KR102422238B1 - TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물 - Google Patents

TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102422238B1
KR102422238B1 KR1020200051069A KR20200051069A KR102422238B1 KR 102422238 B1 KR102422238 B1 KR 102422238B1 KR 1020200051069 A KR1020200051069 A KR 1020200051069A KR 20200051069 A KR20200051069 A KR 20200051069A KR 102422238 B1 KR102422238 B1 KR 102422238B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tgfbip
cov
sars
acetylation
level
Prior art date
Application number
KR1020200051069A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210132535A (ko
Inventor
배종섭
이원화
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020200051069A priority Critical patent/KR102422238B1/ko
Publication of KR20210132535A publication Critical patent/KR20210132535A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102422238B1 publication Critical patent/KR102422238B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/10—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material acylation, e.g. acetylation, formylation, lipoylation, myristoylation, palmitoylation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 SARS-CoV-2 감염증을 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 감염증의 중증도를 진단할 수 있어 SARS-CoV-2 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물{Composition for diagnosing SARS-CoV-2 comprising agents detecting the level of acetylation of transforming growth factor β-induced protein}
본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 SARS-CoV-2 감염증 진단용 조성물에 관한 것이다.
2020년 1월, COVID-19 원인으로 확인된 SARS-CoV-2는 전세계로 확산되었으며 최근 세계 보건기구 (WHO)에 의해 전염병으로 선언되었다. 새로운 코로나 바이러스는 전염성이 높고 병원성인 것으로 보고되어 감염된 환자에게 심각한 폐렴 증상을 유발한다. 이 바이러스는 특히 노인 및/또는 심혈관 질환, 당뇨병, 만성 호흡기 질환 및 암과 같은 근본적인 질병을 가진 사람들에게 심각한 위협이 될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
추정치에 의하면, SARS-CoV-2 폐렴은 10% 미만의 사례 사망률 (CFR)을 나타내며, 이는 다른 두 종류의 인간 관련 인간 코로나 바이러스 (CoV), 즉 SARS-CoV (severe acute respiratory syndrome coronavirus) 및 MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus)의 CFR인 10% 및 34.4% 보다는 치명적이지 않다는 것을 의미한다. 이러한 CoV는 혼란과 경제 재앙을 야기했지만 최근의 확산은 특히 속도와 확산 범위 측면에서 매우 다르게 진행되었다. SARS-CoV-2는 기존에 유행했던 상기 두 종류의 CoV보다 치명적이지는 않지만 훨씬 더 널리 퍼져 있다. SARS-CoV-2 폐렴의 또 다른 중요한 차이점은 잠복기가 14일로서 길다는 것이다.
잠복기 기간이 길어지면 무증상 사람들이 SARS-CoV-2를 지역 사회에 널리 퍼뜨릴 가능성이 높아지므로 더욱 문제가 될 수 있다. 이러한 시나리오에서 취약한 사람들은 치명적인 바이러스에 노출될 위험이 더 높다. 따라서 SARS-CoV-2의 진단은 대유행 질병의 광범위한 통제에서 가장 중요하다. SARS-CoV-2는 혈관의 분해와 함께 생명을 위협하는 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다(Mehta, P. et al. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet (2020)). 분해된 혈관은 다른 장기의 손상을 유발하기 때문에 심각한 장기 손상 전에 SARS-CoV-2 감염을 진단하는 것이 매우 중요하다. 이와 관련하여, SARS-CoV-2 감염의 신뢰성 있고 정확한 진단을 위한 바이오 마커의 확인은 COVID-19 발병의 성공적인 봉쇄의 열쇠이다.
SARS-CoV-2는 ORF1ab(replicase complex), 스파이크 (S), 인벨로프 (E), 막 (M) 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질을 포함하는 바이러스 구조 어셈블리 및 바이러스 복제를 위한 5 가지 주요 단백질 영역을 가지고 있다. SARS-CoV-2 진단용 시판 키트는 RT-PCR 기반 방법을 사용하여 감염 탐지를 위한 바이오 마커로서 이들 유전자의 조합을 검출한다. 양성 결과의 결정은 키트에 따라 달라지며, 일부는 RNA 의존성 RNA 폴리머라제 (RdRp) 및 E 유전자를 탐지하는 반면, 다른 일부는 RdRp, E 및 N 유전자를 검출한다. 결과의 정확성을 위해 관련된 모든 표적 유전자를 감지하는 것이 바람직하다. 그러나, 이는 노동 집약적이고 비용 효과적이지 않기 때문에 진단을 위해 2 내지 3 개의 유전자 만이 선택된다.
또한 검출 및 검출 기준을 결정하는 유전자가 국가마다 다른 논란이 있다. 미국의 CDC는 N 유전자 (N1, N2, N3)의 검출을 권장하고, 한국은 RdRp 유전자 및 E 유전자의 검출을 권장한다. 또 다른 문제는 유전자 검출을 위한 진단 정확도 문제이다. 최근에 WHO가 추천한 RdRp 유전자는 N 유전자보다 덜 민감했다. 유전자의 검출에 의존하는 이들 분석 키트는 종종 잘못된 음성 결과를 나타내며, 낮은 예측성을 나타낸다. 기존 검사의 다른 단점은 환자의 질병 중증도를 나타내지 않는다는 것이다.
따라서, 특히 긴급한 진단 치료가 필요한 임박한 위험이 있는 환자의 경우, 질병의 심각성을 정확하게 식별할 수 있는 신뢰성 있는 바이오 마커를 식별하는 것이 중요하다.
이에, 본 발명자는 감염 의심환자의 혈액을 이용하여 신속하고 정확하게 SARS-CoV-2 감염증을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 예의 연구를 거듭한 결과, SARS-CoV-2 감염증 환자에서 정상인과 비교해 TGFBIp의 아세틸화가 증가되어 있고, TGFBIp의 아세틸화 수준은 감염증의 중증도와도 밀접하게 관련이 되어 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 중증도 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 높을수록 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달서하기 위하여, 본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 높을수록 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 TGFBIp는 TGF-β가 분비하는 다양한 타입의 단백질 중 하나로, 섬유아세포, 연골세포, 평활근세포 및 각막 상피세포 등에서 분비되는 단백질이다. TGFBI는 연결자(linker) 단백질로서 기능하며, 형태발생, 세포 증식, 부착, 이동(migration), 분화 및 염증 과정에서 중요한 역할을 한다.
본 발명에서 상기 중증급성호흡기증후군 바이러스 2는 cofonaviridae에 속하는 RNA 바이러스로서, SARS-CoV-2, COVID-19, 코비드-19, 코로나-19, 2019-nCoV, 2019 신종 코로나바이러스, coronavirus disease 2019 등으로 불리고 있다. 본 발명에서 상기 SARS-CoV-2는 감염 과정에서 다양한 돌연변이를 일으켜 변종이 발생할 수 있으며, 이들 변종 또한 본 발명의 상기 SARS-CoV-2에 모두 포함이 된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, SARS-CoV-2 감염증 환자의 혈액에서 TGFBIp의 아세틸화가 증가되어 있는 것으로 확인이 되었으며, 질환의 중증도에 따라 TGFBIp의 아세틸화 정도가 더 높은 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩타이드(polypeptide)", "펩타이드(peptide)" 및 "단백질"은 상호 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
본 발명의 일 양태에서, 상기 아세틸화는 TGFBIp에서 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 TGFBIp는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQHGPNVCAVQKVIGTNRK
YFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALPLSNLYETLGVVGSTTTQL
YTDRTEKLRPEMEGPGSFTIFAPSNEAWASLPAEVLDSLVSNVNIELLNALRYHMVGRRV
LTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIVTVNCARLLKADHHATNGVVHLIDKVISTIT
NNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYTLLAPTNEAFEKIPSETLNRILGDP
EALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTTLEVGCSGDMLTINGKAIISNKDILAT
NGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAIDLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVF
KDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLYHGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIA
AHDKRGRYGTLFTMDRVLTPPMGTVMDVLKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVF
APTNEAFRALPPRERSRLLGDAKELANILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVS
LKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGVVHVITNVLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAF
SRASQRSVRLAPVYQLLERMKH
본 발명의 일 양태에서, 상기 아세틸화를 수준을 측정하는 제제는 아세틸화 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머일 수 있다.
상기 항체는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 상기 항체는 아세틸화된 TGFBIp 이외에는 비아세틸화 TGFBIp 및 다른 단백질에는 결합하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에서의 상기 항체는 TGFBIp에서 676번째 아미노산인 라이신(K676) 이외에 다른 위치에서의 아미노산이 아세틸화된 COX2에는 결합하지 않는 항체일 수 있다.
상기 항체는 676번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 TGFBIp의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.
또는, 676번째 아미노산인 라이신이 아세틸화된 TGFBIp의 에피토프(epitope) 부위를 포함하는 단백질의 단편을 이용하여 아세틸화된 TGFBIp 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 아세틸화된 TGFBIp에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉, 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
가장 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 TGFBIp 단백질에서 676번째 아미노산인 라이신(K676)의 아세틸화를 포함하는 펩타이드 단편으로서, 본 발명의 항체는 상기 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 즉 서열번호 1로 표시되는 TGFBIp 단백질의 669 내지 682번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 676번째 아미노산인 라이신(K676)이 아세틸화 되어 있는 펩타이드를 에피토프(epitope)로 인식하는 항체를 제작하여 그 유용성을 검증하였다.
본 발명에서 상기 “압타머(aptamer)”는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다. 본 발명에서 상기 압타머는 아세틸화된 TGFBIp에 결합할 수 있는 것이라면 그 종류 및 형태가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 조성물은 TGFBIp의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 TGFBIp의 발현 수준이란 TGFBIp 단백질 또는 TGFBIp 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.
구체예에서, 상기 TGFBIp 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 당업계에 단백질의 발현수준 측정에 사용가능한 것으로 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 TGFBIp 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명에서 상기 TGFBIp 코딩 유전자의 발현 수준을 측정한다는 의미는 상기 TGFBIp 유전자로부터 파생되는 전사물들의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 의미이고, 일례로 TGFBIp mRNA 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.
따라서 TGFBIp 코딩 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 유전자로부터 발현된 mRNA를 검출하는 제제를 의미하는 것일 수 있다. 따라서 TGFBIp 코딩 유전자를 검출하는 제제는, 상기 유전자로부터 발현된 mRNA에 특이적으로 부착 또는 혼성화(hybridization)하는 리간드라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 프라이머(쌍) 또는 프로브 일 수 있다.
상기 “프라이머”는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 TGFBIp mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 TGFBIp 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 TGFBIp mRNA 또는 TGFBIp cDNA의 특정 구간을 증폭하여 TGFBIp mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 TGFBIp mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 TGFBIp mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
“프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 TGFBIp mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 TGFBIp mRNA의 발현양을 측정함으로써 혈관성 치매의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 TGFBIp mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 조성물을 이용하여 TGFBIp의 아세틸화 수준과 TGFBIp의 발현 수준을 동시에 측정한 후, TGFBIp의 아세틸화 수준/TGFBIp의 발현 수준의 비율을 산출함으로써 SARS-CoV-2 감염증을 보다 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명은 또한 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 중증도 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 제공받은 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상인과 비교해 현저히 증가되어 있는 것으로 확인되었을 뿐 아니라, 감염증의 중증도에 따라 TGFBIp의 아세틸화 수준이 구분이 될 수 있는 것으로 확인되었다.
즉, SARS-CoV-2 감염증 환자 중에서 경증 환자보다 집중치료실(ICU)에서의 치료가 요구되는 중증 환자에서 TGFBIp의 아세틸화 수준이 더 높게 나타났으며, 집중치료실(ICU)에서의 치료가 요구되는 중증 환자보다 사망한 환자에게서 TGFBIp의 아세틸화 수준이 더 높은 것으로 확인이 되었다. 또한, SARS-CoV-2에 감염되어 병원 입원 치료를 받은 후 완치판정을 받아 퇴원한 환자에게서 감염중일 때보다 TGFBIp의 아세틸화 수준이 더 낮은 것으로 확인되었다.
따라서, 대상으로부터 제공받은 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 검출함으로써 SARS-CoV-2 감염 여부(즉, 감염자인지 비감염자인지)를 구분할 수 있을 뿐 아니라, 대상의 현재 감염 상태가 경증인지 중증인지 여부까지 구분할 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하여 경증으로 판정된 감염 환자는 통상적인 자가격리 또는 내원치료를 진행하면서 질환의 진행 상태를 지속적으로 모니터링하는 치료전략을 수립할 수 있으며, 중증으로 판정된 감염 환자는 집중치료실(ICU)에 격리되어 적극적인 치료를 진행하는 것으로 치료전략을 수립할 수 있다.
본 발명은 또한 TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에는 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 아세틸화된 TGFBIp를 마커로 인식하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역형광염색, ELISA 등을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 이들 키트는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 아세틸화된 TGFBIp 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 이들 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
마찬가지로, 본 발명이 제공하는 상기 키트에도 TGFBIp의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 아세틸화된 TGFBIp가 SARS-CoV-2 감염증의 진단 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하였고, 이에 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하여 SARS-CoV-2 감염증의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계에서 생물학적 시료란 전혈, 혈장, 혈구, 혈청, 혈관 내피세포, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (a) 단계에서 TGFBIp의 아세틸화 정도를 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 TGFBIp의 아세틸화 정도를, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 TGFBIp 아세틸화 수준과 비교한다. TGFBIp의 아세틸화 수준이 건강한 정상인에 비하여 감소한 피검체는 SARS-CoV-2 감염증에 걸린 것으로 판정할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 TGFBIp의 아세틸화 수준은 (아세틸화 TGFBIp의 발현 수준/전체 TGFBIp의 발현 수준)으로 정량화하여 비교할 수도 있다.
구체적으로, 상기 (a) 단계에서 TGFBIp의 발현 수준을 추가로 측정한 후 아세틸화된 TGFBIp/TGFBIp의 비율을 산출하고, 상기 (b) 단계에서 아세틸화된 TGFBIp/TGFBIp의 비율이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 TGFBIp의 발현 수준이란 TGFBIp 단백질의 발현 수준 또는 TGFBIp를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 포함하며, 이에 대한 상세한 설명은 전술한 바를 참고할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 TGFBIp의 아세틸화 수준이 높을수록 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
즉, 상기 방법에 따라 피검체의 TGFBIp의 아세틸화 정도를 분석한 결과, 아세틸화 정도가 높을수록 질환의 중증도가 심한 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 방법에 따라 (아세틸화 TGFBIp의 발현 수준/전체 TGFBIp의 발현 수준)의 비율을 분석하여 그 정도가 높을수록 질환의 중증도가 심한 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 SARS-CoV-2 감염증을 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 감염증의 중증도를 진단할 수 있어 SARS-CoV-2 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1c를 포함하는 도 1은 SARS-CoV-2 감염증 환자 및 정상인에서 질환의 중증도에 따라 TGFBIp의 발현 수준(1a), 아세틸화된 K676을 포함하는 TGFBIp의 발현 수준 (1b) 및 TGFBIp K676Ac/TGFBIp의 비율(1c)을 분석한 결과이다(Normal: 정상대조군, SARS-CoV2 Non-ICU: 일반 감염증, SARS-CoV-2 ICU 중증 감염증 환자, Discharghed: 감염 후 퇴원환자).
도 2는 TGFBIp K676Ac/TGFBIp의 비율을 SARS-CoV-2 감염증 환자의 혈액에서 분석하여 나타낸 결과이다.
도 3a 내지 3c를 포함하는 도 3은 SARS-CoV-2 감염증의 중증도에 따라 Lactate dehydrogenase의 발현 수준(3a), C-reactive protein (3b) 및 procalcitonin (3c)의 발현 수준을 ELISA로 분석한 결과이다(SARS-CoV2 Non-ICU: 일반 감염증, SARS-CoV-2 ICU 중증 감염증 환자).
도 4는 SARS-CoV-2 감염증 환자의 혈장에서 사이토카인의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 SARS-CoV-2 감염증 환자로부터 분리한 PBMC에서 TGFBIp 단백질과 아세틸화된 K676 TGFBIp의 발현 수준을 면역형광염색으로 확인한 결과이다(Normal: 정상군, SARS-CoV2 ICU: 중증 감염 환자, Discharged: 감염 후 퇴원한 환자).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. 환자 및 정상인의 혈청 샘플
환자들은 대구의 공중 보건소에서 SARS-CoV-2 감염이 확인된 후 영남 대학교 병원 내과에 입원했다. SARS-CoV-2 ICU는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 또는 패혈증으로 진행되어 ICU (intensive care unit)에서 호흡 집중 치료를 받은 중증 환자 그룹이다. 건강한 자원자를 대조군으로 사용하였고 모든 환자의 임상 데이터를 수집하였다. 전혈 수집 후 48 시간 내에 2000 xg에서 5분 동안 원심 분리하여 혈장 샘플을 생성하였다. 연구 프로토콜 (YNUM 2020-03-057)은 한국 대구 영남 대학교 병원 임상 시험 심사위원회의 승인을 받았다.
본 연구에 활용된 환자의 임상정보는 아래 표 1과 같다:
[표 1]
Figure 112020043437063-pat00001
Figure 112020043437063-pat00002
2. K676 아세틸화(K676Ac)된 TGFBIp에 특이적인 항체의 제작
합성한 C-RLAPVYQK(Ac)LLERMK또는 C-RLAPVYQLLERMK 서열의 펩타이드를 항원으로 사용하였다. 항원을 토끼(New Zealand white)에 주사하기 전에 pre-immune serum을 채취하여 negative control로 사용했다. Primary immunization은 항원을 complete Freund's adjuvant(Sigma)와 혼합하여 복강(IP)주사하고 4주 후 incomplete Freund's adjuvant와 혼합한 항원으로 1차 boosting을 진행했다. 1주 후 1차 blood를 채취하여 ELISA test를 진행하고, 매주마다 boosting과 bleeding을 번갈아 진행했다. 3차 boosting 후 rabbit 심장으로부터 채혈하고 final serum을 분리하여 ELISA test로 항체를 확인했다. 항체의 분리 정제는 Affi-gel에 conjugation 하여 분비한 Column에 항체를 binding 시킨 후 PBS로 washing했다. pH 3.0 인 0.1M glycine buffer 로 항체를 elution한 뒤 pH 8.8 Tris buffer 로 중성화 하고, 정제된 항체를 알맞은 농도로 농축 및 투석했다.
3. TGIBIp/TGFBIp K676Ac에 대한 ELISA
정상 또는 SARS-CoV-2 환자 혈장에서의 TGFBIp/TGFBIp K676Ac 농도는 상기 제조된 항체를 이용하여 종래 공지된 바에 따라 경쟁 ELISA 방법에 의해 결정되었다.
4. 실험실 연구
PCT는 효소-결합 형광 면역 분석법(독일 베를린 소재의 B.R.A.H.M.S. Diagnostica)으로 측정하였다. 테스트에는 20 분, 200 μl의 혈청이 필요했다. CRP (C-reactive protein) 및 LDH (lactate dehydrogenase)는 로슈/히타치 모듈식 DP 화학 분석기를 사용하여 측정하였다. 혈액 세포수는 Sysmex XE-2100 자동 혈액학 시스템을 사용하여 수행되었다.
5. 단백질 프로파일링
정상 또는 SARS-CoV-2 환자의 혈장 풀을 인간 XL 사이토카인 어레이 키트 (R&D Systems)에 지시된 바와 같이 처리하였다. 현상된 필름을 스캔하고, 얻어진 이미지를 ImageJ 버전 1.43을 사용하여 분석하였다.
6. IL-1beta, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-gamma 및 TNF-alpha에 대한 ELISA
SARS-CoV-2 환자의 혈장 내 사이토카인의 농도는 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 정량화되었다. ELISA 플레이트 리더 (Tecan, Austria GmbH, Austria)를 사용하여 값을 측정하였다.
Human IL-1betaQuantikine ELISA Kit (DLB50, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Human IL-4 Quantikine ELISA Kit (D4050, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Human IL-6 Quantikine ELISA Kit (D6050, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) Human IL-10 Quantikine ELISA Kit (D1000B, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit (DIF50, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), and Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit (DTA00D, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)
7. PBMC의 분리 및 배양
건강한 정상인, SARS-CoV-2 폐렴 환자 또는 퇴원 환자의 샘플은 영남 대학교 의료 센터에서 입수했다. 실험은 관련 지역 기관 검토위원회 및 윤리위원회 가이드를 준수했다.
헤파린 처리된 혈액 샘플을 4시간 이내에 신선한 상태로 사용하였고, 제조업체의 권고에 따라 Ficoll-Hypaquek 또는 NycoPrepk를 사용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 혈액에서 분리했다. 이어서, 보다 정제된 PBMC를 MACSprep ™ PBMC 분리 키트를 통해 수득하고 1 mM 피루브산나트륨, 2 mM L-글루타민, 4.5 mg/L 글루코오스, 10mM HEPES 및 2 mg/L 중탄산나트륨을 사용하여 RPMI-1640에서 배양하였다.
폴리클로날 토끼 항-TGFBIp 중화 항체는 전술한 바와 같이 수득 및 정제되었다. 사이토카인 분비 억제에 대한 TGFBIp 중화 항체의 효과를 검증하기 위해, SARS-CoV-2 환자로부터 단리된 PBMC 및 TGFBIp 중화 항체 (50 ug/ml)를 6 시간 동안 배양하였다. 상청액을 사이토카인 ELISA의 분석에 사용하였고, 용 해물을 NF-kB 활성 분석에 사용하였다.
8.면역형광염색
TGFBIp/TGFBIp K676Ac 염색의 경우, PBMC를 PBS(v/v) 내 4% 포름 알데히드에 15분 동안 실온에서 고정시켰다. 고정 후, 세포를 4℃에서 밤새 차단 완충액 (PBS 중 5% BSA)에서 차단하였다. 이어서, 세포를 1차 마우스 단일클론 TGFBIp 항체, 항-마우스 알렉사 488 (녹색), 상기 본원발명에서 제작한 1차 토끼 폴리클로날 TGFBIp K676AC 항체 및 항-마우스 알렉사 594 (빨간색)와 함께 인큐베이션 하였다. 그리고 PBMC를 200 배 배율 (Leica microsystem, Germany)로 형광 현미경으로 시각화 하였다.
9. NF-κB 활성 키트
핵 추출물 제조 및 TransAM 분석은 종래 공지된 바에 따라 수행되었다. 개별 NF-κB 서브 유닛의 활성은 ELISA- 기반 NF-κB 패밀리 전사 인자 분석 키트 (43296; Active Motif, Carlsbad, CA, USA)에 의해 검출되었다. 간략하게, 핵 추출물 (2 ㎍)을 96- 웰 플레이트에서 배양하였고, 이를 NF-κB 공통 올리고 뉴클레오티드로 고정시켰다. 포획된 복합체를 특정 NF-κB 1차 항체와 함께 인큐베이션한 다음 HRP-접합된 2차 항체(키트에 포함)로 검출하였다. 마지막으로, 450 nm에서의 광학 밀도 (OD) 값을 Tecan Spark 마이크로 플레이트 리더로 측정하였다.
10. 웨스턴 블로팅 및 면역침강법
건강한 지원자, SARS-CoV-2 환자의 혈장 중 TGFBIp, 아세틸화된 라이신 (K) 및 아세틸화된 K676 TGFBIp는 면역 블롯팅에 의해 검출되었다. SDS-PAGE 후, 각각의 항체로 면역 블롯팅 분석을 수행하였다. 혈장을 항-TGFBIp 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 면역 침전물을 단백질 A/G-S 자기 비드를 사용하여 회수하고, IP 완충액으로 4 회 세척하고, SDS-PAGE의 샘플 완충액에 재현탁시킨 후 10 분 동안 비등시켰다. 이어서 결합된 단백질을 항-아세틸화 된 K 또는 항-아세틸화 된 K676 TGFBIp 항체를 사용한 면역 블롯팅에 의해 분석하였다.
11. TGFBIp, CBP/p300 및 IL-6에 대한 RT(real time)-PCR
TGFBIp 중화 항체 샘플과 함께/없이 PBMCs 배양으로부터 cDNA를 생성하기 위해, 1 ㎍의 총 RNA를 확장 역전사 중합 효소(Roche)를 사용하여 랜덤 6 량체로 역전사시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 Roche Diagnostics GmbH의 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 다음의 LightCycler 조건을 사용하였다: 95 ℃에서 10 분 동안 초기 변성에 이어 95 ℃에서 10 분 동안 변성, 60 ℃에서 5 분 동안 어닐링 및 72 ℃에서 15 분 동안의 신장으로 45 회 사이클. 샘플에서 특이적 mRNA의 양은 상응하는 유전자-특이적 표준 곡선에 따라 측정했다.
Figure 112020043437063-pat00003
12. 통계학적 분석
모든 실험은 3회 이상 독립적으로 수행되었다. 통계적으로 유의미한 차이는 unpaired t 검정을 사용하여 결정되었다. 프리즘 소프트웨어는 통계 분석에 사용되었다. 유의성은 P<0.05로 설정된 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 각 실험에 대한 p- 값은 도면에 나타냈다.
실험결과
1. SARS-CoV-2 유도된 질병에 대한 바이오마커로서 아세틸화된 K676 TGFBIp
SARS-CoV-2 환자의 113 개의 혈액 샘플(비-ICU 환자 샘플 85 개 및 ICU 환자 샘플 10개)로부터 TGFBIp의 수준을 ELISA를 사용하여 측정하였다. 20 명의 건강한 지원자에서 중앙 혈청 TGFBIp 값은 122.72 (77.2-195.65 ng/ml)였다. 비-ICU 환자의 경우 TGFBIp의 수준은 428.65 (109.64-726.14 ng/ml)로 증가했고, ICU 환자 (중증 환자)의 경우에는 757.69 (622.56-977.1 ng/ml)까지 증가했다 (도 1a). 질병으로부터 회복해서 퇴원한 환자(discharged)의 경우 239.48 (128.34-393.09 ng/ml)의 감소된 수준의 TGFBIp를 나타냈다.
TGFBIp, TGFBIp K676Ac (아세틸화된 676 번째 리신)을 분석했을 때, 건강한 지원자에서 11.81 (5.22-23.02 ng/ml), 비-ICU 환자에서 212.1 (22.06-459.89 ng/ml), ICU 환자에서 724.63 (605.47-952.14 ng/ml)로 확인되었으며, 퇴원한 환자의 경우 66.62 (49.99-107.92 ng/ml)로 확인되었다(도 1b). TGFBIp K676Ac 와 총 TGFBIp의 비율로 정의된 아세틸화 비율은 SARS-CoV-2 ICU의 경우 다른 경우보다 유의하게 높았으며 비-ICU의 경우보다 2 배 더 높았다 (도 1c). 사망한 10 명의 환자에서 가장 높은 TGFBIp K676Ac 수준이 관찰되었다 (도 2).
중요하게도, TGFBIp K676Ac는 중증도 및 증상 회복의 정도를 구분하는 임계값에서 명확하게 구별되었다; ICU와 비-ICU 사례 사이의 중증도 결정의 경우 ~532.68 ng/ml, 질병 회복을 결정하는 경우 ~212.10 ng/ml. 이러한 결과는 TGFBIp K676Ac가 SARS-CoV-2-유발 질환을 식별하기 위한 바이오 마커로서 기능할 뿐만 아니라 질환의 중증도를 진단할 수 있음을 의미한다.
폐렴 진단을 위해 LDH, CRP 및 프로칼시토닌(PCT)을 확인했다. LDH와 CRP는 SARS-CoV-2 폐렴 환자의 혈액 시료 중 ICU 환자에서 급격한 증가를 보였으며 PCT에는 유의한 차이가 없었다(도 3a 내지 3c). 비록 LDH와 CRP가 비-ICU와 ICU 환자간에 통계적으로 다른 값을 보였지만, 각각의 경우 분포 범위가 겹쳤으므로 진단을 위한 임계값을 결정할 수 없었다. 결과적으로 폐렴의 통상적인 바이오 마커를 통해서는 SARS-Cov-2 폐렴의 중증도를 결정할 수 없음을 의미한다.
2. SARS-CoV-2 환자와 정상인에서의 혈장 사이토카인 발현의 분석
Lancet 보고서에 따르면 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 패혈증 및 패 혈성 쇼크가 SARS-Cov-2의 주요 사망 원인이다. 그 중 ARDS와 패혈증은 SARS-CoV-2 감염에 대한 일반적인 면역 병리학적 현상이다. SARS-CoV-2 감염에서 ARDS 및 패혈증의 주요 메커니즘 중 하나는 면역세포에 의해 대량의 전-염증성 사이토 카인 및 케모카인의 방출로 인한 치명적인 제어가 불가능한 전신성 염증반응인 사이토카인 폭풍이다.
사이토카인 어레이 분석에 따르면, SARS-CoV-2 환자는 사이토카인 수준의 변화를 나타냈다 (도 4a). 상향 조절된 사이토 카인은 IL-6, IL-8, IL-1β, IFN-γ, IL-4, TNF-α, CCL2, IL-10 등을 포함한다. 하향 조절된 사이토 카인은 ENA-78, EGF, aggrecan, IL-33, CCL-20 등을 포함한다. 특히 SARS-CoV-2 ICU 환자에서 얻은 10 개의 혈장 시료에서 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8 및 IFN-γ의 수준이 유의하게 증가하였다(그림 4b 내지 4g). 이러한 증가된 사이토카인 수준은 모든 환자 샘플에서 일관되었다.
3. SARS-CoV-2 환자의 PBMC에서 TGFBIp K676Ac의 발현 증가
PBMC는 다양한 항-염증성 사이토카인을 분비함으로써 바이러스와 같은 병원체의 침입에 대한 면역 반응을 능동적으로 조절하는 것으로 알려져 있다. 근본적인 질환이 없는 SARS-CoV-2 환자에서 사이토카인 폭풍이 관찰된다는 것을 고려하면, PBMC가 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 영향을 받는 것으로 가정된다. 이와 관련하여, SARS-CoV-2 ICU 환자의 PBMC로부터의 TGFBIp뿐만 아니라 TGFBIp K676Ac의 발현 수준을 면역형광을 통해 확인하였다. TGFBIp K676Ac에 대한 형광 강도는 SARS-CoV2 ICU 환자에서 현저히 증가한 반면에, 퇴원한 환자의 PBMC에서 감소하는 것으로 확인되었다(도 5).
본 발명의 조성물은 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정함으로써 SARS-CoV-2 감염증을 매우 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 TGFBIp의 아세틸화 수준의 분석을 통해 감염증의 중증도를 진단할 수 있어 SARS-CoV-2 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing SARS-CoV-2 comprising agents detecting the level of acetylation of transforming growth factor beta-induced protein <130> NP20-0031 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 682 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transforming growth factor beta induced protein <400> 1 Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu 20 25 30 Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val 35 40 45 Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn 50 55 60 Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly 85 90 95 Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val 100 105 110 Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu 115 120 125 Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser 130 135 140 Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val 145 150 155 160 Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val 165 170 175 Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr 180 185 190 Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly 195 200 205 Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala 210 215 220 Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn 260 265 270 Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile 275 280 285 Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg 290 295 300 Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala 305 310 315 320 Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu 325 330 335 Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile 340 345 350 Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp 355 360 365 Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala 370 375 380 Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu 385 390 395 400 Gly Asn His Leu Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu 405 410 415 Asn Ser Val Phe Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg 420 425 430 Asn Leu Leu Arg Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 435 440 445 Leu Tyr His Gly Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg 450 455 460 Val Phe Val Tyr Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala 465 470 475 480 Ala His Asp Lys Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg 485 490 495 Val Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp 500 505 510 Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr 515 520 525 Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn 530 535 540 Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly 545 550 555 560 Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu 565 570 575 Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu 580 585 590 Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val 595 600 605 Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val 610 615 620 Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln 625 630 635 640 Glu Arg Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Ala Ser Ala Phe Ser Arg Ala Ser Gln Arg Ser Val Arg Leu Ala Pro 660 665 670 Val Tyr Gln Leu Leu Glu Arg Met Lys His 675 680 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope of K676 acetylated TGFBIp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> The X at position 8 is an acetylated lysine <400> 2 Arg Leu Ala Pro Val Tyr Gln Xaa Leu Leu Glu Arg Met Lys 1 5 10

Claims (13)

  1. TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 TGFBIp는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 TGFBIp의 아세틸화된 K676에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 TGFBIp의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 중증도 예측용 조성물.
  8. TGFBIp (transforming growth factor β-induced protein)의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 진단용 키트.
  9. (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함하는,
    SARS-CoV-2 감염증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈구, 혈청, 혈관 내피세포, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 TGFBIp의 발현 수준을 추가로 측정한 후 676번째 아미노산인 라이신(K676)이 아세틸화된 TGFBIp/TGFBIp의 비율을 산출하고, 상기 (b) 단계에서 676번째 아미노산인 라이신(K676)이 아세틸화된 TGFBIp/TGFBIp의 비율이 정상 대조군 시료보다 높을 경우 SARS-CoV-2 감염증으로 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. (a) 중증급성호흡기증후군 바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 TGFBIp의 676번째 아미노산인 라이신(K676)의 아세틸화 수준이 높을수록 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는,
    SARS-CoV-2 감염증 중증도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
KR1020200051069A 2020-04-27 2020-04-27 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물 KR102422238B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200051069A KR102422238B1 (ko) 2020-04-27 2020-04-27 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200051069A KR102422238B1 (ko) 2020-04-27 2020-04-27 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210132535A KR20210132535A (ko) 2021-11-04
KR102422238B1 true KR102422238B1 (ko) 2022-07-18

Family

ID=78521843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200051069A KR102422238B1 (ko) 2020-04-27 2020-04-27 TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102422238B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007535579A (ja) 2004-04-29 2007-12-06 イェール ユニバーシティ 炎症性疾患およびウイルス関連性呼吸器疾患を処置するためのヌクレアーゼ耐性外部ガイド配列

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101258166B1 (ko) * 2010-09-01 2013-04-25 연세대학교 산학협력단 Ｔｇｆｂｉ 유전자 변이 각막 이상증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법
CN109312411A (zh) * 2016-06-07 2019-02-05 斯坦福大学托管董事会 用于诊断细菌和病毒感染的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007535579A (ja) 2004-04-29 2007-12-06 イェール ユニバーシティ 炎症性疾患およびウイルス関連性呼吸器疾患を処置するためのヌクレアーゼ耐性外部ガイド配列

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Amanda L Tatler et al, Proc Am Thorac (2012), vol 9, issue 3, pp 130-136.
Fei Zhou et al, Lancent (online published 2020.03,09.), vol 395, pp 1054-1062.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210132535A (ko) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sheikhzadeh et al. Diagnostic techniques for COVID-19 and new developments
KR101771697B1 (ko) 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
CN108449999B (zh) 使用色酰胺-tRNA合成酶诊断感染病或其并发症的组合物以及检测诊断标记物的方法
KR20140108718A (ko) 가와사키 질환용 바이오마커
US11299768B2 (en) Methods for determining a patient&#39;s susceptibility of contracting a nosocomial infection and for establishing a prognosis of the progression of septic syndrome
Bondet et al. Differential levels of IFNα subtypes in autoimmunity and viral infection
US20230393121A1 (en) A method to monitor virus-specific t cells in biological samples
Aita et al. Salivary proteomic analysis in asymptomatic and symptomatic SARS-CoV-2 infection: Innate immunity, taste perception and FABP5 proteins make the difference
KR102012123B1 (ko) 뎅기 바이러스 및 지카 바이러스의 비구조단백질 1에 동시에 결합 가능한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 이로부터 생성된 항체, 이의 용도
KR102422238B1 (ko) TGFBIp의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 중증급성호흡기증후군 바이러스 2 진단용 조성물
KR101754490B1 (ko) 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법
CN111440859A (zh) 一种人呼吸道合胞病毒感染的生物标志物及应用
WO2011138955A1 (ja) Ｓｉａα２－８Ｓｉａα２－３Ｇａｌβ－Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法
EP1701166B1 (en) Phosphorylated SP1 as a marker in diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and target in drug screening for nash
Farrera-Soler et al. Experimental identification of immuno-dominant B-cell epitopes from SARS-CoV-2
US20100298418A1 (en) Assay for measuring plasma FGL-2 and methods and uses thereof
KR20200015276A (ko) 쯔쯔가무시균 유래 엑소좀을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
KR102524159B1 (ko) 결핵, 비결핵 항산균 감염질환 및 잠복결핵 진단용 바이오마커 및 이의 용도
US11366113B2 (en) Methods for identifying patterns of IFN induced expression and use in diagnosis, monitoring and therapy
TWI767434B (zh) 蛋白質微陣列、其檢測方法、其用途及含有該蛋白質微陣列之試劑盒
CN107022028B (zh) 特异性抗CitH3单克隆抗体及其酶联免疫吸附试验试剂盒在脓毒症诊断中的应用
OLANIYAN et al. Hepatitis C Virus IgG antibody and HCV RNA status in young adults in ETSAKO, Edo State, Nigeria
JP2023073582A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予後判定補助方法
KR20220112204A (ko) 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법
박효리 Analysis of Antibody Response to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant