CN102301008A - 用于确定患者发生医院内感染的易感性以及确立败血性综合征进展的预后的方法 - Google Patents

用于确定患者发生医院内感染的易感性以及确立败血性综合征进展的预后的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种确定患者发生医院内感染的易感性的方法以及一种确立患者败血性综合征进展的预后的方法，其中：a.从患者获得生物样品，并从所述生物样品提取生物材料，b.制备对至少一种靶基因的表达产物特异的至少一种试剂，所述靶基因选自S100A9和S100A8靶基因；c.测定靶基因S100A9和S100A8中至少一种的表达，相对于指定阈值的过表达是发生医院内感染的易感性的指征和败血性综合征进展的较差预后的指征。

Description

用于确定患者发生医院内感染的易感性以及确立败血性综合征进展的预后的方法
本发明涉及一种确定患者发生医院内感染的易感性的方法。本发明还涉及一种确立患者的败血性休克进展的预后的方法。
医院内感染构成真正的公共卫生问题。在法国，每年发生医院内感染的患者数目据估计为500,000到800,000。医院内感染的发生与多种因素有关，诸如使用的医疗技术，以及患者发生医院内感染的易感性。因此，患有免疫系统缺陷的患者，营养不良的人，婴儿，老年人，患败血性综合征的人，大面积烧伤患者，以及处于创伤状态的人可能比其他人更容易发生医院内感染。
败血性综合征(对感染的全身应答)代表了重症监护室的一种主要死亡原因。它可以源于细菌，病毒，真菌病或寄生虫感染。可以按照它们的严重性将败血性综合征分类。下面按照增加的严重性区分：SIRS(全身性炎性应答综合征)，败血症，严重败血症和败血性休克。因此，在2001年，专家组提出了确定这4种临床综合征的标准[1]：
●SIRS是多种感染性或非感染性原因引发的炎性全身性应答。在非感染性原因引发的SIRS状态中，我们可以提及创伤状态，烧伤，胰腺炎，和急性呼吸综合征。炎性全身性应答显示为下列症状的至少两种：a)体温高于38℃或低于36℃；b)心率高于90次搏动每分钟；c)呼吸频率高于20次呼吸每分钟；d)白细胞计数高于12000/mm3或低于4000/mm3，
●败血症是与感染有关的炎性全身性应答综合征，
●严重败血症是与低动脉压和/或灌注不足和/或至少一种器官的功能异常有关的败血症，
●败血性休克是与长期低血压有关的严重败血症，可由以下确定：
●被鉴定的感染部位的存在，
●尽管足够的灌注并用血管升压药治疗，仍长期低血压。
通常，败血症、严重败血症和败血性休克的症状是非常类似的，这3种情况的差异主要在于所有生活机能紊乱的水平。在败血性休克期间，我们主要观察到血压降低，心动过速，呼吸急促，皮肤的纹理化，体温过低或体温过高，颤抖。这些症状还伴有“靶”器官的功能异常，以及远离感染病灶的器官(肾，肺，中枢神经系统，消化系统和凝血系统)的功能恶化，反映在少尿(＜0.5ml/kg/h)，肾功能不全，低氧血，血小板减少，激动和精神混乱。
败血性综合征患者对于医院内感染(即与待在卫生机构有关的感染)多多少少也是敏感的。这种敏感性对于这些患者的存活和良好恢复具有相当大的影响。
败血性综合征从败血症阶段进展到严重败血症阶段，然后到败血性休克阶段不是系统性的，因为约64％的败血症患者发展成为严重败血症，23％的严重败血症患者进展到败血性休克。在败血性休克这个最终阶段之前，必须对患者进行治疗，以便终止并逆转病理生理过程。因此，必须恢复令人满意的血液动力学状态，并且必须提供有效通气量。还必须有同时的休克对症疗法和尽可能基于细菌学数据的抗生素治疗。
看起来尽管可以通过标准控制(诸如在获得表明感染源的细菌学分析结果之前进行广谱抗生素治疗)使一些败血性综合征(尤其是败血性休克)患者恢复，但是其他患者(患有更加严重的败血性综合征)需要实施强化疗法，诸如活化的蛋白C。除了非常高的花费外，这种疗法将患者置于严重不良作用(凝血病症等等)的风险中。因此有效靶向很可能受益于这类治疗的患者是非常重要的。
因此，了解炎性全身性应答的病因学和确定炎性全身性应答患者对发生医院内感染的易感性对于建议适于患者的治疗来说是非常重要的。对于患者来说非常重要的另一个因素是能够尽早确立败血性休克进展的预后。
迄今为止，还没有确定患者患上医院内感染的易感性的检测，尤其是针对炎性全身性应答的患者，而无论所述炎性全身性应答是否与感染有关。本发明人出乎意料地证实，基因S100A9和/或S100A8的表达分析尤其适于确定所述易感性，此外它适合于确立败血性休克进展的预后。
在下一步之前，给出下列定义用于更好的理解本发明。
败血性综合征表示对感染的全身应答。这种败血性综合征可以处于SIRS，败血症，严重败血症或败血性休克的阶段。优选地，败血性综合征是败血性休克。
医院内感染表示在患者在卫生机构入院时不存在但在入院后48小时在所述机构发生的任何感染。
术语靶基因表示S100A9基因和S100A8基因，尤其是参考GenBank中登录号为NM_002965.3的S100A9基因和参考GenBank中登录号为NM_002964.3的S100A8基因。
S100A9基因和S100A8基因的表达产物表示信使RNA或mRNA的片段，cDNA或cDNA的片段，蛋白或蛋白片段。
生物样品表示获自患者的任何材料，其可能含有能够检测基因表达的生物材料。它尤其可以是患者的血液，血清，唾液或组织或循环细胞的样品。这类生物样品可以通过本领域技术人员已知的任何取样方式获得，诸如尤其是血液样品。
生物材料表示能够检测基因表达的任何材料，诸如尤其是核酸或蛋白，或其编码序列。核酸可以尤其是RNA(核糖核酸)诸如mRNA(信使RNA)。根据本发明优选的实施方案，生物材料是核酸，甚至更优选是mRNA。
从生物样品提取生物材料可以通过本领域技术人员公知的提取核酸或蛋白的所有方案来实施。
作为指导，核酸可以尤其是通过以下步骤提取：
●生物样品中存在的细胞的裂解阶段，以便释放微生物的蛋白和/或脂质包膜(作为干扰后续反应的细胞碎片)中包含的核酸。作为实例，有可能使用下列专利申请描述的裂解方法：
○WO-A-00/05338，关于混合型磁性和机械裂解，
○WO-A-99/53304，关于电裂解，和
○WO-A-99/15321，关于机械裂解。
本领域技术人员可以使用公知的其他裂解方法，诸如热或渗透压休克或通过离液剂诸如胍盐的化学裂解(US-A-5,234,809)。
●纯化阶段，允许将核酸与裂解阶段盐析的其它细胞组分分离。这个阶段通常能够浓缩核酸。举例来说，可以使用任选包被寡核苷酸(通过吸附或共价)的磁性颗粒(参考专利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，从而通过洗涤阶段纯化与这些磁性颗粒附着的核酸。如果需要后续扩增所述核酸，这个阶段的核酸纯化是尤其有益的。这些磁性颗粒的尤其感兴趣的实施方案描述于专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500。核酸纯化方法另一个感兴趣的实例是使用柱形式或惰性颗粒[2]或磁性颗粒形式(Merck：MagPrepTM Silica，Promega：MagneSilTM Paramagnetic颗粒)的二氧化硅。其他广泛使用的方法基于柱或顺磁微粒形式(Whatman：DEAE-Magarose)的离子交换树脂(Levison PR et al.，J.Chromatography，1998，p.337-344)。高度相关但非本发明专有的另一个方法是吸附到金属氧化支持物(来自公司Xtrana：Xtra-BindTM基质)。这个提取阶段可以在自动装置中进行。easyMAG自动装置是尤其合适的。
特异性试剂表示与生物材料反应以直接或间接证实靶基因表达(其可以通过分析得自这些基因的mRNA或通过分析该基因编码的蛋白来测定)的试剂。
作为指导，当我们希望通过分析该基因编码的蛋白来测定靶基因的表达时，这种特异性试剂包括对该靶基因编码的蛋白特异的至少一种抗体。
作为指导，当我们希望通过分析从该基因开始转录的mRNA来测定靶基因的表达时，这种特异性试剂包括对该mRNA的互补DNA特异的至少一种扩增引物(它然后被称作对靶基因特异的扩增引物)。可以根据本领域技术人员公知的方案获得与mRNA互补的DNA。作为指导，从生物样品提取总RNA(包括核糖体RNA，转移RNA，mRNA)。然后通过逆转录酶进行逆转录反应，其能够从RNA片段获得DNA互补片段(cDNA)。这个阶段的实施是本领域技术人员公知的。当我们更希望只获得与信使RNA互补的DNA时，这种酶促阶段是在只包括胸腺嘧啶碱基(polyT)的核苷酸片段(其通过互补性与各种mRNA的polyA序列杂交以形成polyT-polyA复合物，其然后作为利用逆转录酶进行的逆转录反应的起点)的条件下进行。然后获得各种DNA，它们与最初存在于生物样品中的各种信使RNA互补。下文中，cDNA表示与信使RNA互补的DNA。
扩增引物表示一种核苷酸片段，具有5到100个核苷酸单位，优选15到25个核苷酸单位，并且在启始酶促聚合的确定条件下(例如在酶促扩增反应中)具有杂交特异性。
酶扩增反应表示通过至少一种酶的作用借助特异性扩增引物产生靶核苷酸片段的多个拷贝的过程。这些扩增反应是本领域技术人员公知的，我们特别提及的是下列技术：PCR(聚合酶链式反应)，LCR(连接酶链式反应)，RCR(修复链式反应)，利用专利申请WO-A-90/06995的3SR(自动维持序列扩增)，NASBA(基于核酸序列的扩增)，和利用专利US-A-5,399,491的TMA(转录介导的扩增)。
术语扩增子则表示通过酶促扩增技术产生的多核苷酸。优选地，当酶促扩增是PCR时，特异性试剂包括至少2个特异性扩增引物，以便扩增与源于靶基因的mRNA互补的DNA特定区域。当酶促扩增是在逆转录反应后进行的PCR时，其被称作RT-PCR。
杂交探针表示包括5到100个核苷酸单位(尤其是6到35个核苷酸单位)的核苷酸片段，并在指定条件下具有杂交的特异性以形成与靶核苷酸片段的杂交复合物。在本发明中，靶核苷酸片段可以是信使RNA包括的核苷酸序列，或通过所述信使RNA的逆转录获得的互补DNA包括的核苷酸序列。
杂交表示在合适条件下，两个核苷酸片段(诸如例如具有足够互补序列的杂交探针和靶核苷酸片段)能够形成具有稳定和特异性氢键的双链的过程。与多核苷酸“能够杂交”的核苷酸片段是在杂交条件下(每种情况下可以采用已知的方式确定)可以与所述多核苷酸杂交的片段。杂交条件由严格性(即操作条件的严格性)确定。当严格性增加时，杂交的特异性也随之增加。严格性被定义为探针/靶双链体的碱基组成以及两个核酸之间的错配程度的函数。严格性还可以是反应参数(诸如杂交液中存在的离子物质的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度)的函数。进行杂交反应的条件的严格性在很大程度上取决于使用的杂交探针。所有这些数据都是公知的，本领域技术人员可以确定合适的条件。通常，取决于使用的杂交探针的长度，杂交反应的温度为约20到70℃，尤其是在浓度约0.5到1M的盐溶液中为35到65℃。然后进行杂交反应的检测阶段。
检测表示通过物理方法的直接检测，或借助于标记物的检测方法。存在许多检测核酸的方法[4，5]。
标记物表示能够产生信号的示踪物。这些示踪物的非限制性列表包括例如通过比色法、荧光或者发光产生可检测信号的酶，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；生色团诸如荧光、发光或者染色化合物；通过电子显微镜检查或者从它们的电性质诸如电导率，通过电流分析法或伏安法，或通过阻抗测量可检测的电子密度基团；通过光学法(诸如衍射，表面等离子体共振，接触角变化)或通过物理方法(诸如原子力光谱法，隧道效应等)可检测的那些基团；放射性分子诸如32P，35S或125I。因此，可以在酶促扩增阶段期间标记多核苷酸，例如使用三磷酸核苷酸标记用于扩增反应。标记的核苷酸将是产生DNA的扩增系统(诸如PCR)中的脱氧核糖核苷酸，或产生RNA的扩增技术(诸如TMA或NASBA技术)中的核糖核苷酸。还可以在扩增阶段后标记多核苷酸，例如按照文献WO-A-91/19812描述的夹心杂交技术通过杂交标记的探针进行。
就本发明来说，杂交探针可以是所谓的捕获探针。在这种情况下，靶核苷酸片段可以事先通过标记物进行标记。所谓的捕获探针可以通过任何合适的方法被固定在(immobilisée)或可固定在(immobilisable)固相支持物上，即直接或间接地，例如通过共价结合或者吸附。然后在所述检测探针和标记的靶核苷酸片段之间进行杂交反应。
杂交探针还可以是所谓的检测探针。在这种情况下，杂交探针可以通过标记物进行标记。然后在所述捕获探针和标记的靶核苷酸片段之间进行杂交反应。
无论使用所谓的捕获探针还是所谓的检测探针，可以在固相支持物(包括其上固定核酸的所有材料)上进行杂交反应。合成材料或天然材料，任选化学修饰的，可以用作固相支持物，尤其是多糖诸如基于纤维素的材料，例如纸张，纤维素衍生物诸如醋酸纤维素和硝酸纤维素或葡聚糖，聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯类型的单体的，天然纤维诸如棉花，和合成纤维诸如尼龙；矿物质材料诸如二氧化硅，石英，玻璃，陶瓷；胶乳；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等。固相支持物可以是以下形式：微量滴定板，如申请WO-A-94/12670描述的膜，颗粒或生物芯片。
在本发明中，可以通过给定时间转录的mRNA的表达来分析S100A9 基因和S100A8基因的表达测定。在这种情况下，生物材料是核酸，并且特异性试剂可以无区别的是如前所述的扩增引物或杂交探针。
靶基因的表达可以如下确定：
1)从生物样品提取总RNA后，如前所述进行逆转录阶段，以便获得与生物样品中最初存在的各种信使RNA互补的各种DNA(或cDNA)
2)特异性扩增cDNA。在这种情况下，使用的特异性试剂包括至少一个如前所述的对靶基因特异的扩增引物。尤其可以通过PCR类型的扩增反应或通过任何其他合适的扩增技术来进行这个阶段。
3)通过定量cDNA来测定靶基因的表达。尤其可以通过使用进行到饱和的扩增反应获得的量化范围来定量cDNA。考虑到不同阶段(逆转录，PCR等)观察到的酶促效力的变化，可以通过同时测定所谓的持家基因(其表达在不同组的患者中是相似的)的表达来将不同组患者的靶基因表达标准化。通过测定靶基因表达与持家基因表达的比值，可以校正不同实验之间的任何变异性。本领域技术人员尤其可以参考下列出版物[6，7]。
靶基因的表达还可以如下确定：
1)从生物样品提取总RNA后，如前所述进行逆转录阶段，以便获得与生物样品中最初存在的各种信使RNA互补的各种DNA(或cDNA)
2)将cDNA固定到膜上
3)通过将cDNA与先前标记的对靶基因特异的杂交探针进行杂交来测定靶基因的表达。这些杂交技术是本领域技术人员公知的，我们尤其提及的是Northern印迹。尤其当基因是弱表达时，在与靶基因的信使RNA互补的DNA的特异性扩增阶段后进行这种杂交反应。
靶基因的表达还可以通过靶基因编码的蛋白的表达来分析。在这种情况下，生物材料是蛋白，可以使用需要或无需配体的数种检测技术。质谱可以用作无需配体的检测技术。特异性试剂可以是用于需要配体的检测系统中对靶基因编码的蛋白特异的抗体。
可以通过本领域技术人员已知的常规方法，从原核生物体(诸如细菌)，或真核生物体(诸如酵母，哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞)，或通过胞外生成系统，获得重组抗体(对靶基因翻译的蛋白特异)。
单克隆抗体可以根据本领域技术人员已知的常规技术制备，诸如杂交瘤技术，其一般原理在下文回顾。
首先，用感兴趣的靶抗原免疫动物，通常是小鼠(或体外免疫范围内培养的细胞)，其B淋巴细胞然后能够产生针对所述抗原的抗体。然后将这些抗体生成淋巴细胞与“永生化的”骨髓瘤细胞(实施例中是鼠的)融合以产生杂交瘤。从获得的细胞的异质混合物，然后挑选能够产生特定抗体并且能无限增殖的细胞。每个杂交瘤以克隆形式增殖，均引起单克隆抗体的产生，例如可以通过ELISA，一维或二维免疫转移，免疫荧光或生物传感器来检测对感兴趣抗原的识别特性。然后纯化(尤其是通过亲和层析)如此挑选的单克隆抗体。
例如可以通过蛋白水解获得抗体片段。因此，它们可以通过酶促消化获得，产生Fab型(用木瓜蛋白酶处理[8])或F(ab)′2型(用胃蛋白酶处理[9])的片段。它们还可以通过重组方法制备[10]。另一种适于本发明目的的抗体片段包括Fv片段，其是由Fab片段的可变轻链结构域(VL)和可变重链结构域(VH)的非共价结合(因此是两条多肽链的结合)组成的二聚体。为了提高由于两条多肽链的解离造成的Fv片段的稳定性，可以通过在结构域VL和结构域VH之间插入合适的肽键进行遗传工程化来修饰这种Fv片段[11]。然后这被称作scFv(“单链片段可变”)，因为其由单一多肽链组成。优选由15到25个氨基酸组成的肽键的使用能够将结构域的C端连接到其他结构域的N端，从而构成具有类似于抗体完整形式的结合特性的单体分子。VL和VH结构域的两种排列方向都是合适的(VL-连接-VH和VH-连接-VL)，因为它们具有相同的功能特性。当然，本领域技术人员已知的并且具有上文所述的免疫特征的任何片段都适合于本发明的目的。
当生物材料是由基因表达产生的蛋白时，后者的表达可以通过检测和/或定量所述蛋白来测定，通过Western印迹或ELISA，或本领域技术人员已知的任何其他方法，诸如基于生物材料的化学发光法进行。
ELISA技术(″酶联免疫吸附测定″)是固相支持物上的免疫酶促测定法。这种检测属于EIA(″酶免疫测定″)的更普通范围，其中测定与酶催化反应偶联。该技术使用一种或两种抗体。将用于检测免疫复合物(抗原/抗体)形成的抗体与酶偶联，可以通过生色或荧光底物产生信号发射。
Western印迹是用于检测样品中特定蛋白的试验，通过对该蛋白特异的抗体进行，包括下文描述的下列阶段。
第一个阶段是凝胶电泳，其能够根据它们的大小分离样品中的蛋白。
然后通过压力或应用电流将凝胶中的蛋白转移到膜(硝酸纤维素，PVDF等)上，随后蛋白通过疏水和离子相互作用固定到膜上。
在饱和掉非特异性相互作用的位点后，将对待测蛋白特异的第一抗体(一抗)与膜温育。
然后清洗膜以去除未结合的一抗，并与所谓的二抗(其将结合一抗)温育。这种二抗通常结合酶，所述酶允许能够目测鉴定膜上待测的蛋白。添加用酶标记的底物产生膜上可见的颜色反应。
通过分析S100A9基因和/或S100A8基因的表达，能够确定患者发生医院内感染的易感性，尤其是具有炎性全身性应答的患者，并确立败血性综合征进展的预后。可以例如通过分析患者(其发生医院内感染的易感性是未知的)中至少一种靶基因的表达并与敏感患者的靶基因平均表达的已知值和不敏感患者的靶基因平均表达的已知值进行比较，确定患者是否有可能发生医院内感染。采用同样的方式，可以例如通过分析至少一种靶基因的表达并与靶基因已知表达的平均值进行比较，确立败血性综合征进展的预后，包括存活或死亡的预后。
因此本发明涉及一种确定患者发生医院内感染的易感性的方法，其中：
a)从患者获得生物样品并从所述生物样品提取生物材料
b)制备至少一个靶基因的表达产物的至少一种特异性试剂，所述靶基因选自S100A9和S100A8靶基因
c)测定靶基因S100A9和S100A8中至少一个的表达，相对于指定阈值的过表达是发生医院内感染的易感性的指征。
在阶段c)，可以确定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表达，S100A9靶基因相对于指定阈值的过表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的过表达是发生医院内感染的易感性的指征。
本领域技术人员已知确定阈值的各种可能方法。举例来说，我们可以提及Youden′s指数的确定。
Youden′s指数对应于非错误总体程度的测量。其在0(针对不允许鉴别两群体的检验)和1(针对允许准确鉴别两个群体的检验)之间变化。Youden′s指数的最大值对应于假结果(假阴性或假阳性)数目最低的阈值。Youden′s指数越接近1，诊断性能越好[12]。
具体来说，生物样品取自具有炎性全身性应答的患者，而无论所述炎性全身性应答是否与感染有关。生物样品可以是血液样品，生物材料提取物可以是例如核酸。优选地，从生物样品提取总RNA，并通过分析mRNA的表达测定靶基因的表达。
在本发明方法优选的实施方案中，特异性试剂包括对S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表达产物特异的至少一种扩增引物或至少一种杂交探针，或对S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表达产物特异的至少一种抗体。
所述方法尤其适于确定败血性综合征患者发生医院内感染的易感性，即所述患者具有对感染(诸如SIRS，败血症，严重败血症和败血性休克)的炎性全身性应答。
因此使用对S100A9基因和/或S100A8基因的表达产物特异的试剂来确定患者发生医院内感染的易感性，尤其是确定具有炎性全身性应答的患者的易感性，而无论所述炎性全身性应答是否与感染有关。所述试剂可以包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针，至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针，至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物，至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物，至少一种对分子S100A9特异的抗体或至少一种对分子S100A8特异的抗体。
S100A9和/或S100A8基因的表达分析还能够确立败血性综合征进展的预后(包括存活和死亡的预后)。
因此，本发明提供一种确立患者的败血性综合征进展的预后的方法，其中：
a)从患者获得生物样品并从所述生物样品提取生物材料
b)制备至少一种靶基因的表达产物的至少一种特异性试剂，所述靶基因选自S100A9和S100A8靶基因
c)测定靶基因S100A9和S100A8中至少一种的表达，相对于指定阈值的低表达是败血性综合征进展的良好预后的指征，而相对于指定阈值的过表达是败血性综合征进展的较差预后的指征。
在阶段c)，可以确定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表达，S100A9靶基因相对于指定阈值的低表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的低表达是败血性综合征进展的良好预后的指征；
S100A9靶基因相对于指定阈值的过表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的过表达是败血性综合征进展的较差预后的指征。
确定阈值在本领域技术人员的能力范围内。举例来说，我们可以提及Youden′s指数的确定。Youden′s指数对应于非错误总体程度的测量。其在0(针对不允许鉴别两群体的检验)和1(针对允许准确鉴别两个群体的检验)之间变化。Youden′s指数的最大值对应于假结果(假阴性或假阳性)数目最低的阈值。Youden′s指数越接近1，诊断性能越好[12]。
生物样品可以是血液样品，生物材料提取物可以是例如核酸。优选地，从生物样品提取总RNA并通过分析mRNA的表达测定靶基因的表达。
在本发明方法优选的实施方案中，特异性试剂包括对S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表达产物特异的至少一种扩增引物或至少一种杂交探针，或对S100A9靶基因和/或S100A8靶基因的表达产物特异的至少一种抗体。
因此使用对S100A9基因和/或S100A8基因的表达产物特异的试剂来确立患者的败血性综合征进展的预后(包括存活或死亡的预后)。所述试剂可以包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针，至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针，至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物，至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物，至少一种对分子S100A9特异的抗体或至少一种对分子S100A8特异的抗体。
附图
图1显示S100A8和S100A9基因表达的相关性(n＝86)。其显示分子S100A9和S100A8的基因表达之间存在强相关性，Spearman系数＞0.90(r＝0.9134)。在鉴别有可能发生医院内感染的患者和确立败血性综合征进展的预后方面，分子S100A9和S100A8的基因表达具有类似的能力。
图2显示在败血性休克发病后D7和D10之间获得样品中，存活和未存活患者之间S100A8基因表达的显著差异(p＝0.0461)。图例：HV＝健康志愿者；S＝存活患者；NS＝未存活患者。
实施例
实施例1-S100A9基因表达的研究
检测样品
使用一组44例健康志愿者(S)和一组148例败血性综合征患者(SEP)(在败血性休克后D1，D2或D3取样(H0是血管升压治疗注射))用于比较外周血中S100A9基因的表达。鉴定一组44例健康患者(S)和一组148例患败血性休克的患者(SEP)。
RNA的提取和cDNA的合成
对于每位患者，生物样品是血液样品，在患者SEP患有的败血性综合征发病后前10天期间定期获得。还通过相同的方案在健康患者(S)中进行取样。这些样品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA管(PreAnalytiX，FrankinLakes，USA)。
在采血阶段后为了获得细胞的完全裂解，将管在室温下静置4小时，然后在-20℃保存直至提取生物材料。更确切地说，在这个方案中，按照制造商的推荐，通过PAXgene Blood RNA
Figure BPA00001406166100121
试剂盒(PreAnalytiX)提取总RNA。简单来说，将管离心(10分钟，3000g)以获得核酸的沉淀。清洗这种沉淀，然后放入含蛋白酶K的缓冲液中以消化蛋白(55℃ 10分钟)。进行重复离心(5分钟，19000g)以去除细胞碎片，添加乙醇以优化核酸固定的条件。将总RNA特异性固定到PAXgene RNA离心柱，在后者洗脱前，利用不含RNAse的DNAse setTM(Qiagen Ltd，Crawley，UK)进行污染DNA的消化。
对于每次提取，使用RNA 6000 Nano ChipTM试剂盒(Agilent technologies)通过毛细管电泳验证总RNA的质量。使用的装置是bioanalyzer 2100。在20μl终体积中进行逆转录(RT)反应。将总RNA(0.5μg)与1μl 50μM的polyT和1μL退火缓冲液混合，然后在65℃温育5分钟。在冰上冷却后，将溶液与10μl 2×First Strand Reaction Mix和2μL SuperScript III/RNaseTM outenzyme Mix RT(15U/μl)混合，所有这些产品都获自SuperScript First StrandSynthesis Super Mix TM RT-PCR系统(Invitrogen)。逆转录在50℃进行50分钟，然后通过在85℃温育5分钟终止。最后，将每份cDNA溶液用DEPC水稀释到1/10。
用于定量的标准范围的制备
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A9靶基因(GenBank No.NM_002965.3)的153-179区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物：5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’(SEQ ID NO：2)
通过实时PCR分析mRNA的表达
使用LightCyclerTM(Roche)通过实时定量PCR来定量如上所述重转录为cDNA的S100A9靶基因的mRNA。使用Fast-StartTM DNA Master SYBRGreen I实时PCR试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行PCR反应。在含3.6μl水，2.4μl MgCl2，2μl SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBRgreen+Taq DNA聚合酶)和1μl每种引物(10μM)和10μl cDNA溶液的20μl终体积中进行每个PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95℃ 10分钟的变性阶段后，利用40个循环的″touch-down″PCR方案(95℃ 10秒，68-58℃杂交10秒，然后72℃延伸16秒)进行扩增。每个循环结束后，测量SYBR Green发射的荧光。
为了证明扩增的特异性，将PCR产物系统接受解链曲线分析(LightCyclerTM-Roche)。为此，以0.1℃/秒的升高速率，在从58℃升高到98℃的温度下处理PCR产物。对于每个PCR产物，曲线分析期间获得单峰，表征为特定解链温度。
定量持家基因CPB需要的引物组合由Search-LC(Heidelberg，Germany；reference 488116)提供。
利用LightCycler Relative Quantification SoftwareTM(Roche MolecularBiochemicals)通过相对定量技术分析靶mRNA的量相对于持家基因亲环蛋白B的mRNA量。使用LightCyclerTM软件(Roche)的″二阶导数最大法(Second Derivative Maximum Method)″自动确定每个样品的″交点(CrossingPoint)″(Cp)。Cp值被定义为荧光显著不同于背景噪声的循环数目。
利用每个标准品一式四份进行1/10的5个系列稀释，以便产生表示Cp作为拷贝数对数函数的校准曲线。优化标准品稀释以便校准曲线覆盖预期靶基因和持家基因的表达水平。利用LightCycler Relative QuantificationSoftware(Roche Molecular Biochemicals)产生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相对标准曲线，并用于定量。
获得的结果
获得的结果显示于下表1。
表1
  患者   N   中位数   下四分位数   上四分位数
  S   44   1.46   1.065   1.87
  SEP   148   16.62   11.87   25.835
健康受试者与败血性休克患者之间的Mann-Whitney检验的p值＜0.0001。
在败血性休克的前3天，标记物S100A9的表达相对于健康供体显著过表达。
实施例2-S100A8基因表达的研究
检测样品
使用一组32例健康志愿者(S)和一组86例败血性综合征患者(SEP)(在败血性休克后D7和D10取样(H0是血管升压治疗注射))用于比较外周血中S100A8基因的表达。鉴定一组32例健康患者(S)和一组86例患败血性休克的患者(SEP)。
RNA的提取和cDNA的合成
对于每位患者，生物样品是血液样品，在SEP患者的败血性综合征发病后前10天期间定期获得。还根据相同的方案在健康患者(S)中进行取样。这些样品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA管(PreAnalytiX，Frankin Lakes，USA)。
在收集血液样品阶段后为了获得细胞的完全裂解，将管在室温下静置4小时，然后在-20℃保存直至提取生物材料。更确切地说，在这个方案中，按照制造商的推荐，通过PAXgene Blood RNA
Figure BPA00001406166100141
试剂盒(PreAnalytiX)提取总RNA。简单来说，将管离心(10分钟，3000g)以获得核酸沉淀。清洗这种沉淀，然后放入含蛋白酶K的缓冲液中以消化蛋白(55℃ 10分钟)。进行重复离心(5分钟，19000g)以去除细胞碎片，添加乙醇以优化核酸固定的条件。将总RNA特异性固定到PAXgene RNA离心柱，在后者洗脱前，用不含RNAse的DNAse setTM(Qiagen Ltd，Crawley，UK)进行污染DNA的消化。
对于每次提取，使用RNA 6000Nano ChipTM试剂盒(Agilent technologies)通过毛细管电泳验证总RNA的质量。使用的装置是bioanalyzer 2100。在20μl终体积中进行逆转录(RT)反应。将总RNA(0.5μg)与1μl 50μM的polyT和1μL退火缓冲液混合，然后在65℃温育5分钟。在冰上冷却后，将溶液与10μl 2×First Strand Reaction Mix和2μL SuperScript III/RNaseTM outenzyme Mix RT(15U/μl)混合，所有这些产品都获自SuperScript First StrandSynthesis Super Mix TM RT-PCR系统(Invitrogen)。逆转录在50℃进行50分钟，然后通过在85℃温育5分钟终止。最后，将每份cDNA溶液用DEPC水稀释到1/10。
用于定量的标准范围的制备
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A8靶基因(GenBank No.NM_002964.3)的129-280区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物：5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’(SEQ ID NO：4)
通过实时PCR分析mRNA的表达
使用LightCyclerTM(Roche)通过实时定量PCR来定量如上所述重转录为cDNA的S100A8靶基因的mRNA。使用Fast-StartTM DNA Master SYBRGreen I实时PCR试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行PCR反应。在含3.6μl水，2.4μl MgCl2，2μl SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBRgreen+Taq DNA聚合酶)和1μl每种引物(10μM)和10μl cDNA溶液的20μl终体积中进行每个PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95℃10分钟的变性阶段后，利用40个循环的″touch-down″PCR方案(95℃ 10秒，68-58℃杂交10秒，然后72℃延伸16秒)进行扩增。每个循环结束后，测量SYBR Green发射的荧光。
为了证明扩增的特异性，将PCR产物系统进行解链曲线分析(LightCyclerTM-Roche)。为此，以0.1℃/秒的升高速率，在从58℃升高到98℃的温度下处理PCR产物。对于每个PCR产物，曲线分析期间获得单峰，表征为特异解链温度。
定量持家基因CPB需要的引物组合由Search-LC(Heidelberg，Germany；reference 488116)提供。
利用LightCycler Relative Quantification SoftwareTM(Roche MolecularBiochemicals)通过相对定量技术分析靶mRNA的量相对于持家基因亲环蛋白B的mRNA量。使用LightCyclerTM软件(Roche)的″二阶导数最大法″自动确定每个样品的″交点″(Cp)。Cp值被定义为荧光显著不同于背景噪声的循环数目。
利用每个标准品一式四份进行1/10的5个系列稀释，以产生表示Cp作为拷贝数对数函数的校准曲线。优化标准品稀释以便校准曲线覆盖预期靶基因和持家基因的表达水平。利用LightCycler Relative QuantificationSoftware(Roche Molecular Biochemicals)产生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相对标准曲线并用于定量。
获得的结果
获得的结果显示于下面的表2。
表2
  患者   N   中位数   下四分位数   上四分位数
  S   32   12.9   8.5   20.4
  SEP   86   183.5   96.6   438.5
健康受试者与败血性休克患者之间的Mann-Whitney检验的p值＜0.0001。
在败血性休克后的第D7到D10天，标记物S100A8的表达相对于健康供体显著过表达。
实施例3-败血性休克患者中S100A8的存活预后值的研究
检测样品
对86例患者的群组进行研究，所述患者已经患有败血性休克，并进入Lyon-Sud医疗中心的Surgical或Medical重症监护室。在败血性休克后D7，D8，D9或D10从这些患者收集样品(H0是血管升压治疗的开始)。
RNA的提取和cDNA的合成
对于每位患者，生物样品是血液样品，从败血性综合征发病后前10天每天取样(患者SEP)。这些样品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA管(PreAnalytiX，Frankin Lakes，USA)。
在收集血液样品阶段后为了获得细胞的完全裂解，将管在室温下静置4小时，然后在-20℃保存直至提取生物材料。更确切地说，在这个方案中，按照制造商的推荐，通过PAXgene Blood RNA
Figure BPA00001406166100161
试剂盒(PreAnalytiX)提取总RNA。简单来说，将管离心(在3000g 10分钟)以获得核酸的沉淀。清洗这种沉淀，然后放入含蛋白酶K的缓冲液中以消化蛋白(55℃ 10分钟)。进行重复离心(在19000g 5分钟)以去除细胞碎片，添加乙醇以优化核酸固定的条件。将总RNA特异性固定到PAXgene RNA离心柱TM，在后者洗脱前，用不含RNAse的DNAse setTM(Qiagen Ltd，Crawley，UK)进行污染DNA的消化。
对于每次提取，使用RNA 6000 Nano ChipTM试剂盒(Agilent technologies)通过毛细管电泳验证总RNA的质量。使用的装置是bioanalyzer 2100TM。在20μl的终体积中进行逆转录(RT)反应。将总RNA(0.5μg)与1μl 50μM的oligo(dT)和1μL退火缓冲液混合，然后在65℃温育5分钟。在冰上冷却后，将溶液与10μl 2×First Strand Reaction Mix和2μL SuperScript III/RNase outenzyme Mix RT(15U/μl)混合，所有这些产品都获自SuperScript First StrandSynthesis Super MixTM RT-PCR系统(Invitrogen)。逆转录在50℃进行50分钟，然后通过在85℃温育5分钟终止。最后，将每份cDNA溶液用DEPC水稀释到1/10。
用于定量的标准范围的制备
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A8靶基因(GenBank No.NM_002964.3)的129-280区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物：5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’(SEQ ID NO：4)
通过实时定量PCR分析mRNA的表达
使用LightCyclerTM 2.0(Roche)通过实时定量PCR来定量如上所述重转录为cDNA的S100A8靶基因的mRNA。使用Fast-StartTM DNA Master SYBRGreen I实时PCR试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行PCR反应。在含3.6μl水，2.4μl MgCl2，2μl SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBRgreen+Taq DNA聚合酶)和1μl每种引物(10μM)和10μl cDNA溶液的20μl终体积中进行每个PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95℃10分钟的变性阶段后，利用40个循环的″touch-down″PCR方案(95℃10秒，68-58℃(0.5℃/循环)杂交10秒，然后72℃延伸16秒)进行扩增。每个循环结束后，测量SYBR Green发射的荧光。
为了证明扩增的特异性，将PCR产物系统进行解链曲线分析(LightCyclerTM 2.0-Roche)。为此，以0.1℃/秒的升高速率，在从58℃升高到98℃的温度下处理PCR产物。对于每个PCR产物，曲线分析期间获得单峰，表征为特异解链温度。
定量持家基因CPB需要的引物组合由Search-LC(Heidelberg，Germany；reference 488116)提供。
利用LightCycler Relative Quantification SoftwareTM(Roche MolecularBiochemicals)通过相对定量技术分析靶mRNA的量相对于持家基因亲环蛋白B的mRNA量。使用LightCyclerTM软件(Roche)的″二阶导数最大法″自动确定每个样品的″交点″(Cp)。Cp值被定义为荧光显著不同于背景噪声的循环数目。
利用每个标准品一式四份进行1/10的5个系列稀释，以便产生表示Cp作为拷贝数对数函数的校准曲线。优化标准品稀释以便校准曲线覆盖预期靶基因和持家基因的表达水平。利用LightCycler Relative QuantificationSoftware(Roche Molecular Biochemicals)产生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相对标准曲线并用于定量。
分析的结果
为了确定S100A8基因的表达是否与患者存活有关，进行MannWhitney检验。图2显示在败血性休克发病后D7和D10之间获得的样品中，存活和未存活患者之间S100A8基因表达的显著差异(p＝0.0461)。
实施例4-S100A9基因的表达用于确定患者发生医院内感染的易感性的研究
检测样品
对93例患者的群组进行研究，所述患者已经患有败血性休克，并进入Lyon-Sud医疗中心的Surgical或Medical重症监护室。在败血性休克后D7，D8，D9或D10从这些患者收集样品(H0是血管升压治疗的开始)。
在对该群组的53天观察期间，在患有败血性休克的这些患者中，27例患者在休克后继发发生医院内感染，而66例不发生医院内感染。
RNA的提取和cDNA的合成
对于每位患者，生物样品是血液样品，从败血性综合征发病后前10天期间每天定期取样(患者SEP)。还根据相同的方案从健康受试者(S)取样。这些样品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA管(PreAnalytiX，Frankin Lakes，USA)。
在收集血液样品阶段后为了获得细胞的完全裂解，将管在室温下静置4小时，然后在-20℃保存直至提取生物材料。更确切地说，在这个方案中，按照制造商的推荐，通过PAXgene Blood RNA
Figure BPA00001406166100181
试剂盒(PreAnalytiX)提取总RNA。简单来说，将管离心(在3000g 10分钟)以获得核酸的沉淀。清洗这种沉淀，然后放入含蛋白酶K的缓冲液中以消化蛋白(55℃ 10分钟)。进行重复离心(在19000g 5分钟)以去除细胞碎片，添加乙醇以优化核酸固定的条件。将总RNA特异性固定到PAXgene RNA离心柱TM，在后者洗脱前，利用不含RNAse的DNAse setTM(Qiagen Ltd，Crawley，UK)进行污染DNA的消化。
对于每次提取，使用RNA 6000Nano ChipTM试剂盒(Agilent technologies)通过毛细管电泳验证总RNA的质量。使用的装置是bioanalyzer 2100TM。在20μl终体积中进行逆转录(RT)反应。将总RNA(0.5μg)与1μl 50μM的polyT和1μL 50μM的oligo(dT)和1μL退火缓冲液混合，然后在65℃温育5分钟。在冰上冷却后，将溶液与10μl 2×First Strand Reaction Mix和2μL SuperScriptIII/RNase out enzyme Mix RT(15U/μl)混合，所有这些产品都获自SuperScript First Strand Synthesis Super MixTM RT-PCR系统(Invitrogen)。逆转录在50℃进行50分钟，然后通过在85℃温育5分钟终止。最后，将每份cDNA溶液用DEPC水稀释到1/10。
用于定量的标准范围的制备
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A9靶基因(GenBank No.NM_002965.3)的153-179区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物：5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’(SEQ ID NO：2)
通过实时PCR分析mRNA的表达
使用LightCyclerTM(Roche)通过实时定量PCR来定量如上所述重转录为cDNA的S100A9靶基因的mRNA。使用Fast-StartTM DNA Master SYBRGreen I实时PCR试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行PCR反应。在含3.6μl水，2.4μl MgCl2，2μl SYBR Green mix(Fast start DNA master SYBRgreen+Taq DNA聚合酶)和1μl每种引物(10μM)和10μl cDNA溶液的20μl终体积中进行每个PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95℃ 10分钟的变性阶段后，利用40个循环的″touch-down″PCR方案(95℃ 10秒，68-58℃杂交10秒，然后72℃延伸16秒)进行扩增。每个循环结束后，测量SYBR Green发射的荧光。
为了证明扩增的特异性，将PCR产物系统进行解链曲线分析(LightCyclerTM-Roche)。为此，以0.1℃/秒的升高速率，在从58℃升高到98℃的温度下处理PCR产物。对于每个PCR产物，曲线分析期间获得单一峰，表征为特异解链温度。
定量持家基因CPB需要的引物组合由Search-LC(Heidelberg，Germany；reference 488116)提供。
利用LightCycler Relative Quantification SoftwareTM(Roche MolecularBiochemicals)通过相对定量技术分析靶mRNA的量相对于持家基因亲环蛋白B的mRNA量。使用LightCyclerTM软件(Roche)的″二阶导数最大法″自动确定每个样品的″交点″(Cp)。Cp值被定义为荧光显著不同于背景噪声的循环数目。
利用每个标准品一式四份进行1/10的5个系列稀释，以便产生表示Cp作为拷贝数对数函数的校准曲线。优化标准品稀释以便校准曲线覆盖预期靶基因和持家基因的表达水平。利用LightCycler Relative QuantificationSoftware(Roche Molecular Biochemicals)产生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相对标准曲线，并用于定量。
单变量和多变量分析的结果
为了确定对医院内感染的发生有影响的变量，进行单变量分析，然后进行多变量分析。通过完成作为不同变量函数的医院内感染达到或未达到的状况的对数回归，并针对败血性休克发病后第D7到D10天mRNA中的S100A9标记物进行单变量分析。然后利用单变量分析，对显示显著水平(p)＜0.15的变量进行多元对数回归。使用显著性阈值为0.05的“反向”选择法(开始时，在模型中考虑所有变量，然后将它们一个接一个撤回)。获得的结果显示于下表3。显示针对每个结果的比值比(O.R.)及其95％置信区间。
Figure BPA00001406166100211
从表3可以看出，多变量分析显示在败血性休克发病后第7到10天≥6.1的S100A9标记物表达显著增加医院内感染的发生概率(比值比为6.2)。
实施例5-S100A9基因表达与S100A8基因表达的相关性的研究
检测样品
对86例患者的群组进行研究，所述患者已经患有败血性休克，并进入Lyon-Sud医疗中心的Surgical或Medical重症监护室。在败血性休克后D7，D8，D9或D10从这些患者收集样品(H0是血管升压治疗的开始)。
RNA的提取和cDNA的合成
对于每位患者，生物样品是血液样品，从败血性综合征发病后前10天每天取样(患者SEP)。这些样品直接收集到PAXgeneTM Blood RNA管(PreAnalytiX，Frankin Lakes，USA)。
在收集血液样品阶段后为了获得细胞的完全裂解，将管在室温下静置4小时，然后在-20℃保存直至提取生物材料。更确切地说，在这个方案中，按照制造商的推荐，通过PAXgene Blood RNA
Figure BPA00001406166100221
试剂盒(PreAnalytiX)提取总RNA。简单来说，将管离心(在3000g 10分钟)以获得核酸的沉淀。清洗这种沉淀，然后放入含蛋白酶K的缓冲液中以消化蛋白(55℃ 10分钟)。进行重复离心(在19000g 5分钟)以去除细胞碎片，添加乙醇以优化核酸固定的条件。将总RNA特异性固定到PAXgene RNA离心柱TM，在后者洗脱前，利用不含RNAse的DNAse setTM(Qiagen Ltd，Crawley，UK)进行污染DNA的消化。
对于每次提取，使用RNA 6000 Nano ChipTM试剂盒(Agilent technologies)通过毛细管电泳验证总RNA的质量。使用的装置是bioanalyzer 2100TM。在20μl终体积中进行逆转录(RT)反应。将总RNA(0.5μg)与1μl 50μM的oligo(dT)和1μL退火缓冲液混合，然后在65℃温育5分钟。在冰上冷却后，将溶液与10μl 2×First Strand Reaction Mix和2μL SuperScript III/RNase outenzyme Mix RT(15U/μl)混合，所有这些产品都获自SuperScript First StrandSynthesis Super MixTM RT-PCR系统(Invitrogen)。逆转录在50℃进行50分钟，然后通过在85℃温育5分钟终止。最后，将每份cDNA溶液用DEPC水稀释到1/10。
用于定量的标准范围的制备
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A9靶基因(GenBank No.NM_002965.3)的153-179区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-TCAAAGAGCTGGTGCGAAAA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物：5’-AACTCCTCGAAGCTCAGCTG-3’(SEQ ID NO：2)
从获自健康受试者的cDNA混合物开始，S100A8靶基因(GenBank No.NM_002964.3)的129-280区域的扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，旨在饱和，使用下列引物对：
有义引物：5’-ATTTCCATGCCGTCTACAGG-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物：5’-CACCAGAATGAGGAACTCCT-3’(SEQ ID NO：4)
通过实时定量PCR分析mRNA的表达
使用LightCyclerTM 2.0(Roche)通过实时定量PCR来定量如上所述重转录为cDNA的S100A9和S100A8靶基因的mRNA。使用Fast-StartTM DNAMaster SYBR Green I实时PCR试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)进行PCR反应。在含3.6μl水，2.4μl MgCl2，2μl SYBR Green mix(Fast start DNAmaster SYBR green+Taq DNA聚合酶)和1μl每种引物(10μM)和10μl cDNA溶液的20μl终体积中进行每个PCR。使用的引物是先前描述的那些。
在95℃10分钟的变性阶段后，利用40个循环的″touch-down″PCR方案(95℃10秒，68-58℃(0.5℃/循环)杂交10秒，然后72℃延伸16秒)进行扩增。每个循环结束后，测量SYBR Green发射的荧光。
为了证明扩增的特异性，将PCR产物系统进行解链曲线分析(LightCyclerTM 2.0-Roche)。为此，以0.1℃/秒的升高速率，在从58℃升高到98℃的温度下处理PCR产物。对于每个PCR产物，曲线分析期间获得单一峰，表征为特异的解链温度。
定量持家基因CPB需要的引物组合由Search-LC(Heidelberg，Germany；reference 488116)提供。
利用LightCycler Relative Quantification SoftwareTM(Roche MolecularBiochemicals)通过相对定量技术分析mRNA靶的量相对于持家基因亲环蛋白B的mRNA量。使用LightCyclerTM软件(Roche)的″二阶导数最大法″自动确定每个样品的″交点″(Cp)。Cp值被定义为荧光显著不同于背景噪声的循环数目。
利用每个标准品一式四份进行1/10的5个系列稀释，以便产生表示Cp作为拷贝数对数函数的校准曲线。优化标准品稀释以便校准曲线覆盖预期靶基因和持家基因的表达水平。利用LightCycler Relative QuantificationSoftware(Roche Molecular Biochemicals)产生描述靶基因和持家基因的PCR效果的相对标准曲线，并用于定量。
分析的结果
为了确定S100A9基因的表达是否与S100A8基因的表达有关，进行相关性分析。图1给出的结果显示在这两种分子的基因表达之间存在强相关性，Spearman系数＞0.90。因此在鉴别有可能发生医院内感染的患者和确立败血性综合征进展的预后方面，分子S100A9和S100A8的基因表达具有类似的能力。
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Figure IPA00001406165700011

Claims (32)

1.一种确定患者发生医院内感染的易感性的方法，其中：
a)从患者获得生物样品，并从所述生物样品提取生物材料
d)制备至少一种靶基因的表达产物的至少一种特异性试剂，所述靶基因选自S100A9和S100A8靶基因
e)测定靶基因S100A9和S100A8中至少一种的表达，相对于指定阈值的过表达是发生医院内感染的易感性的指征。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在阶段c)测定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表达，S100A9靶基因相对于指定阈值的过表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的过表达是发生医院内感染的易感性的指征。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物样品取自具有炎性全身性应答的患者，而无论所述炎性全身性应答是否与感染有关。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物样品是血液样品。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述生物材料是核酸或蛋白。
6.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物。
7.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物。
8.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针。
9.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针。
10.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A9特异的抗体。
11.如权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A8特异的抗体。
12.S100A9基因和/或S100A8基因表达产物的至少一种特异性试剂用于确定患者发生医院内感染的易感性的用途，尤其是用于确定具有炎性全身性应答的患者发生医院内感染的易感性的用途，而无论所述炎性全身性应答是否与感染有关。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针。
14.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针。
15.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物。
16.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物。
17.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A9特异的抗体。
18.如权利要求12所述的用途，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A8特异的抗体。
19.一种建立患者的败血性综合征进展的预后的方法，其中：
a)从患者获得生物样品，并从所述生物样品提取生物材料
d)制备至少一种靶基因的表达产物的至少一种特异性试剂，所述靶基因选自S100A9和S100A8靶基因
e)测定靶基因S100A9和S100A8中至少一种的表达，相对于指定阈值的低表达是败血性综合征进展的良好预后的指征，相对于指定阈值的过表达是败血性综合征进展的较差预后的指征。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于在阶段c)测定S100A9靶基因和S100A8靶基因的表达，S100A9靶基因相对于指定阈值的低表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的低表达是败血性综合征进展的良好预后的指征；
S100A9靶基因相对于指定阈值的过表达和S100A8靶基因相对于指定阈值的过表达是败血性综合征进展的较差预后的指征。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于所述生物样品是血液样品。
22.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于所述生物材料是核酸或蛋白。
23.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物。
24.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物。
25.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针。
26.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针。
27.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A9特异的抗体。
28.如权利要求19到22中任一项所述的方法，其特征在于S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A8特异的抗体。
29.S100A9基因和/或S100A8基因表达产物的至少一种特异性试剂用于确立患者败血性综合征进展的预后的用途。
30.如权利要求29所述的用途，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂和S100A8基因的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的杂交探针和包括至少一种对S100A8靶基因特异的杂交探针。
31.如权利要求29所述的用途，其特征在于S100A9基因的特异性试剂包括至少一种对S100A9靶基因特异的扩增引物，和S100A8基因的特异性试剂包括至少一种对S100A8靶基因特异的扩增引物。
32.如权利要求29所述的用途，其特征在于S100A9基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A9特异的抗体，和S100A8基因表达产物的特异性试剂包括至少一种对分子S100A8特异的抗体。
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