KR20200102746A - 췌장암 진단용 조성물 - Google Patents

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KR20200102746A KR1020190021113A KR20190021113A KR20200102746A KR 20200102746 A KR20200102746 A KR 20200102746A KR 1020190021113 A KR1020190021113 A KR 1020190021113A KR 20190021113 A KR20190021113 A KR 20190021113A KR 20200102746 A KR20200102746 A KR 20200102746A
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Abstract

본 발명은 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB)과 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 조직검사가 필요하여 조기 진단이 어려웠던 췌장암에 대하여, 환자 유래 혈액만으로 비침습적이고, 간단하면서도 높은 정확도로 췌장암을 예측 또는 진단할 수 있다.

Description

췌장암 진단용 조성물{Composition for Diagnosing Pancreatic Cancer}
본 발명은 췌장암 진단용 조성물 및 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물 및 이를 이용한 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
췌장(Pancreas)은 위장의 뒤쪽에 위치한 20cm 정도의 길이를 가지는 소화액과 호르몬을 분비하는 장기로서, 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관암을 말한다. 국내에서 사망률이 높은 5대 종양 중 다섯 번째에 해당하며, 전체 종양 중에서 생존율이 가장 낮다. 췌장암은 서양식 식사가 보편화되면서 점차 증가추세이며, 주로 남자에게서 많이 발생하는 것으로 알려져 있다.
췌장암은 초기에는 증상이 잘 나타나지 않아 조기발견이 어렵고, 흡연, 커피, 음주, 육식위주의 식사습관, 당뇨, 만성 췌장염, 비용종성 대장암 증후군 등의 병력과 베타나프틸아민(Beta-naphthylamine), 벤지딘(Benzidine) 등의 물질이 원인으로 알려져 있다.
췌장에 생기는 종양은 수술적 절제로 치료가 가능한 양성종양에서부터 예후가 매우 불량한 악성종양에 이르기까지 유형이 매우 다양하다. 그 중에서 가장 흔한 낭성 종양(물혹)은 장액성과 점액성 낭성 종양, 췌관 내 유두상 점액 종양, 고형 유두상 종양, 그리고 림프 상피성 낭종과 낭종성 기형종 같은 종양으로 분류할 수 있으며, 악성 종양으로는 췌장 외분비 종양인 췌관 선암종, 선방세포 암종 그리고 신경내분비 종양으로 구분할 수 있다.
췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신전이가 일어난 후에 통증과 체중 감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 임상 증세는 대부분이 서서히 발병하고, 식욕 감퇴, 허약해지기 쉬우며, 체중 감소는 가장 흔한 증세이다. 췌장암은 5년 생존율이 1~4%, 중앙생존기간 5개월에 이르는 치명적인 암으로 인체의 암 중에서 가장 불량한 예후를 보이고 있다. 또한, 80~90% 환자에서 진단시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암 요법에 의존하고 있으므로, 그 어떤 인체 암보다도 조기진단법 개발이 절실히 요망되고 있다.
현재 사용되고 있는 췌장암의 잔단방법은 췌장 관찰을 위한 초음파검사와 전산화단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI)을 실시하고, 췌관과 담관의 형태를 내시경을 통해 살펴보는 내시경적 역행성담췌관조영술(ERCP), 내시경적 초음파검사(EUS)를 실시한다. 이 외에 양성자방출단층촬영(PET), 혈청종양표지자, 복강경검사 등을 통해 검사하여 진단한다.
한편, 최근에는 체외진단기술 중 하나인 분자진단을 통한 암진단 기술에 대한 연구가 각광받고 있으며, 분자진단이란, 체내 특히, 세포 내에서 발생하는 다양한 생리적 현상을 분자 수준에서 수치나 신호 또는 영상으로 진단하는 기술로서, 특히 genome과 proteome 상의 마커를 타겟으로 분자생물학적 방법을 활용하여 진단, 질환 모니터링, 질환발생 위험감지, 맞춤형 치료방법의 선택에 있어서 중요한 판단근거로 활용되고 있다. 분자진단 기술이 적용되는 진단의학 분야는 선천성 유전병 진단, 약물 효용성 확인을 위한 약물 유전학, 감염병을 대상으로 하는 병리유전학, 성인병 위험도 분석, 종양 진단 등으로, 보다 정확한 진단을 위하여 종양의 종류 및 진행정도에 대한 다양한 마커가 개발 중에 있다.
약물이 인체에 미치는 효과를 확인할 수 있는 분자진단기술인 동반진단 기술은 신규 약물 또는 기존의 약물 사용에 대한 용도 확장에 있어서, 약물 치료와 병행한 진단 검사를 통해 약물 치료효과의 극대화를 목표로 한다. 분자진단 기술은 생물학적 상호작용의 검출 및 정량화를 위하여, 생물 분자에 대한 labelling 및 광학, 화학, 전기전자 분야의 검출기술의 적용이 필요하기 때문에, 바이오기술과 광학, 전기전자, 기계공학, 화학 및 의학이 합쳐진 전형적인 융복합기술을 기반으로 한다. 그 중에서도 바이오 마커의 발굴은 분자진단 기술 개발의 핵심으로 활발한 연구가 진행되고 있다. 분자진단 기술은 대표적으로 인체 유래물의 전처리, 단백질 검출기술, 핵산/유전자 검출 및 분석기술을 핵심기술로 하여 바이오칩, 현장검사 기기 등에 활용되고 있고, 분자의학영상기술을 접목하여 보다 정확한 진단효율을 위하여 다양한 관련 기술이 활발하게 개량되고 있다.
분자진단기술의 정확성은 종양 특이적 마커에 의하여 결정된다. 췌장암 진단에 있어서, 가장 보편적으로 사용되고 있는 혈장 마커는 CA19-9(sialylated Lewis blood group antigen)이지만, 치료 예후 검증이나, 민감성 41%~86%, 특이성 33~100%이며, 특히 췌장암 말기에 나타나기 때문에, 조기진단 마커로서는 적절하지 않은 문제가 있다.
현재까지 연구에 의하여 알려진 췌장암 검출용 바이오마커로는 마트릴린(matrilin), 트랜스티레틴(transthyretin) 및 스트라티핀(stratifin)(대한민국 특허 제10-0819122호), REG4 단백질(한국 특허공개 제2009-0003308호), XIST RNA(
한국 특허공개 제2012-0009781호), LBFL313 패밀리(한국 특허공개 제2007-0119250호), 케라틴 8단백질(미국 출원공개 제2011/0294136호), CA19-9, GPC-1 등(He XY et al., World Journal of Gastroenterology, 20(32):11242, 2014; Okano K et al., World Journal of Gastroenterology, 20(32):11233, 2014)등이 있으며, 단독으로는 췌장암 특이성이 낮아 진단에 부적합하기 때문에, 췌장암 조기진단에 활용하기에는 미흡한 상황이다.
췌장암 마커 개발을 위해서는 우선, 실제 환자 유래 종양세포 및 조직을 이용한 실험적 연구와 이행 연구가 필수적이다. 그러나 실제로는 췌장암 환자로부터 연구를 위한 종양세포 또는 조직의 획득이 상당히 어려워 개발을 어렵게 만드는 요인으로 작용하고 있다. 이에 대한 대안으로 유전적 고위험군을 대상으로 하는 코호트 구축으로 바이오마커 개발의 성과를 내고 있으나, 아직도 활용가능한 조기진단 기술 개발은 미미한 상태이다.
본 발명자들은 조직검사 등의 위험을 감수할 필요 없는 혈액을 사용하여, 췌장암 환자의 혈액 내 단핵구에서 특이적으로 mRNA의 발현이 증가하는 췌장암 바이오마커를 확인하고, 이를 이용한 췌장암 진단방법을 개발한 바 있으며(한국 특허공개 제2018-0058650호), 상기 발견한 바이오마커를 이용한 진단방법의 민감도와 정확도를 높일 필요가 있었다.
이에, 본 발명자들은 췌장암 진단에 있어서, 환자의 혈액을 이용하여 높은 정확도와 민감도를 가지는 분자진단 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 췌장암 환자의 말초혈액 단핵구에서 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB), 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)의 조합에 대한 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 확인하는 경우, 췌장암을 보다 정확하게 조기 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 환자의 혈액을 이용하여 높은 정확도와 민감도를 가지는 췌장암 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈액성분을 포함하는 샘플에서 바이오마커의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 혈액성분을 포함하는 샘플에서, (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 조직검사가 필요하여 조기 진단이 어려웠던 췌장암에 대하여, 환자 유래 혈액만으로 비침습적이고, 간단하면서도 높은 정확도로 췌장암을 조기에 예측 또는 진단할 수 있다.
도 1은 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22, IFNLR isoform1 및IL-29의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22, IFNLR isoform1, IL-29 및 GPC-1의 mRNA의 발현수준을 확인한 qPCR 결과를 이용하여 ANOVA 테스트를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 mRNA 발현을 qPCR 결과를 이용하여, 췌장암군과 대조군, 췌장염 및 담도암군 예측을 위해 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22 조합으로 predicted probability (p) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 mRNA 발현을 qPCR 결과를 이용하여, 췌장암군과 대조군, 췌장염 및 담도암군 예측을 위해 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22 조합으로 스코어링(scoring) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 단백질 발현을 FACS 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA및 IL-22의 단백질 발현을 FACS 분석 결과를 이용하여, ANOVA 테스트를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 단백질 발현을 FACS 분석 결과를 이용하여, 독립표본 t-검정(independent two sample t-test)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 정상인, 췌장염 환자, 담도암 환자 및 췌장암 환자에서 채취한 혈액 유래 말초혈액단핵구 샘플에서 IL-10RB, IL-22RA및 IL-22의 단백질 발현을 FACS 분석 결과를 이용하여, 로지스틱 회귀(logistic regression) 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
췌장암은 초기에는 별로 증세를 느끼지 않으며, 이미 전신 전이가 일어난 후에 통증과 체중감소 등의 증세가 나타나는 것이 보통이어서, 더욱 치유율이 낮은 편이므로 정기적인 진단이 매우 중요하다. 또한, 80~90% 환자에서 췌장암 진단 시 완치를 기대하는 근치적 절제가 불가능한 상태에서 발견되기 때문에 예후가 불량하고 치료는 주로 항암요법에 의존하고 있으므로, 조기 진단법의 개발이 절실하다.
본 발명자들은 환자의 액체 생검으로부터 면역계 특이 마커인 인터루킨 10 수용체(Interleukin 10 receptor, IL-1OR), 인터루킨 22 수용체(Interleukin 22 receptor, IL-22R), 인터루킨 22(Interleukin 22), 인터루킨 29(Interleukin 29) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1)의 발현 수준을 측정하여 췌장암의 발병 여부 등을 예측 또는 진단할 수 있는 방법을 개발한 바 있다(한국 특허공개 제2018-0058650호).
본 발명에서는 상기 면역계 특이 마커를 이용한 췌장암의 진단에 있어서, 정확도와 민감도를 개선한 분자진단 방법을 개발하였으며, 췌장암 환자의 혈액 유래의 말초혈액단핵구에서 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(IL-1ORB), 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1)의 발현을 조합하여 측정하는 경우, 췌장암에 대한 진단 정확도가 현저히 향상되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및 (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 진단용 조성물은 정상군과 췌장암의 환자군을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있다. 아울러, 다른 종류의 암, 예를 들면 폐암 또는 대장암 등과 구별하여 췌장암을 선별적으로 검출 또는 진단할 수 있으며, 뿐만아니라, 종래의 진단방법으로 구분이 어려웠던 췌장염 및 담도암을 췌장암과 구분하여 정확히 검출 또는 진단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 췌장암 진단용 조성물의 검체는 췌장암 의심 환자 유래의 혈액인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 혈액에서 분리된 단핵구인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오마커의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오마커의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 결합하여 증폭시키는 프라이머, 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "췌장암(pancreatic cancer)"이란 췌장 세포에서 기원하는 암을 의미한다. 췌장암에는 여러 가지 종류가 있는데 췌관 세포에서 발생한 췌관 선암종이 90% 정도를 차지하고 있어 일반적으로 췌장암이라고 하면 췌관선암종을 의미한다. 그 외에 낭종성암(낭선암), 내분비종양 등이 있다. 췌장암 환자 중 약 5~10%는 유전 소인을 가지고 있는데, 췌장암 환자에서 췌장암의 가족력이 있는 경우는 약 78% 정도로 일반인에서의 췌장암 발생률 06%에 비해 빈도가 높다. 췌장암은 5년 생존율이 5% 이하로 예후가 매우 나쁜 암이다. 그 이유는 대부분 암이 진행된 후에 발견되기 때문에 발견 당시 수술 절제가 가능한 경우가 20%이내이고, 육안으로 보기에 완전히 절제되었다 하더라도 미세 전이에 의해 생존율 향상이 적으며, 항암제 및 방사선 치료에 대한 반응이 낮기 때문이다. 따라서, 생존율을 향상시킬 수 있는 가장 중요한 방법은 증상이 없거나 비특이적일 때 조기 발견하여 수술하는 것이다.
본 발명에서 "췌장염(pancreatitis)"이란 췌장(pancreas)에 염증이 발생하여 생기는 질병으로 급성 췌장염(acute pancreatitis) 및 만성 췌장염(chronic pancreatitis)이 있다. 이자액(pancreatic juice)은 아밀라아제(amylase,탄수화물을 가수분해함), 트립신(trypsin, 단백질 가수분해에 작용), 리파아제(lipase, 지방 가수분해에 작용)와 같은 소화 효소를 포함한다. 췌장염은 과음(alcohol abuse), 담석(gallstones) 등에 의해서 이자액이 원활하게 흐르지 않아 상기 효소들이 췌장의 자가분해를 유발하여 발생할 뿐만 아니라, 대사 장애, 약물,복부 손상 등의 다양한 원인 등에 의해서도 발생한다. 췌장염은 췌장선세포의 손상, 광범위한 간질성 부종, 출혈 및 손상 부위로의 호중구성 과립구의 이동을 유발하는 췌장의 염증성 질환이다. 췌장염은 크게 두 가지 유형으로 나누어 볼 수 있는데, 간질성 부종(interstitial edema)과 췌장 주변의 지방성 괴사(peripancreatic fat necrosis)가 발견되는 경증(mild type)의 췌장염, 췌장 주변(peripancreatic) 및 췌장 내부(intrapancreatic)의 광범위한 지방성 괴사, 췌장의 유조직 궤사(pancreatic parenchymal necrosis), 출혈을 동반하는 중증(severe type)의 췌장염이 있다(Bank PA, Am J gastroenterol, 89, pp151-152, 1994; Bradley EL, Arch Surg, 128, pp586-590, 1993; 김창덕, 대한소화기학회지, 46, pp321-332, 2005).
본 발명에서 "담도암(cholangiocarcinoma)"은 담관 세포에서 발생하는 선암종(腺癌腫)이 대부분이어서, 일반적으로 담도암이라고 하면 담관 선암종을 가리킨다. 간외 담도암은 발생 부위에 따라 상부(근위부), 중부, 하부(원위부) 담도암으로 구분된다. 상부 담도암은 주간관(主肝管, common hepatic duct, 총간관)의 합류부에서 발생하는 클라츠킨(Klatskin) 종양을 포함해 전체 담도암의 약 50%를 차지하며, 중부 담도암과 하부 담도암이 각기 20~30%를 차지한다. 담도암은 담낭암과 마찬가지로 초기에는 증상이 거의 없을 뿐 아니라, 있다 해도 소화기계통 다른 부위(특히 위나 간)에 문제가 있을 때의 증상과 뚜렷이 구분되지 않아 조기 발견이 매우 힘들다. 그래서 구체적 증상이 나타나 검사를 받았을 때는 이미 상당히 진행되어 있는 경우가 많다. 담도암의 진단을 위하여 임상에서 사용되는 검사들로는 초음파검사, 전산화단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 내시경적 역행성 담췌관조영술(ERCP), 경피경간 담도조영술(PTC), 내시경 초음파검사(EUS), 양성자방출단층촬영(PET), 그리고 혈청 종양표지자검사 등이 있다.
본 발명에서 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 "인터루킨 10 수용체(Interleukin 10 receptor,IL-10R)"란 Ⅱ형 사이토카인 리셉터로, 2개의 α 서브유닛과 2개의 β 서브유닛으로 구성되는 4분자체에 해당한다. α 서브유닛은 T 세포, B 세포, NK 세포, 비만세포(mast cells) 및 수지상 세포(dendritic cells)와 같은 조혈세포에서 발현되며, β 서브유닛은 다양하게 발현된다. 본 발명에서는 상기 인터루킨 10 수용체는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(IL-10RB)일 수 있다.
상기 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛에 대한 mRNA는 7개의 엑손영역으로 구성되며, 본 발명의 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 상기 7개 엑손영역의 전부 또는 7개 엑손영역의 일부 또는 하나의 엑손 영역의 일부를 포함하는 단편에 대하여 발현수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "인터루킨 22 수용체(Interleukin 22 receptor,IL-22R)"란 Ⅱ형 사이토카인 리셉터로, α1 서브유닛과 β2 서브유닛의 이형이합체(heterodimer)에 해당하며 인터루킨 22(interleukin 22)에 결합한다. 본 발명에서 상기 인터루킨 22 수용체는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(IL-22RA1)일 수 있다.
상기 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛에 대한 mRNA는 7개의 엑손영역으로 구성되며, 본 발명의 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 상기 7개 엑손영역의 전부 또는 7개 엑손영역의 일부 또는 하나의 엑손 영역의 일부를 포함하는 단편에 대하여 발현수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22)"란 세포 면역 반응을 중재하는, IL-10 패밀리 또는 IL-10 수퍼패밀리(IL-19, IL-20, IL-24 및 IL-26)으로 불리는 사이토카인의 그룹에 속하는 사이토카인이다. 상기 인터루킨 22는 IL-10R2 및 IL-22R1의 서브유닛으로 구성되는 이형 이합체 세포 표면 수용체에 결합한다. 본 발명에서 상기 인터루킨 22는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 인터루킨 22에 대한 mRNA는 5개의 엑손영역으로 구성되며, 본 발명의 인터루킨 22를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 상기 5개 엑손영역의 전부 또는 5개 엑손영역의 일부 또는 하나의 엑손 영역의 일부를 포함하는 단편에 대하여 발현수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "인터페론 람다 수용체 1(Interferon lambda receptor 1, IFNLR1)"이란 Ⅱ형 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 인터루킨 10 수용체 베타 서브유닛과 결합하여 수용체 복합체(receptor complex)를 형성한다. 이러한 수용체 복합체는 인터루킨 28A, 인터루킨28B 및 인터루킨 29와 상호작용을 할 수 있다. 본 발명에서 상기 인터페론 람다 수용체 1로는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1 isoform 1)일 수 있다.
상기 인터페론 람다 수용체 1에 대한 mRNA는 7개의 엑손영역으로 구성되며, 본 발명의 인터페론 람다 수용체 1를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 상기 7개 엑손영역의 전부 또는 7개 엑손영역의 일부 또는 하나의 엑손 영역의 일부를 포함하는 단편에 대하여 발현수준을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에서 "인터루킨 29(Interleukin 29, IL-29)"란 '인터페론 람다-1(Interferon lambda-1)'이라고도 불리우며, 염색체 19번에 위치하는 인터루킨 29 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 나선형의 사이토카인 패밀리(helical cytokine family)에 속하며, Ⅲ형 인터페론에 해당한다. 상기 인터루킨 29는 미생물에 대한 숙주 방어에 중요한 역할을 하며, 그 발현 수준은 바이러스에 감염된 세포에서 매우 증가되어 있다. 본 발명에서 상기 인터루킨 29는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명에서 상기 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 인터루킨 22, 인터루킨 29 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 수준은, 목적하는 개체에서 분리된 생검으로, 바람직하게는 액체 생검(liquid biopsy)인, 예를 들면, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 분리된 세포, 보다 바람직하게는 상기 액체 생검으로부터 분리된 단핵구로부터 측정될 수 있다.
본 발명에서는 목적하는 개체로부터 분리된 혈액, 혈청 또는 혈장의 액체 생검, 또는 이로부터 분리된 단핵구에서, 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1의 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정함으로써 신속하고 간단하지만 매우 정확하게 췌장암을 포함하는 다양한 질환의 발병 여부와 발병 가능성을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 인터루킨 22, 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 인터루킨 22, 인터루킨 28A, 인터루킨 28B 아이소폼 1, 인터루킨 28B 아이소폼 2, 인터루킨 29 또는 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1의 각각의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "단백질의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 포함하는 본 발명의 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 췌장 질환의 진단용 마커인 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체 및 인터루킨 22의 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미한다.
상기 수용체의 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측 정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 인터루킨 22에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체 및 인터루킨 22의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol, 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 항체를 이용한 바이오마커의 검출방법으로는 방사성 면역분석, 면역조직화학 분석, 계내 (in situ) 혼성화 분석, 경쟁적-결합 분석, 웨스턴 블롯 (western blot) 분석, ELISA 분석, 및 유동 세포 측정 분석, 예를 들어 종양-연관 대식세포의 M2대 M1 표현형 결정을 위한 2색 FACS 분석을 포함한다 (Mantovani et al, (2002) TRENDS in Immunology 23:549-555).
본 발명에서 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991)"Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thyminesubstituted polyamide" Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al, Nature 355(6360):5646(1992);Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine" J Mol Med 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library" Proc Natl Acad Sci USA 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에 따른 진단용 조성물에서, 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체 및 인터루킨 22를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체 및 인터루킨 22 각각을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터루킨 29의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 췌장암을 포함하는 본 발명의 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1를 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, 상기 바이오마커의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다. 본 발명에서 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 표적 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포 또는 조직)에서 표적 유전자의 mRNA 발현량을 조사하여 유전자의 발현 정도를 결정한다. 따라사 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시할 수 있다. mRNA를 얻기 위하여, 먼저 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내 의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, qPCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
또한, 본 발명의 프라이머에 의하여 증폭되는 단편은 본 발명의 바이오마커 mRNA의 전체 또는 일부 단편일 수 있다.
본 발명의 프라이머는 표적유전자의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 표적 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛을 증폭하기 위한 프라이머로는 하기 표 1의 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프라이머 세트 1~3을 사용할 수 있다.
인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(IL-10RB) 프라이머 세트
세트 Type 서열 (5’→3’) 서열
번호		 Amplicon
사이즈 		증폭부위
1 Forward Primer ATG AGC ATT CAG ACT GGG TAA A 6
Reverse Primer GGG CTA AGA AAC GCA TAT GTA AAG 7
PCR산물 117 exon3-4
2 Forward Primer GAC TGG GTA AAC ATC ACC TTC T 8
Reverse Primer GGG CTA AGA AAC GCA TAT GTA AAG 9
PCR산물 106 exon3-4
3 Forward Primer GGA GCC ATG GAC AAC TTA TT 10
Reverse Primer GTT TCG TCA TGG GTT GTT TG 11
PCR산물 108 Exon5-6
4 TGAATACTACCTTGACGGAATG 12
Reverse Primer CAGGACAGAAGGTGATGTTT 13
PCR산물 123 exon3
5 Forward Primer GTGCGTTTACAAGAAGACAAAG 14
Reverse Primer CTCATCCGACAATGGAAAGG 15
PCR산물 127 exon6-7
6 Forward Primer GAACATTCTACAGTGGGAGTC 16
Reverse Primer ACATTCCGTCAAGGTAGTATTC 17
PCR산물 118 exon2-3
7 Forward Primer TCTCAAGTCTTTCCAAGTATGG 18
Reverse Primer ATCCACAGGACAGAAGGT 19
PCR산물 101 exon3
8 Forward Primer CTGTGGTGCGTTTACAAGA 20
Reverse Primer AAGTGTGTTATGATGAGGATGG 21
PCR산물 102 exon6-7
9 Forward Primer CACAGCTCAGTACCTAAGTTATAG 22
Reverse Primer CCAGTCTGAATGCTCATCTG 23
PCR산물 145 exon2-3
10 Forward Primer CAAACAACCCATGACGAAAC 24
Reverse Primer GCGTACTTTGTCTTCTTGTAAAC 25
PCR산물 134 exon5-6
11 Forward Primer CCTTGACGGAATGTGATTTCT 26
Reverse Primer GAAGGTGATGTTTACCCAGTC 27
PCR산물 107 exon3
12 Forward Primer GGCCATCCTCATCATAACAC 28
Reverse Primer GAGTCTTCTGCAATGACACTTA 29
PCR산물 95 exon7
13 Forward Primer CACAGCACCTGAAAGAGTT 30
Reverse Primer CTCTCAGAGTCTTCTGCAATG 31
PCR산물 124 exon6-7
14 Forward Primer CCTGTGGATGACACCATTATT 32
Reverse Primer CACATTCTTCATAGTCCAAGTTTC 33
PCR산물 126 exon3-4
15 Forward Primer TGACCACACCTTGAGAGT 34
Reverse Primer GGGTCCAATAATGGTGTCAT 35
PCR산물 97 exon3-4
16 Forward Primer GGTGTCAGCATTGGGAAT 36
Reverse Primer CTTAGGTACTGAGCTGTGAAAG 37
PCR산물 132 exon1-2
17 Forward Primer ATGGCCTCGGTCTTCAT 38
Reverse Primer AGGTGCTGTGGAAGAGAA 39
PCR산물 116 exon6
18 Forward Primer GACTTTCACAGCTCAGTACC 40
Reverse Primer CCATACTTGGAAAGACTTGAGA 41
PCR산물 99 exon2-3
19 Forward Primer ACTGGGTAAACATCACCTTC 42
Reverse Primer GTCCAAGTTTCGTATTCATTCTC 43
PCR산물
20 Forward Primer CTAGGAATTCTCTTCCACAGC 44
Reverse Primer AACATCATTCTCATCCGACAA 45
PCR산물 101 exon6-7
21 Forward Primer GTTCAAGTTCGAGGGTTTCT 46
Reverse Primer GACCGTTTCGTCATGGG 47
PCR산물 90 exon5-6
22 Forward Primer CTGTGAGCAAACAACCCA 48
Reverse Primer TCTTGTAAACGCACCACAG 49
PCR산물 128 exon5-6
23 Forward Primer CCTTTCCATTGTCGGATGA 50
Reverse Primer CAGCTGTCACCAGGATTC 51
PCR산물 94 exon7
24 Forward Primer GGTCCTCAGAAACCTGGA 52
Reverse Primer AGACAGGCTCACTCCATT 53
PCR산물 98 exon5
25 Forward Primer CAAAGGGAACCTGACTTTCA 54
Reverse Primer TTCAGCCCTGACTCTCAA 55
PCR산물 139 exon2-3
26 Forward Primer GGTACCACCTCCCGAAA 56
Reverse Primer TGAAAGTCAGGTTCCCTTTG 57
PCR산물 98 exon2
본 발명의 일 양태에서, 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛을 증폭하기 위한 프라이머로는 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프라이머 세트 1~4을 사용할 수 있다.
인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(IL-22RA1) 프라이머 세트
세트 Type 서열 (5’→3’) 서열번호 Amplicon 사이즈 증폭부위
1 Forward Primer CTG GGA CAC TTT CTA GTC CTA AAC C 58
Reverse Primer GCT TCT TGG GAT TCC TCC ATA G 59
136 exon7
2 Forward Primer CCA TGA CCT GTT CTA CCA CTT AG 60
Reverse Primer GTC AGG CCG AAG AAC TCA TAT T 61
96 exon4-5
3 Forward Primer CTG ATG TGA CCT GTA TCT CCA AAG 62
Reverse Primer CCT GGA GCT CTA AGT GGT AGA A 63
141 exon4
4 Forward Primer CAT CTT CCA TGA CCT GTT CTA C 64
Reverse Primer CAG GCC GAA GAA CTC ATA TTC 65
100 exon4-5
5 Forward Primer GGTCTACAGCATCGAGTATAAG 66
Reverse Primer TGACCCTGGCATAGTAGAG 67
PCR산물 137 exon2-3
6 Forward Primer GGAGGGAAGCAGAGAGAATA 68
Reverse Primer GGTGGGAACGCAAATCAT 69
PCR산물 84 exon5
7 Forward Primer CATGTTAGGTGGCCTTTCT 70
Reverse Primer GATGTTCTGTCTGTGCAAATC 71
PCR산물 108 exon7
8 Forward Primer CGAAGCTCAATTCCCATTCT 72
Reverse Primer CAGAACCTTCCATGCATACC 73
PCR산물 122 exon7
9 Forward Primer CCAGTCCAGCAACTTTGA 74
Reverse Primer CCTCTCTCCGTACGTCTTAT 75
PCR산물 100 exon2-3
10 Forward Primer AAGGTCAGCTTCAGAAAGAG 76
Reverse Primer CTTCTTGGGATTCCTCCATAG 77
PCR산물 99 exon7
11 Forward Primer ACATGGACCTACTCCTTCTC 78
Reverse Primer GGCTTGGTGACATATCTGTAG 79
PCR산물 95 exon6
12 Forward Primer CCAAGATGACTGACAGGTTC 80
Reverse Primer CGATCTCACTTTGGAGATACAG 81
PCR산물 83 exon3-4
13 Forward Primer CATGACCTGTTCTACCACTTAG 82
Reverse Primer CATGATGGTGCCAAGGAA 83
PCR산물 126 exon4-5
14 Forward Primer TGGAAGGTTCTGGCAAAG 84
Reverse Primer CAGAGAAAGGCCACCTAAC 85
PCR산물 122 exon7
15 Forward Primer GTTCCTTGGCACCATCAT 86
Reverse Primer AGAAGGAGTAGGTCCATGTC 87
PCR산물 107 exon5-6
16 Forward Primer CTATGGAGGAATCCCAAGAAG 88
Reverse Primer CCTTTAGGTACTGTGGTGTC 89
PCR산물 120 exon7
17 Forward Primer CACCTGATGTGACCTGTATC 90
Reverse Primer GAAGATGTCTTCCAGGGTTAG 91
PCR산물 113 exon4
18 Forward Primer GGGACACCACAGTACCTAAA 92
Reverse Primer GAACATGGACGGGAAGGA 93
PCR산물 104 exon7
19 Forward Primer GAGCTACAGATATGTCACCAAG 94
Reverse Primer AGGTCAAAGACAGGGATCA 95
본 발명의 일 양태에서, 인터루킨 22를 증폭하기 위한 프라이머로는 하기 표 3의 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프라이머 세트 1~3을 사용할 수 있다.
인터루킨 22 프라이머 세트
세트 Type 서열 (5’→3’) 서열
번호 		Amplicon
사이즈		 증폭부위
1 Forward Primer AAC TTC CAG CAG CCC TAT ATC 96
Reverse Primer ATA GCA GCG CTC ACT CAT AC 97
PCR산물 135 exon1-3
2 Forward Primer AAG TCC AAC TTC CAG CAG CCC TAT 98
Reverse Primer AGG GAA CAG CAC TTC TTC AAG GGT 99
PCR산물 189 exon1-3
3 Forward Primer GGC TAG CTT GGC TGA TAA C 100
Reverse Primer GCA CCT GCT TCA TCA GAT AG 101
PCR산물 101 exon1-3
4 Forward Primer TGTTCCACGGAGTCAGTAT 102
Reverse Primer GCATATAAGGCTGGAACCTATC 103
PCR산물 111 exon2-3
5 Forward Primer AAGTGCTGTTCCCTCAATC 104
Reverse Primer GCAGGTCATCACCTTCAATA 105
PCR산물 114 exon3-4
6 Forward Primer AGCTGCCTCCTTCTCTT 106
Reverse Primer GGTGCGGTTGGTGATATAG 107
PCR산물 114 exon1
7 Forward Primer AGGCTAAGCACATGTCATATT 108
Reverse Primer ATCTCTCCACTCTCTCCAAG 109
PCR산물 101 exon3-4
8 Forward Primer CACCTTCATGCTGGCTAAG 110
Reverse Primer TAGCAGCGCTCACTCATA 111
PCR산물 105 exon1-3
9 Forward Primer TGGCTGATAACAACACAGAC 112
Reverse Primer GTTCAGCACCTGCTTCAT 113
PCR산물 98 eoxn2-3
10 Forward Primer TTCCAGCAGCCCTATATCA 114
Reverse Primer ATACTGACTCCGTGGAACA 115
PCR산물 116 exon1-3
11 Forward Primer CTGTTCCCTCAATCTGATAGG 116
Reverse Primer CTCTGGATATGCAGGTCATC 117
PCR산물 119 exon3-4
12 Forward Primer CCCTTGAAGAAGTGCTGTT 118
Reverse Primer GACATGTGCTTAGCCTGTT 119
PCR산물 102 exon3-4
13 Forward Primer ATCTGTGAGCTCTTTCCTTATG 120
Reverse Primer ATATAGGGCTGCTGGAAGT 121
PCR산물 138 exon1
14 Forward Primer GCTGAAGGACACAGTGAAA 122
Reverse Primer CTCAGAGACATAAACAGCAAATC 123
PCR산물 84 exon4-5
15 Forward Primer TTGACAAGTCCAACTTCCAG 124
Reverse Primer ACGAACGTCTGTGTTGTTAT 125
PCR산물 95 exon1-2
16 Forward Primer ACGGAGTCAGTATGAGTGAG 126
Reverse Primer GAACCTATCAGATTGAGGGAAC 127
PCR산물 92 exon2-3
17 Forward Primer CAGACGTTCGTCTCATTGG 128
Reverse Primer GGGAACAGCACTTCTTCAA 129
PCR산물 109 exon2-3
18 Forward Primer GATAGGTTCCAGCCTTATATGC 130
Reverse Primer CACTGTGTCCTTCAGCTTT 131
PCR산물 132 exon3-4
19 Forward Primer GAGCGCTGCTATCTGATGAA 132
Reverse Primer GCACCACCTCCTGCATATAA 133
본 발명의 일 양태에서, 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1를 증폭하기 위한 프라이머로는 하기 표 4의 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프라이머 세트 1을 사용할 수 있다.
인터페론 람다 수용체 아이소폼 1 프라이머 세트
세트 Type 서열 (5’→3’) 서열번호 Amplicon 사이즈 증폭부위
1 Forward Primer CGTTCAGTGTCCCGAAATACA 134
Reverse Primer CCCTGCGGCAATTACTAACA 135
PCR 산물 135 exon5-6
2 Forward Primer TGGGTCCTCTGGCTATTT 136
Reverse Primer CCAGGAGGAGAGGTTATCTT 137
PCR 산물 142 exon7
3 Forward Primer GAATGACTTGTTCCTCTGTCC 138
Reverse Primer TCTTCTGTGTCCTCCTCATC 139
PCR 산물 147 exon7
4 Forward Primer CCACCCAACAGACAAGATG 140
Reverse Primer GAAGGTGGTTCAATGTAGGG 141
PCR 산물 109 exon7
5 Forward Primer CCCTACATTGAACCACCTTC 142
Reverse Primer CTGAAGAATCCCAAGCAGAG 143
PCR 산물 136 exon7
6 Forward Primer AACAGACAAGATGGAAGAAGG 144
Reverse Primer CAGGAAAGAAGGTGGTTCAA 145
PCR 산물 110 exon7
7 Forward Primer GAGTCCGTGAATGACTTGTT 146
Reverse Primer CCTCATCCTCCTCCTCTTC 147
PCR 산물 142 exon7
8 Forward Primer GCTTCTGATACTGCTGTTAGTA 148
Reverse Primer GGTGTGTGTGTCCAGAAA 149
PCR 산물 122 exon6-7
9 Forward Primer GTTTCAGCGGGCAAAGA 150
Reverse Primer GACAGAGGAACAAGTCATTCA 151
PCR 산물 110 exon6-7
10 Forward Primer TCAGTGCCAGAACCATCTA 152
Reverse Primer CAGCAGTATCAGAAGCGATG 153
PCR 산물 131 exon5-6
11 Forward Primer TAAGCCCACCTGCTTCTT 154
Reverse Primer ATGAGGGTCTTCCAGATCAC 155
PCR 산물 120 exon5-6
12 Forward Primer GAAGAGCTCCCAGAAGATAAC 156
Reverse Primer CAGAAGGTCAGTGTCTGAAG 157
PCR 산물 113 exon7
13 Forward Primer TCCTCTGCTTGGGATTCT 158
Reverse Primer GAGATTCTTGGTGCCCATC 159
PCR 산물 136 exon7
14 Forward Primer TCCGAATACCTGGATTACCT 160
Reverse Primer CAGAATGCCACCTCATACTT 161
PCR 산물 149 exon3-4
15 Forward Primer AAACAAGACCCTATTTCCAGTC 162
Reverse Primer GGCTTAGAGAACTTGCTGTATT 163
PCR 산물 141 exon4-5
16 Forward Primer CTGGCTATTTGGCTGAGAA 164
Reverse Primer GTTATCTTCTGGGAGCTCTTC 165
PCR 산물 122 exon7
17 Forward Primer AAGTATGAGGTGGCATTCTG 166
Reverse Primer GAACGTGTAGATGGTTCTGG 167
PCR 산물 144 exon4-5
18 Forward Primer CCTGTGGCAACCTTTCA 168
Reverse Primer GGTCCTTCTTCCATCTTGTC 169
PCR 산물 142 exon7
19 Forward Primer AAGGAGCTGCTATGTTCTATG 170
Reverse Primer GTAATCCAGGTATTCGGACTC 171
PCR 산물 126 exon3
20 Forward Primer AGACCAGAGTCCGTGAAT 172
Reverse Primer CTCTGCAAGGTCCTTCTTC 173
PCR 산물 126 exon7
21 Forward Primer CCCAGGATGTGACCTATTT 174
Reverse Primer GTTTCTTCAGGCACATCATAG 175
이렇게 증폭된 표적 유전자의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 각 유전자의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 각 유전자의 발현이 정상인의 발현 수준과 비교하여 높은 수준으로 나오는 경우에는 췌장암으로 진단할 수 있다.
또한, 상기 표적 유전자 또는 이의 cDNA에 혼성화되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 췌장암 가능성을 진단할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 표적 유전자 cDNA에 혼성화되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀 룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이로 제조될 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다. 각 표적 유전자의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 유전자의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다. 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스옥시다아제와 t- NBT(nitroblue tetrazolium)등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 췌장암으로의 진행 가능성을 예측할 수 있다. 즉, 시료에서 각 표적 유전자 cDNA에 대한 시그널이 정상인에서의 발현수준의 것 보다 강하게 나오는 경우에는 췌장암 가능성을 진단할 수 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496502] LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 췌장암 진단용 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트를 사용하는 경우, 정상군과 췌장암의 환자군을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있다. 아울러, 다른 종류의 암, 예를 들면 폐암 또는 대장암 등과 구별하여 췌장암을 선별적으로 검출 또는 진단할 수 있으며, 뿐만아니라, 종래의 진단방법으로 구분이 어려웠던 췌장염 및 담도암을 췌장암과 구분하여 정확히 검출 또는 진단할 수 있다.
발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 질환의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 암호화하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다.
또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 혈액성분을 포함하는 샘플에서, (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 샘플은 혈액 유래 단핵구인 것을 특징으로 할 수 있으며, 샘플에서 측정된 상기 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB)과 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현수준이 정상 대조군에서의 발현수준보다 높은 경우 췌장 질환의 발병가능성이 높다고 판정하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 상기 바이오마커 조합에서 3이상의 바이오마커 단백질 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현수준이 정상 대조군에서의 발현수준보다 높은 경우 췌장 질환의 발병가능성이 높다고 판정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공방법을 사용하는 경우, 정상군과 췌장암의 환자군을 구별하여 검출 또는 진단할 수 있다. 아울러, 다른 종류의 암, 예를 들면 폐암 또는 대장암 등과 구별하여 췌장암을 선별적으로 검출 또는 진단할 수 있으며, 뿐만아니라, 종래의 진단방법으로 구분이 어려웠던 췌장염 및 담도암을 췌장암과 구분하여 정확히 검출 또는 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체 및 상기 인터루킨 22의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22, 상기 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1 각각에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서, 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체 및 상기 인터루킨 22의 발현 수준은 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
한편, 본 발명에서는, 상기 단백질의 발현 수준의 측정 또는 비교분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1 각각의 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서는 상기 인터루킨 10 수용체, 상기 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준의 측정 또는 비교는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 질환 발병 여부를 진단하고자 하는 개체의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 췌장암 등의 질환의 발병 가능성 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체로부터 분리된 생검으로부터 측정된 인터루킨 10 수용체와 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1로 구성되는 군에서 선택되는 바이오마커 중 하나 이상의 바이오마커 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준 보다 높은 경우 질환 중 특히 췌장 질환의 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체로부터 분리된 생검으로부터 측정된 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 22 수용체, 상기 인터루킨 22 및 인터페론 람다 수용체 아이소폼 1으로 구성되는 바이오마커 중 2이상의 바이오마커를 발현하는 세포수의 비율이 정상 대조군 대비 3배 내지 20배, 4배 내지 18배, 5배 내지 13배, 7배 내지 11배, 또는 8배 내지 10배인 경우 췌장 질환, 특히는 췌장암의 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다. 바람직하게는 상기 목적하는 개체로부터 분리된 생검으로부터 측정된 바이오마커의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준이 증가된 경우 췌장 질환, 특히는 췌장암의 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: qPCR을 이용한 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서의 췌장암 바이오마커의 발현 확인
췌장암에서 췌장암 바이오마커의 발현변화를 확인하기 위하여, 췌장암 환자의 혈액 유래 말초혈액 단핵구에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22, IL-29 및 IFNLR isoform1의 mRNA 발현을 확인하였다. 추가적으로, 대조군으로 췌장암 바이오마커로 이미 알려진 GPC-1(Glypican-1)의 mRNA 발현을 확인하였다.
먼저, 췌장암 환자 42명과 췌장염환자 18명, 담도암 환자 18명 및 정상 대조군 24명의 혈액을 EDTA 튜브에 채취하여 상온에 보관하였다. 혈액의 점도가 높을 경우 단핵구의 분리가 어려우므로, 1X PBS에 1:1로 희석하여 준비하였다. 15ml 코니칼 튜브(conical tube)에 비중차이가 나는 피콜(Histopaq 1077 및 1119, sigma)을 두가지 준비하고, 피콜 위에 혈액 샘플이 섞이지 않게 첨가하였다. 가속과 감속을 최소로 하여 800g으로 25분 동안 원심분리하면, 비중이 다른 혈장, 말초혈액단핵구(PBMC), Histopaq 1077, 과립구, Histopaq 1119, 적혈구 순으로 분리된다. 중간에 흰 세포층(단핵구)을 따로 회수한 뒤 PBS를 첨가하여 400g으로 3분 동안 원심분리하며 세척한 후 사용하였으며, 나머지는 -80℃에 보관하였다.
상기 수득한 단핵구에서 qPCR을 이용하여, 각 군에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22, IL-29, IFNLR isoform1 및 GPC-1의 mRNA 발현수준을 측정하였다.
각각의 세포는 RNA를 분리한 후(Qiagen, USA), PrimeScript RT Master MIX(Perfect Real Time, Takara #RR036A)를 이용하여, cDNA를 제조하고, StepOnePlus(AB사) PCR 기기를 사용하여 PCR을 수행하였다. 분석은 기기 상의 Ct 값을 excel에서 data화 한 다음에, Prism으로 그래프를 그려 확인하였다. 사용한 프라이머 서열(5'→3')은 다음과 같다.
IL-10R
F: ATG AGC ATT CAG ACT GGG TAA A(서열번호 6)
R: GGG CTA AGA AAC GCA TAT GTA AAG(서열번호 7)
IL-22R
F: CTG GGA CAC TTT CTA GTC CTA AAC C(서열번호 58)
R: GCT TCT TGG GAT TCC TCC ATA G(서열번호 59)
IL-22
F: AAC TTC CAG CAG CCC TAT ATC(서열번호 96)
R: ATA GCA GCG CTC ACT CAT AC(서열번호 97)
IFNLR1
F: CGT TCA GTG TCC CGA AAT ACA(서열번호 134)
R: CCC TGC GGC AAT TAC TAA CA(서열번호 135)
IL-29
F: CTA GAC CAG CCC CTT CAC AC(서열번호 176)
R: AAG GTG ACA GAT GCC TCC AG(서열번호 177)
GPC-1
F: GTC ATG AAG CTG GTC TAC TG(서열번호 178)
R: AGC CCT TGA GCA CAT TTC(서열번호 179)
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 말초혈액단핵구 샘플에서는 정상 대조군, 췌장염, 담도암 군에 비해, 췌장암군에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22, IFNLR isoform1, IL-29 및 GPC-1의 mRNA의 발현수준이 유의미하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(ΔCt값의 감소는 유전자 발현의 증가를 의미함). 아울러, 췌장암군과 췌장염군을 비교하였을 때, 췌장암군에서 IL-10RB, IL-22RA, IL-22 및 GPC-1의 mRNA 발현수준이 유의미하게 증가하였고, 췌장암군과 담도암군을 비교하였을 때, 췌장암군에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 mRNA 발현수준이 유의미하게 증가하여, IFNLR isoform1, IL-29 및 GPC-1 마커로는 췌장암과 담도암의 구별이 어려우며, IFNLR isoform1 및 IL-29 마커로는 췌장암과 췌장염의 구별이 어려운 것으로 확인되었다.
말초혈액 단핵구 샘플에서 췌장암을 정상인, 췌장염 및 담도암과 모두 유의미하게 구별할 수 있는 마커는 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22인 것으로 확인되었다.
실시예 2: qPCR 데이터를 이용한 바이오마커 조합에 의한 췌장암 진단 효율 확인
실시예 1에서 획득한 결과를 바탕으로, 바이오마커 조합에 의한 췌장암 진단효율 향상을 위하여, 다양한 조합으로 진단효율 스코어(score)를 분석하였다.
분석 소프트 웨어는 SASSAS (version 9.3, SAS Inc., Cary, NC, USA)를 사용하였다. 하기 분석에서 민감도 (Sensitivity)는 질병을 가지고 있는 사람이 진단에서 양성의 결과를 얻을 확률을 나타내며, 특이도 (Specificity)는 질병을 가지고 있지 않은 사람이 진단에서 음성의 결과를 얻을 확률을 나타내며 AUC (Area Under the roc Curve)는 ROC 곡선의 아래 면적으로, 예측 인자의 performance를 평가하는 척도이다.
* ROC (Receiver Operating Characteristic): 예측 인자를 이용한 진단 결과의 민감도(Y축)와 1-특이도(X축)간의 산점도를 연결한 커브이다.
여기서 질병을 가지고 있는 군은 췌장암군을 의미하고, 질병을 가지고 있지 않은 군은 대조군, 췌장염 및 담도암군을 의미한다. 진단 결과는 biomarker의 조합이 optimal cut-off point를 넘을 때의 결과를 의미한다. 3가지 척도 모두 0.5에 가까울수록 질병에 대한 변별력이 낮아지는 것을 의미하고, 1에 가까울수록 질병에 대한 변별력이 높아지는 것을 의미한다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 췌장암군과 대조군, 췌장염 및 담도암군 예측을 위해 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22 조합으로 predicted probability (p) 분석한 결과에서, IL-10RB와 IL-22RA의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.838이고, 민감도(sensitivity)가 0.881이며, 특이도(specificity)가 0.767이었다. IL-10RB와 IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.850이고, 민감도(sensitivity)가 0.810이며, 특이도(specificity)가 0.847이었다. IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.856이고, 민감도(sensitivity)가 0.833이며, 특이도(specificity)가 0.864이었다. 세가지 마커를 모두 포함하는 조합이 진단정확도와 특이도가 가장 높아, 췌장암 여부에 대한 높은 예측력을 나타내었다.
아울러, 도 4에 나타난 바와 같이, 췌장암군과 대조군, 췌장염 및 담도암군 예측을 위해 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22 조합으로 스코어링(scoring) 분석한 결과, IL-10RB와 IL-22RA의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.818이고, 민감도(sensitivity)가 0.905이며, 특이도(specificity)가 0.583이었다. IL-10RB와 IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.801이고, 민감도(sensitivity)가 0.881이며, 특이도(specificity)가 0.661이었다. IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.840이고, 민감도(sensitivity)가 0.667이며, 특이도(specificity)가 0.881이었다. 세가지 마커를 모두 포함하는 조합이 진단정확도와 특이도가 가장 높아, 췌장암 여부에 대한 높은 예측력을 나타내었다.
실시예 3: FACS를 이용한 말초혈액 단핵구(PBMC)에서의 췌장암 바이오마커의 발현 확인
췌장암에서 췌장암 바이오마커의 발현변화를 확인하기 위하여, 췌장암 환자의 혈액 유래 말초혈액 단핵구에서 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22의 단백질 발현을 각각에 특이적인 항체를 이용하여, FACS 분석을 통하여 확인하였다. 사용한 항체는 하기 항체를 사용하였다.
1. PE - anti human IL-22 antibody (Biolegend, Ca.366704), Isotype: PE anti mouse IgG2a
2. PerCP - anti human IL-22R antibody(R&D, Ca. FAB2770C), Isotype: Percp anti mouse IgG1
3. PE - anti human IL-10R antibody(Biolegend, Ca. 308804), Isotype : PE anti mouse IgG2a
먼저, 췌장암 환자 63명과 췌장염환자 50명, 담도암 환자 31명 및 정상 대조군 51명의 혈액을 췌취하여 실시예 1과 동일한 방법으로 혈액에서 말초혈액 단핵구를 분리하였다.
분리된 단핵구로 IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22에 대한 세포표면 마커용 FACS 분석을 수행하였으며, 50μL FACS 버퍼에 단핵구 세포를 현탁시키고, IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22에 대한 항체를 각각 처리하고, 얼음에서 1시간 반응시킨 후, FACS 버퍼로 2회 세척후, FACS 버퍼 500μL에 재현탁 시킨 후, 리딩을 수행하였다.
세포내 마커를 위한 FACS 염색은 단핵구 세포를 500μL 고정버퍼에 첨가하여 얼음에서 30분간 고정한 후, FACS 버퍼로 2회 세척 후, Perm 버퍼 1mL에 재현탁시킨 후, 20분간 2회 원심분리하고, Perm 버퍼 50μL에 재현탁한 후, 얼음에서 1시간 항체와 반응시켰다. 그 후, FACS 버퍼로 2회 세척하고, FACS 버퍼 500μL에 재현탁 시킨 후, 리딩을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Newman-Keuls multiple comparison test로 나타내었다. 정상 대조군, 췌장염군 및 담도암군에 비하여 췌장암군에서 바이오마커 발현 수준이 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 특히, IL-10RB 양성 세포와 IL-22 양성세포가 증가하였다. 상기 결과를 이용한 ANOVA 검정 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, IL-22RA와 IL-10RB는 정상인, 췌장염 및 담도암 각각에 대하여, 양성 세포수에서 유의한 차이를 나타내었으며, IL-22의 경우는 정상인 vs 췌장암에서 유의한 차이를 나타내었다.
실시예 4: FACS 데이터를 이용한 바이오마커 조합에 의한 췌장암 진단 효율 확인
실시예 3에서 획득한 결과를 바탕으로, 바이오마커 조합에 의한 췌장암 진단효율 향상을 위하여, 다양한 조합으로 진단효율 스코어(score)를 분석하였다.
독립표본 t-검정(independent two sample t-test)을 수행한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, IL-22 + IL-22RA 조합, IL-22 + IL-10RB 조합, IL-22RA + IL-10RB 조합, 및 IL-22 + IL-22RA + IL-10RB 모두에서 정상인, 췌장염 및 담도암 군과 췌장암이 유의한 평균차이를 나타내었다.
로지스틱 회귀(logistic regression) 분석 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Model 1(IL-22), Model 2(IL-22RA), Model 3(IL-10RB)은 단변수 로지스틱 회귀분석(univariable logistic regression)을 수행하였고, Model 4(IL-22 + IL-22RA), Model 5(IL-22 + IL-10RB), Model 6(IL-22RA + IL-10RB)은 2개 변수에 대한 다변수 로지스틱 회귀분석(multivariable logistic regression)을 수행하고, Model 7(IL-22 + IL-22RA + IL-10RB)은 3개 변수에 대한 다변수 로지스틱 회귀분석(multivariable logistic regression)을 수행하였다. Model 5, Model 6 및 Model 7의 다변수 로지스틱 회귀분석에서는 모형의 확률값을 받아서 분석하였으며, 진단정확도(AUC)는 Model 7이 가장 큰 예측력을 보였고, 연속형 변수들의 최적 컷오프 포인트를 끊은 후, 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 구하였다. 7개 model 중 진단정확도(AUC), 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)가 가장 큰 값을 분홍색으로 나타내었다.
그 결과, IL-22 + IL-22RA + IL-10RB 조합인 model 7의 경우 진단정확도(AUC)가 0.739로 가장 높은 것으로 확인되었다.
아울러, IL-22(A) + IL-22RA(AR) + IL-10RB(BR) 조합 중 하나의 마커를 IFNLR1(LR)로 치환한 바이오마커 조합에 의한 췌장암 진단효율 스코어(score)를 분석한 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, IL-10RB+IFNLR1+IL-22의 조합(BR+LR+A)과 L-10RB+IL-22RA+IFNLR1 조합(BR+AR+LR)의 경우, 정확도에서 IL-22+IL-22RA+IL-10RB 조합(BR+AR+A)과 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
AUC(95% CI) vs BR+AR+A vs LR+AR+A vs BR+LR+A vs BR+AR+LR
1) outcome : 1+3+4 vs 2
BR+AR+A (Model14) 0.856(0.777-0.936) ref 0.0674 0.6922 0.9418
BR+LR+A 0.850(0.772-0.929) 0.6922 0.0874 ref 0.7101
BR+AR+LR 0.858(0.778-0.938) 0.9418 0.0546 0.7101 ref
2) outcome : 1 vs 2
BR+AR+A (Model14) 0.866(0.773-0.959) ref 0.122 0.8444 0.9098
BR+LR+A 0.869(0.784-0.954) 0.8444 0.0701 ref 0.7673
BR+AR+LR 0.863(0.774-0.952) 0.9098 0.0979 0.7673 ref
1+3+4 vs 2: 정상 대조군, 췌장염 및 담도암군 vs 췌장암
1 vs 2: 정상 대조군 vs 췌장암
BR:IL-10RB, LR: IFNLR1, AR:IL-22RA 및 A:IL-22
비교예 : IL- 10RB마커 제외 조합에 의한 췌장암 진단
실시예 1에서 획득한 결과를 바탕으로, IL-10RB(BR)마커를 제외한 마커 조합에 의한 췌장암 진단효율 스코어(score)를 분석하였으며, 분석은 실시예 2의 방법으로 ROC (Receiver Operating Characteristic)을 수행하였다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 췌장암군과 정상 대조군, 췌장염 및 담도암군 예측을 위해 IFNLR1, IL-10RB, IL-22RA 및 IL-22 조합으로 predicted probability (p) 분석한 결과에서, IL-22 + IL-22RA + IL-10RB 조합의 진단정확도(AUC)가 0.856이었고, IFNLR1+IL-22RA+IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.795로 현저히 떨어졌고, 아울러, 췌장암군과 정상 대조군 예측을 결과에서는 L-22 + IL-22RA + IL-10RB 조합의 진단정확도(AUC)가 0.866이었고, IFNLR1+IL-22RA+IL-22의 조합은 진단정확도(AUC)가 0.777로 역시 현저히 떨어지는 것으로 나타났다.
AUC(95% CI) vs BR+AR+A vs LR+AR+A vs BR+LR+A vs BR+AR+LR
1) outcome : 1+3+4 vs 2
BR+AR+A (Model14) 0.856(0.777-0.936) ref 0.0674 0.6922 0.9418
LR+AR+A 0.795(0.707-0.882) 0.0674 ref 0.0874 0.0546
BR+LR+A 0.850(0.772-0.929) 0.6922 0.0874 ref 0.7101
BR+AR+LR 0.858(0.778-0.938) 0.9418 0.0546 0.7101 ref
2) outcome : 1 vs 2
BR+AR+A (Model14) 0.866(0.773-0.959) ref 0.122 0.8444 0.9098
LR+AR+A 0.777(0.660-0.894) 0.122 ref 0.0701 0.0979
BR+LR+A 0.869(0.784-0.954) 0.8444 0.0701 ref 0.7673
BR+AR+LR 0.863(0.774-0.952) 0.9098 0.0979 0.7673 ref
1+3+4 vs 2: 정상 대조군, 췌장염 및 담도암군 vs 췌장암
1 vs 2: 정상 대조군 vs 췌장암
BR:IL-10RB, LR: IFNLR1, AR:IL-22RA 및 A:IL-22
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> HuVet bio, InC. <120> Composition for Diagnosing Pancreatic Cancer <130> P18-B248 <160> 179 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens IL-10RB <400> 1 Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 35 40 45 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His 115 120 125 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala 210 215 220 Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly 225 230 235 240 Cys Phe Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe 245 250 255 Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His 260 265 270 Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu 275 280 285 Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser 290 295 300 Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly 305 310 315 320 Gln Gly Pro Gln Ser 325 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens IL-22RA <400> 2 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60 Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205 Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile 290 295 300 Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser 305 310 315 320 Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys 370 375 380 Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415 Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460 His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val 465 470 475 480 Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510 Leu Gln Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540 Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560 Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 565 570 <210> 3 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens IL-22 <400> 3 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Ile <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens IL-29 <400> 4 Met Ala Ala Ala Trp Thr Val Val Leu Val Thr Leu Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Thr Ser Lys Pro Thr Thr Thr Gly Lys 20 25 30 Gly Cys His Ile Gly Arg Phe Lys Ser Leu Ser Pro Gln Glu Leu Ala 35 40 45 Ser Phe Lys Lys Ala Arg Asp Ala Leu Glu Glu Ser Leu Lys Leu Lys 50 55 60 Asn Trp Ser Cys Ser Ser Pro Val Phe Pro Gly Asn Trp Asp Leu Arg 65 70 75 80 Leu Leu Gln Val Arg Glu Arg Pro Val Ala Leu Glu Ala Glu Leu Ala 85 90 95 Leu Thr Leu Lys Val Leu Glu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Glu Asp 100 105 110 Val Leu Asp Gln Pro Leu His Thr Leu His His Ile Leu Ser Gln Leu 115 120 125 Gln Ala Cys Ile Gln Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Arg Pro Arg Gly 130 135 140 Arg Leu His His Trp Leu His Arg Leu Gln Glu Ala Pro Lys Lys Glu 145 150 155 160 Ser Ala Gly Cys Leu Glu Ala Ser Val Thr Phe Asn Leu Phe Arg Leu 165 170 175 Leu Thr Arg Asp Leu Lys Tyr Val Ala Asp Gly Asn Leu Cys Leu Arg 180 185 190 Thr Ser Thr His Pro Glu Ser Thr 195 200 <210> 5 <211> 520 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens IFNLR isoform1 <400> 5 Met Ala Gly Pro Glu Arg Trp Gly Pro Leu Leu Leu Cys Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ala Ala Pro Gly Arg Pro Arg Leu Ala Pro Pro Gln Asn Val Thr Leu 20 25 30 Leu Ser Gln Asn Phe Ser Val Tyr Leu Thr Trp Leu Pro Gly Leu Gly 35 40 45 Asn Pro Gln Asp Val Thr Tyr Phe Val Ala Tyr Gln Ser Ser Pro Thr 50 55 60 Arg Arg Arg Trp Arg Glu Val Glu Glu Cys Ala Gly 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Asp Ala 485 490 495 Gly Ser Trp Gly Ala Glu Ser Thr Gln Arg Thr Glu Asp Arg Gly Arg 500 505 510 Thr Leu Gly His Tyr Met Ala Arg 515 520 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgagcattc agactgggta aa 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gggctaagaa acgcatatgt aaag 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gactgggtaa acatcacctt ct 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gggctaagaa acgcatatgt aaag 24 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggagccatgg acaacttatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtttcgtcat gggttgtttg 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgaatactac cttgacggaa tg 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caggacagaa ggtgatgttt 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gtgcgtttac aagaagacaa ag 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctcatccgac aatggaaagg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaacattcta cagtgggagt c 21 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acattccgtc aaggtagtat tc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tctcaagtct ttccaagtat gg 22 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atccacagga cagaaggt 18 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctgtggtgcg tttacaaga 19 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aagtgtgtta tgatgaggat gg 22 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cacagctcag tacctaagtt atag 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccagtctgaa tgctcatctg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 caaacaaccc atgacgaaac 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcgtactttg tcttcttgta aac 23 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 ccttgacgga atgtgatttc t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gaaggtgatg tttacccagt c 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ggccatcctc atcataacac 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gagtcttctg caatgacact ta 22 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cacagcacct gaaagagtt 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ctctcagagt cttctgcaat g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cctgtggatg acaccattat t 21 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cacattcttc atagtccaag tttc 24 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 tgaccacacc ttgagagt 18 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gggtccaata atggtgtcat 20 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ggtgtcagca ttgggaat 18 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cttaggtact gagctgtgaa ag 22 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 atggcctcgg tcttcat 17 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 aggtgctgtg gaagagaa 18 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gactttcaca gctcagtacc 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ccatacttgg aaagacttga ga 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 actgggtaaa catcaccttc 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gtccaagttt cgtattcatt ctc 23 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ctaggaattc tcttccacag c 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 aacatcattc tcatccgaca a 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gttcaagttc gagggtttct 20 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gaccgtttcg tcatggg 17 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ctgtgagcaa acaaccca 18 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tcttgtaaac gcaccacag 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cctttccatt gtcggatga 19 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 cagctgtcac caggattc 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ggtcctcaga aacctgga 18 <210> 53 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 agacaggctc actccatt 18 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 caaagggaac ctgactttca 20 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ttcagccctg actctcaa 18 <210> 56 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ggtaccacct cccgaaa 17 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 tgaaagtcag gttccctttg 20 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ctgggacact ttctagtcct aaacc 25 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gcttcttggg attcctccat ag 22 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ccatgacctg ttctaccact tag 23 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gtcaggccga agaactcata tt 22 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ctgatgtgac ctgtatctcc aaag 24 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 cctggagctc taagtggtag aa 22 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 catcttccat gacctgttct ac 22 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 caggccgaag aactcatatt c 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 ggtctacagc atcgagtata ag 22 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tgaccctggc atagtagag 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ggagggaagc agagagaata 20 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ggtgggaacg caaatcat 18 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 catgttaggt ggcctttct 19 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 gatgttctgt ctgtgcaaat c 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 cgaagctcaa ttcccattct 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 cagaaccttc catgcatacc 20 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ccagtccagc aactttga 18 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 cctctctccg tacgtcttat 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 aaggtcagct tcagaaagag 20 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 cttcttggga ttcctccata g 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 acatggacct actccttctc 20 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ggcttggtga catatctgta g 21 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ccaagatgac tgacaggttc 20 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 cgatctcact ttggagatac ag 22 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 catgacctgt tctaccactt ag 22 <210> 83 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 catgatggtg ccaaggaa 18 <210> 84 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 tggaaggttc tggcaaag 18 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 cagagaaagg ccacctaac 19 <210> 86 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 gttccttggc accatcat 18 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 agaaggagta ggtccatgtc 20 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 ctatggagga atcccaagaa g 21 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 cctttaggta ctgtggtgtc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 cacctgatgt gacctgtatc 20 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 gaagatgtct tccagggtta g 21 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 gggacaccac agtacctaaa 20 <210> 93 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 gaacatggac gggaagga 18 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 gagctacaga tatgtcacca ag 22 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 aggtcaaaga cagggatca 19 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 aacttccagc agccctatat c 21 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 atagcagcgc tcactcatac 20 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 aagtccaact tccagcagcc ctat 24 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 agggaacagc acttcttcaa gggt 24 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 ggctagcttg gctgataac 19 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 gcacctgctt catcagatag 20 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 tgttccacgg agtcagtat 19 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 gcatataagg ctggaaccta tc 22 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 aagtgctgtt ccctcaatc 19 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gcaggtcatc accttcaata 20 <210> 106 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 agctgcctcc ttctctt 17 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 ggtgcggttg gtgatatag 19 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 aggctaagca catgtcatat t 21 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 atctctccac tctctccaag 20 <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 caccttcatg ctggctaag 19 <210> 111 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 tagcagcgct cactcata 18 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 tggctgataa caacacagac 20 <210> 113 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 gttcagcacc tgcttcat 18 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 ttccagcagc cctatatca 19 <210> 115 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 atactgactc cgtggaaca 19 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 ctgttccctc aatctgatag g 21 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 ctctggatat gcaggtcatc 20 <210> 118 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 cccttgaaga agtgctgtt 19 <210> 119 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 gacatgtgct tagcctgtt 19 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 atctgtgagc tctttcctta tg 22 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 atatagggct gctggaagt 19 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 gctgaaggac acagtgaaa 19 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 ctcagagaca taaacagcaa atc 23 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 ttgacaagtc caacttccag 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 acgaacgtct gtgttgttat 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 acggagtcag tatgagtgag 20 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 gaacctatca gattgaggga ac 22 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 cagacgttcg tctcattgg 19 <210> 129 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 gggaacagca cttcttcaa 19 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 gataggttcc agccttatat gc 22 <210> 131 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 cactgtgtcc ttcagcttt 19 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 gagcgctgct atctgatgaa 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 gcaccacctc ctgcatataa 20 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 cgttcagtgt cccgaaatac a 21 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 ccctgcggca attactaaca 20 <210> 136 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 tgggtcctct ggctattt 18 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 ccaggaggag aggttatctt 20 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 gaatgacttg ttcctctgtc c 21 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 tcttctgtgt cctcctcatc 20 <210> 140 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 ccacccaaca gacaagatg 19 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 gaaggtggtt caatgtaggg 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ccctacattg aaccaccttc 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 ctgaagaatc ccaagcagag 20 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 aacagacaag atggaagaag g 21 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 caggaaagaa ggtggttcaa 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 gagtccgtga atgacttgtt 20 <210> 147 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 cctcatcctc ctcctcttc 19 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 gcttctgata ctgctgttag ta 22 <210> 149 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 149 ggtgtgtgtg tccagaaa 18 <210> 150 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 150 gtttcagcgg gcaaaga 17 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 151 gacagaggaa caagtcattc a 21 <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 152 tcagtgccag aaccatcta 19 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 153 cagcagtatc agaagcgatg 20 <210> 154 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 154 taagcccacc tgcttctt 18 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 155 atgagggtct tccagatcac 20 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 156 gaagagctcc cagaagataa c 21 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 157 cagaaggtca gtgtctgaag 20 <210> 158 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 158 tcctctgctt gggattct 18 <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 159 gagattcttg gtgcccatc 19 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 160 tccgaatacc tggattacct 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 161 cagaatgcca cctcatactt 20 <210> 162 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 162 aaacaagacc ctatttccag tc 22 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 163 ggcttagaga acttgctgta tt 22 <210> 164 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 164 ctggctattt ggctgagaa 19 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 165 gttatcttct gggagctctt c 21 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 166 aagtatgagg tggcattctg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 167 gaacgtgtag atggttctgg 20 <210> 168 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 168 cctgtggcaa cctttca 17 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 169 ggtccttctt ccatcttgtc 20 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 170 aaggagctgc tatgttctat g 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 171 gtaatccagg tattcggact c 21 <210> 172 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 172 agaccagagt ccgtgaat 18 <210> 173 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 173 ctctgcaagg tccttcttc 19 <210> 174 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 174 cccaggatgt gacctattt 19 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 175 gtttcttcag gcacatcata g 21 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 176 ctagaccagc cccttcacac 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 177 aaggtgacag atgcctccag 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 178 gtcatgaagc tggtctactg 20 <210> 179 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 179 agcccttgag cacatttc 18

Claims (10)

  1. (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제; 및
    (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 췌장암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 췌장암 진단용 조성물의 검체는 혈액인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 췌장암 진단용 조성물의 검체는 혈액 유래 단핵구인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머, 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 췌장암 진단용 조성물을 포함하는, 췌장암 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 췌장암 진단용 키트.
  8. 혈액성분을 포함하는 샘플에서,
    (i) 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB) 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (ii) 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보 제공방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 유래 단핵구인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 샘플에서 측정된 인터루킨 10 수용체의 β 서브유닛(Interleukin 10 receptor β subunit, IL-1ORB)과 인터루킨 22 수용체 α1 서브유닛(Interleukin 22 receptor α1 subunit, IL-22RA1), 인터루킨 22(Interleukin 22, IL-22) 및 인터페론 람다 수용체 1 아이소폼 1(Interferon lambda receptor 1 isoform 1, IFNLR1)로 구성되는 췌장암 진단용 바이오마커에서 선택되는 하나 이상의 바이오마커 단백질 또는 상기 바이오마커 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현수준이 정상 대조군에서의 발현수준보다 높은 경우 췌장 질환의 발병가능성이 높다고 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.

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WO2024117803A1 (ko) * 2022-11-30 2024-06-06 연세대학교 산학협력단 췌장암의 예후 예측을 위한 새로운 바이오 마커

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