KR101771697B1 - 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 - Google Patents

트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 (tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS)를 이용한 감염 질환의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 조성물, 진단용 키트, 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 WRS를 검출하는 방법, WRS를 이용한 감염 질환에 대한 사망 위험도 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 WRS는 감염으로 유발되는 감염 질환에서만 증가되기 때문에 비감염성 질환과 차별되며, 감염 초기에 급속하게 증가한다. 또한 WRS의 수준은 감염으로 유발되는 질환 또는 합병증의 중증도 및 예후와 밀접한 상관관계를 가지고 있다. 따라서 WRS는 기존의 감염 질환 또는 이의 합병증의 마커보다 더욱 신속하고 정확한 진단 마커로 사용될 수 있다.

Description

트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법{Composition and method for detecting a diagnostic marker for infectious disease or infectious complications using tryptophanyl-tRNA synthetase}
본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 (tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS)를 이용한 감염 질환의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 조성물, 진단용 키트, 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 WRS를 검출하는 방법, WRS를 이용한 감염 질환에 대한 사망 위험도 판별 방법에 관한 것이다.
감염질환은 균, 세균, 바이러스 등의 외래물이 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 이들의 정확한 동정 및 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우, 생명을 잃을 수 있는 질병이다. 위생 수준의 향상에 따라서 감염질환의 유병율은 대체로 감소하는 것으로 보이나, 항생제 투여의 오남용, 이식에 따른 면역 억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 면역력 감소, 당뇨, 고혈압 등 기저질환 보유자의 증가 등으로 치명적인 결과를 초래하는 감염질환의 위협은 증가되는 상황이다.
현재 감염에 대한 진단 도구는 환자의 증상을 토대로 하는 임상의사의 경험적 판단과 더불어 대표적으로 혈액과 소변으로부터의 직접적인 미생물 배양과 감염된 기관을 확인하기 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)이 있다. 그러나 실험실에서의 미생물 배양 결과는 음성인 경우가 대부분이고, PCR 방법은 시간적인 제한이 있다. 칼시토닌의 프로호르몬(prohormone of calcitonin, PCT)은 대부분의 세균과 곰팡이 감염에서 감염 초기 3-4시간 내에 수치가 증가하지만, 더 높은 수준의 변화는 다른 병원체보다도 그람 음성 세균에 의해 야기된다. 또한 이 호르몬 수준이 바이러스 감염에 의해서도 상승하는지는 알려져 있지 않다. 이렇듯, 지난 연구들을 통해 감염질환의 많은 미생물을 검출하는데 상당한 진보가 있어 왔지만 현재 이용되고 있는 진단 방법들은 여전히 많은 노동을 필요로 하고 있고 민감도 및 특이성이 낮은 형편이다.
특히 감염질환은 대부분 감염부위의 염증반응을 수반하며, 그 중의 일부는 전신 염증반응을 일으켜 치명적인 결과를 초래하기도 한다. 이러한 전신 염증 반응은 그 원인에 따라서 치료법이 상이하여 비감염성 원인으로 유발된 각종 전신 염증 반응(systemic inflammatory response)과 병원체 감염에 의한 염증 반응을 신속하게 구별하여 진단하는 것은 적절한 치료를 위해서 매우 중요하다. 특히 감염질환에 의해 초래되는 감염성 염증 환자는 사망에 이르를 수 있는 등 최대한 빨리 적절한 항생제 치료를 시작하는 것이 중요하기 때문에 이러한 진단은 급성 감염성 염증 환자의 생존을 위해 필수적이다.
현재 C-반응 단백질(C-reactive protein, CRP)이 다양한 염증 질환을 위한 일반적인 진단 마커로 사용되고 있다. 하지만, CRP 수치는 감염과 비감염에 의한 염증 질환에서 모두 수치가 증가하기 때문에 감염성 염증을 구별할 수 없다. 따라서 빠르게 감염에 의한 염증을 구별할 수 있는 진단용 시약을 개발해야 할 필요가 있다.
Snider RH Jr et al. (1997) Journal of Investigative Medicine, 45(9):552-560
이에 본 발명자들은 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)의 감염에 의한 감염질환 발생시 체내 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS 또는 WRS, 이하 WRS라 함) 수준이 감염 초기부터 빠르게 증가하며, 특히 감염성 염증 질환을 수반하는 경우 WRS의 수준이 정상인에 비하여 크게 증가하고, 비감염성 염증 질환의 경우 WRS 수준과 관련이 없는 등 WRS의 수준은 감염 질환과 이들의 합병증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 마커로서 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 트립토파닐 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 발현 수준이 증가한 피검체를 감염 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 트립토파닐 tRNA 합성효소를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 트립토파닐 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 수준이 높을 수록 사망 위험도가 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 트립토파닐 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 발현 수준이 증가한 피검체를 감염 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 트립토파닐 tRNA 합성효소를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 트립토파닐 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 수준이 높을 수록 사망 위험도가 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도를 판별하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 WRS가 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)에 의한 감염에 의하여 발현 수준이 감염 초기부터 급속하게 증가하며, 감염 합병증으로 폐렴이나 패혈증 같은 증상이 나타나게 되는 경우 정상인 대조군보다 현저하게 증가함을 처음으로 확인하였다. 나아가 패혈증 환자의 경우 WRS 발현 수준은 패혈증의 중증도 및 예후와 높은 상관관계를 가지고 있으며, WRS는 감염성 염증에서만 증가하기 때문에 감염성 염증 질환과 비감염성 염증 질환을 신속하고 정확하게 구분할 수 있어, 새로운 감염 질환 및 감염 합병증에서의 진단 마커로서의 가치가 매우 높다는 것을 확인하였다.
본 발명자들이 WRS와 감염 질환의 진단과 관련하여 확인한 바는 구체적으로 다음과 같다.
본 발명의 일실시예에서 WRS는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)로 인한 감염에서 크게 증가함을 확인하였다. 인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)가 살모넬라균(Salmonella typhimurium) 또는 RSV, PR8 등 바이러스에 감염되면 감염 초기, 늦어도 감염 후 1시간 이내에 이들 PBMC에서 세포 외부로 분비되는 WRS 수준이 급속히 증가한다. 또한 바이러스성 폐렴 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 양도 정상인 대조군에 비하여 증가하였다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 특히 박테리아 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 인한 패혈증 또는 패혈증 쇼크 환자의 혈청에서 WRS의 양이 건강한 정상인 대조군의 혈청에 비하여 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 세포 외부로 분비되는 다른 종류의 아미노아실 티알엔에이 중합효소(aminoacyl tRNA synthetase, ARS)인 GRS와 KRS는 패혈증 환자와 정상인 대조군 사이에 차이가 없어, 감염으로 인한 WRS의 증가는 ARS 일반적인 현상이 아니라 WRS 특이적인 것임을 알 수 있었다.
그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 및 곰팡이 감염에 의한 패혈증 환자 각각에서 WRS의 증가 경향에 통계학적으로 유의성 있는 차이가 없는 것으로 보아, 그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 또는 곰팡이 감염에 의한 패혈증 진단에 모두 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 단일 감염 환자와 다중 감염 환자 사이에서도 혈중 WRS 수치에 유의성 있는 차이가 나타나지 않은 것으로 보아, 단일 감염 또는 다중 감염으로 인한 패혈증 진단에 모두 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
특히, 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammation reactive symptom, SIRS), 비감염성 만성 염증 질환인 천식과 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 등 자가면역질환 환자의 혈청에서는 WRS의 양이 정상인 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 따라서 WRS의 발현 수준은 모든 염증 반응에서 증가하는 것이 아니라, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 유발된 염증 반응에서만 특이적으로 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 WRS의 수준은 패혈증 환자에서보다 패혈성 쇼크 환자에서 더욱 증가하여, WRS의 발현 수준이 패혈증 중증도와도 관련이 있는 것으로 나타났다. 즉, WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증 증상이 심한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 WRS의 ROC curve 분석을 통하여 WRS가 감염으로 유발된 염증을 진단하는데 있어 민감성(sensitivity)과 정확성(specificity)이 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 SOFA score로 표시되는 패혈증의 중증도와의 상관관계에 있어서도 WRS는 기존의 염증 진단 마커인 CRP보다 더욱 높은 상관관계를 갖는 것으로 분석되었다. 즉, WRS의 발현 수준이 높을수록 SOFA score가 높아 패혈증으로 인한 기관 기능상실(organ failure)이 발생할 확률이 높은 것으로 판단할 수 있다.
패혈증 진단 28일 후 사망한 패혈증 환자의 WRS 수준은 생존한 패혈증 환자에서보다 현저하게 높아, WRS가 패혈증 중증도 및 예후와 높은 상관관계가 있음을 더욱 입증하였다. 즉, WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증의 중증도가 높고 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에서는 120명의 정상인, 18명의 (감염질환 이외의 원인에 의한) SIRS 환자, 166명의 패혈증 환자 및 160명의 패혈성 쇼크 환자의 혈청 (serum)을 대상으로 연구자 임상실험을 통하여 종래에 사용되는 마커인 프로칼시토닌 (procalcitonin)과의 비교하여, WRS에 의한 결과가 프로칼시토닌의 결과와 연관성은 있으나, WRS의 경우 감염질환의 합병증에 대해서만 특이적으로 구분되어 검출되며, 사망 우려의 환자의 선별도 가능함을 확인할 수 있었다.
앞서 서술한 WRS의 발현 수준과 폐렴 및 패혈증의 중증도 사이의 밀접한 상관관계를 이용하여 기존의 패혈증 진단 마커보다 더욱 효율적인 패혈증의 진단 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있다. 특히 WRS는 패혈증 특이적으로 증가하고, 감염 초기에 급속하게 증가하기 때문에 감염성 염증 질환인 패혈증과 비감염성 염증 질환을 신속하게 구분함으로써 염증의 원인을 알지 못하여 발생하는 초기 대응의 지연을 방지하고 환자가 가장 적합한 치료를 받도록 할 수 있다.
본 발명자들의 발견을 바탕으로 본 발명은 WRS의 발현 수준, 즉 WRS 단백질 또는 WRS mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 'WRS' 는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 의미하며, 트립토판 티알엔에이 연결효소(tryptophan-tRNA ligase), TrpRS, WARS 등으로도 알려져 있다. WRS는 아미노산 트립토판과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. WRS는 인간에서는 WARS 유전자에 의해 암호화되며, 단백질의 아미노산 서열과 mRNA 염기 서열은 Genbank accession number NP_004175.2(단백질), Genbank accession number NM_004184.3(mRNA 염기서열) 등으로 공지되어 있다. WRS는 cytoplasmic form(WARS 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic)과 mitochondrial form(WARS2 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 본 발명에서의 WRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다.
본 발명에서 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.
'진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 WRS 유전자의 발현 수준, 즉 WRS 단백질 또는 WRS mRNA의 수준을 측정하여 감염 질환의 병리 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 진단용 조성물이 WRS 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 WRS 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
상기 WRS 단백질은 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 WRS 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
'항체(antibody)'는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 WRS 이외에는 다른 종류의 아미노아실 티알엔에이 합성효소를 포함하는 다른 단백질에는 반응하지 않고, WRS 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. WRS 항체는 WRS 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. WRS 항원성 부위를 포함하는 WRS 단백질의 단편을 이용하여 WRS 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, WRS에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 WRS 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 발명에서 WRS 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 WRS 아미노산 서열을 포함하는 것으로서, 본 발명에서 WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 WRS 특이적인 항체를 WRS의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 WRS 단백질의 수준을 측정할 수 있다.
한편 본 발명의 진단용 조성물이 WRS mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 WRS mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 WRS mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 WRS mRNA는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 인간의 WRS mRNA 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 WRS mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 WRS의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 WRS mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
'프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 WRS mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 WRS 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 WRS mRNA 또는 WRS cDNA의 특정 구간을 증폭하여 WRS mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 WRS mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 WRS mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 WRS mRNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 한 세트 또는 한 쌍일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3과 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트일 수 있다.
'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 WRS mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 WRS mRNA의 발현양을 측정함으로써 감염성 염증 질환의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 WRS mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에서 감염은 하나 또는 두 종류이상의 외인성 박테리아(세균, 그람 음성균 또는 그람 양성균을 모두 포함한다), 바이러스, 곰팡이 (균)가 몸속에 침입하여 정착, 증식, 기생상태가 되는 것을 의미하며, 감염 질환은 병원체의 감염의 결과로 생체에서 반응을 일으켜서 발생하는 모든 질환일 수 있다. 감염 질환의 결과로 나타나는 반응은 염증, 통증, 발열, 피로감, 부종, 혈압 강하 등이 있을 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 감염 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 폐렴, 폐결핵, 결핵, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 요로감염, 방광염, 신우신염, 요도염, 전립선염, 상기도감염, 중이염일 수 있으며, 더 바람직하게는 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 폐렴, 패혈증, 패혈성 쇼크일 수 있다.
본 발명에서 상기 패혈증은 감염 질환의 합병증으로 나타나는 전신성 염증 반응 증후군으로 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇼크(septic shock), 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능 장애까지 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)으로 진행되어 사망할 수 있는 치명적인 질환이다.
본 명세서에서 사용되는 패혈증은, 패혈증의 최종 단계와 관련된 패혈증, 중증 패혈증, 패혈증성 쇼크 및 패혈증에 수반하는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)의 발병을 포함하나, 이에 제한되지 않으며 패혈증의 모든 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 WRS mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에는 WRS의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 WRS 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 WRS mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
분석을 위해 사용되는 시료는 혈액, 혈청, 소변, 누액, 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 감염성 염증 질환 특이적 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장으로부터 측정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한 본 발명은 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에서 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 WRS의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 WRS의 발현 수준이 증가한 피검체를 감염 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 WRS를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 WRS가 신규한 감염 질환의 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하여 WRS의 발현 수준을 측정하여 감염 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명의 방법을 단계에 따라 설명한다.
본 발명의 방법의 (a) 단계는 피검체의 시료를 제공하는 단계이다.
상기 시료는 감염 질환 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액일 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.
본 발명의 방법의 (b) 단계는 (a) 단계에서 제공한 시료에서 WRS의 발현 수준을 측정하는 단계이다. 상기 WRS의 발현 수준은 WRS 단백질 또는 WRS mRNA의 발현 수준일 수 있다.
WRS 단백질의 수준은 WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. WRS 단백질 특이적인 항체는 본 발명의 진단용 조성물에 서술한 바와 같다. WRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 ELISA 방법을 이용할 수 있다.
WRS mRNA 수준은 WRS mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트나 프로브를 이용하여 피검체의 시료로부터 WRS의 mRNA나 cDNA를 증폭하거나, 프로브와 혼성화 반응(hybridization)을 이용하여 피검체 시료 내 WRS mRNA의 존재와 발현량을 측정할 수 있다. WRS의 프라이머와 프로브는 본 발명의 진단용 조성물에서 서술한 바와 같다. WRS mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 나노스트링(nanostring)을 이용한 혼성화 방법, 조직 절편의 인시투 혼성화 방법(in situ hybridization) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법의 (c) 단계는 (b) 단계에서 측정한 피검체 시료의 WRS의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 WRS의 발현 수준이 증가한 피검체를 감염성 질환에 걸린 것으로 판정하는 단계이다.
상술한 (b) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 WRS의 발현 수준을, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 WRS 수준과 비교한다. WRS의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 감염성 질환에 걸린 것으로 판정한다. 또한 감염성 질환이 패혈증인 경우, WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증이 중증인 것으로 판단할 수 있다. 진단의 기준이 되는 WRS 발현 수준 증가의 정도에 대하여서는, 선택한 WRS 발현 수준 측정 방법에 맞게 당업계에 공지된 기술에 따라 WRS의 발현 수준과 패혈증 중증도 사이의 상관성을 분석하여 WRS 발현 수준의 범위에 따라 패혈증의 중증도를 나타내도록 적절한 진단의 기준을 제공할 수도 있다. 본 발명에서는 패혈증의 중증도로서 중증 패혈증과 패혈성 쇼크, SOFA score, 패혈증 진단 후 28일째 생존 여부 등 다양한 지표를 이용하여 WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증 중증도도 높아지는 밀접한 상관관계가 있음을 보인 바 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에서는 연구자 임상실험을 통하여 사망 환자의 혈청에서의 WRS의 발현양이 생존 환자에 비해서 유의하게 증가되어 있음을 확인하였고, 이는 종래에 사용되는 마커인 프로칼시토닌 (procalcitonin)에서는 구분할 수 없는 것임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사망 위험도는 감염 질환에 의한 사망 위험도를 의미하며, 감염에 의한 사망은 염증반응, 고열, 통증, 호흡곤란, 저체온, 혈압강하 등의 일부 또는 전부의 증상을 보이다, 쇼크, 일부 또는 다발성의 장기 부전으로 사망에 이르게 되는 것을 의미한다.
아울러, 본 발명은
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 트립토파닐 tRNA 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 수준이 높을 수록 사망 위험도가 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 감염 질환에 의한 사망 위험도를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 판별 방법에서의 시료 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
따라서, 본 발명에 따르면 WRS는 감염으로 유발되는 감염 질환에서만 증가되기 때문에 비감염성 질환과 차별되며, 감염 초기에 급속하게 증가한다. 또한 WRS의 수준은 감염으로 유발되는 질환 또는 합병증의 중증도 및 예후와 밀접한 상관관계를 가지고 있다. 따라서 WRS는 기존의 감염 질환 또는 이의 합병증의 마커보다 더욱 신속하고 정확한 진단 마커로 사용될 수 있다.
도 1은 살모넬라균(S. typhimurium , ST)을 106, 107 또는 108CFU로 복강 주사한 마우스의 복강삼출액(peritoneal lavage fluid)에서 ELISA로 측정한 감염 후 시간에 따른 WRS의 변화를 나타낸다. 가로축은 ST 감염 후 복강 삼출액을 수득한 시간을 나타낸다(Time after ST innoculation(hr)).
도 2는 바이러스 감염에 따른 WRS 분비 양상을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다.
도 2의 A는 RSV(MOI=2) 또는 PR8 바이러스(MOI=2)로 감염한 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)의 배양액에 존재하는 WRS 수준의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 도 2의 B는 정상인(H.C, n=20), 바이러스성 폐렴(viral pneumonia, n=5) 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 Mann Whitney test를 이용하였으며, * 표시한 p 값은 0.04이다.
도 3A는 건강한 정상인(healthy control, H.C), 중증 패혈증(Severe sepsis), 패혈성 쇼크(Septic shock) 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다. 도 3B 및 도 3C는 각각 건강한 정상인(H.C)과 패혈증 환자의 혈청에 존재하는 GRS 또는 KRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸 것이다(통계적 유의성 도 3A의 경우 Dunn's comparison test after Kruskal wallis test로 판단하였으며 도 3B 및 도 3C는 two-tailed Mann-Whitney test로 판단하였다 , ***는 p<0.001, *는 p<0.05를 나타낸다. n.s는 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다).
도 4A는 건강한 정상인(H.C)과 곰팡이(fungi) 감염 패혈증 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다. 도 4B 및 도 3B 및 도 3C는 각각 건강한 정상인(H.C)과 패혈증 환자의 혈청에 존재하는 GRS 또는 KRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸 것이다(통계적 유의성은 two-tailed Mann-Whitney test로 판단하였으며, ***는 p<0.001, *는 p<0.05를 나타낸다. n.s는 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다).
도 5A는 그람-음성균 감염 환자, 그람-양성균 감염 환자 및 곰팡이 감염 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다. 도 5B는 단일 감염 환자 및 다중 감염 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준을 측정하는 ELISA 실험 결과를 나타낸다(통계적 유의성은 Dunn's comparison test after Kruskal wallis test로 판단하였으며, ***는 p<0.001, *는 p<0.05를 나타낸다. n.s는 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다).
도 6은 전신선 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS, 도 6A), 만성 무균성 염증(sterile chronic inflammatory diseases) 질환인 천식(asthma, ASA, 도 6B), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA, 도 6C) 그리고 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome, SS, 도 6C) 환자의 WRS의 수준을 건강한 정상인 대조군(healthy control, HC)과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 WRS의 ROC curve를 나타낸다.
도 8은 WRS와 CRP의 SOFA score와의 상관성을 보여주는 그래프를 나타낸다. r은 피어슨 상관계수, p는 확률값을 나타낸다.
도 9는 패혈증 진단 28일 후 생존한 환자와 사망한 환자의 WRS 수준을 나타낸다. 통계적 유의성은 Mann Whitney test를 이용하였으며, *** 표시한 p 값은 0.0007이다.
도 10은 혈청에서의 WRS와 프로칼시토닌 (procalcitonin) 수준을 스피어맨스 연관 분석을 통해 확인한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
임상실험
실험 방법은 서울대학교 검토 위원회(institutional review board)의 허가를 받고 진행하였다(허가번호 1502-001-010). 건강한 대조군의 혈청(serum) 샘플은 서울대학교 건강 센터에서 수집하였다. 99명의 패혈증 환자의 혈청 샘플은 중증 패혈증이나 패혈성 쇼크 중환자실을 통해 구하였다. 실험에 사용한 혈청을 제공한 환자들은 서울의 대학 연계 병원의 중환자실에 입원했던 환자들로, 박테리아 감염이 확인된 환자들만 실험에 참여하였다. 중증 패혈증이나 패혈성 쇼크의 진단은 ACCP/SCCM consensus conference(1992년)의 기준에 따라 이루어졌다. 실험은 검토 위원회의 방침에 따라 실험에 참여한 모든 환자들에 대하여 고지에 입각한 동의를 얻고 진행되었다. 실험은 또한 서울아산병원의 검토 위원회의 허가를 받았다. 2014년 1월과 2015년 7월 사이에 서울 세브란스 병원 알레르기-천식 클리닉에 입원한 총 35명의 환자가 실험에 참여하였다. 실험은 26명의 건강한 대조군과, 알레르기 전문의에 의해 증상과 폐기능 검사 결과(기관지 확장제(bronchodilator) 사용 후 1초간 강제된 내쉬는 호흡 부피(forced expiratory volume for 1 second, FEV1)의 증가율이 12% 초과)를 바탕으로 천식으로 진단받은 35명의 안정된 천식 환자들을 포함하였다. 상기 안정된 천식은 최근 1개월간 약물 투여랑의 증가 없이 통상적인 약물 투여량을 유지해 온 천식 환자들로 정의하였다. 임상실험은 세브란스 병원과 연세대학교 건강 시스템의 허가를 받았다(허가번호 4-2013-0397). 42명의 원발성 쇼그렌 증후군 환자(primary Sjogren's syndrome, pSS), 35명의 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 환자, 그리고 20명의 건강한 대조군의 혈청을 수집하였다. 원발성 쇼그렌 증후군은 American-European Consensus Group criteria for pSS 또는 2012 American College of Rheumatology criteria에 따라 진단되었다. 류마티스 관절염은 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis 또는 2010 rheumatoid arthritis classification criteria에 따라 진단되었다. 헬싱키 선언의 원칙에 따라 실험에 참여한 모든 환자와 건강한 대조군으로부터 실험에 대한 고지에 입각한 동의를 받았다. 상기 실험은 서울 성모 병원 검토 위원회의 허가를 받았다(KC13ONMI0646).
임상실험 - 프로칼시토닌과의 비교실험
120명의 정상인, 18명의 (감염질환 이외의 원인에 의한) SIRS 환자 , 166명의 패혈증 환자 및 160명의 패혈성 쇼크 환자를 대상으로 각 기관의 검토 위원회의 방침에 따라 실험에 참여한 모든 환자들에 대하여 고지에 입각한 동의를 얻고 진행되었다. 이 때 채혈은 대상자가 적법한 동의서를 구독한 후 시행되었다. 환자의 경우 서울의 대학병원 중환자실에 입원했던 환자들로부터 얻은 것으로, 전신성 염증반응 증후군 (SIRS), 패혈증이나 패혈성 쇼크의 진단은 ACCP/SCCM consensus conference(1992년)의 기준에 따라 이루어졌다.
혈청의 프로칼시토닌 (RayBiotech, USA Cat No : ELH-PROCALC)과 WRS (CUSABIO, China, Cat No: CSB-E11789h)수준은 각각의 ELISA kit 를 이용하여 측정한 것으로 제조사가 제시한 방법에 따라 측정하였다.
세포 배양
인간 말초혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 sodium citrate를 포함하는 Cell Preparation Tube(CPTTM,BectonDickinson)을 이용하여 분리하였다.
박테리아 종류(strain)와 감염
Salmonella typhimurium(ATCC 14028)은 한국 미생물 보존 센터(서울)에서 구하였다. 박테리아는 BD bioscience의 영양 배지(nutrient broth)를 이용하여 통상적으로 배양하였다. 감염 전에 박테리아는 하룻밤 동안 배양하고, 1X108CFU의 밀도로 수득하였다. 박테리아 밀도는 600nm의 흡광도와 검정선(calibration curve)를 이용하여 추산하였다. PBMC나 마우스 감염 실험을 위해서 박테리아는 PBS로 세척하고 혈청을 포함하지 않는 배지나 PBS에 재분산하였다.
효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
마우스와 인간의 WRS, KRS의 정량적 분석을 위하여 배양 배지나 혈청에 분비된 단백질의 양을 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. WRS ELISA kit는 Cusabio(Wuhan, China, 카탈로그 번호 CSB-E11789h)로부터 구입하였으며, KRS는 USCN(Wuhan, China, 카탈로그 번호 SED002 Hu)에서 구입하여서 측정하였다.
통계(Statistics)
확률값(provability value, p-value)이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 모든 통계적 계산은 Graphpad prism 5.0(GraphPad Software)을 이용하여 실시하였다.
<실시예 1>
박테리아 또는 바이러스 감염으로 인한 WRS 수준 증가
<1-1> 살모넬라균 감염에 의한 WRS 분비
마우스 복강에 살모넬라균(Salmonella typimurium)을 주입하고, 복강삼출액에 존재하는 WRS의 양을 확인하였다.
9~10주령 C57BL/6 암컷에 106, 107 또는 108CFU의 살모넬라균을 복강주사하고, 박테리아 감염 후 네 시간까지 한 시간마다 5~11마리의 마우스에서 복강삼출액을 수득하여 복강삼출액에 존재하는 WRS의 양을 ELISA로 측정하였다(도 1).
복강 삼출액으로 분비된 WRS는 살모넬라균 감염 후 매우 초기 단계에서부터 분비되어 살모넬라균 농도의존적으로 증가하였으며, 감염 후 1시간째 WRS의 양은 거의 최고치에 달하였다.
<1-2> 바이러스 감염에 의한 WRS 분비
박테리아 외에 바이러스 감염에 의하여 WRS의 분비가 일어나는지를 인간 말초혈액 단핵구 세포와 바이러스성 폐렴 환자의 혈청을 이용하여 알아보았다.
인간 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)들을 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)와 인플루엔자 바이러스(influenza virus)인 PR8 바이러스로 감염하였을 때, 세포 배양 배지에서는 감염 후 30분부터 WRS가 크게 증가하였으며, 실험을 진행한 감염 후 4시간까지 분비된 WRS의 수준이 유지되는 것을 확인하였다(도 2의 A). 또한 바이러스성 폐렴(viral pneumonia) 환자의 혈청에서 정상인 대조군(H.C)과 비교하여 WRS의 양이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 2의 B).
이상의 실험 결과는 바이러스 감염에 의하여 WRS의 수준이 증가함을 보여준다.
<실시예 2>
감염성 염증 질환에서의 WRS 특이적 분비
<2-1> 패혈증과 패혈성 쇼크 환자에서의 WRS의 증가
감염으로 인한 합병증인 패혈증과 패혈성 쇼크 환자의 WRS의 수준을 정상인 대조군과 비교하였다.
본 실험에 참여한 패혈증 환자들은 서울아산병원의 중환자실에 입원한 박테리아 감염이 확인된 중증 패혈증 환자(severe sepsis)와 패혈성 쇼크(septic shock) 환자들로, 환자들에서 검출된 박테리아 및 곰팡이(fungi)는 표 1에 기재한 바와 같다.
중증 패혈증 환자와 패혈성 쇼크 환자의 혈청에서는 건강한 정상인(healthy control, H.C)에 비하여 WRS의 수준이 크게 증가한 것을 확인하였다(도 3A). 측정된 WRS 수치는 건강한 정상인에서 0.18±0.06 ng/ml(n=20)인데 비하여 패혈증 환자에서는 2.63±0.62 ng/ml(n=37)로, 약 20배 증가하였다. 또한 패혈증 쇼크 환자의 WRS 수치는 6.35±0.90 ng/ml(n=63)으로, 정상인 대조군에 비해서는 약 50배 증가하였다. 패혈증 쇼크 환자의 WRS 수치는 중증 패혈증 환자에서보다 더욱 증가하여 WRS의 수준이 패혈증 중증도(severity)와도 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다.
패혈증 환자에서 WRS 수준이 정상인보다 크게 증가한 것과는 대조적으로 다른 종류의 분비되는 아미노아실 티알엔에이 합성효소(aminoacyl tRNA synthetase, ARS)인 글라이실 티알엔에이 합성효소(glycyl-tRNA synthetase, GRS) 및 라이실 티알엔에이 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS)는 유의한 변화를 보이지 않았다(도 3B 및 도 3C).
Figure 112016085562973-pat00001
한편, 도 4에 나타낸 바와 같이, 박테리아 감염뿐만 아니라 곰팡이(fungi) 패혈증 환자의 혈청에서도 WRS의 수치는 증가되어 있는 것으로 확인되으며(n=8, 4.52±1.83 ng/mL, Mann-Whitney test), GRS 및 KRS의 혈청 수치에서는 유의한 변화가 나타나지 않았다.
상기 패혈증 환자 중 그람-음성균 박테리아 감염 환자(n=62, 5.98±0.93 ng/mL) 및 그람-양성균 박테리아 감염 환자(n=25, 2.87±0.72 ng/mL), 곰팡이 감염 환자(n=8, 4.52±1.83) 사이에서는 유의적인 차이가 관찰되지 않았으며, 다중 병원균 감염 환자(n=11, 3.53±1.22 ng/mL) 및 단일 병원균 감염 환자(n=94, 5.01±0.67 ng/mL) 사이에서도 유의적인 차이가 관찰되지는 않았다(도 5).
<2-2> 비감염성 염증 질환에서의 WRS 수준
감염에 의하지 않은 전신선 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 만성 무균성 염증(sterile chronic inflammatory diseases) 질환인 천식(asthma), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 그리고 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 환자의 WRS의 수준을 건강한 정상인 대조군과 비교하였다.
이들 비감염성 염증 질환 환자의 혈청에 존재하는 WRS의 수준은 건강한 정상인 대조군과 크게 다르지 않음을 관찰하였다(도 6). 전신성 염증반응 증후군(도 6의 A), 천식 환자(도 6의 B), 류마티스 관절염 환자(도 6의 C), 그리고 쇼그렌 증후군 환자(도 6의 C)의 혈청에서 감지되는 WRS는 건강한 정상인 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다.
< 실시예 3>
감염성 염증 질환의 진단 마커로서의 WRS 의 효율성
<3-1> 감염성 염증 질환 마커로서 WRS 의 성능
감염성 염증 질환 마커로서의 WRS의 성능을 확인하기 위하여 수용자 작용 특징 곡선(receiver operating characteristics curve, ROC curve)를 작성하였다.
박테리아 감염 패혈증 환자 100명의 데이터로 산출한 ROC curve에 나타난 WRS의 AUC는 0.90(p<0.0001), cut off 수치는 0.28ng/mL, 민감성(sensitivity)은 82% 그리고 정확성(specificity)은 80%인 것으로 나타났다(도 7).
<3-2> WRS 의 수준과 감염성 염증 질환 중증도 및 예후 사이의 상관
감염성 염증 질환 마커로서의 WRS의 성능을 더욱 확인하기 위하여 WRS의 수준과 패혈증 중증도와 패혈증 예후의 상관성을 알아보았다.
패혈증 환자의 예후를 나타내는 순차기관 기능상실 평가 스코어(sequential organ failure assessment score, SOFA score)와, 환자의 혈청에서 감지되는 WRS 또는 CRP의 수준을 그래프로 나타내고 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 계산하여 상관성 여부를 판단하였다(도 8). WRS의 피어슨 상관계수는 0.43으로, CRP의 0.15보다 현저히 높았으며, 통계적으로도 유의한 상관성을 나타내었다. 즉, WRS의 수준은 기존의 염증 지표인 CRP보다 패혈증 환자의 SOFA score와 더욱 밀접한 상관관계를 가지고 있음을 알 수 있다.
또한 패혈증 환자의 예후를 나타내는 다른 지표로서 패혈증 진단 후 28일의 생존 여부와 WRS의 수준을 확인하고 만 휘트니 테스트로 통계적 유의성을 판단하였다(도 9). 패혈증 진단 후 28일에 사망한 환자들에서는 생존한 환자에서보다 WRS 수준이 통계적으로도 유의한 큰 차이를 보였다(사망, n=27, WRS 9.14+1.63ng/ml;생존, n=72, WRS 3.36+0.49ng/ml). 즉, WRS 수준이 높을수록 패혈증 생존 예후가 좋지 않음을 알 수 있다.
< 실시예 4>
프로칼시토닌 ( procalcitonin )과의 비교
<4-1> 혈청내의 함량 비교
120명의 정상인, 18명의 (감염질환 이외의 원인에 의한) SIRS 환자 , 166명의 패혈증 환자 및 160명의 패혈성 쇼크 환자의 혈청 (serum)을 대상으로 이들 각 환자에서의 WRS (CUSABIO, China, Cat No: CSB-E11789h)와 주요 염증 마커로 알려져 있는 프로칼시토닌 (RayBiotech, USA Cat No: ELH-PROCALC)을 대상으로 이들의 양을 제조사의 지침에 따라 ELISA방법으로 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 보듯이 프로칼시토닌과 WRS 모두 정상인에 비해 비감염성 전신성 염증 증후군 (SIRS)와 감염성 질환이 구분되었고, 특히 WRS 는 감염질환의 중증도가 높을수록 더 많은 양이 검출되어 중증도와 관련성이 있음을 시사하였다.
정상 대조군과 환자에서의 WRS와 프로칼시토닌의 비교
구분 정상
(n = 120)		 SIRS
(n = 18)		 패혈증
(n = 166)		 패혈성 쇼크
(n=160)		 P value
WRS (ng/mL) 0.06 ± 0.02 0.20 ± 0.12 1.29 ± 0.20 6.78 ± 0.79 0.000
Procalcitonin (ng/mL) 0.03 ± 0.01 1.02 ± 0.36 2.02 ± 0.23 2.98 ± 0.31 0.000
<4-2> 생존여부에 따른 함량의 비교
패혈증, 패혈성 쇼크 환자에 대해서 28일 경과시의 생존여부에 따라서 생존자와 사망자의 군을 나누었다. 각 군의 환자 혈청에서의 WRS와 프로칼시토닌의 함량을 상기 실시예 <4-1>에서와 같이 정량적으로 측정하였다.
그 결과 하기 표 3에서 보듯이, 프로칼시토닌의 경우 생존자와 사망자간 측정값의 차이가 없었으나, WRS의 경우 통계적으로 차이가 있어, 예후 예측 인자로써의 가능성을 보여 주었다.
생존 환자와 사망 환자에서의 WRS와 프로칼시토닌의 비교
생존자 사망자 P value
WRS (ng/mL) 2.47±0.40 6.22±0.84 <0.05
Procalcitonin (ng/mL) 2.29±0.22 2.73±0.35 NS
<4-3> 프로칼시토닌과의 연관 분석
종래에 사용되는 프로칼시토닌과 WRS의 진단 결과의 상호 연관성을 확인하기 위하여 패혈증 환자에 대해서 WRS와 프로칼시토닌에서의 측정값을 이용하여 스피어맨스 연관 분석 (Spearman's correlation analysis)를 수행하였다.
그 결과, 도 10에서 보듯이, WRS와 프로칼시토닌간에 Spearman's rho 값 (r)이 0.127, p값이 0.022로 나타나 연관성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, WRS는 감염으로 유발되는 감염 질환에서만 증가되기 때문에 비감염성 질환과 차별되며, 감염 초기에 급속하게 증가한다. 또한 WRS의 수준은 감염으로 유발되는 질환 또는 합병증의 중증도 및 예후와 밀접한 상관관계를 가지고 있다. 따라서 WRS는 기존의 감염 질환 또는 이의 합병증의 마커보다 더욱 신속하고 정확한 진단 마커로 사용될 수 있다.
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Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 바이러스, 박테리아 및 곰팡이(fungi)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의한 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아는 그람-음성균 또는 그람-양성균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 제제는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 삭제
  10. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단용 키트.
  11. 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
    (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 mRNA의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 트립토파닐 티알엔에이 합성효소의 발현 수준이 증가한 피검체를 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 트립토파닐 tRNA 합성효소 단백질 또는 mRNA를 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 의한 사망 위험도 판별용 조성물.
  15. (a) 피검체의 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이를 암호화하는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 단백질 또는 mRNA의 수준이 높을수록 사망 위험도가 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 의한 사망 위험도를 판별하는 방법.
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