CN107385101A - 一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可应用于抑郁情绪或抑郁症检测试剂或检测试剂盒中的血清microRNA，miR‑221‑3p，并通过基因工程体外转录得到miR‑221‑3p的标准品和血清中miR‑221‑3p的绝对含量与抑郁情绪或抑郁症患者血清中miRNA‑221‑3p荧光定量PCR测定的Ct值所对应的标准曲线，简化了抑郁症检测的程序。本发明提供了一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，加入了miR‑221‑3p标准品，检测简单，灵敏度高、特异性强，结果准确，具有良好的临床抑郁情绪及抑郁症检测能力。

Description

一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用。
背景技术
抑郁症(Major depression)是以情绪低落、快感缺乏和兴趣丧失等精神心理症候群为主要表现并伴有其他心理和躯体症状的情感障碍。抑郁症的临床表现差异很大，其主要的临床表现可以分为核心症状和伴随症状(心理症状群和躯体症状群)两大类。抑郁的核心症状包括心境或情绪低落，兴趣缺乏以及乐趣丧失，这是抑郁的关键症状。其中，情绪低落是指病人体验到情绪低、悲伤；兴趣缺乏是指病人对各种以前喜爱的活动缺乏乐趣；乐趣丧失是指病人无法从生活中体验到乐趣，或快感缺失(Anhedonia)。以上三种主征是相互联系的，可以同时出现或只以其中某一、二种突出。
目前，抑郁症的发病机理尚不清楚，其诊断手段也没有针对抑郁症和抑郁情绪的特异性检查项目，其诊断和疗效的判断主要是基于患者的症状描述、精神状态检查和临床行为学观察，缺乏可靠的具有临床诊断意义的生物学指标，导致较高的漏诊、误诊。由于持续性心理障碍至少出现两周，严重状态甚至至少持续两年才能确认，目前的诊断缺少快速，灵敏的指标，难以在短时间内确认患者是否患有该病或已发病，更没有措施进行早期预防，避免悲剧的发生。开发准确而客观的抑郁症实验室诊断和疗效评价方法将对我国抑郁症的防治工作起到极大的推动作用。
发明内容
本发明公开了一种用于检测患者抑郁情绪及抑郁症的血清特异性microRNA：miR-221-3p，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之一在于提供一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，用于检测miR-221-3p在抑郁情绪及抑郁症患者血清中的含量。
本发明的目的之二在于提供一种microRNA在血清抑郁情绪及抑郁症检测试盒中的应用，所述血清microRNA为miR-221-3p，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过采集围术期无抑郁情绪患者、轻度抑郁情绪患者、中重度抑郁情绪患者和临床诊断为抑郁症的患者血液，使用荧光定量PCR方法，检测miR-221-3p的相对表达量的变化，并制备标准品，根据标准曲线，计算miR-221-3p在不同个体样本中的绝对拷贝数，将抑郁情绪评分(PHQ-9)与miR-221-3p绝对含量进行相关性分析，得出血清中较高浓度miR-221-3p的绝对含量对抑郁情绪及抑郁症的判断有临床指导意义。
经供血者同意后，根据用PHQ9抑郁量表评定的抑郁患者的抑郁程度，将供血者分为无抑郁组(n＝22)，轻度抑郁组(n＝20)和中度及以上组(n＝22)。分别抽取三组供血者的静脉血：无抑郁组静脉血22份、轻度抑郁组静脉血20份、中度及以上组静脉血22份，室温凝固，离心取血清，用TIRzol LS试剂提取血清RNA，用miR-221-3p颈环反转录特异引物进行反转录，miRNA-423-5p作为参照基因，颈环反转录特异性引物为miR-423-5p-RT，其序列号如SEQ ID NO.2所示。反转录得到cDNA后，用miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物：miR-221-3p-F、miR-221-3p-R和参照基因miR-423-5p引物miR-423-5p-F、miR-423-5p-R，进行荧光定量PCR检测各组样品。实验相关指标均以均数±标准差的形式表示；以miR-423-5p为内参，无抑郁组为基准；P值代表各样品血清miR-221-3p相对含量差异，由独立样本t检验得出。结果发现血清中miR-221-3p在无抑郁组、轻度抑郁组、中度及以上组中相对表达量分别为：1.14±1.01、2.52±2.27、4.19±3.54，表明血清中miR-221-3p基因的含量可以很好的指示抑郁情绪。
但上述检测方法是一种相对定量的检测方法，每次判断患者是否存在抑郁，均需要与正常个体进行比较，不便于临床抑郁症患者的辅助判断；本发明通过基因工程的方法，构建含有miR-221-3p基因片段的重组质粒，通过体外转录得到miR-221-3p的标准品RNA，制定出标准曲线，通过荧光定量PCR测定结果，可以计算出miR-221-3p在血清中的绝对含量，这样就不需要与正常个体进行比较，也能够清楚的界定miR-221-3p在患者血清中的含量。
一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYB Green染料，所述试剂盒还包括用于扩增miR-221-3p基因的miR-221-3p颈环反转录特异引物、miR-221-3p标准品以及miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物。
所述miR-221-3p颈环反转录特异引物为miR-221-3p-RT，其序列如SEQ ID NO.2所示。所述miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物为：miR-221-3p-F和miR-221-3p-R，其序列号分别为：miR-221-3p-F：5’GGGAAGCUACAUUGUCUGC3’；miR-221-3p-R：5’CAGUGCGUGUCGUGGAGU3’。所述RNA提取试剂为TIRzol LS试剂。
所述miR-221-3p标准品的制备方法为：
步骤A：以miR-221-3p的反转录产物为模板，用引物miR-221-BamHI-F和miR-221-EcoRI-R进行扩增获得带有BamH1和EcoR1酶切位点并含有miR-221-3p的基因片段，其序列号如SEQ ID NO.3所示；将得到的基因片段与pcDNA3.1质粒同时用BamH1和EcoR1进行双酶切，纯化后进行酶切连接反应，最后转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过菌落PCR和基因测序最终确定构建miR-221-3p重组质粒构建成功；
步骤B：以步骤A中经测序验证构建成功的pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒为模板，用引物CMV-F和BGH进行PCR扩增得到含有T7RNA聚合酶启动子和miRNA-221-3p序列的DNA片段,其序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤C：将步骤B所得的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳DNA片段提取纯化后，作为转录模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录，去除DNA模板后，再通过RNA提取试剂盒纯化获取RNA沉淀即为miR-221-3p标准品。
所述体外转录的体系包括：RNase-free水、NTP缓冲液、模板DNA、T7RNA聚合酶。所述体外转录包括以下步骤：
a：将体系中的各组分充分混匀后37℃孵育2h，进行DNA片段体外转录。
b：将步骤a得到的产物在70℃加热10分钟灭活T7RNA聚合酶。
c：将步骤b得到的转录产物加入2μl无RNA酶的Dnase-I酶，混匀后37℃孵化15min，去除DNA模板。
利用实时荧光定量PCR对梯度稀释后的标准品进行扩增，分析结果，以标准品系列稀释后的Ct值为横坐标，相对应的拷贝数为纵坐标建立标准曲线如，得到其对应方程式为：Y＝3.49214E+12e-0.5871X，R2＝0.9999，Y代表样品的拷贝数，X代表样品的Ct值。
根据前述标准曲线方程，已知各样品Ct值对应的血清miRNA-221-3p的绝对含量，使抑郁症或者抑郁情绪患者可通过荧光定量PCR测定的血清中miRNA-221-3p基因的Ct值，得到抑郁症或者抑郁情绪患者中miRNA-221-3p基因的绝对含量，辅助进行患者抑郁情绪或者抑郁症的诊断。
其试剂盒具体应用步骤为：
(1)用miR-221-3p标准品构建标准曲线；
(2)抽取患者静脉血，室温凝固后，离心分离得到血清；
(3)用RNA提取试剂提取得到血清RNA；
(4)用RNA反转录试剂反转录提取出的血清RNA，得到cDNA；
(5)用miR-221-3p颈环反转录特异引物进行cDNA进行扩增，并以SRYB Green染料作为荧光物质，用实时荧光定量PCR检测特异性引物；
(6)将步骤(5)得到的荧光定量PCR检测的检测结果对应步骤(1)的标准曲线，得到miR-221-3p在患者血清中的含量，及其含量对应的患者抑郁情绪或抑郁症程度，作为诊断患者抑郁情绪的程度和抑郁症程度的判断依据之一。
本发明公开了一种用于检测患者抑郁情绪及抑郁症的血清特异性microRNA：miR-221-3p，其序列如SEQ ID NO.1所示，并基于miR-221-3p提供了一种可应用于抑郁情绪或抑郁症检测的试剂盒。
本发明通过基因工程体外转录得到miR-221-3p基因的标准品和血清中miR-221-3p的绝对含量与抑郁情绪或抑郁症患者血清中miRNA-221-3p荧光定量PCR测定的Ct值所对应的标准曲线，简化了抑郁症检测的程序。
本发明提供了一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒的应用方法，加入了miR-221-3p标准品，检测应用方法简单，灵敏度高、特异性强，结果准确，具有良好的临床抑郁情绪及抑郁症检测能力。
附图说明
图1为miR-221-3p基因PCR扩增产物的电泳图；
图2为阳性菌落电泳图；
图3为pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒测序结果对比图；
图4为miR-221-3p标准曲线；
图5为围术期患者PHQ-9抑郁评分与血清miR-221-3p浓度相关性分析。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。
本发明公开了一种用于检测患者抑郁情绪及抑郁症的血清特异性microRNA：miR-221-3p，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种基于血清microRNA的临床抑郁情绪及抑郁症的检测试剂盒，用于检测miR-221-3p基因在抑郁情绪及抑郁症患者血清中的含量。
所述试剂盒包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYB Green染料，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增miR-221-3p颈环反转录特异引物、miR-221-3p标准品以及miR-221-3p标准品荧光定量PCR检测特异性引物。
其miR-221-3p标准品通过以下步骤制备：
步骤A：miR-221-3p基因的重组质粒构建：
以miR-221-3p的反转录产物为模板，用引物miR-221-BamHI-F和miR-221-EcoRI-R，进行扩增获得带有BamH1和EcoR1酶切位点并含有miR-221-3p的基因片段，其序列号如SEQ ID NO.3所示。获得基因片段后的电泳如图1所示。
所述miR-221-BamHI-F序列为：5’AUAGGAUCCGGGAAGCUACAUUGUCUGC3’。
所述miR-221-EcoRI-R序列为：5’AUAGAAUUCCAGUGCGUGUCGUGGAGU3’。
步骤B：将得到的片段与pcDNA3.1质粒同时用BamH1和EcoR1进行双酶切，纯化后进行酶切连接反应，最后转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过菌落PCR和基因测序最终确定构建miR-221-3p重组质粒构建成功。其菌落PCR电泳结果如图2所示，miRNA-221-3p与pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒测序结果对比如图3所示。
通过以上基因工程方法，得到了含有miRNA-221-3p基因的重组质粒。
步骤C：miR-221-3p标准品的转录和纯化：
以经测序验证构建成功的pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒为模板，用引物CMV-F和BGH进行PCR扩增得到含有T7RNA聚合酶启动子和miRNA-221-3p序列的DNA片段，序列如下SEQ ID NO.4所示。
所述CMV-F序列为：5’cgcaaaugggcgguaggcgtug3’。
所述BGH序列为：5’ccucgacugugccuucua3’。
所得片段经琼脂糖凝胶电泳DNA片段提取纯化后，作为转录模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录，具体过程如下：
a：体外转录体系如表1所示，将表1所述体系充分混匀后37℃孵育2h。
试剂 容积
RNase-free水 7μl(根据模板浓度决定)
NTP缓冲液 10μl
模板DNA 1μl
T7RNA聚合酶 2μl
总体积 20μl
表1
b：70℃加热10分钟灭活T7RNA聚合酶。
c：得到的转录产物加入2μl无RNA酶的Dnase-I酶，混匀后37℃孵化15min，去除DNA模板，再通过RNA提取试剂盒纯化获取RNA沉淀即为本发明miR-221-3p标准品。
计算标准品的拷贝数及浓度：标准品的拷贝数(copies)＝[(ng数×10-9)×阿伏伽德罗常数]/(碱基数×RNA碱基的平均分子量)。阿伏伽德罗常数为6.02×1023，RNA碱基的平均分子量为345，ng数＝标准品RNA质量(ng)。标准品的浓度(copies/ug)＝[标准品的拷贝数(copies)/标准品RNA ng数]×1000。
miR-221-3p标准品制备后，利用实时荧光定量PCR对梯度稀释后的标准品进行扩增，其结果如表2所示。以标准品系列稀释后的Ct值为横坐标，相对应的拷贝数为纵坐标建立标准曲线如图4所示，其对应方程式为：Y＝3.49214E+12e-0.5871X，R2＝0.9999，Y代表样品的拷贝数，X代表样品的Ct值。
CT值 稀释倍数 拷贝数(copies)
33.06 108 12768
29.13 107 127686
25.43 106 1276866
21.235 105 12768665
17.39 104 127686652
13.42 103 1276866520
9.61 102 12768665200
表2
本发明还提供了一种检测临床抑郁情绪及抑郁症血清的试剂盒的应用方法，其具体步骤为：
(1)用miR-221-3p标准品构建标准曲线；
(2)抽取患者静脉血，室温凝固后，离心分离得到血清；
(3)用RNA提取试剂提取得到血清RNA；
(4)用RNA反转录试剂反转录提取出的血清RNA，得到cDNA；
(5)用miR-221-3p颈环反转录特异引物进行cDNA进行扩增，并以SRYB Green染料作为荧光物质，用实时荧光定量PCR检测特异性引物。
实施例1
根据PHQ评分，筛选无抑郁情绪、轻度抑郁情绪、中度及以上抑郁情绪和抑郁症患者72名，经供血者同意后，分别抽取四组供血者的静脉血：无抑郁组静脉血22份、轻度抑郁组静脉血20份、中度及以上组静脉血22份，抑郁症组静脉血8份，室温凝固，离心取血清，采用本发明提供的试剂盒进行检测，其检测结果如表3所示：
表3
根据前述标准曲线方程，已知各样品Ct值得血清miRNA-221-3p的绝对含量(copies)。如表2所示：我们分析患者不同PHQ评分的血清miRNA-221-3p平均浓度及范围发现：轻度(PHQ平均分为6.03)和中度及以上抑郁情绪患者(PHQ平均分为12.14)血清miRNA-221-3p平均浓度(9.6x106，1.6x107)均明显高于无抑郁患者(7.7×106)(p<0.05)。无抑郁患者血清miRNA-221-3p浓度低值为2.9x105，高值为1.6x107；轻度抑郁情绪患者血清miRNA-221-3p浓度低值为6.1x105，高值为2.7x107；中度及以上抑郁情绪患者血清miRNA-221-3p浓度低值为2.0x106，高值为4.4x107。抑郁患者血清miRNA-221-3p浓度低值为2.7x107，高值为3.2x108。
实施例2
根据PHQ评分，筛选围术期轻度抑郁情绪、中度及以上抑郁情绪患者60名，经供血者同意后，分别抽取患者的静脉血，室温凝固，离心取血清，采用本发明提供的试剂盒进行检测，其检测结果以血清miRNA-221-3p浓度为横坐标，PHQ-9评分为纵坐标，得出结果如图5所示，线性回归方程为：Y＝2E-07X+5.529，R2＝0.2636，相关系数R＝0.513。根据数据分布情况添加两条直线进一步分析，位于直线交叉点处血清miR-221-3p浓度为1.7*107copies/μg RNA，对应PHQ-9评分为6分；位于交叉点左侧患者，即血清miR-221-3p浓度均小于1.7*107copies/μg RNA，虽然PHQ-9抑郁评分高者，而血清miR-221-3p浓度并不高，说明低血清miR-221-3p浓度对于抑郁情绪并没有好指示作用；位于交叉点右侧患者，血清miR-221-3p浓度均大于1.7*107copies/μg RNA，而PHQ-9抑郁评分均在6分以上，说明较高浓度的血清miR-221-3p对于中重度抑郁情绪有较好指示作用。因此当血清中miR-221-3p的含量>1.7*107copies/μg RNA时，患者均存在明显的抑郁情绪，因此血清中miR-221-3p的含量可作为判断围术期患者抑郁情绪的生物学标志之一。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南医科大学附属医院
<120> 一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 2
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gucguaucca gugcgugucg uggagucggc aauugcacug gauacgacga aaccc 55
<210> 3
<211> 85
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
auaggauccg ggaagcuaca uugucugcug gguuucgucg uauccagugc aauugccgac 60
uccacgacac gcacuggaau ucuau 85
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 60
ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 120
aagctggcta gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc ggatccggga agctacattg 180
tctgctgggt ttcgtcgtat ccagtgcaat tgccgactcc acgacacgca ctggaattct 240
gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat 300
cagcctcgac tgtgccttct a 321

Claims (6)

1.一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，SRYB Green染料，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增miR-221-3p基因的miR-221-3p颈环反转录特异引物、miR-221-3p标准品以及miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物。
2.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p颈环反转录特异引物为miR-221-3p-RT。
3.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p荧光定量PCR检测特异性引物为：miR-221-3p-F和miR-221-3p-R，其序列分别为：
miR-221-3p-F：5’GGGAAGCUACAUUGUCUGC3’；
miR-221-3p-R：5’CAGUGCGUGUCGUGGAGU3’。
4.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述RNA提取试剂为TIRzol LS 试剂。
5.根据权利要求1~4任一项所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒，其特征在于：所述miR-221-3p标准品的制备方法为：
步骤A：以miR-221-3p的反转录产物为模板，用引物miR-221-BamHI-F和miR-221-EcoRI-R进行扩增获得带有BamH1和EcoR1酶切位点并含有miR-221-3p的基因片段；将得到的基因片段与pcDNA3.1质粒同时用BamH1和EcoR1进行双酶切，纯化后进行酶切连接反应，最后转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过菌落PCR和基因测序最终确定构建miR-221-3p重组质粒构建成功；
步骤B：以步骤A中经测序验证构建成功的pcDNA3.1-miRNA-221-3p重组质粒为模板，用引物CMV-F和BGH进行PCR扩增得到含有T7 RNA聚合酶启动子和miRNA-221-3p序列的DNA片段；
步骤C：将步骤B所得的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳DNA片段提取纯化后，作为转录模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录，去除DNA模板，再通过RNA提取试剂盒纯化获取RNA沉淀即为miR-221-3p标准品。
6.根据权利要求1所述的一种检测临床抑郁情绪及抑郁症的试剂盒的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）用miR-221-3p标准品构建标准曲线；
（2）抽取患者静脉血，室温凝固后，离心分离得到血清；
（3）用RNA提取试剂提取得到血清RNA；
（4）用RNA反转录试剂反转录提取出的血清RNA，得到cDNA；
（5）用miR-221-3p颈环反转录特异引物进行cDNA进行扩增，用特异性引物进行荧光定量PCR检测；
（6）将步骤（5）得到的荧光定量PCR检测的检测结果对应步骤（1）的标准曲线，得到miR-221-3p在患者血清中的含量，及其含量对应的患者抑郁情绪或抑郁症程度。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229877A (zh) * 2019-06-21 2019-09-13 广东药科大学附属第一医院 一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120034612A1 (en) * 2010-07-14 2012-02-09 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods and Kits for miRNA Isolation and Quantitation
CN103571849A (zh) * 2012-08-06 2014-02-12 北京市理化分析测试中心 用于检测抑郁症的基因及其检测方法和试剂盒
CN105950768A (zh) * 2016-07-01 2016-09-21 江苏医诺万细胞诊疗有限公司 一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法
US20170044613A1 (en) * 2014-04-22 2017-02-16 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Methods, Processes, Devices and Kits for the Measurement of Post Traumatic Stress Disorder MicroRNA Markers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120034612A1 (en) * 2010-07-14 2012-02-09 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods and Kits for miRNA Isolation and Quantitation
CN103571849A (zh) * 2012-08-06 2014-02-12 北京市理化分析测试中心 用于检测抑郁症的基因及其检测方法和试剂盒
US20170044613A1 (en) * 2014-04-22 2017-02-16 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Methods, Processes, Devices and Kits for the Measurement of Post Traumatic Stress Disorder MicroRNA Markers
CN105950768A (zh) * 2016-07-01 2016-09-21 江苏医诺万细胞诊疗有限公司 一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI-MINFAN 等: "Differential expression of microRNA in peripheral blood mononuclear cells as specific biomarker for major depressive disorder patients", 《JOURNAL OF PSYCHIATRIC RESEARCH》 *
刘元会 等: "MicroRNA与抑郁症靶向治疗", 《国际精神病学杂志》 *
刘元会: "抑郁患者脑脊液和血清中差异性miRNAs鉴定的临床研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
王联生 等: "抑郁症相关微RNA的研究进展", 《医学综述》 *
袁榴娣 等: "《高级生物化学与分子生物学实验教程》", 31 March 2006, 东南大学出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229877A (zh) * 2019-06-21 2019-09-13 广东药科大学附属第一医院 一种miRNA在制备预防或诊断血脂异常肝郁证试剂中的应用

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