RU2663724C2 - Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома - Google Patents
Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663724C2 RU2663724C2 RU2014122607A RU2014122607A RU2663724C2 RU 2663724 C2 RU2663724 C2 RU 2663724C2 RU 2014122607 A RU2014122607 A RU 2014122607A RU 2014122607 A RU2014122607 A RU 2014122607A RU 2663724 C2 RU2663724 C2 RU 2663724C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- target gene
- expression
- specific
- hybridization
- Prior art date
Links
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 title claims abstract description 38
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 50
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 title description 27
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 title description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 85
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 62
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 54
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 48
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 101150012953 S100a9 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 51
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 44
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 42
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 40
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 34
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 102100032420 Protein S100-A9 Human genes 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 22
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 17
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 15
- 101150060340 S100a8 gene Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 14
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 5
- 102100040283 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Human genes 0.000 description 5
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 5
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 108010048032 cyclophilin B Proteins 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 238000011430 maximum method Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 108010044156 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase b Proteins 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- -1 PCR Proteins 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 206010058558 Hypoperfusion Diseases 0.000 description 1
- 206010021113 Hypothermia Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010030302 Oliguria Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000594 atomic force spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000004209 confusion Diseases 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 206010013395 disorientation Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 208000018875 hypoxemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010202 multivariate logistic regression analysis Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 206010043089 tachypnoea Diseases 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
- C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к определению прогноза развития септического синдрома у пациента, и может быть использовано в медицине. Получают биологический образец, выбранный из образца крови, сыворотки, слюны, ткани или циркулирующих клеток пациента, и экстрагируют биологический материал: нуклеиновую кислоту или белок из биологического образца. С использованием специфического реагента в отношении продукта экспрессии гена-мишени S100A9, выбранного из праймера амплификации, зонда гибридизации и/или антитела, определяют экспрессию гена-мишени S100A9. Изобретение позволяет по сверхэкспрессии гена-мишени S100A9 по отношению к определенной пороговой величине определить прогноз развития септического синдрома у пациента. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способу определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции. Объектом настоящего изобретения также является способ составления прогноза развития септического шока у пациента.
Внутрибольничные инфекции представляют собой реальную проблему здравоохранения. Во Франции число пациентов, которые подвергаются каждый год внутрибольничной инфекции, оценивают как составляющее от 500000 до 800000. Появление внутрибольничных инфекций связано с различными факторами, такими, как используемые терапевтические методы, однако, также с восприимчивостью пациента к такой внутрибольничной инфекции. Так, пациенты с иммунодефицитной системой, пациенты с гипотрофией, новорожденные, люди пожилого возраста, люди с септическом синдромом, получившие серьезные ожоги люди, люди в травматическом состоянии могут быть более предрасположены, чем другие, к внутрибольничной инфекции.
Септический синдром, системный ответ на инфекцию, представляет собой одну из первых причин смертности в реанимационных отделениях. Он может проистекать от бактериальной, вирусной, микотической или паразитарной инфекции. Эти септические синдромы могут быть классифицированы в зависимости от их тяжести. В возрастающем порядке тяжести различают SIRS (cиндром системного воспалительного ответа), сепсис, тяжелый сепсис и септический шок. Группой экспертов в 2001 г. также предложены критерии определений этих четырех клинических синдромов[1]:
- SIRS представляет собой воспалительный системный ответ, вызываемый многообразием инфекционных или нет причин. Из состояний SIRS, вызываемых неинфекционными причинами, можно назвать травматические состояния, ожоги, панкреатиты, острые респираторные синдромы. Воспалительный системный ответ обнаруживается по меньшей мере по двум из следующих признаков: а) температура выше 38°С или ниже 36°С; b) сердечный ритм выше 90 пульсаций в минуту; с) респираторный ритм выше 20 дыханий в минуту; d) число лейкоцитов выше 12000/мм2 или ниже 4000/мм2;
- сепсис представляет собой синдром воспалительного системного ответа в связи с инфекцией;
- тяжелый сепсис представляет собой сепсис, ассоциированный с артериальной гипотензией, и/или гипоперфузией, и/или дисфункцией по меньшей мере одного органа;
- септический шок представляет собой тяжелый сепсис, ассоциированный с устойчивой гипотензией, и может быть квалифицирован по:
- наличию идентифицированного инфекционного участка,
- устойчивой гипотензии несмотря на адекватные меры повышения давления и лечения повышающими кровяное давление лекарственными средствами.
Как правило, признаки сепсиса, тяжелого сепсиса и септического шока являются близкими, и различие между этими тремя состояниями заключается, главным образом, в значительности пертурбации всех витальных функций. Во время септического шока наблюдают, главным образом, снижение артериального давления, тахикардию, полипноэ, мраморировки кожи, гипо- или гипертермию, ознобы. Эти признаки также сопровождаются дисфункцией органов-«мишеней» с ухудшением функции органов на расстоянии от очага инфекции (почки, легкие, центральная нервная система, пищеварительная система и системы коагуляции крови), выражающимся в олигурии (<0,5 мл/кг/час), почечной недостаточности, гипоксемии, тромбопении, ажитации, дезориентации во времени и пространстве.
Пациенты с септическим синдромом также более или менее восприимчивы к внутрибольничным инфекциям, то есть, инфекциям в связи с пребыванием в лечебном учреждении. Эта восприимчивость оказывает большое воздействие на выживание и полное выздоровление этих пациентов.
Развитие септического синдрома, начиная от стадии сепсиса к стадии тяжелого сепсиса, затем септического шока, не является систематическим, так как примерно у 64% пациентов с сепсисом развивается тяжелый сепсис, и у 23% пациентов с тяжелым сепсисом проявляется септический шок. Перед этой последней стадией септического шока пациенту должны быть предписаны лечения с целью прекращения и реверсирования физиопатологического процесса. Также необходимо восстанавливать удовлетворительное гемодинамическое состояние и обеспечивать эффективную вентиляцию. Также необходимо проводить одновременно симптоматическое лечение шока и антибиотическое лечение, адаптированное, насколько возможно, в зависимости от бактериологических данных.
Оказывается, что, если в случае некоторых пациентов развивается септический синдром, и, в особенности, септический шок, они могут быть реанимированы путем принятия стандартных мер, таких, как лечение антибиотиком широкого спектра, проводимое до результатов бактериологических анализов, указывающих источник инфекции; в случае других пациентов, у которых развивается намного более тяжелый септический синдром, требуется проведение «тяжелых» терапий, как использование активированного белка С. Сверх очень высокой стоимости, этот вид терапии подвергает пациентов рискам очень значительных нежелательных эффектов (нарушения коагуляции…). Следовательно, очень важным является нацеливание эффективным образом восприимчивых пациентов к получению пользы от такого лечения.
В связи с этим, знание этиологии воспалительного системного ответа и определение восприимчивости пациента с воспалительным системным ответом к внутрибольничной инфекции являются существенными для назначения пациенту адаптированного лечения. Другим важным параметрам для пациента является наличие возможности составления по возможности наиболее раннего прогноза развития септического шока.
На сегодняшний день не существует теста, который позволял бы определять восприимчивость пациента к развитию внутрибольничной инфекции, в особенности, пациента с воспалительным системным ответом, связанным или нет с инфекцией. Авторами настоящего изобретения неожиданно выявлено, что анализ экспрессии генов S100A9 и/или S100A8 особенно адаптирован для определения такой восприимчивости и что, к тому же, он применим для составления прогноза развития септического шока.
В соответствии с вышеприведенным и нижеприводимым контекстом, для лучшего понимания изобретения приводятся нижеследующие определения.
Под септическим синдромом понимают системный ответ на инфекцию. Этот септический синдром может быть на стадии SIRS, сепсиса, тяжелого сепсиса или септического шока. Предпочтительно, септическим синдромом является септический шок.
Под внутрибольничной инфекцией понимают любую инфекцию, «приобретаемую» в лечебном учреждении спустя 48 часов после госпитализации и которой не было до попадания пациента в это учреждение.
Под генами-мишенями, геном S100A9 и геном S100A8, понимают, в частности, ген S100A9, обозначенный в банке генов под номером доступа NM_002965.3, и ген S100A8, обозначенный в банке генов под номером доступа NM_002964.3.
Под продуктом экспрессии гена S100A9 и гена S100A8 понимают матричную РНК (мРНК) или фрагмент мРНК, кДНК или фрагмент кДНК, белок или фрагмент белка.
Под биологическим образцом понимают любой материал, происходящий от пациента, который может содержать биологический материал, позволяющий детектировать экспрессию гена. Это может быть, в частности, образец крови, сыворотки, слюны или ткани или циркулирующих клеток пациента. Получают этот биологический образец любым типом отбора, известным специалисту в данной области, таким, как, в частности, взятие пробы крови.
Под биологическим материалом понимают любой материал, позволяющий детектировать экспрессию гена, как, в частности, нуклеиновая кислота или белок или его кодирующая последовательность. Нуклеиновой кислотой может быть, в особенности, РНК (рибонуклеиновая кислота), такая как мРНК (матричная РНК). Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения биологическим материалом является нуклеиновая кислота и еще более предпочтительно мРНК.
Экстракция биологического материала из биологического образца может быть осуществлена согласно любому из протоколов экстракции нуклеиновых кислот или белков, хорошо известных специалисту в данной области.
Для сведения, экстракция нуклеиновых кислот, в частности, может быть осуществлена за счет:
- стадии лизиса клеток, присутствующих в биологическом образце, в целях высвобождения нуклеиновых кислот, содержащихся в белковых и/или липидных оболочках микроорганизмов (как клеточные дебрисы, которые пертурбируют дальнейшие реакции). В качестве примера, можно использовать способы лизиса, такие, как описываемые в заявках на патенты:
- WO-A-00/05338, способ смешанного магнитного и механического лизиса,
- WO-A-99/53304, способ электрического лизиса, и
- WO-A-99/15321, способ механического лизиса.
Специалист в данной области может использовать другие, хорошо известные, способы лизиса, такие, как тепловые или осмотические удары или химические лизисы за счет хаотропных агентов, таких как гуанидиевые соли (заявка на патент США 5234809);
- стадии очистки, позволяющей осуществлять разделение между нуклеиновыми кислотами и другими клеточными компонентами, высаленными на стадии лизиса. Эта стадия обычно позволяет концентрировать нуклеиновые кислоты. В качестве примера, можно использовать магнитные частицы, необязательно покрытые олигонуклеотидами, за счет адсорбции или ковалентной связи (см. на этот предмет заявки на патенты США А-4672040 и А-5750338), и таким образом очищать нуклеиновые кислоты, которые фиксировались на этих магнитных частицах, за счет стадии промывки. Эта стадия очистки нуклеиновых кислот особенно представляет интерес, если в дальнейшем желают амплифицировать вышеуказанные нуклеиновые кислоты. Особенно представляющий интерес способ реализации этих магнитных частиц описывается в Международных заявках на патенты: WO-A-97/45202 и WO-A-99/35500. Другим, представляющим интерес, примером способа очистки нуклеиновых кислот является использование диоксида кремния либо в колоночной форме, либо в форме инертных[2] или магнитных частиц (Merck: MagPrep® Silica; Promega: MagneSilTM, парамагнитные частицы). Другие, очень широко распространенные, способы базируются на использовании ионообменных смол в колонке или в особом парамагнитном формате (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison P.R. и др., J. Chromatography, 337-344 (1998)). Другим, очень подходящим, но не исключительным, для изобретения способом является способ адсорбции на носителе из оксида металла (фирма Xtrana: матрица Xtra-BindTM). Такая стадия экстракции может быть осуществлена в автоматах. Особенно адаптированным является автомат easyMAG®.
Под специфическим реагентом понимают реагент, который реагирует с биологическим материалом для выявления, прямо или непрямо, экспрессии гена-мишени, которая может быть определена путем анализа мРНК, происходящих от этого гена, или путем анализа кодируемого этим геном белка.
Для сведения, когда желают определить экспрессию гена-мишени путем анализа кодируемого этим геном белка, этот специфический реагент включает по меньшей мере одно антитело, специфичное к белку, кодируемому этим геном-мишенью.
Для сведения, когда желают определить экспрессию гена-мишени путем анализа мРНК-транскриптов, исходя из этого гена, этот специфический реагент включает по меньшей мере один специфический праймер амплификации комплементарной ДНК этой мРНК (тогда речь идет о специфическом праймере амплификации гена-мишени). Комплементарная ДНК матричной РНК может быть получена согласно протоколу, хорошо известному специалисту в данной области. Для сведения, экстрагируют все РНК (включающие рибосомальные РНК, транспортные РНК, мРНК) из биологического образца. Затем проводят реакцию обратной транскрипции с помощью фермента обратная транскриптаза, которая позволяет получать, исходя из фрагмента РНК, комплементарный фрагмент ДНК (кДНК). Осуществление такой стадии хорошо известно специалисту в данной области. Когда желают, более конкретно, получать только комплементарные ДНК матричных РНК, эту ферментативную стадию осуществляют в присутствии нуклеотидных фрагментов, включающих только тиминовые основания (polyT), которые гибридизируются за счет комплементарности с последовательностью polyT различных мРНК с образованием комплекса polyT-polyA, который служит тогда исходной точкой для реакции обратной транскрипции, осуществляемой с помощью фермента обратная транскриптаза. Тогда получают различные комплементарные ДНК различных матричных РНК, первоначально присутствующих в биологическом образце. В дальнейшем контексте обозначением кДНК называют комплементарную ДНК матричной РНК.
Под праймером амплификации понимают нуклеотидный фрагмент, включающий 5-100 нуклеотидных мотивов, предпочтительно, 15-20 нуклеотидных мотивов, и обладающий специфичностью гибридизации в определенных условиях для инициации ферментативной полимеризации, например, в случае ферментативной реакции амплификации.
Под ферментативной реакцией амплификации понимают процесс, генерирующий множественные копии нуклеотидного фрагмента-мишени с помощью специфических праймеров амплификации за счет воздействия по меньшей мере одного фермента. Такие реакции амплификации хорошо известны специалисту в данной области и можно назвать, в частности, следующие способы: ПЦР (полимеразная цепная реакция), LCR (лигазная цепная реакция), RCR (репаративная цепная реакция), 3SR (самоподдерживаемая репликация последовательности), в соответствии с Международной заявкой на патент WO-A-90/06995), NASBA (базирующаяся на полинуклеотидной последовательности амплификация) и ТМА (опосредуемая транскрипцией амплификация), в соответствии с заявкой на патент США А-5399491.
Тогда речь идет о ампликонах для обозначения полинуклеотидов, генерируемых по способу ферментативной амплификации. Предпочтительно, когда ферментативной амплификацией является ПЦР, специфический реагент включает по меньшей мере 2 специфических праймера амплификации, чтобы амплифицировать конкретную область комплементарной ДНК матричной РНК, происходящей от гена-мишени. Когда ферментативной амплификацией является ПЦР, осуществляемая после реакции обратной транскрипции, речь идет о RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой).
Под зондом гибридизации понимают нуклеотидный фрагмент, включающий 5-100 нуклеотидных мотивов, особенно, 6-35 нуклеотидных мотивов, обладающий специфичностью гибридизации в определенных условиях для образования гибридного комплекса с нуклеотидным фрагментом-мишенью. Согласно настоящему изобретению, нуклеотидным фрагментом-мишенью может быть нуклеотидная последовательность, включенная в матричную РНК, или нуклеотидная последовательность, включенная в комплементарную ДНК, полученную путем обратной транскрипции вышеуказанной матричной РНК.
Под гибридизацией понимают процесс, во время которого, в соответствующих условиях, два нуклеотидных фрагмента, таких, как, например, зонд гибридизации и нуклеотидный фрагмент-мишень, имеющие достаточно комплементарные последовательности, способны образовывать двойную нить со стабильными и специфическими водородными связями. Нуклеотидным фрагментом, «способным гибридизироваться» с полинуклеотидом, является фрагмент, который может гибридизироваться с вышеуказанным полинуклеотидом в условиях гибридизации, которые могут быть определены известным образом в каждом случае. Условия гибридизации определяют путем строгого контроля, то есть, точного соблюдения рабочих условий. Гибридизация является тем более специфической, когда она осуществляется при более сильном строгом контроле. Строгий контроль определяется, в частности, с точки зрения состава оснований дуплекса зонд/мишень, а также степенью мезоконъюгации между двумя нуклеиновыми кислотами. Строгий контроль также может быть функцией параметров реакции, таких, как концентрация и тип ионов, присутствующих в растворе для гибридизации, природа и концентрация денатурирующих агентов и/или температура гибридизации. Строгий контроль в отношении условий, при которых должна быть реализована реакция гибридизации, главным образом зависит от используемых зондов гибридизации. Все эти данные хорошо известны и соответствующие условия могут быть определены специалистом в данной области. Как правило, в зависимости от длины используемых зондов гибридизации, температура реакции гибридизации составляет от примерно 20°С до 70°С, в частности, от 35°С до 65°С, в солевом растворе с концентрацией около 0,5-1 М. Затем осуществляют стадию детекции реакции гибридизации.
Под детекцией понимают либо прямую детекцию физическим методом, либо способ детекции с помощью маркера. Для детекции нуклеиновых кислот существуют многочисленные способы детекции[4,5].
Под маркером понимают меченое вещество, способное давать сигнал. Неисчерпывающий перечень этих меченых веществ включает ферменты, которые продуцируют сигнал, детектируемый, например, путем калориметрии, флуоресценции или люминесценции, как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; хромофоры, как флуоресцентные, люминесцентные или окрашивающие соединения; группы с электронной плотностью, детектируемые с помощью электронного микроскопа или за счет их электрических свойств, как удельная проводимость, методами амперометрии или вольтаметрии, или путем измерений импеданса; группы, детектируемые оптическими методами, как дифракция, резонанс поверхностного плазмона, изменение угла контакта, или физическими методами, как спектроскопия атомных сил, туннельный эффект и т.д.; радиоактивные молекулы, как 32Р, 35S или 125I. Так, полинуклеотид может быть маркирован во время стадии ферментативной амплификации, например, используя маркированный нуклеотидтрифосфат для реакции амплификации. Маркированным нуклеотидом является дезоксирибонуклеотид в системах амплификации, генерирующих ДНК, как ПЦР, или рибонуклеотид в способах амплификации, генерирующих РНК, как способы ТМА или NASBA. Полинуклеотид также может быть маркирован после стадии амплификации, например, гибридизируя маркированный зонд по способу гибридизации сэндвич-типа, описанному в документе WO-А-91/19812.
Согласно настоящему изобретению, зондом гибридизации может быть так называемый зонд-ловушка. В этом случае, нуклеотидный фрагмент-мишень может быть предварительно маркирован с помощью маркера. Так называемый зонд-ловушка является имммобилизированным или иммобилизируемым на твердом носителе с помощью любого соответствующего способа, то есть, прямо или непрямо, например, за счет ковалентной связи или адсорбции. Тогда осуществляют реакцию гибридизации между вышеуказанным зондом-ловушкой и маркированным нуклеотидным фрагментом-мишенью.
Зондом гибридизации также может быть так называемый зонд детекции. В этом случае, зонд гибридизации может быть маркирован с помощью маркера. Тогда осуществляют реакцию гибридизации между вышеуказанным зондом детекции и нуклеотидным фрагментом-мишенью.
Когда используют так называемый зонд-ловушку или так называемый зонд детекции, реакция гибридизации может быть осуществлена на твердом носителе, который включает все материалы, на которых может быть иммобилизирована нуклеиновая кислота. В качестве твердого носителя могут быть использованы синтетические материалы или природные материалы, необязательно химически модифицированные, в частности, полисахариды, такие, как материалы на основе целлюлозы, такие как, например, бумага, производные целлюлозы, такие, как ацетат целлюлозы и нитроцеллюлоза или декстран; полимеры, сополимеры, в частности, на основе мономеров стирольного типа, натуральные волокна, такие, как хлопок, и синтетические волокна, такие, как нейлон; минеральные материалы, такие, как диоксид кремния, кварц, стекла, керамика; латекс; магнитные частицы; металлические производные, гели и т.д. Твердый носитель может быть в форме титрационного микропланшета, мембраны, как описано в Международной заявке WO-A-94/12670, частицы или биочипа.
Согласно настоящему изобретению, определение экспрессии гена S100A9 и гена S100A8 может быть проанализировано путем экспрессии матричных РНК, которые в данное время являются транскриптами. В этом случае, биологическим материалом является нуклеиновая кислота и специфическим реагентом может быть безразлично праймер амплификации или зонд гибридизации, такие, как указанные выше.
Экспрессию гена-мишени можно определять следующим образом:
1) после экстракции всех РНК из биологического образца, осуществляют стадию обратной транскрипции, такую, как указанная выше, чтобы получить различные комплементарные ДНК различных матричных РНК, первоначально присутствующих в биологическом образце (или кДНК);
2) специфически амплифицируют кДНК. В этом случае, используемый специфический реагент включает по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени, такой, как указанный выше. Эта стадия может быть осуществлена, в частности, путем реакции амплификации типа ПЦР или любым другим способом соответствующей амплификации;
3) определяют экспрессию гена-мишени, определяя количество кДНК. кДНК могут быть количественно определены, в частности, путем использования диапазона квантификации, получаемого путем реакции амплификации, доводимой вплоть до насыщения. Для учета вариабельности ферментативной эффективности, которая может наблюдаться во время различных стадий (обратная транскрипция, ПЦР…), можно нормировать экспрессию гена-мишени различных групп пациентов путем одновременного определения экспрессии так называемого гена «домашнего хозяйства», экспрессия которого является подобной у различных групп пациентов. Реализуя соотношение между экспрессией гена-мишени и экспрессией гена «домашнего хозяйства», таким образом корректируют любую вариабельность между различными экспериментированиями. Специалист в данной области может, в частности, полагаться на следующие публикации[6,7].
Экспрессию гена-мишени также можно определять следующим образом:
1) после экстракции всех РНК из биологического образца, осуществляют стадию обратной транскрипции, такую, как указанная выше, чтобы получить различные комплементарные ДНК различных матричных РНК, первоначально присутствующих в биологическом образце (или кДНК);
2) иммобилизируют комплементарные ДНК на мембране;
3) определяют экспрессию гена-мишени, гибридизируя кДНК со специфическими, предварительно маркированными, зондами гибридизации гена-мишени. Такие способы гибридизации хорошо известны специалисту в данной области, и можно назвать, в частности, способ нозерн-блоттинга. Эта реакция гибридизации может быть реализована после стадии специфической амплификации комплементарных ДНК матричных РНК гена-мишени, когда, в частности, ген является слабо экспрессируемым.
Экспрессия гена-мишени также может быть проанализирована путем экспрессии белков, кодируемых геном-мишенью. В этом случае, биологическим материалом является белок, и могут быть использованы несколько способов детекции с лигандом или без него. Масс-спектрометрия может быть использована в качестве способа детекции без лиганда. Специфическим реагентом может быть антитело, специфичное к белку, кодируемому геном мишенью, для системы детекции с лигандом.
Рекомбинантные антитела, специфичные к белку, продуцируемому геном-мишенью, могут быть получены согласно классическим, известным специалисту в данной области, способам, исходя из прокариот, таких, как бактерии, или исходя из эукариот, таких, как дрожжи, клетки млекопитающих, растений, насекомых или животных, или за счет систем внеклеточного продуцирования.
Моноклональные антитела могут быть получены согласно классическим, известным специалисту в данной области, способам, таким, как гибридомный способ, основной принцип которого приводится ниже.
Во-первых, с помощью представляющего интерес антигена-мишени иммунизируют животное, обычно мышь, (или культивируемые клетки в рамках иммунизаций in vitro), лимфоциты В которого тогда способны продуцировать антитела к вышеуказанному антигену. Эти лимфоциты, продуценты антител, затем гибридизируют с «бессмертными» миеломатозными клетками (в примере, мышиными) с целью образования гибридом. Исходя из гетерогенной смеси таким образом полученных клеток, тогда осуществляют отбор клеток, способных продуцировать конкретное антитело и бесконечно размножаться. Каждая гибридома размножается в форме клона, причем каждый приводит к продуцированию моноклонального антитела, свойства распознавания которого по отношению к представляющему интерес антигену могут быть тестированы, например, при использовании твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), путем иммуноблоттинга по одному или двум параметрам, путем иммунофлуоресценции или с помощью биоловушки. Таким образом селекционированные моноклональные антитела затем очищают, в частности, согласно способу аффинной хроматографии.
Фрагменты антитела могут быть получены, например, путем протеолиза. Так, они могут быть получены путем ферментативного расщепления, приводящего в результате к фрагментам типа Fab (обработка папаином[8]) или типа F(ab)’2 (обработка пепсином[9]). Они также могут быть получены рекомбинантным путем[10]. Другой фрагмент антитела, который соответствует целям настоящего изобретения, включает фрагмент Fv, который представляет собой димер, образованный нековалентной ассоциацией «легкого» изменяемого домена (VL) и «тяжелого» изменяемого домена (VH) фрагмента Fab, следовательно, ассоциацией двух полипептидных цепей. В целях улучшения стабильности фрагмента Fv, возникающей вследствие диссоциации двух полипептидных цепей, этот фрагмент Fv может быть модифицирован путем генной инженерии за счет введения адаптированной пептидной связи между доменом VL и доменом VH[11]. Тогда речь идет о фрагменте scFv («изменяемый одноцепочечный фрагмент»), так как он образован одной полипептидной цепью. Использование пептидной связи, предпочтительно состоящей из 15-25 аминокислот, позволяет связывать С-конец одного домена с N-концом другого домена с образованием, таким образом, мономерной молекулы, снабженной свойствами связывания, подобными свойствам связывания антитела в его полной форме. Две ориентации доменов VL и VH допускаются (VL-связь-VH и VH-связь-VL), так как они обладают идентичными функциональными свойствами. Разумеется, любой фрагмент, известный специалисту в данной области и обладающий вышеопределенными иммунологическими характеристиками, пригоден в целях изобретения.
Когда биологическим материалом является белок, происходящий из экспрессии гена, экспрессию этого последнего можно определять, детектируя и квантифицируя упомянутый белок путем вестерн-блоттинга или ELISA или любым другим методом, известным специалисту в данной области, таким, как метод хемилюминесценции, исходя из биологического материала.
Метод ELISA («твердофазный иммуноферментный анализ») представляет собой иммуноферментативное количественное определение на твердом носителе. Этот анализ входит в более общие рамки EIA («иммуноферментный анализ»), в случае которого количественное определение связано с катализируемой ферментом реакцией. В методе используют одно или два антитела. Антитело для детекции образования иммунных комплексов (антиген/антитело) связано с ферментом и может генерировать эмиссию сигнала за счет хромогенного или флуорогенного субстрата.
Метод вестерн-блоттинга представляет собой тест для детекции специфического белка в образце с помощью специфичного к этому белку антитела, включающий следующие стадии, такие, как описанные ниже.
Первая стадия представляет собой электрофорез в геле, который позволяет разделять белки образца по их размеру.
Белки в геле тогда переносят на мембрану (нитроцеллюлоза, PVDF…) под давлением или за счет использования электрического тока, причем белки фиксируются на мембране благодаря гидрофобным и ионным взаимодействиям.
После насыщения сайтов неспецифического взаимодействия, первое антитело, специфичное к исследуемому белку, (первичное антитело) инкубируют с мембраной.
Мембрану затем промывают в целях удаления несвязанных первичных антител, затем инкубируют с так называемыми вторичными антителами, которые связываются с первичными антителами. Это вторичное антитело обычно связано с ферментом, который позволяет осуществлять визуальную идентификацию исследуемого белка на мембране. Добавление меченого субстрата фермента вызывает цветную реакцию, которая видима на мембране.
Анализ экспрессии гена S100A9 и/или гена S100A8 позволяет определять восприимчивость пациента к внутрибольничной инфекции, в особенности пациента с воспалительным системным ответом, и составлять прогноз развития септического синдрома. Можно, например, анализировать экспрессию по меньшей мере одного гена-мишени у пациента, в случае которого не было известно о восприимчивости к внутрибольничной инфекции, и путем сравнения с известными величинами обычной экспрессии гена-мишени у восприимчивых пациентов и известными величинами обычной экспрессии гена-мишени у невосприимчивых пациентов определять, восприимчив ли пациент к внутрибольничной инфекции. Таким же образом можно, например, анализировать экспрессию по меньшей мере одного гена-мишени и путем сравнения с обычными величинами известной экспрессии гена-мишени составлять прогноз развития септического синдрома, включая прогноз в отношении выживания или смерти.
Следовательно, объектом настоящего изобретения является способ определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции, согласно которому:
а) получают биологический образец пациента и экстрагируют биологический материал из биологического образца;
b) получают по меньшей мере один специфический реагент в отношении продукта экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени, выбираемого среди генов-мишеней S100A9 и S100A8;
c) определяют экспрессию по меньшей мере одного из генов-мишеней S100A9 и S100A8, причем сверхэкспрессия по отношению к определенной пороговой величине является указанием на восприимчивость к внутрибольничной инфекции.
На стадии с) можно определять экспрессию гена-мишени S100A9 и гена-мишени S100A8, причем сверхэкспрессия гена-мишени S100A9 по отношению к определенной пороговой величине и сверхэкспрессия гена-мишени S100A8 по отношению к определенной пороговой величине являются указанием на восприимчивость к внутрибольничной инфекции.
Специалист в данной области обладает различными возможностями для определения пороговой величины. Можно назвать, например, определение показателя Youden.
Показатель Youden соответствует определению общего процента без погрешности. Он изменяется от 0, для теста, не позволяющего осуществлять распознавание двух популяций, до 1, для теста, позволяющего осуществлять полное распознавание двух популяций. Максимум показателя Youden соответствует пороговой величине, для которой количество ложных результатов (отрицательный ложный и положительный ложный) является наиболее незначительным. Чем ближе показатель Youden к 1, тем более хорошими являются диагностические данные[12].
В особенности, биологический образец берут у пациента с воспалительным системным ответом, ассоциированным или нет с инфекцией. Биологическим образцом может быть образец крови и экстрагированным биологическим материалом может быть, кроме того, нуклеиновая кислота. Предпочтительно из биологического образца экстрагируют все РНК, и определение экспрессии гена-мишени осуществляют путем анализа экспрессии мРНК.
Согласно предпочтительному варианту осуществления способа в соответствии с данным изобретением, специфический реагент включает по меньшей мере один праймер амплификации или по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении продукта экспрессии гена-мишени S100A9 и/или гена-мишени S100A8; или по меньшей мере одно антитело, специфичное к продукту экспрессии гена-мишени S100A9 и/или гена-мишени S100A8.
Способ, в частности, применим для определения восприимчивости к внутрибольничной инфекции пациента с септическим синдромом, то есть, с воспалительным системным ответом на инфекцию, как например SIRS, сепсис, тяжелый сепсис и септический шок.
Специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 и/или гена S100A8, следовательно, используют для определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции, в особенности пациента с воспалительным системным ответом, ассоциированным или нет с инфекцией. Реагент может включать по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении гена-мишени S100A9 по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении гена-мишени S100A8 по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A9 по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A8 по меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A9, или по меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A8.
Анализ экспрессии гена S100A9 и/или S100A8 также позволяет составлять прогноз развития септического синдрома (прогноз, включающий выживание или смерть).
Объектом настоящего изобретения также является способ составления прогноза развития септического синдрома у пациента, согласно которому:
а) получают биологический образец пациента и экстрагируют биологический материал из биологического образца;
b) получают по меньшей мере один специфический реагент в отношении продукта экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени, выбираемого среди генов-мишеней S100A9 и S100A8;
c) определяют экспрессию по меньшей мере одного из генов-мишеней S100A9 и S100A8, причем субэкспрессия по отношению к определенной пороговой величине является указанием на хороший прогноз в отношении развития септического синдрома, и сверхэкспрессия по отношению к определенной пороговой величине является указанием на плохой прогноз в отношении развития септического синдрома.
На стадии с) можно определять экспрессию гена-мишени S100A9 и гена-мишени S100A8, причем субэкспрессия гена-мишени S100A9 по отношению к определенной пороговой величине и субэкспрессия гена-мишени S100A8 по отношению к определенной пороговой величине являются указанием на хороший прогноз в отношении развития септического синдрома;
сверхэкспрессия гена-мишени S100A9 по отношению к определенной пороговой величине и сверхэкспрессия гена-мишени S100A8 по отношению к определенной пороговой величине являются указанием на плохой прогноз в отношении развития септического синдрома.
Определение пороговой величины является доступным пониманию специалиста в данной области. Можно назвать, например, определение показателя Youden. Показатель Youden соответствует определению общего процента без погрешности. Он варьирует от 0, для теста, не позволяющего осуществлять распознавание двух популяций, до 1, для теста, позволяющего осуществлять полное распознавание двух популяций. Максимум показателя Youden соответствует пороговой величине, для которой количество ложных результатов (отрицательный ложный и положительный ложный) является наиболее незначительным. Чем ближе показатель Youden к 1, тем более хорошими являются диагностические данные[12].
Биологическим образцом может быть образец крови, и экстрагированным биологическим материалом может быть, кроме того, нуклеиновая кислота. Предпочтительно, из биологического образца экстрагируют все РНК, и определение экспрессии гена-мишени осуществляют путем анализа экспрессии мРНК.
Согласно предпочтительному варианту осуществления способа в соответствии с изобретением, специфический реагент включает по меньшей мере один праймер амплификации или по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении продукта экспрессии гена-мишени S100A9 и/или гена-мишени S100A8; или по меньшей мере одно антитело, специфичное к продукту экспрессии гена-мишени S100A9 и/или гена-мишени S100A8.
Специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 и/или гена S100A8, следовательно, используют для составления прогноза развития септического синдрома у пациента (включая прогноз выживания или смерти). Реагент может включать по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении гена-мишени S100A9 по меньшей мере один специфический зонд гибридизации в отношении гена-мишени S100A8 по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A9 по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A8 по меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A9, или по меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A8.
Фигуры
Фиг. 1 представляет собой корреляцию экспрессии гена S100A9 и гена S100A8 (n=86). На ней представлена сильная корреляция, которая существует между генными экспрессиями молекул S100A9 и S100A8 с коэффициентом Spearman >0,90 (r=0,9134). Генные экспрессии молекул S100A9 и S100A8 обладают похожей способностью к распознаванию пациентов, восприимчивых к внутрибольничной инфекции, и составлению прогноза развития септического синдрома.
Фиг. 2 иллюстрирует значительное различие экспрессии гена S100A8 (р=0,0461) между выжившими и невыжившими пациентами в случае взятия проб, осуществляемых между днем 7 и днем 10 после начала септического шока. Пояснительный список условных обозначений: HV = здоровые волонтеры; S = выжившие пациенты; NS = невыжившие пациенты.
Примеры
Пример 1
Исследование экспрессии гена S100A9
Образцы
Использовали группу из 44 здоровых волонтеров (S) и группу из 148 пациентов, пораженных септическим синдромом (SEP) и пробы для анализа у которых брали в день 1, день 2 и день 3 после септического шока (Н0 означает инъекцию повышающего кровяное давление средства), в целях сравнения экспрессии гена S100A9 в периферической крови. Тогда четко различали группу из 44 здоровых пациентов (S) и группу из 148 пациентов с развивающимся септическим шоком (SEP).
Экстракция РНК и синтез кДНК
В случае каждого пациента, биологический образец представлял собой пробу крови, регулярно отбираемую в течение первых 10 дней, следующих за началом септического синдрома, развивающегося у SEP-пациентов. Взятие пробы также осуществляли, согласно тому же самому протоколу, у здоровых пациентов (S). Эти пробы собирали прямо в пробирки PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, США).
После стадии взятия пробы крови и для достижения полного лизиса клеток, пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего хранили при температуре -20°С вплоть до экстракции биологического материала. Более конкретно, согласно этому протоколу, все РНК экстрагировали с помощью наборов PAXgene Blood RNA® (PreAnalytiX), соблюдая рекомендации изготовителя. Вкратце, пробирки центрифугировали (10 минут, ускорение 3000 g) для получения осадка нуклеиновых кислот. Этот осадок промывали и вновь помещали в буфер, содержащий протеиназу К, необходимую для расщепления белков (10 минут, при температуре 55°С). Осуществляли новое центрифугирование (5 минут, ускорение 19000 g) для удаления клеточных дебрисов и добавляли этанол для оптимизации условий фиксации нуклеиновых кислот. Все РНК специфически фиксировали в колонках PAXgene RNA spin column и, перед их элюированием, осуществляли расщепление загрязняющей ДНК с помощью набора RNAse free DNAse setTМ (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
Для каждой экстракции, контролировали качество всех РНК путем капиллярного электрофореза, используя набор RNA 6000 Nano ChipТМ (Agilent Technologies). Используемым инструментом является биоанализатор 2100. Реакцию обратной транскрипции (RT) осуществляли в конечном объеме 20 мкл. Полную РНК (0,5 мкг) смешивали с 1 мкл 50 мкМ polyT и 1 мкл буфера для гибридизации, затем инкубировали в течение 5 минут при температуре 65°С. После охлаждения на льду, раствор смешивали с 10 мкл 2х первого фермента цепной реакции Mix и 2 мкл SuperScript III/RNaseTM без фермента Mix RT (15 Ед/мкл), причем все эти продукты происходили из системы для ПЦР с обратной транскриптазой SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR (Invitrogen). Обратную транскрипцию осуществляли в течение 50 минут при температуре 50°С, затем прекращали путем инкубации в течение 5 минут при температуре 85°С. В завершение, каждый раствор кДНК разводили в 1/10 в DEPC-воде.
Получение эталонных наборов для количественного определения
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 153-179 гена-мишени S100A9 (банк генов, № NM_002965.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’ (идентифицированная последовательность № 1)
антисмысловой праймер: 5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’ (идентифицированная последовательность № 2)
Анализ экспрессии мРНК путем ПЦР в реальном режиме времени
Ретранскриптные мРНК гена-мишени S100A9, в виде кДНК, как описано выше, количественно определяли путем количественной ПЦР в режиме реального времени, используя LightCyclerTM (Roche). Реакции ПЦР осуществляли с помощью набора для ПЦР в режиме реального времени Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals). Каждую ПЦР осуществляли в конечном объеме 20 мкл, содержащем 3,6 мкл воды, 2,4 мкл MgCl2, 2 мкл SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq ДНК-полимераза) и 1 мкл каждого праймера (10 мкМ) и 10 мкл раствора кДНК. Используемыми праймерами являются вышеуказанные праймеры.
После стадии денатурации в течение 10 минут при температуре 95°С, осуществляли амплификацию с помощью 40 циклов согласно протоколу «touch-down» ПЦР (10 секунд при температуре 95°С, 10 секунд гибридизации при температуре 68-58°С с последующим выдерживанием в течение 16 секунд при температуре 72°С). В конце каждого цикла измеряли эмиттируемую SYBR Green флуоресценцию.
Для подтверждения специфичности амплификации, продукты ПЦР систематически анализировали в соответствии с кривой гибридизации (LightCyclerTM - Roche). Для этого, продукты ПЦР подвергали обработке возрастающей от 58°С до 98°С температурой с повышением 0,1°С/с. Для каждого продукта ПЦР получали один пик во время анализа кривой, характерный для температуры специфической гибридизации.
Комбинацию праймеров, необходимых для количественного определения гена «домашнего хозяйства» СРВ, получали от фирмы Search-LC (Гейдельберг, Германия; индекс 488116).
Количество мРНК-мишени по отношению к количеству мРНК гена «домашнего хозяйства» циклофилина В анализировали по способу относительной квантификации при использовании программного обеспечения LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). «Second Derivative Maximum Method» программного обеспечения LightCyclerТМ (Roche) использовали для определения автоматически «области гибридизации» (Ср) для каждого образца. Значение Ср определяли как количество циклов, для которого флуоресценция была значительно отличающейся от шумового фона.
Пять последовательных разведений в 1/10 осуществляли в четырех повторениях в случае каждого стандарта, чтобы построить калибровочную кривую, выражающую Ср в зависимости от логарифма числа копий. Разведения стандарта оптимизировали для того, чтобы калибровочная кривая перекрывала уровень экспрессии, ожидаемый для каждого гена-мишени и гена «домашнего хозяйства». Были построены относительные стандартные кривые, описывающие эффективность ПЦР для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства», и использованы для осуществления квантификации с помощью программного обеспечения LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Полученные результаты
Полученные результаты представлены в нижеприводимой таблице 1.
Таблица 1 | ||||
Пациенты | Количество | Медиана | Нижний квартиль | Верхний квартиль |
S | 44 | 1,46 | 1,065 | 1,87 |
SEP | 148 | 16,62 | 11,87 | 25,835 |
р_Значение теста Mann-Whitney между здоровыми людьми и пациентами, пораженными септическим шоком, составляет <0,0001.
Экспрессия маркера S100A9 в первые 3 дня септического шока была значительно более сильно выражена по отношению к здоровым донорам.
Пример 2
Исследование экспрессии гена S100A8
Образцы
Использовали группу из 32 здоровых волонтеров (S) и группу из 86 пациентов, пораженных септическим синдромом (SEP) и пробы для анализа у которых брали между днем 7 и днем 10 после септического шока (Н0 означает инъекцию повышающего кровяное давление средства), в целях сравнения экспрессии гена S100A8 в периферической крови. Тогда четко различали группу из 32 здоровых пациентов (S) и группу из 86 пациентов с развивающимся септическим шоком (SEP).
Экстракция РНК и синтез кДНК
В случае каждого пациента, биологический образец представляет собой пробу крови, регулярно отбираемую в течение первых 10 дней, следующих за началом септического синдрома, развивающегося у SEP-пациентов. Взятие пробы также осуществляли, согласно тому же самому протоколу, у здоровых пациентов (S). Эти пробы собирали прямо в пробирки PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, США).
После стадии взятия пробы крови и для достижения полного лизиса клеток, пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего хранили при температуре -20°С вплоть до экстракции биологического материала. Более конкретно, согласно этому протоколу, все РНК экстрагировали с помощью наборов PAXgene Blood RNA® (PreAnalytiX), соблюдая рекомендации изготовителя. Вкратце, пробирки центрифугировали (10 минут, ускорение 3000 g) для получения осадка нуклеиновых кислот. Этот осадок промывали и вновь помещали в буфер, содержащий протеиназу К, необходимую для расщепления белков (10 минут, при температуре 55°С). Осуществляли новое центрифугирование (5 минут, ускорение 19000 g) для удаления клеточных дебрисов и добавляли этанол для оптимизации условий фиксации нуклеиновых кислот. Все РНК специфически фиксировали в колонках PAXgene RNA spin column и, перед их элюированием, осуществляли расщепление загрязняющей ДНК с помощью набора RNAse free DNAse setТМ (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
Для каждой экстракции, контролировали качество всех РНК путем капиллярного электрофореза, используя набор RNA 6000 Nano ChipТМ (Agilent Technologies). Используемым инструментом является биоанализатор 2100. Реакцию обратной транскрипции (RT) осуществляли в конечном объеме 20 мкл. Полную РНК (0,5 мкг) смешивали с 1 мкл 50 мкМ polyT и 1 мкл буфера для гибридизации, затем инкубировали в течение 5 минут при температуре 65оС. После охлаждения на льду, раствор смешивали с 10 мкл 2х первого фермента цепной реакции Mix и 2 мкл SuperScript III/RNaseTM без фермента Mix RT (15 Ед/мкл), причем все эти продукты происходили из системы для ПЦР с обратной транскриптазой SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR (Invitrogen). Обратную транскрипцию осуществляли в течение 50 минут при температуре 50°С, затем прекращали путем инкубации в течение 5 минут при температуре 85°С. В завершение, каждый раствор кДНК разводили в 1/10 в DEPC-воде.
Получение эталонных наборов для количественного определения
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 129-280 гена-мишени S100A8 (банк генов, № NM_002964.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’ (идентифицированная последовательность № 3)
антисмысловой праймер: 5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’ (идентифицированная последовательность № 4)
Анализ экспрессии мРНК путем ПЦР в реальном режиме времени
Ретранскриптные мРНК гена-мишени S100A8, в виде кДНК, как описано выше, количественно определяли путем количественной ПЦР в режиме реального времени, используя LightCyclerTM (Roche). Реакции ПЦР осуществляли с помощью набора для ПЦР в режиме реального времени Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals). Каждую ПЦР осуществляли в конечном объеме 20 мкл, содержащем 3,6 мкл воды, 2,4 мкл MgCl2, 2 мкл SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq ДНК полимераза) и 1 мкл каждого праймера (10 мкМ) и 10 мкл раствора кДНК. Используемыми праймерами являются вышеуказанные праймеры.
После стадии денатурации в течение 10 минут при температуре 95°С, осуществляли амплификацию с помощью 40 циклов согласно протоколу «touch-down» ПЦР (10 секунд при температуре 95°С, 10 секунд гибридизации при температуре 68-58°С с последующим выдерживанием в течение 16 секунд при температуре 72°С). В конце каждого цикла измеряли эмиттируемую SYBR Green флуоресценцию.
Для подтверждения специфичности амплификации, продукты ПЦР систематически анализировали в соответствии с кривой гибридизации (LightCyclerTM - Roche). Для этого, продукты ПЦР подвергали обработке возрастающей от 58°С до 98°С температурой с повышением 0,1°С/с. Для каждого продукта ПЦР получали один пик во время анализа кривой, характерный для температуры специфической гибридизации.
Комбинацию праймеров, необходимых для количественного определения гена «домашнего хозяйства» СРВ, получали от фирмы Search-LC (Гейдельберг, Германия; индекс 488116).
Количество мРНК-мишени по отношению к количеству мРНК гена «домашнего хозяйства» циклофилина В анализировали по способу относительной квантификации при использовании программного обеспечения LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). «Second Derivative Maximum Method» программного обеспечения LightCyclerТМ (Roche) использовали для определения автоматически «области гибридизации» (Ср) для каждого образца. Значение Ср определяли как количество циклов, для которого флуоресценция была значительно отличающейся от шумового фона.
Пять последовательных разведений в 1/10 осуществляли в четырех повторениях в случае каждого стандарта, чтобы построить калибровочную кривую, выражающую Ср в зависимости от логарифма числа копий. Разведения стандарта оптимизировали для того, чтобы калибровочная кривая перекрывала уровень экспрессии, ожидаемый для каждого гена-мишени и гена «домашнего хозяйства». Были построены относительные стандартные кривые, описывающие эффективность ПЦР для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства», и использованы для осуществления квантификации с помощью программного обеспечения LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Полученные результаты
Полученные результаты представлены в нижеприводимой таблице 2.
Таблица 2 | ||||
Пациенты | Количество | Медиана | Нижний квартиль | Верхний квартиль |
S | 32 | 12,9 | 8,5 | 20,4 |
SEP | 86 | 183,5 | 96,6 | 438,5 |
р_Значение теста Mann-Whitney между здоровыми людьми и пациентами, пораженными септическим шоком, составляет <0,0001.
Экспрессия маркера S100A8 в дни от 7 до 10 после септического шока была значительно более сильно выражена по отношению к здоровым донорам.
Пример 3
Исследование прогностического значения выживания S100A8 у пациентов с септическим шоком
Образцы
Исследование проводили при использовании группы из 86 пациентов с развитым септическим шоком и принятых в хирургическое или терапевтическое реанимационное отделение больничного центра Lyon-Sud. У этих пациентов брали пробы для анализа в день 7, день 8, день 9 или день 10 после септического шока (Н0 означает начало введения повышающего кровяное давление средства).
Экстракция РНК и синтез кДНК
В случае каждого пациента, биологический образец представляет собой пробу крови, которую ежедневно отбирали в течение первых 10 дней, следующих за началом септического синдрома (SEP-пациенты). Эти пробы собирали прямо в пробирки PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, США).
После стадии взятия пробы крови и для достижения полного лизиса клеток, пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего хранили при температуре -20°С вплоть до экстракции биологического материала. Более конкретно, согласно этому протоколу, все РНК экстрагировали с помощью наборов PAXgene Blood RNA® (PreAnalytiX), соблюдая рекомендации изготовителя. Вкратце, пробирки центрифугировали (10 минут, ускорение 3000 g) для получения осадка нуклеиновых кислот. Этот осадок промывали и вновь помещали в буфер, содержащий протеиназу К, необходимую для расщепления белков (10 минут, при температуре 55°С). Осуществляли новое центрифугирование (5 минут, ускорение 19000 g) для удаления клеточных дебрисов и добавляли этанол для оптимизации условий фиксации нуклеиновых кислот. Все РНК специфически фиксировали в колонках PAXgene RNA spin column и, перед их элюированием, осуществляли расщепление загрязняющей ДНК с помощью набора RNAse free DNAse setТМ (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
Для каждой экстракции, контролировали качество всех РНК путем капиллярного электрофореза, используя набор RNA 6000 Nano ChipТМ (Agilent Technologies). Используемым инструментом является биоанализатор 2100ТМ. Реакцию обратной транскрипции (RT) осуществляли в конечном объеме 20 мкл. Полную РНК (0,5 мкг) смешивали с 1 мкл 50 мкМ oligo(dT) и 1 мкл буфера для гибридизации, затем инкубировали в течение 5 минут при температуре 65°С. После охлаждения на льду, раствор смешивали с 10 мкл 2х первого фермента цепной реакции Mix и 2 мкл SuperScript III/RNase без фермента Mix RT (15 Ед/мкл), причем все эти продукты происходили из системы SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR (Invitrogen). Обратную транскрипцию осуществляли в течение 50 минут при температуре 50°С, затем прекращали путем инкубации в течение 5 минут при температуре 85°С. В завершение, каждый раствор кДНК разводили в 1/10 в DEPC-воде.
Получение эталонных наборов для количественного определения
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 129-280 гена-мишени S100A8 (банк генов, № NM_002964.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’ (идентифицированная последовательность № 3)
антисмысловой праймер: 5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’ (идентифицированная последовательность № 4)
Анализ экспрессии мРНК путем количественной ПЦР в реальном режиме времени
Ретранскриптные мРНК гена-мишени S100A9, в виде кДНК, как описано выше, количественно определяли путем количественной ПЦР в режиме реального времени, используя LightCyclerTM (Roche). Реакции ПЦР осуществляли с помощью набора для ПЦР в режиме реального времени Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals). Каждую ПЦР осуществляли в конечном объеме 20 мкл, содержащем 3,6 мкл воды, 2,4 мкл MgCl2, 2 мкл SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq ДНК-полимераза) и 1 мкл каждого праймера (10 мкМ) и 10 мкл раствора кДНК. Используемыми праймерами являются вышеуказанные праймеры.
После стадии денатурации в течение 10 минут при температуре 95°С, осуществляли амплификацию с помощью 40 циклов согласно протоколу «touch-down» ПЦР (10 секунд при температуре 95°С, 10 секунд гибридизации при температуре 68-58°С (0,5оС/цикл), с последующим выдерживанием в течение 16 секунд при температуре 72°С). В конце каждого цикла измеряли эмиттируемую SYBR Green флуоресценцию.
Для подтверждения специфичности амплификации, продукты ПЦР систематически анализировали в соответствии с кривой гибридизации (LightCyclerTM 2.0 - Roche). Для этого, продукты ПЦР подвергали обработке возрастающей от 58°С до 98°С температурой с повышением 0,1°С/с. Для каждого продукта ПЦР получали один пик во время анализа кривой, характерный для температуры специфической гибридизации.
Комбинацию праймеров, необходимых для количественного определения гена «домашнего хозяйства» СРВ, получали от фирмы Search-LC (Гейдельберг, Германия; индекс 488116).
Количество мРНК-мишени по отношению к количеству мРНК гена «домашнего хозяйства» циклофилина В анализировали по способу относительной квантификации при использовании программного обеспечения LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). «Second Derivative Maximum Method» программного обеспечения LightCyclerТМ (Roche) использовали для определения автоматически «области гибридизации» (Ср) для каждого образца. Значение Ср определяли как количество циклов, для которого флуоресценция была значительно отличающейся от шумового фона.
Пять последовательных разведений в 1/10 осуществляли в четырех повторениях в случае каждого стандарта, чтобы построить калибровочную кривую, выражающую Ср в зависимости от логарифма числа копий. Разведения стандарта оптимизировали для того, чтобы калибровочная кривая перекрывала уровень экспрессии, ожидаемый для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства». Были построены относительные стандартные кривые, описывающие эффективность ПЦР для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства», и использованы для осуществления квантификации с помощью программного обеспечения LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Анализ результатов
Для определения, коррелирует ли экспрессия гена S100A8 с выживанием пациента, осуществляли тест Mann-Whitney. На фиг.2 проиллюстрировано значительное различие экспрессии гена S100A8 (р=0,0461) между выжившими пациентами и невыжившими пациентами при использовании образцов проб крови, отбираемых между днем 7 и днем 10 после начала септического шока.
Пример 4
Исследование экспрессии гена S100A9 для определения восприимчивости пациентов к внутрибольничной инфекции
Образцы
Исследование проводили при использовании группы из 93 пациентов с проявляемым септическим шоком и принятых в хирургическое или терапевтическое реанимационное отделение больничного центра Lyon-Sud. У этих пациентов брали пробы для анализа в день 7, день 8, день 9 или день 10 после септического шока (Н0 означает начало введения повышающего кровяное давление средства).
Среди этих пациентов с проявляемым септическим шоком 27 пациентов вторично подверглись шоку за счет внутрибольничной инфекции и 66 пациентов не подверглись внутрибольничной инфекции в течение 53 дней наблюдения этой группы.
Экстракция РНК и синтез кДНК
В случае каждого пациента, биологический образец представляет собой пробу крови, которую регулярно отбирали в течение первых 10 дней, следующих за началом септического синдрома (SEP-пациенты). Взятие проб также осуществляли, согласно тому же самому протоколу, у здоровых субъектов (S). Эти пробы собирали прямо в пробирки PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, США).
После стадии взятия пробы крови и для достижения полного лизиса клеток, пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего хранили при температуре -20°С вплоть до экстракции биологического материала. Более конкретно, согласно этому протоколу, все РНК экстрагировали с помощью наборов PAXgene Blood RNA® (PreAnalytiX), соблюдая рекомендации изготовителя. Вкратце, пробирки центрифугировали (10 минут, ускорение 3000 g) для получения осадка нуклеиновых кислот. Этот осадок промывали и вновь помещали в буфер, содержащий протеиназу К, необходимую для расщепления белков (10 минут, при температуре 55°С). Осуществляли новое центрифугирование (5 минут, ускорение 19000 g) для удаления клеточных дебрисов и добавляли этанол для оптимизации условий фиксации нуклеиновых кислот. Все РНК специфически фиксировали в колонках PAXgene RNA spin columnТМ и, перед их элюированием, осуществляли расщепление загрязняющей ДНК с помощью набора RNAse free DNAse setТМ (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
В случае каждой экстракции, контролировали качество всех РНК путем капиллярного электрофореза, используя набор RNA 6000 Nano ChipТМ (Agilent Technologies). Используемым инструментом является биоанализатор 2100ТМ. Реакцию обратной транскрипции (RT) осуществляли в конечном объеме 20 мкл. Полную РНК (0,5 мкг) смешивали с 1 мкл 50 мкМ polyT и 1 мкл 50 мкМ oligo(dT) и 1 мкл буфера для гибридизации, затем инкубировали в течение 5 минут при температуре 65°С. После охлаждения на льду, раствор смешивали с 10 мкл 2х первого фермента цепной реакции Mix и 2 мкл SuperScript III/RNase без фермента Mix RT (15 Ед/мкл), причем все эти продукты происходили из системы SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR (Invitrogen). Обратную транскрипцию осуществляли в течение 50 минут при температуре 50°С, затем прекращали путем инкубации в течение 5 минут при температуре 85°С. В завершение, каждый раствор кДНК разводили в 1/10 в DEPC-воде.
Получение эталонных наборов для количественного определения
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 153-179 гена-мишени S100A9 (банк генов, № NM_002965.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’ (идентифицированная последовательность № 1)
антисмысловой праймер: 5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’ (идентифицированная последовательность № 2)
Анализ экспрессии мРНК путем ПЦР в реальном режиме времени
Ретранскриптные мРНК гена-мишени S100A9, в виде кДНК, как описано выше, количественно определяли путем количественной ПЦР в режиме реального времени, используя LightCyclerTM (Roche). Реакции ПЦР осуществляли с помощью набора для ПЦР в режиме реального времени Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals). Каждую ПЦР осуществляли в конечном объеме 20 мкл, содержащем 3,6 мкл воды, 2,4 мкл MgCl2, 2 мкл SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq ДНК-полимераза) и 1 мкл каждого праймера (10 мкМ) и 10 мкл раствора кДНК. Используемыми праймерами являются вышеуказанные праймеры.
После стадии денатурации в течение 10 минут при температуре 95°С, осуществляли амплификацию с помощью 40 циклов согласно протоколу «touch-down» ПЦР (10 секунд при температуре 95°С, 10 секунд гибридизации при температуре 68-58°С, с последующим выдерживанием в течение 16 секунд при температуре 72°С). В конце каждого цикла измеряли эмиттируемую SYBR Green флуоресценцию.
Для подтверждения специфичности амплификации, продукты ПЦР систематически анализировали в соответствии с кривой гибридизации (LightCyclerTM - Roche). Для этого, продукты ПЦР подвергали обработке возрастающей от 58°С до 98°С температурой с повышением 0,1°С/с. Для каждого продукта ПЦР получали один пик во время анализа кривой, характерный для температуры специфической гибридизации.
Комбинацию праймеров, необходимых для количественного определения гена «домашнего хозяйства» СРВ, получали от фирмы Search-LC (Гейдельберг, Германия; индекс 488116).
Количество мРНК-мишени по отношению к количеству мРНК гена «домашнего хозяйства» циклофилина В анализировали по способу относительной квантификации при использовании программного обеспечения LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). «Second Derivative Maximum Method» программного обеспечения LightCyclerТМ (Roche) использовали для определения автоматически «области гибридизации» (Ср) для каждого образца. Значение Ср определяли как количество циклов, для которого флуоресценция была значительно отличающейся от шумового фона.
Пять последовательных разведений в 1/10 осуществляли в четырех повторениях в случае каждого стандарта, чтобы построить калибровочную кривую, выражающую Ср в зависимости от логарифма числа копий. Разведения стандарта оптимизировали для того, чтобы калибровочная кривая перекрывала уровень экспрессии, ожидаемый для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства». Были построены относительные стандартные кривые, описывающие эффективность ПЦР для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства», и использованы для осуществления квантификации с помощью программного обеспечения LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Результаты моноварьируемого и мультиварьируемого анализов
Для определения переменных, влияющих на неожиданное появление внутрибольничной инфекции, осуществляли моноварьируемый анализ, затем мультиварьируемый анализ. Моноварьируемый анализ реализовали, осуществляя логистическую регрессию достигаемого или не достигаемого статуса внутрибольничной инфекции в зависимости от различных переменных и в отношении маркера S100A9 в случае мРНК в дни от 7 до 10 после начала септического шока. Затем реализовали мультиварьируемую логистическую регрессию в отношении переменных, представляющих уровень значимости (р)<0,15 при моноварьируемом анализе. Метод «обратной» селекции (вначале все переменные принимали во внимание на модели, затем их извлекали по одной) использовали с порогом значимости 0,05. Результаты представлены в нижеприводимой таблице 3. Для каждого результата указаны коэффициент нечетности (O.R.) и его доверительный интервал 95%.
Таблица 3 | |||||||
Моноварьируемый анализ (N=93) | Мультиварьируемый анализ (N=93) | ||||||
OR | 95% CI | P | OR | 95% CI | P | ||
Пол | Мужской | 1 | - | - | |||
Женский | 1,6 | 0,641-3,997 | 0,3143 | ||||
Возраст (лет) | >65 | 1 | - | - | - | - | - |
≤ 65 | 2,04 | 0,814-5,115 | 0,1285 | - | - | 0,1186 | |
SAPS II с допущением | >51 | 1 | - | - | |||
≤51 | 1,107 | 0,450-2,723 | 0,8246 | ||||
SOFA с допущением | <10 | 1 | - | - | - | - | - |
≥10 | 3,036 | 1,132-8,144 | 0,0274- | - | - | 0,1384 | |
Созаболеваемости | 0 | 1 | - | - | |||
≥1 | 1,021 | 0,414-2,514 | 0,9645 | ||||
Тип инфекции | Внутрибольничная | 1 | - | - | |||
Общая | 1,144 | 0,467-2,803 | 0,7682 | ||||
Область инфекции | Легочная | 1 | - | - | |||
Абдоминальная | 1,735 | 0,644-4,672 | 0,3268 | ||||
Другие | 1,172 | 0,299-4,597 | 0,8540 | ||||
S100A9 (МРНК) | <6,1 | 1 | - | - | 1 | - | - |
≥6,1 | 6,27 | 1,718-22,891 | 0,0055 | 6,242 | 1,662-23,447 | 0,0067 | |
OR: коэффициент нечетности. СI: доверительный интервал. Р: порог значимости. |
Как это следует из таблицы 3, мультиварьируемый анализ показывает, что экспрессия маркера S100A9≥6,1 в дни 7-10 после начала септического шока значительно повышает вероятность неожиданного появления внутрибольничной инфекции (коэффициент нечетности составляет 6,2).
Пример 5
Исследование корреляции экспрессии гена S100A9 и экспрессии гена S100A8
Образцы
Исследование проводили при использовании группы из 86 пациентов с проявляемым септическим шоком и принятых в хирургическое или терапевтическое реанимационное отделение больничного центра Lyon-Sud. У этих пациентов брали пробы для анализа в день 7, день 8, день 9 или день 10 после септического шока (Н0 означает начало введения повышающего кровяное давление средства).
Экстракция РНК и синтез кДНК
В случае каждого пациента, биологический образец представляет собой пробу крови, которую ежедневно отбирали в течение первых 10 дней, следующих за началом септического синдрома (SEP-пациенты). Эти пробы собирали прямо в пробирки PAXgeneTM Blood RNA (PreAnalytiX, Frankin Lakes, США).
После стадии взятия пробы крови и для достижения полного лизиса клеток, пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего хранили при температуре -20°С вплоть до экстракции биологического материала. Более конкретно, согласно этому протоколу, все РНК экстрагировали с помощью наборов PAXgene Blood RNA® (PreAnalytiX), соблюдая рекомендации изготовителя. Вкратце, пробирки центрифугировали (10 минут, ускорение 3000 g) для получения осадка нуклеиновых кислот. Этот осадок промывали и вновь помещали в буфер, содержащий протеиназу К, необходимую для расщепления белков (10 минут, при температуре 55°С). Осуществляли новое центрифугирование (5 минут, ускорение 19000 g) для удаления клеточных дебрисов и добавляли этанол для оптимизации условий фиксации нуклеиновых кислот. Все РНК специфически фиксировали в колонках PAXgene RNA spin columnТМ и, перед их элюированием, осуществляли расщепление загрязняющей ДНК с помощью набора RNAse free DNAse setТМ (Qiagen Ltd, Crawley, UK).
В случае каждой экстракции, контролировали качество всех РНК путем капиллярного электрофореза, используя набор RNA 6000 Nano ChipТМ (Agilent Technologies). Используемым инструментом является биоанализатор 2100ТМ. Реакцию обратной транскрипции (RT) осуществляли в конечном объеме 20 мкл. Полную РНК (0,5 мкг) смешивали с 1 мкл 50 мкМ oligo(dT) и 1 мкл буфера для гибридизации, затем инкубировали в течение 5 минут при температуре 65°С. После охлаждения на льду, раствор смешивали с 10 мкл 2х первого фермента цепной реакции Mix и 2 мкл SuperScript III/RNase без фермента Mix RT (15 Ед/мкл), причем все эти продукты происходили из системы для ПЦР с обратной транскриптазой SuperScript First Strand Synthesis Super MiхTM RT-PCR (Invitrogen). Обратную транскрипцию осуществляли в течение 50 минут при температуре 50°С, затем прекращали путем инкубации в течение 5 минут при температуре 85°С. В завершение, каждый раствор кДНК разводили в 1/10 в DEPC-воде.
Получение эталонных наборов для количественного определения
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 153-179 гена-мишени S100A9 (банк генов, № NM_002965.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’ (идентифицированная последовательность № 1)
антисмысловой праймер: 5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’ (идентифицированная последовательность № 2)
Исходя из пула кДНК, происходящего от здоровых субъектов, осуществляли амплификацию области 129-280 гена-мишени S100A8 (банк генов, № NM_002964.3) путем ПЦР (полимеразная цепная реакция), проводимой вплоть до насыщения, используя следующую пару праймеров:
смысловой праймер: 5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’ (идентифицированная последовательность № 3)
антисмысловой праймер: 5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’ (идентифицированная последовательность № 4)
Анализ экспрессии мРНК путем количественной ПЦР в реальном режиме времени
Ретранскриптные мРНК генов-мишеней S100A9 и S100A8, в виде кДНК, как описано выше, количественно определяли путем количественной ПЦР в режиме реального времени, используя LightCyclerTM 2.0 (Roche). Реакции ПЦР осуществляли с помощью набора для ПЦР в режиме реального времени Fast-StartTM DNA Master SYBR Green I (Roche Molecular Biochemicals). Каждую ПЦР осуществляли в конечном объеме 20 мкл, содержащем 3,6 мкл воды, 2,4 мкл MgCl2, 2 мкл SYBR Green mix (Fast start DNA master SYBR green + Taq ДНК-полимераза) и 1 мкл каждого праймера (10 мкМ) и 10 мкл раствора кДНК. Используемыми праймерами являются вышеуказанные праймеры.
После стадии денатурации в течение 10 минут при температуре 95°С, осуществляли амплификацию с помощью 40 циклов согласно протоколу «touch-down» ПЦР (10 секунд при температуре 95°С, 10 секунд гибридизации при температуре 68-58°С (0,5°С/цикл), с последующим выдерживанием в течение 16 секунд при температуре 72°С). В конце каждого цикла измеряли эмиттируемую SYBR Green флуоресценцию.
Для подтверждения специфичности амплификации, продукты ПЦР систематически анализировали в соответствии с кривой гибридизации (LightCyclerTM 2.0 - Roche). Для этого, продукты ПЦР подвергали обработке возрастающей от 58°С до 98°С температурой с повышением 0,1°С/с. Для каждого продукта ПЦР получали один пик во время анализа кривой, характерный для температуры специфической гибридизации.
Комбинацию праймеров, необходимых для количественного определения гена «домашнего хозяйства» СРВ, получали от фирмы Search-LC (Гейдельберг, Германия; индекс 488116).
Количество мРНК-мишеней по отношению к количеству мРНК гена «домашнего хозяйства» циклофилина В анализировали по способу относительной квантификации при использовании программного обеспечения LightCycler Relative Quantification SoftwareTM (Roche Molecular Biochemicals). «Second Derivative Maximum Method» программного обеспечения LightCyclerТМ (Roche) использовали для определения автоматически «области гибридизации» (Ср) для каждого образца. Значение Ср определяли как количество циклов, для которого флуоресценция была значительно отличающейся от шумового фона.
Пять последовательных разведений в 1/10 осуществляли в четырех повторениях в случае каждого стандарта, чтобы построить калибровочную кривую, выражающую Ср в зависимости от логарифма числа копий. Разведения стандарта оптимизировали для того, чтобы калибровочная кривая перекрывала уровень экспрессии, ожидаемый для генов-мишеней и гена «домашнего хозяйства». Были построены относительные стандартные кривые, описывающие эффективность ПЦР для гена-мишени и гена «домашнего хозяйства», и использованы для осуществления квантификации с помощью программного обеспечения LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Анализ результатов
Для определения, коррелирует ли экспрессия гена S100A9 с экспрессией гена S100A8, осуществляли корреляционный анализ. Результаты, представленные на фиг.1, показывают, что существует сильная корреляция между генными экспрессиями этих двух молекул с коэффициентом Spearman >0,90. Генные экспрессии молекул S100A9 и S100A8, следовательно, обладают подобной способностью к распознаванию пациентов, восприимчивых к внутрибольничной инфекции, и к составлению прогноза развития септического синдрома.
Библиографические ссылки
[I] M.M. Levy, M.P. Fink, J.C. Marshall, E. Abraham, D. Angus, D. Cook, J. Cohen, S.M. Opal, J.L. Vincent and G. Ramsay, 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference, Crit. Care Med. 31 (2003), pp. 1250-1256.
[2] Boom R. et al., J. Clin. Microbiol., 1990, n° 28 (3), pр. 495-503.
[4] Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), pр. 453-458.
[5] Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, pр. 173-249.
[6] Bustin S.A. Journal of molecular endocrinology, 2002, 29:23-39.
[7] Giulietti A. Methods, 2001, 25:386-401.
[8] Porter R.R, 1959, Biochem. J., 73:119-126.
[9] Nisonoff A. et al., 1960, Science, 132:1770-1771.
[10] Skerra A., 1993, Curr. Opin. Immunol., 5:256-262.
[II] Huston P. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85:5879-5883.
[12] Fluss R., Faraggi D., Reiser B. (2005), "Estimation of the Youden index and its associated cutoff point". Biometrical Journal, 47:458-72.
Claims (12)
1. Способ составления прогноза развития септического синдрома у пациента, согласно которому:
а) получают биологический образец, выбранный из образца крови, сыворотки, слюны, ткани, циркулирующих клеток пациента, и экстрагируют биологический материал из биологического образца, причем указанный биологический материал представляет собой нуклеиновую кислоту или белок;
b) получают по меньшей мере один специфический реагент, выбранный из праймера амплификации, зонда гибридизации, антитела, в отношении продукта экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени, представляющего собой ген-мишень S100A9;
c) определяют, исходя из биологического материала, экстрагированного из биологического образца, экспрессию гена-мишени S100A9, причем субэкспрессия по отношению к определенной пороговой величине является указанием на хороший прогноз в отношении развития септического синдрома, и сверхэкспрессия по отношению к определенной пороговой величине является указанием на плохой прогноз в отношении развития септического синдрома.
2. Способ по п.1, согласно которому биологическим образцом является образец крови.
3. Способ по п.1, согласно которому специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 включает по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A9.
4. Способ по п.1, согласно которому специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 включает по меньшей мере один специфический зонд гибридизации гена-мишени S100A9.
5. Способ по п.1, согласно которому специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 включает меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A9.
6. Применение по меньшей мере одного специфического реагента, выбранного из праймера амплификации, зонда гибридизации, антитела, в отношении продукта экспрессии гена S100A9 для составления прогноза в отношении развития септического синдрома у пациента.
7. Применение по п.6, согласно которому специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 включает по меньшей мере один специфический зонд гибридизации гена-мишени S100A9.
8. Применение по п.6, согласно которому специфический реагент в отношении гена S100A9 включает по меньшей мере один специфический праймер амплификации гена-мишени S100A9.
9. Применение по п.6, согласно которому специфический реагент в отношении продукта экспрессии гена S100A9 включает по меньшей мере одно антитело, специфичное к молекуле S100A9.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0950305 | 2009-01-19 | ||
FR0950305A FR2941239B1 (fr) | 2009-01-19 | 2009-01-19 | Procede pour determiner la susceptibilite a contracter une infection nosocomiale chez un patient presentant une reponse systemique inflammatoire associee ou non a une infection. |
FR0950306A FR2941240B1 (fr) | 2009-01-19 | 2009-01-19 | Procede pour determiner la sensibilite d'un patient a contracter une infection nosocomiale. |
FR0950306 | 2009-01-19 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011134644/10A Division RU2525707C2 (ru) | 2009-01-19 | 2010-01-18 | Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014122607A RU2014122607A (ru) | 2015-12-10 |
RU2663724C2 true RU2663724C2 (ru) | 2018-08-08 |
Family
ID=42101520
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011134644/10A RU2525707C2 (ru) | 2009-01-19 | 2010-01-18 | Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома |
RU2014122607A RU2663724C2 (ru) | 2009-01-19 | 2014-06-03 | Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011134644/10A RU2525707C2 (ru) | 2009-01-19 | 2010-01-18 | Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11299768B2 (ru) |
EP (1) | EP2379752B1 (ru) |
JP (2) | JP5832903B2 (ru) |
KR (2) | KR20180026561A (ru) |
CN (2) | CN103923980B (ru) |
BR (1) | BRPI1006850B8 (ru) |
ES (1) | ES2556771T3 (ru) |
MX (1) | MX2011007624A (ru) |
RU (2) | RU2525707C2 (ru) |
WO (1) | WO2010082004A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743453C1 (ru) * | 2020-07-03 | 2021-02-18 | Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии И Реабилитологии" (Фнкц Рр) | Способ прогнозирования инфекционных осложнений критических состояний |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2970975B1 (fr) | 2011-01-27 | 2016-11-04 | Biomerieux Sa | Procede et kit pour determiner in vitro le statut immunitaire d'un individu |
FR2988479B1 (fr) * | 2012-03-23 | 2014-12-19 | Hospices Civils Lyon | Procede de determination de la susceptibilite aux infections nosocomiales |
FR3010792B1 (fr) | 2013-09-18 | 2017-03-17 | Biomerieux Sa | Procede d'evaluation du risque de mortalite chez les patients qui presentent une reponse inflammatoire systemique (sirs) ou des syndromes septiques |
FR3101358A1 (fr) * | 2019-09-27 | 2021-04-02 | Bioaster | Procédé pour déterminer le risque de survenue d’une infection associée aux soins chez un patient |
KR102501195B1 (ko) | 2020-07-21 | 2023-02-21 | 주식회사 카카오헬스케어 | 병원의 의사결정 장치, 방법, 컴퓨터 판독 가능한 기록매체 및 컴퓨터 프로그램 |
FR3125300A1 (fr) * | 2021-07-19 | 2023-01-20 | Biomerieux | Utilisation du virus torque teno (ttv) en tant que marqueurs pour determiner le risque de complication chez un patient admis au sein d’un etablissement de sante |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060051803A1 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-09 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
RU2310850C1 (ru) * | 2006-05-02 | 2007-11-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО УГМА Росздрава) | Способ прогнозирования послеоперационного нагноения раны |
US20080070235A1 (en) * | 2003-04-02 | 2008-03-20 | Sirs-Lab Gmbh | Method for Recognizing Acute Generalized Inflammatory Conditions (Sirs), Sepsis, Sepsis-Like Conditions and Systemic Infections |
EP1950310A1 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | Charite-Universitätsmedizin Berlin | Method for risk prediction of a postoperative sepsis in a human |
Family Cites Families (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4672040A (en) | 1983-05-12 | 1987-06-09 | Advanced Magnetics, Inc. | Magnetic particles for use in separations |
US5750338A (en) | 1986-10-23 | 1998-05-12 | Amoco Corporation | Target and background capture methods with amplification for affinity assays |
ZA899593B (en) | 1988-12-16 | 1990-09-26 | Siska Diagnostics Inc | Self-sustained,sequence replication system |
US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
FR2663040B1 (fr) | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
US5846704A (en) | 1992-11-27 | 1998-12-08 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for typing of HCV isolates |
US6218529B1 (en) * | 1995-07-31 | 2001-04-17 | Urocor, Inc. | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer |
FR2749082B1 (fr) | 1996-05-24 | 1998-06-26 | Bio Merieux | Particules superparamagnetiques et monodispersees |
EP0942983B2 (en) * | 1996-10-31 | 2014-09-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines |
WO1999015321A1 (en) | 1997-09-19 | 1999-04-01 | Lignocell Holz-Biotechnologie Gesellschaft Mbh | Process for improving the impregnability of wood by pretreatment with fungi |
FR2773416B1 (fr) | 1998-01-06 | 2000-02-11 | Bio Merieux | Particules magnetiques perfectionnees, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations dans la separation de molecules |
FR2777293B1 (fr) | 1998-04-10 | 2000-05-19 | Bio Merieux | Procede d'electro-separation d'un echantillon biologique et dispositif de mise en oeuvre |
FR2781500B1 (fr) | 1998-07-23 | 2000-09-08 | Bio Merieux | Dispositif perfectionne et procede de lyse de micro-organismes |
AU1548802A (en) * | 2000-06-21 | 2002-01-02 | Digene Corp | Universal collection medium |
WO2002040716A2 (en) * | 2000-11-16 | 2002-05-23 | Cemines, Llc | Profiling tumor specific markers for the diagnosis and treatment of neoplastic disease |
ATE272214T1 (de) | 2001-12-04 | 2004-08-15 | Brahms Ag | Verfahren zur diagnose von sepsis unter bestimmung von s100b |
AU2003212246A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-04 | Johannes Roth | Method for diagnosis of inflammatory diseases using mrp8/mrp14 |
GB0215509D0 (en) * | 2002-07-04 | 2002-08-14 | Novartis Ag | Marker genes |
US20040152107A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-08-05 | C. Anthony Altar | Gene signature of electroshock therapy and methods of use |
WO2004044142A2 (en) * | 2002-11-05 | 2004-05-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Mesenchymal stem cells and methods of use thereof |
WO2004081573A1 (en) | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Novartis Ag | Method to evaluate the likelihood of development of bone metastasis based on the determination of calcium proteins |
DE10324997A1 (de) | 2003-06-03 | 2004-12-23 | Switch Biotech Ag | Mrp8/Mrp14 Inhibitoren und ihre Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden |
US8060315B2 (en) * | 2004-07-27 | 2011-11-15 | Carefusion 303, Inc. | Method for measuring the incidence of hospital acquired infections |
EP1799858A4 (en) * | 2004-09-20 | 2009-03-04 | Univ Pittsburgh | MULTI MODE MULTIPLEX FIRE PROCEDURES |
WO2006063133A2 (en) | 2004-12-06 | 2006-06-15 | The Johns Hopkins University | Biomarker for inflammatory bowel disease |
WO2006122723A1 (en) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Vaecgene Biotech Gmbh | Method for the prevention and/or treatment of autoimmune disease or allogeneic transplant rejections |
AU2006299417A1 (en) * | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Biosite Incorporated | Methods and compositions for diagnosis and/or prognosis in Systemic Inflammatory Response Syndromes |
US7732664B2 (en) * | 2006-03-08 | 2010-06-08 | Universidade De Sao Paulo - Usp. | Genes associated to sucrose content |
BRPI0708970A2 (pt) * | 2006-03-21 | 2011-06-21 | Wyeth Corp | método para o tratamento de um sujeito com uma doença ou transtorno caracterizado por depósito amilóide de a-beta; método de inibição ou redução da acumulação de depósito amilóide de a-beta em um sujeito; método de inibição ou redução da neurodegeneração em um sujeito; e método de inibição ou redução do declìnio cognitivo, ou de melhora da cognição, em um sujeito |
JP5619016B2 (ja) * | 2008-10-28 | 2014-11-05 | アシスタンスピュブリック−オピトド パリAssistance Publique−Hopitaux De Paris | 重症敗血症及び敗血症性ショック中の死亡の危険性が高い患者を迅速に決定するための方法及びキット |
US8283131B2 (en) * | 2008-10-28 | 2012-10-09 | Assistance Publique-Hopitaux De Paris | Methods and kits for the rapid determination of patients at high risk of death during severe sepsis and septic shock |
-
2010
- 2010-01-18 ES ES10707312.4T patent/ES2556771T3/es active Active
- 2010-01-18 BR BRPI1006850A patent/BRPI1006850B8/pt active IP Right Grant
- 2010-01-18 WO PCT/FR2010/050070 patent/WO2010082004A1/fr active Application Filing
- 2010-01-18 EP EP10707312.4A patent/EP2379752B1/fr active Active
- 2010-01-18 MX MX2011007624A patent/MX2011007624A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-01-18 JP JP2011545785A patent/JP5832903B2/ja active Active
- 2010-01-18 US US13/140,678 patent/US11299768B2/en active Active
- 2010-01-18 RU RU2011134644/10A patent/RU2525707C2/ru active
- 2010-01-18 CN CN201410101355.XA patent/CN103923980B/zh active Active
- 2010-01-18 KR KR1020187005733A patent/KR20180026561A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-01-18 CN CN201080004721.XA patent/CN102301008B/zh active Active
- 2010-01-18 KR KR1020117019336A patent/KR101834993B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-06-03 RU RU2014122607A patent/RU2663724C2/ru active
-
2015
- 2015-06-03 JP JP2015113078A patent/JP6254975B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080070235A1 (en) * | 2003-04-02 | 2008-03-20 | Sirs-Lab Gmbh | Method for Recognizing Acute Generalized Inflammatory Conditions (Sirs), Sepsis, Sepsis-Like Conditions and Systemic Infections |
US20060051803A1 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-09 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
RU2310850C1 (ru) * | 2006-05-02 | 2007-11-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО УГМА Росздрава) | Способ прогнозирования послеоперационного нагноения раны |
EP1950310A1 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-30 | Charite-Universitätsmedizin Berlin | Method for risk prediction of a postoperative sepsis in a human |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
EHLERMANN P. et al., Increased proinflammatory endothelial response to S100A8/A9 after preactivation through advanced glycation end products, Cardiovasc. Diabetol., 2006, 5:6. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2743453C1 (ru) * | 2020-07-03 | 2021-02-18 | Федеральное Государственное Бюджетное Научное Учреждение "Федеральный Научно-Клинический Центр Реаниматологии И Реабилитологии" (Фнкц Рр) | Способ прогнозирования инфекционных осложнений критических состояний |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6254975B2 (ja) | 2017-12-27 |
BRPI1006850B1 (pt) | 2021-04-06 |
JP2016005453A (ja) | 2016-01-14 |
WO2010082004A9 (fr) | 2010-09-30 |
KR20180026561A (ko) | 2018-03-12 |
JP2012514993A (ja) | 2012-07-05 |
CN103923980B (zh) | 2017-01-11 |
BRPI1006850A2 (pt) | 2016-08-09 |
KR101834993B1 (ko) | 2018-03-06 |
RU2525707C2 (ru) | 2014-08-20 |
KR20110111491A (ko) | 2011-10-11 |
RU2011134644A (ru) | 2013-02-27 |
CN103923980A (zh) | 2014-07-16 |
US11299768B2 (en) | 2022-04-12 |
WO2010082004A1 (fr) | 2010-07-22 |
MX2011007624A (es) | 2011-10-12 |
ES2556771T3 (es) | 2016-01-20 |
JP5832903B2 (ja) | 2015-12-16 |
BRPI1006850B8 (pt) | 2021-07-27 |
EP2379752B1 (fr) | 2015-09-30 |
US20110250592A1 (en) | 2011-10-13 |
RU2014122607A (ru) | 2015-12-10 |
CN102301008B (zh) | 2015-05-13 |
EP2379752A1 (fr) | 2011-10-26 |
CN102301008A (zh) | 2011-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2663724C2 (ru) | Способы определения восприимчивости пациента к внутрибольничной инфекции и составления прогноза развития септического синдрома | |
EP3543359B1 (en) | Molecular marker, kit and application for use in early diagnosis and prediction of sepsis as complication of acute kidney injury | |
AU2016361646B2 (en) | Method for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) | |
EP3346270B1 (en) | Composition for diagnosing infectious diseases or infectious complications by using tryptophanyl-trna synthetase and method for detecting diagnostic marker | |
WO2019236768A1 (en) | Nasal genes used to identify, characterize, and diagnose viral respiratory infections | |
JP2023157965A (ja) | アトピー性皮膚炎の検出方法 | |
CN109593843A (zh) | 生物标志物klhl35在阿尔茨海默诊治中的应用 | |
US11377690B2 (en) | Method and kit for making an in vitro prognosis of severity for a patient in septic shock | |
CN114582509A (zh) | 一种葡萄膜黑色素瘤预后风险评分模型及其应用 | |
FR2941240A1 (fr) | Procede pour determiner la sensibilite d'un patient a contracter une infection nosocomiale. | |
FR2941239A1 (fr) | Procede pour determiner la susceptibilite a contracter une infection nosocomiale chez un patient presentant une reponse systemique inflammatoire associee ou non a une infection. | |
CN111363808B (zh) | 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用 | |
KR102202120B1 (ko) | 알츠하이머 질환의 진단 또는 치료를 위한 Ube2h의 용도 | |
US20220259661A1 (en) | Kit for assessing the risk of complications in patients with systemic inflammatory response syndrome (sirs) | |
EP4230749A1 (en) | In vitro method for predicting a risk of post-chikungunya chronic inflammatory joint disease | |
KR101821402B1 (ko) | 관절염 진단 방법 | |
KR20230096835A (ko) | 비침습성 치매 진단을 위한 조성물 및 이를 이용한 진단 키트 | |
KR20220020461A (ko) | 코로나바이러스감염증-19의 진단용 조성물 | |
CN114107461A (zh) | 环状rna标志物及其在诊断和预测复发性流产病理妊娠中的应用 | |
CZ309154B6 (cs) | Způsob predikce závažnosti průběhu infekčního onemocnění a biomarker pro použití při provádění tohoto způsobu a monitoringu terapie infekčního onemocnění |