to oxidative stress in primary cultured corneal fibroblasts from patients with granular corneal dystrophy type II. Am J Pathol 2009;175:248-261.

37. Jester JV, Huang J, Fisher S, et al. Myofibroblast differentiation of normal human keratocytes and hTERT, extended-life human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44:1850-1858.

38. Guo X, Ramirez A, Waddell DS, Li Z, Liu X, Wang XF. Axin and GSK3- control Smad3 protein stability and modulate TGF- signaling. Genes Dev 2008;22:106-120.

39. Sarkar S, Floto RA, Berger Z, et al. Lithium induces autophagy by inhibiting inositol monophosphatase. J Cell Biol 2005;170:1101-1111.

40. Jope RS. Lithium and GSK-3: one inhibitor, two inhibitory actions, multiple outcomes. Trends Pharmacol Sci 2003;24:441-443.

41. Ryves WJ, Harwood AJ. Lithium inhibits glycogen synthase kinase-3 by competition for magnesium. Biochem Biophys Res Commun 2001;280:720-725.

42. Millet C, Yamashita M, Heller M, Yu LR, Veenstra TD, Zhang YE. A negative feedback control of transforming growth factor-beta signaling by glycogen synthase kinase 3-mediated Smad3 linker phosphorylation at Ser-204. J Biol Chem 2009;284:19808-19816.

43. Choi SI, Yoo YM, Kim BY, et al. Involvement of TGF-{beta} receptor- and integrin-mediated signaling pathways in the pathogenesis of granular corneal dystrophy II. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:1832-1847.

44. Sarkar S, Krishna G, Imarisio S, Saiki S, O'Kane CJ, Rubinsztein DC. A rational mechanism for combination treatment of Huntington's disease using lithium and rapamycin. Hum Mol Genet 2008;17:170-178.

45. Sarkar S, Rubinsztein DC. Inositol and IP3 levels regulate autophagy: biology and therapeutic speculations. Autophagy 2006;2:132-134.

46. Lai JS, Zhao C, Warsh JJ, Li PP. Cytoprotection by lithium and valproate varies between cell types and cellular stresses. Eur J Pharmacol 2006;539:18-26.

47. Bowerman B. Cell biology. Oxidative stress and cancer: a beta-catenin convergence. Science 2005;308:1119-1120.

48. Maiese K, Chong ZZ. Insights into oxidative stress and potential novel therapeutic targets for Alzheimer disease. Restor Neurol Neurosci 2004;22:87-104.

49. Schafer M, Goodenough S, Moosmann B, Behl C. Inhibition of glycogen synthase kinase 3 beta is involved in the resistance to oxidative stress in neuronal HT22 cells. Brain Res 2004;1005:84-89.

50. King TD, Jope RS. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 protects cells from intrinsic but not extrinsic oxidative stress. Neuroreport 2005;16:597-601.

51. Chen RW, Chuang DM. Long term lithium treatment suppresses p53 and Bax expression but increases Bcl-2 expression. A prominent role in neuroprotection against excitotoxicity. J Biol Chem 1999;274:6039-6042.

52. Rowe MK, Chuang DM. Lithium neuroprotection: molecular mechanisms and clinical implications. Expert Rev Mol Med 2004;6:1-18.

Claims (10)

1. 리튬(lithium)을 포함하며, 오토파지 경로를 이용하여 각막에 축적된 변이 TGFBI 단백질을 제거하는 TGFBI(TGF beta induced) 유전자 변이 각막이상증(corneal dystrophy)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 리튬은 리튬이온, 약제학적으로 허용가능한 리튬염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물의 형태로 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 리튬염은 리튬 카보네이트(Li₂CO₃), 리튬 시트레이트(lithium citrate), 리튬 설페이트(Li₂SO₄), 리튬 아스파테이트(lithium aspartate), 리튬 오로테이트(lithium orotate), 염화리튬(LiCl) 및 리튬 아세테이트(lithium acetate)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 아벨리노(Avellino type) 각막이상증, 라이스-뷔클러(Reis-Bucklers type) 각막이상증, 격자(lattice type) 각막이상증, 과립(granular type) 각막이상증, 티엘-벵케(Thiel-Behnke type) 각막이상증, 상피기저막(epithelial basement membrane) 각막이상증 및 그로에노우브(Groenouw type) 각막이상증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 TGFBI 단백질은 정상 TGFBI 단백질과 비교하여 R124H, R124C, R555W, R555Q, I522N, N544S, M619K, F547S, A546D, V625D, G623D, V505D, P551Q, L558P, V624M, H626P, L173P, H572R, T538P, H572del, L527R, L569R, H626R, R124L, T125del, E126del 및 R124S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변이가 일어난 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 변이형 TGFBI 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 각막세포의 산화적 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
10. 삭제

Images