KR101821402B1

KR101821402B1 - 관절염 진단 방법

Info

Publication number: KR101821402B1
Application number: KR1020150099075A
Authority: KR
Inventors: 류제황; 김수연; 송원현
Original assignee: 전남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2018-01-25
Also published as: KR20170008350A

Abstract

본 발명은 관절염 진단 방법 및 관절염 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명은 류마티스 관절염를 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 제공한다.

Description

관절염 진단 방법{Method for Diagnosing Arthritis}

본 발명은 관절염 진단 방법에 관한 것이다.

류마티스 관절염은 자가 면역 질환 중의 하나이며 정확한 원인 및 치료법이 개발되어져 있지 않은 질병 중의 하나이다. 류마티스 관절염은 퇴행성 관절염와 더불어 만성 관절염 중 환자군이 많은 질병으로 알려져 있으며, 퇴행성 관절염과 차이점은 류마티스 관절염은 염증성 관절염으로 알려져 있다(Richardson B. et al., Clin Immunol, 109, 72-79, 2003). 우리나라의 류마티스 관절염 환자 수는 1%로 추정하고 있다.

상기 질병은 다양한 연령군에서 야기 될 수 있지만 성비로 따져 볼 때, 남성보다는 여성 환자의 수가 높은 것으로 확인되며, 연령으로 살펴보면 35-50세의 환자수가 높은 것을 알 수 있다. 상기 질병이 만성적으로 진행을 하게 되면 일상생활을 하기에 여러 가지 제약을 받을 수 있다. 통증으로 인한 사회생활의 단절로 인하여 우울증 형태를 띄게 되고, 그로 인한 사회적 및 경제적 손실을 유발 할 수 있다.

류마티스 관절염의 정확한 원인으로 알려진 것은 없으며, 다만 유전적 혹은 사회적인 요인으로 병이 유발된다고 추정할 뿐이다. 유전적인 요인으로는 사람 몸에는 개인의 조직형을 결정하는 HLA-DR(Human Leukocyte Antigen-DR)로 불리는 유전자가 있는데, 이 중 특정한 유형의 HLA-DR4를 가지고 있는 사람들은 그렇지 않은 사람에 비해 류마티스 관절염이 더 많이 발생하고 경과도 더 심할 뿐만 아니라 관절에 대한 자가 면역 반응이 더 잘 나타나는 것으로 알려져 있다(Avouac et al., Ann. Rheum. Dis., 65(7):845-851 2006).

세로토닌은 체내에 들어온 트립토판(tryptophan)이 분해되어서 생기는 화합물 중 하나이며, 세로토닌을 분비하는 곳은 뇌 및 창자 2군데에서 생성이 된다. 생성된 세로토닌의 약 90% 이상이 창자에서 생성되는 세로토닌이다. 흔히 세로토닌은 행복 호르몬으로 알려져 있다. 앞서 언급 했듯이 세로토닌은 창자와 뇌에서 생성이 되는데 2군데서 생성된 세로토닌을 합성하는 효소는 다르다. 뇌에서 세로토닌을 만드는 효소는 Tph2이며, 창자에서 생성되는 효소는 Tph1 호르몬이다. 체내에 유입된 트립토판은 Tph 효소에 의해서 최종 대사되는 화합물인 세로토닌으로 대사가 되어지는데, 뇌에서 생성된 Tph2 호르몬은 뇌의 지질수용체에 의해서 혈류를 타고 이동되지는 않는다(Mann JJ et al. Arch. Gen. Psychiatry 49, 442446. 1992). 실제 뇌에서 생성되는 세로토닌의 양은 5%가 되지 않는다고 알려져 있다. 신체의 혈류를 타고 이동을 하는 세로토닌은 창자에서 생성된 물질들이 이러한 물질들이 혈류를 타고 다니면서 창자의 수축과 이완을 도와주거나 혈소판에 영향을 주어서 혈액 응고에 영향을 주게 된다. 또한 세로토닌은 신체 내의 염증반응이 일어나게 되면 다량 분비되는 것으로 알려져 있다(Gershon MD and Tack J. Gastroenterology 132, 397-414. 2007).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 자가 면역 질환의 하나인 관절염의 신규한 바이오마커를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 류마티스 관절염 환자의 활막 조직에서 류마티스 관절염을 일으킨다고 알려진 Hif-2α가 발현되는 유사부위에서 Tph1이 과발현되고 상기 Tph1에 의해 합성된 세로토닌이 염증 관련 신호를 개시하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 관절염 진단 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 관절염 진단 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절염 진단 방법을 제공한다:

(a) 생물학적 시료 내 세로토닌(serotonin) 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계; 및

(b) 상기 세로토닌 mRNA 또는 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 상향-조절(up-regulation)되는 경우 관절염인 것으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절염 진단 방법을 제공한다.

(a) 생물학적 시료 내 Tph1(tryptophan hydroxylase 1)의 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계; 및

(b) 상기 Tph1 mRNA 또는 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 상향-조절(up-regulation)되는 경우 관절염인 것으로 판정한다.

본 발명의 관절염 진단 방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 (a): 세로토닌 또는 Tph1의 검출

본 발명은 세로토닌 또는 Tph1을 검출하여 관절염을 진단한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 통풍(gout) 또는 척추 관절염(spondylarthritis)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 관절염은 류마티스 관절염 또는 소아 류마티스 관절염이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "류마티스 관절염"은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환으로서, 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있는 질환이다.

본 발명은 관절염을 진단하기 위해 생물학적 시료를 분리한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 활액(synovial fluid) 또는 활막(synovial membrane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물학적 시료이다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 활막액 또는 활액이다.

본 명세서에서, 용어 “활막액”은 활막 관절의 캐비티(cavity)에 존재하는 점성이 있는 비뉴튼(non-Newtonian)액으로, 상기 활막액은 “활액”, “관절액” 및 “윤활액”과 동의어이다.

본 명세서에서, 용어 “활막”은 활막 관절(synovial joint)의 관절낭(articular capsule) 및 관절강(joint cavity) 사이에 존재하는 부드러운 조직이다.

상기 생물학적 시료 내 세로토닌 또는 Tph1의 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 세로토닌 또는 Tph1의 유전자 또는 단백질의 발현 여부는 혼성화법, 유전자 증폭법 또는 면역분석법을 이용하여 실시하여 판단할 수 있다.

상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 세로토닌 또는 Tph1의 존재를 확인한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 관절염 진단 방법은 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 세로토닌을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 접근번호 EF444987에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열 또는 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 접근번호 X52836, NM_004179, AY098914, BC106740 및 BC106739에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다. 상기 세로토닌을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 이에 한정되지 않으며, 미국국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 검색되는 어떠한 세로토닌을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열도 가능하다.

상술한 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 관절염을 판단할 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 활막 또는 연골 유래 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1×SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6×SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 관절염 진단 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(예컨대, 정상 세포)보다 상향-조절(up-regulated)되는 경우에는 관절염인 것으로 판단한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 혼성화법으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용하여 실시된다.

본 발명의 관절염 진단 방법은 유전자 증폭법에 의해 실시될 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 활막액 또는 활막)에서 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 mRNA 양을 조사하여 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 체외로 분리된 동물의 활막액 또는 활막 세포에서 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 상향-조절되는 경우, 관절염으로 판단한다.

따라서 본 발명의 관절염 진단 방법은 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 본 발명의 세로토닌의 뉴클레오타이드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 관절염 진단 방법은 면역분석법에 의해 실시될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 관절염을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1을 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 세로토닌 또는 Tph1에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 세로토닌 또는 Tph1 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염염을 결정할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1에 대한 시그널이 정상 시료 보다 상향-조절되는 경우, 관절염인 것으로 판단한다.

본 발명의 방법은 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 세로토닌 또는 Tph1은 관절염이 있는 객체에서 고발현 되는 생체 분자이다. 이러한 세로토닌 또는 Tph1의 고발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “고발현”은 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도가 정상 시료와 비교하여 높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 발현 분석을 한 경우, 발현이 적은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 세로토닌 또는 Tph1이 정상세포와 비교하여 2-20 배 정도 고발현 되는 경우, 본 발명에서의 “고발현”으로 판정하고 관절염인 것으로 판정한다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 활막액 내 세로토닌 또는 활막 내 Tph1의 유전자 또는 단백질의 발현 정도가 대조군보다 상향-조절 되는 경우 관절염으로 진단한다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, 본 발명은 세로토닌을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편 또는 세로토닌에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 관절염 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Tph1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편 또는 세로토닌에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 관절염 진단 키트를 제공한다.

상기 관절염 진단 키트는 혼성화 키트, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석 키트이다.

본 발명의 키트은 상기 관절염 진단 방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 관절염 진단 방법 및 관절염 진단 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 류마티스 관절염을 진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 제공한다.

도 1a 내지 1f는 Hif-2α 과발현 활막에서 Tph1의 발현을 확인한 결과로, 도 1a는 C57BL/6 마우스의 활액에 1×10⁹ PFU의 Ad-Mock, Ad-Hif1α 또는 Ad-Hif2α를 관절 내 투여(Intra-articular injection)하여 3주 동안 관찰 한 후 H&E 염색한 결과를 나타낸다. 도 1b는 Safranin-O 염색을 통해서 관절의 손상정도를 측정을 나타낸다. 도 1c는 퇴행성 관절염 환자(OA)와 류마티스 관절염 환자의 활막(RA)을 이용하여 Hif2α의 발현 및 Tph1의 발현을 면역화학염색법을 통해 나타낸다. 도 1d는 콜라겐 유도 마우스 모델의 NI(No induced) 및 CIA(Collgene induced arthritis) 활막을 이용하여 Hif2α 및 Tph1의 발현을 면역화학염색법을 통해 나타낸다. 도 1e는 면역화학염색법을 이용하여 활막세포에서 Hif2α, Tph1 및 DAPI의 발현을 나타낸다. 도 1f는 DBA1/J 마우스의 활액에 1×10⁹ PFU의 Ad-Hif2α 및 Ad-Mock를 관절 내 투여하여 3주 동안 관찰 한 후 Hif2α 및 Tph1의 발현을 면역화학염색법을 통해 나타낸다.
도 2a 내지 2e는 Hif2α 과발현 활막섬유세포(Fibroblast-like synoviocyte; FLS)의 Tph1 발현을 나타낸다. 도 2a는 C57BL/6 마우스의 활막에서 세포을 분리하여 활막섬유세포에 Ad-Hif2α를 처리한 후 24시간 반응 한 후 Hif2α, Tph1 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR, 웨스턴 블럿 및 qPCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2b는 활막섬유세포에 IL-1β를 24시간 반응 한 후 Hif2α, Tph1 및 Gapdh 발현을 RT-PCR, 웨스턴 블럿 및 qPCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2c는 활막섬유세포에 Ad-Hif2α를 처리한 후 24시간 반응 한 후 Hif-2α를 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2d는 활막섬유세포에 Ad-Hif2α를 처리한 후 24시간 반응 한 후 Tph1를 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2e는 활막섬유세포에 Ad-Hif2α를 처리한 후 24시간 반응 한 후 Hif-2α와 Tph1를 함께 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3c 내지 3e는 활막섬유세포에 Ad-Hif2α 800 MOI를 24시간 동안 반응 한 후 면역화학염색법을 이용하여 Hif-2α 및 Tph1을 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 3g는 Tph1이 과발현된 활막 섬유 세포에서 Tph1 발현을 나타낸다. 도 3a는 활막섬유세포에 Ad-Tph1을 24시간 반응 한 후 Hif2α, Tph1, Cox2, iNos, IL-6 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해서 확인한 결과를 나타낸다. 도 3b는 IL-1β를 24시간 반응한 후 Hif2α, Tph1, Cox2, iNos 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 3c 내지 3d는 활막섬유세포에 Tph1 siRNA를 24시간 반응 한 후 Hif2α, Tph1, IL-6, Cox2 및 iNos의 발현을 RT-PCR 및 qPCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3e는 세로토닌을 24시간 반응 한 후 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3f 내지 3g는 세로토닌과 함께 IL-1β를 함께 24시간 반응 한 후 Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4, Adamts5, Cox2, iNos, IL-6 및 Gapdh를 RT-PCR로 확인, iNos, IL-6, Cox2를 qPCR로 확인 및 Cox2, IL-6를 웨스턴 블랏으로 확인 한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 도4d는 연골세포에서 세로토닌의 발현을 나타낸다. 도 4a는 ICR 생후 5일령 마우스에서 연골 세포를 분리하여 사용하였다. 분리된 연골 세포에 세로토닌을 24시간 반응한 후 Col2a1, Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4, Adamts5, Cox2, iNos, IL-6 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR를 통해 나타낸다. 도 4b 내지 4c는 세로토닌과 함께 IL-1β를 처리한 후 24시간 반응 한 후 Col2a1, Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4, Adamts5, Cox2, iNos, IL-6 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR 및 IL-6, iNos, Cox2의 발현을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 4d는 세로토닌과 함께 IL-1β를 처리한 후 24시간 반응한 후 Cox2, Erk의 발현을 qPCR 및 PGE2 분석을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 5a 내지 도e는 활막 섬유세포에서 리셉터의 발현을 확인 한 결과를 나타낸다.
도 5a는 IL-1β를 24시간 처리한 후 세로토닌의 리셉터의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도 5b 내지 5c는 IL-1β를 24시간 처리한 후 세로토닌의 리셉터 Htr1b, Htr2a, Htr6 및 Gapdh의 발현을 확인하였고, Ad-Hif2a를 24시간 처리 한 후 Htr1b, Htr2a, Htr6 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR 및 qPCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도5d는 리셉터의 억제제를 이용한 실험결과를 나타낸다. IL-1β, 세로토닌와 Htr1b 억제제 SB216641 및 Htr2a 억제제 M100907를 24시간 처리 한 후 Cox2, iNos, IL-6 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 6a 내지 6e는 연골세포에서의 리셉터 발현을 나타낸다. 도 6a는 IL-1β를 24시간 처리한 후 세로토닌의 리셉터의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도 6b 내지 6c는 사람의 류마티스 관절염 환자의 연골 조직에서 Htr1b 및 Htr2a의 발현을 확인하였고, 류마티스 관절염의 동물 모델의 연골에서 Htr1b 및 Htr2a의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도 6d는 IL-1β를 24시간 처리한 후 세로토닌의 리셉터 Htr1b, Htr2a 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR 및 qPCR로 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도6e는 각각의 리셉터가 억제된 환경을 만들어서 실험한 결과들 이다. IL-1β, 세로토닌 및 Htr1B siRNA 또는 Htr2A siRNA를 24시간 처리 한 후 Cox2, iNos, Htr1b, Htr2a, Mmp13 및 Gapdh의 발현을 RT-PCR 및 Cox2의 발현을 웨스턴 블랏을 이용한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

활막 섬유세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS) 분리 및 배양

C57BL/6 마우스(8 주령, 웅성)의 활막을 작은 조각으로 자른 다음 Ⅰ형 콜라게나아제(collagenase) 2 ㎎/㎖를 4시간 동안 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다. 이후, 세포를 모은 후 항습 5%, CO₂ 5% 인큐베이터를 이용하여 DMEM에서 배양하였다. 4-8 계대의 활막 세포를 이용하여 실험을 실시하였다.

콜라겐-유도성 관절염 동물 모델

0.05M 아세트산에 소 Ⅱ형 콜라겐(2 ㎎/㎖)을 용해 시키고 CFA(Complete Freund's Adjuvant)로 에멀젼(1:1 비)한 후, 0.1 ㎖ (꼬리 피하 주사) DBA1/J 마우스에 투여하였다. 1차 투여 후 3주 후에 동일한 방법으로 2차 투여를 실시하였는데, 1차 투여와 달리 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)로 에멀젼(1:1 비)한 후 투여하였다. 2차 투여 후 마우스 관절의 염증의 시작, 부종의 정도를 2일 마다 한번씩 3주 동안 관찰하였다. 마우스를 희생 한 후 관절을 모은 후 10% NBF(Neutral Buffered Formalin)로 고정한 후 탈회 과정을 지난 다음 파리핀으로 포매하였다.

바이러스-유도성 관절염 동물 모델

아데노바이러스(adenovirus) Ad-mock(대조군), Ad-Hif2α 또는 Ad-Tph1를 1×10⁹ PFU(Plaque Forming Unit)/10 ㎕를 활액에 투여하였다. 1주일에 한번씩 주사한 후 관절의 염증의 시작, 부종을 정도를 2일마다 한번씩 3주 동안 마우스 상태를 관찰하였다. 마우스를 희생 한 후 관절을 모은 후 10% NBF로 고정한 후 탈회 과정을 지난 다음 파리핀으로 포매하였다.

면역조직화학적 분석

인간 또는 마우스 유래의 고정된 무릎 시편을 10% NBF에 포매하고 4 ㎛의 크기로 절단하였다. 탈파라핀 및 수화 후 섹션을 진행하였다. 항체(Hif2α, 1:150; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃ 항습 챔버에서 하루 밤 동안 배양한 다음, 비오틴화 래빗 항-고트 항체(1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후, ABC(Avidin Botin Complex) 용액을 30분 동안 처리하고, DAB(Diaminobenzidine) 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 색원체(chromogen)를 검출하였다.

조직 섹션들을 현미경으로 관찰하고 대표 섹션들의 사진을 찍었다.

웨스턴 블랏 분석

IL-1β, Ad-Hif2α, Ad-Tph1으로 자극한 후 연골세포 및 활막 섬유 세포를 용해 버퍼로 균질화하고, 피어스(pierce) BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 분석(Thermo, USA)를 사용하여 전체 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 8% 폴리아크릴아미드-SDS 겔을 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 다음 5% 탈지우유로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고 TBS(0.01% 트윈-20 포함 PBS)에서 트윈-20으로 세척하고 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 배양하였다. ERK(BD), Hif-2α(Santa Cruz Biotechnology) 또는 Tph1(Thermo)에 대한 1차 항체를 TBS에서 0.01% 트윈-20으로 각각 1:1000 으로 희석하였다. 막을 세척하고, HRP-결합 된 이차항체(1:2000; Cell Signaling Technology)와 함께 배양하고 ECL 검출 키트(GE Healthcare, Buckinghamshire, U.K.)로 확인하였다.

Safranin O 염색

마우스 유래의 고정된 무릎 시편을 10% NBF에 포매하고 5 ㎛의 크기로 절단하였다. 탈파라핀 및 수화 후 섹션을 진행하였다. 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)을 이용하여 먼저 핵을 염색을 하였다. 그 후 수화 과정을 거친 후 0.01% 패스트 그린(Fast green)을 이용하여 주변 조직을 염색을 한 후 0.1% 아세트산으로 세척한 후 0.1% safranin O 염색하여 관절 부분을 확인 하였다.

RT-PCR

세포를 35 ㎜ 디쉬에 3×10⁵세포/웰로 배양 한 후 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 반응하였다. 세포에 트리졸 시약(trizol reagent)을 이용하여 RNA 추출을 한 후 ImpromⅡ 키트(promega)를 이용하여 1 ㎍의 RNA를 올리고 dT 프라이머로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 RT-PCR를 실시 하였다. RT-PCR reaction buffer(AmpONE, geneall)에 primer 10 pMol의 농도를 진행 하였다. 사용된 프라이머(5'에서 3' 방향)는 다음과 같다:

GAPDH(Forward-TCACTGCCACCCAGAAGA, Reverse-TGTAGGCCATGAGGTCCA), Tph1(Forward-ACAAGGAGAACAAAGAGAACAAAGACC, Reverse-ACAGTCTCCATAACGTCTTCCTTC), Hif-2α(Forward-AGAAGAGCAAAGACGTGTCCACCGAG, Reverse-GTAGAACTCATAGGCAGAGCGTCCAAG),Col2a1(Forward-CACACTGGTAAGTGGGGCAAGACCG,Reverse-GGATTGTGTTGTTTCAGGGTTCGGG), Mmp3(Forward-CTGTGTGTGGTTGTGTGCTCATCCTAC, Reverse-GGCAAATCCGGTGTATAATTCACAATC), Mmp9(Forward-TGCACTGGGCTTAGATCATTCC, Reverse-CCGTCCTTGAAGAAATGCAGAG), Mmp12(Forward-CCCAGAGGTCAAGATGGATG, Reverse-GGCTGGATAGAGAA), Mmp13(Forward-TGATGGACCTTCTGGTCTTCTGGC, Reverse-CATCCACATGGTTGGGAAGTTCTG), Adamts4(Forward-ACTTCCTGGACAATGGTTATGGGC, Reverse-ATGAAGTCCTTGAGCTGGTCCACG), Adamts5(Forward-GCCATTGTAATAACCCTGCACC, Reverse-TCAGTCCCATCCGTAACCTTTG), Cox2(Forward-CCAAACCAGCAGACTCATACTCATAG, Reverse-CATCTCTCTGCTCTGGTCAATGGAG), iNOS(Forward-TCACTGGGACAGCACAGAAT, Reverse-TGTGTCTGCAGATGTGCTGA), IL-6(Forward-AGAGATACAAAGAAATGGATGC, Reverse-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC), Htr1A(Forward-CTCACTTGGCTCATTGGCTTTCTC, Reverse-AGAAAGCGCCGAAAGTGGAGTAGATG), Htr1B(Forward-CCTCTCACCAACCTCTCCCACAAC, Reverse-AGCACTGCAACAGGTGATATCCGAC), Htr1D(Forward-ATGTCCCCTCCAAACCAGTCCCTAG, Reverse-CACCACGAGCGAGATTCTGAGAGC), Htr1F(Forward-GAGGAACTGTTAAACCGAATGCCATC, Reverse-GGGCATCACCAGGACAGCTACAAG), Htr2A(Forward-CATTGCGGGAAACATACTGGTCATC, Reverse-TGGACACGGGCATGACAAGGAAAC), Htr2B(Forward-CATTGCGGGAAACATACTGGTCATC, Reverse-TGGACACGGGCATGACAAGGAAAC), Htr2C(Forward-TGGCAGTAAGCATGGAGAGAAAC, Reverse-GGGCACAAATATCTAGGTAAAGGC), Htr3A(Forward-GATACCACCCAGCCTGCTCTACTAAG, Reverse-CATCAATGGAGACAGTAGTAGGCTTC), Htr3B(Forward-ATGATTCTTCTGTGGTCCTGCCTC, Reverse-TAAAGAGCTGCCTGGTGAGACGGTG), Htr4(Forward-AAAGGAAATTCAGCCACAACTCTAAC, Reverse-CTCCTTAGCAGTGACATAGATCG), Htr5A(Forward-TGGAACCTAACCGCAGCTTGGACAC, Reverse-TGTGTGGTACTCGGTGGAAGGTGC), Htr5B(Forward-GTCGCCGAGCAACAGTAACCTTC, Reverse-AAGCACAAACACGCCAATCAAGATC), Htr6(Forward-GGGATACTGTAATAGCACCATGAACC, Reverse-ACGAAGAAGTTGACCACAGTAGGG), Htr7(Forward-CTGGTGGTGATCTCGGTGTGCTTTG, Reverse-TGCAGAAGAAGTGGCCGAAGATCC).

Real-time PCR

세포를 35 ㎜ 디쉬에 3×10⁵세포/웰로 배양 한 후 시료를 농도별로 처리한 후 24시간 반응하였다. 세포에 트리졸 시약(trizol reagent)을 이용하여 RNA 추출을 한 후 ImpromⅡ 키트(promega)를 이용하여 1 ㎍의 RNA를 올리고 dT 프라이머로 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR은 SYBR Green PCR 마스터 믹스(ABI)를 이용하여 실시하였고, StepOnePlus Real-time PCR 기기를 이용하였다. 사용된 프라이머(5'에서 3' 방향)는 다음과 같다:

GAPDH(Forward-TCACTGCCACCCAGAAGA, Reverse-TGTAGGCCATGAGGTCCA), Tph1(Forward-ACAAGGAGAACAAAGAGAACAAAGACC, Reverse-ACAGTCTCCATAACGTCTTCCTTC), Hif-2α(Forward-AGAAGAGCAAAGACGTGTCCACCGAG, Reverse-GTAGAACTCATAGGCAGAGCGTCCAAG), Cox2(Forward-CCAAACCAGCAGACTCATACTCATAG, Reverse-CATCTCTCTGCTCTGGTCAATGGAG), iNOS(Forward-TCACTGGGACAGCACAGAAT, Reverse-TGTGTCTGCAGATGTGCTGA), IL-6(Forward-AGAGATACAAAGAAATGGATGC, Reverse-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC), Htr1B(Forward-CCTCTCACCAACCTCTCCCACAAC, Reverse-AGCACTGCAACAGGTGATATCCGAC), Htr2A(Forward-CATTGCGGGAAACATACTGGTCATC, Reverse-TGGACACGGGCATGACAAGGAAAC).

트랜스펙션

세포를 35 ㎜ 디쉬에 3×10⁵세포/웰로 배양 한 후, 리포펙타민2000(인비트로젠)를 이용하여 실험을 진행하였다. DMEM 배지에 리포펙타민을 넣은 후 10분 동안 반응하였다. 이때, DMEM 배지에 siRNA를 1:1 혼합하여 반응을 유도하였다. 그 후 리포펙타민 혼합액과 siRNA 혼합액을 혼합한 후 15분 동안 반응하였다. 반응 종결 후 디쉬에 처리한 후 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 배지를 제거하고 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 교환 한 후 24시간 배양을 진행 한다. 사용된 siRNA는 다음과 같다:

Tph1(Thermo, SMARTpool), Hif2α(Dharmacon), Htr1B(Dharmacon) 및 Htr2A (Dharmacon).

억제제 처리

세포를 35 ㎜ 디쉬에 3×10⁵세포/웰로 배양 한 후, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에 SB216641, M100907을 농도별로 각각 처리 30분 동안 배양을 한다. 그 후 IL-β와 세로토닌을 동시에 처리한 후 24시간동안 배양을 한다.

실험 결과

Hif-2α의 과발현된 활막에서 Tph1의 발현

C57BL/6 마우스의 활액에 아데노 바이러스 관절 내 투여(Intra-articular injection)를 수행하였다. Ad-Mock(대조군), Ad-Hif-1α 또는 Ad-Hif-2α 바이러스를 1×10⁹ PFU/10 ㎕ IA 투여하였다. 1주일에 한번씩 총 3번의 투여를 실시하였다. 그 후, 10% NBF에 고정을 한 후 0.5M EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid)를 이용하여 탈회 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하였다. 조직을 5 ㎛로 절편 한 후 H&E 염색법을 이용하여 세포의 분포를 확인하였다(도 1a). Ad-Mock의 조직을 확인하여 보면 세포의 분포가 증가된 것을 확인 할수 없었다. Ad-Hif1α 역시 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 하지만 Ad-Hif2α의 조직에서 활막의 세포 수가 증가된 것을 관찰하였다(도 1a). 관절의 손상 유무를 확인 하기 위해서 사프라닌 O(Safranin O) 염색법을 수행하였다(도 1b). 세포의 분포를 확인한 H&E와 동일한 결과로 Ad-Mock 및 Ad-Hif1α의 조직에서는 연골의 손상을 확인 할수 없었다. 하지만 Ad-Hif2α의 조직은 연골이 손상이 되어 연골층이 얇아 진것을 확인 할수 있었고, 연골 손상을 보다 정확하게 확인한 맨킨 스코어(Mankin score, The reliability of the Mankin score for osteoarthritis, J Orthop Res. 1992 Jan;10(1):58-61)로 Ad-Hif2α에서 연골의 손상 정도가 다른 조직들에 비해서 현저히 증가된 것을 확인 할 수 있었다(도 1b). 퇴행성 관절염 환자의 활막 조직 및 류마티스 관절염 환자의 활막 조직(환자 동의하에 원광대학교 병원에서 조직을 기증 받음)을 면역화학염색법을 이용하여 Hif-2α의 발현을 확인하였다. 결과를 보면 활막조직 중에서 가장 바깥쪽으로 섬유아세포가 다량 존재하고 있고 그 부위에서 발현이 증가된 것을 확인 할 수 있었다(도 1c). 류마티스 관절염 동물 모델인 콜라겐 유도 마우스 모델의 관절 조직 부분을 면역화학 염색법으로 확인하였다. Hif-2α가 다량 발현이 되었고 Hif-2α가 발현이 되는 유사한 부분에서 Tph1이 발현되어진 것을 확인 할 수 있었다(도 1d). 활막조직에서 Hif-2α 및 Tph1의 발현 부위를 정확히 확인하기 위해서 더블 염색법을 가지고 확인한 결과, 동일한 결과를 얻을 수 있었다(도 1e). 아데노 바이러스를 이용하여 IA(관절 내) 투여한 활막 조직에서 Hif-2α 및 Tph1의 발현을 면역화학법으로 확인한 결과 Tph1이 발현된 것을 확인 할 수 있었다(도 1f). 결론적으로 도 1의 결과는 Hif-2α가 발현이 되는 곳과 유사한 부분에서Tph1의 발현이 증가 되는 것을 확인하였다.

Hif-2α가 과발현된 활막 섬유 세포에서 Tph1의 발현

C57BL/6 마우스(8주령, 다물 사이언스)의 활막을 작은 조각으로 자른 다음 Ⅰ형 콜라게나아제(collagenase) 2 ㎎/㎖를 4시간 동안 DMEM에서 배양하였다. 이후, 세포를 모은 후 항습 5%, CO₂ 5% 인큐베이터를 이용하여 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 4-8 계대의 활막 세포를 이용하여 실험을 실시하였다. 활막 섬유 세포에 Ad-Hif2α을 24시간 처리 한 후 Hif2α, Tph1의 발현을 확인 한 결과 농도 의존적으로 Hif2α 및 Tph1의 발현이 증가 되는 것을 RT-PCR, 웨스턴 블럿 및 qPCR를 통해서 확인하였다(도 2a). IL-1β를 24시간 처리 한 후 Hif2α 및 Tph1의 발현을 확인한 결과, 농도 의존적으로 Hif2α 및 Tph1의 발현이 증가 되는 것을 RT-PCR, 웨스턴블럿, qPCR를 통해서 확인하였다(도 2b). 면역화학염색법을 이용하여 Ad-Hif2α을 24시간 반응을 한 후 Hif-2α 및 Tph1의 발현을 확인하였다(도 2c 내지 2f). Hif2α는 염색질에 다량 존재를 하는 물질이고, Tph1은 핵 내에 존재하는 물질이다. 염색 사진을 보면 Hif2a는 염색질에 Tph1은 핵에서 발현이 증가 되어진 것을 확인을 할 수 있었고, 더블 염색법을 이용하여 Hif2α가 발현되는 세포에서 Tph1이 발현 되는 것을 확인한 결과를 얻을 수 있었다. 본 결과로 토대로 예상을 해보면 Hif2α가 발현이 되는 곳과 유사한 부분에서 Tph1의 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다.

Tph1이 과발현된 활막 섬유 세포에서 Tph1 발현

활막 섬유 세포에 Ad-Tph1을 24시간 처리한 후 Tph1, IL-6, Cox2및 iNos의 발현을 확인하였다(도 3a). Ad-Tph1의 농도 의존적으로 Tph1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. Ad-Tph1의 농도 의존적으로 IL-6, Cox2 및 iNos 역시 증가되었다. IL-1β를 24시간 처리 한 후, Hif2α, Tph1, IL-6, Cox2 및 iNos의 발현을 확인하였다(도 3b). IL-1β의 농도 의존적으로 Hif2α의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. Tph1이 억제된 환경에서 Hif2α, Tph1, IL-6, Cox2 및 iNos의 발현을 확인하였다(도 3c 및 3d). Tph1 siRNA를 IL-1β를 함께 24시간 처리한 후 Tph1, IL-6, Cox2 및 iNos의 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도3c, d). 하지만 Hif2α의 발현은 변화가 없었다. 본 결과로 예상 할 수 있는 것은 Tph1이 Hif2α에 의해서 조절되는 것이다. Tph1이 대사되는 최종 산물은 세로토닌(5-HT)이다. 활막 섬유 세포에 세로토닌만 24시간 처리한 후 발현을 확인하였다(도 3e). 그 결과 Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4, Cox2, iNos 및 IL-6의 발현이 확인 되지 않았다. 세로토닌을 IL-1β와 함께 24시간 처리한 후 발현을 확인하였다(도 3f). Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13 및 Adamts4 의 발현은 세로토닌에 의해서 변화를 확인 할 수 없었으나, Cox2, iNos 및 IL-6는 세로토닌의 농도에 따라 발현이 증가 되는 것을 확인 하였다. 본 결과로 예상이 되어 지는 것은 면역 반응을 일으킨다고 알려진 물질들이 세로토닌에 의해서 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다.

연골세포에서 세로토닌 발현

ICR 5일령 마우스로부터 관절 부분만 분리하였다. 1% Ⅱ형 콜라게나아제를 처리하여 3시간 반응시켰다. 연골만 분리 한 후 1% Ⅱ형 콜라게나아제를 처리하여 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 2시간 반응시켰다. 그 후 세포를 씨딩하여 연골 세포를 수득하였다. 연골세포에 세로토닌만 24시간 처리 하여 발현을 확인하였다(도 4a). Col2a1, Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4, Adamts5, Cox2, iNos 및 IL-6의 발현 하지 않음을 확인하였다. IL-1β 및 세로토닌을 함께 24시간 반응 한 후 발현을 확인하였다(도 4b). Col2a1은 농도 의존적으로 발현이 감소되는 것을 확인 할 수 있었고, Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Adamts4 및 Adamts5는 세로토닌에 의해서 발현이 변화하지 않았다. 하지만 Cox2, iNos 및 IL-6는 세로토닌에 의해서 발현이 증가 되는 것을 확인 하였다(도 4c 및 4d). 이상의 결과로 볼 때 연골세포에서도 활막 세포와 마찬가지로 면역 반응을 일어난다고 알려진 물질들이 세로토닌에 의해서 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다.

활막 섬유 세포에서 수용체의 발현

세로토닌의 수용체는 14종류가 알려져 있다. 활막 섬유 세포에 IL-1β을 24시간 처리 한 후 수용체의 발현을 확인한 결과, Htr1B, Htr2A 및 Htr6의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 5a). IL-1β 24시간 처리 한 후 발현을 확인한 결과, Htr1B, Htr2A 및 Htr6의 발현이 농도 의존적으로 증가 되는 것을 확인하였다(도 5b 내지 5c). 이 결과로 예상 할 수 있는 것은 14종류 세로토닌의 수용체 중에 활막 섬유 세포에 영향을 주는 수용체는 Htr1B, Htr2A 및 Htr6으로 확인되었다. Htr1B 억제제인 SB216641 또는 Htr2A 억제제인 M100907를 IL-1β와 세로토닌을 함께 24시간 처리한 후 Cox2, iNos 및 IL-6의 발현을 확인 하였다(도 5d). 그 결과 Htr1B의 억제제는 변화를 확인 할 수 없었으나, Htr2A의 억제제는 농도 의존적으로 발현이 감소되는 것을 확인 하였다. 이상의 결과를 정리 하여 보면 Htr2A를 억제를 하였을때 면역 반응을 증가 시킨는 유전자인 Cox2, iNos 및 IL-6의 발현이 감소되는 것으로 확인이 되어 졌다.

연골세포에서 수용체의 발현

연골세포에 IL-1β 24시간 처리 한 후 수용체의 발현을 확인한 결과, Htr1B 및 Htr2A,의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 6a). 류마티스 관절염 환자의 연골에서 Htr1B 및 Htr2A의 발현을 확인 하였다(도 6b). Htr1B 및 Htr2A의 발현이 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 류마티스 관절염 동물 모델에서 확인 한 결과, Htr1b 및 Htr2a의 발현이 증가된 것을 확인 할 수 있었다(도 6c). 연골세포에 IL-1β를 24시간 처리한 후 각각의 수용체의 발현을 확인한 결과, 농도 의존적으로 Htr1B, Htr2A의 발현이 증가 되어 진 것을 확인 할 수 있었다(도 6d). Htr1B siRNA를 이용하여 수용체를 억제한 환경에서 발현을 확인하였다(도 6e). Htr1B siRNA, IL-1β 및 세로토닌을 함께 24시간 처리한 후 Htr1B, Cox2, iNos 및 Mmp13의 발현이 감소 되는 것을 확인 할 수 있었고, Htr2A의 발현에는 변화를 주지 않는 것을 확인하였다. Htr2A siRNA를 이용하여 수용체를 억제한 환경에서 발현을 확인 하였다(도 6f). Htr2a siRNA, IL-1β 및 세로토닌을 함께 24시간 처리한 후 Htr2A, Cox2, iNos 및 Mmp13의 발현이 감소 되는 것을 확인 할 수 있었고, Htr1B의 발현에는 변화를 주지 않는 것을 확인 하였다. 결론적으로 Htr1B 및 Htr2A를 억제를 하게 되면 연골세포에서는 면역 반응을 유발하는 Cox2, iNos 및 IL-6의 발현이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

삭제
다음의 단계를 포함하는 관절염 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 인간으로부터 분리된 생물학적 시료 내 Tph1(tryptophan hydroxylase 1)의 유전자 또는 단백질의 발현 정도를 검출하는 단계; 및
(b) 상기 Tph1 mRNA 또는 단백질의 발현이 대조군과 비교하여 상향-조절(up-regulation)되는 경우 관절염인 것으로 판정한다.
제 2 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 통풍(gout) 또는 척추 관절염(spondylarthritis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 활막액(synovial fluid) 또는 활막(synovial membrane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) Tph1(tryptophan hydroxylase 1)의 유전자 또는 단백질을 포함하는 인간으로부터 분리된 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현량을 측정하는 단계로서, 상기 시료가 상기 단백질 또는 유전자의 발현을 감소시키는 경우에는 상기 시료는 관절염의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.
Tph1(tryptophan hydroxylase 1)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 상기 Tph1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 관절염 진단 키트로, 상기 Tph1의 발현이 대조군과 비교하여 상향-조절(up-regulation)되는 경우 관절염인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 관절염 진단 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 키트는 혼성화 키트, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), 통풍(gout) 또는 척추 관절염(spondylarthritis)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis)인 것을 특징으로 하는 키트.