TW201912786A - Trec或krec含量的評估方法、該方法所使用之粒子及其用途 - Google Patents

Trec或krec含量的評估方法、該方法所使用之粒子及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係提供一種新穎的粒子及其用途來作為目的，前述粒子係能夠作為，用於以更高精度的方式來進行TREC及/或KREC的量之評估的對照DNA等使用。本發明的一態樣係一種粒子，其特徵在於：含有訊息接合部份之TREC(T-cell Receptor Excision Circles)的核酸片段、及含有訊息接合部份之KREC(Kappa-deleting Receptor Excision Circles)的核酸片段，其中的至少任一者被導入細胞內或脂質體內。

Description

TREC或KREC含量的評估方法、該方法所使用之粒子及其用途
本發明係關於T淋巴球受體切除環(TREC, T-cell Receptor Excision Circles)或Kappa刪除受體切除環(KREC, Kappa-deleting Receptor Excision Circles)之量的評估方法、該方法所使用之粒子及其用途。更具體而言，本發明的一態樣係關於原發性嚴重複合型免疫缺乏症(SCID, severe combined immunodeficiency)等的新生兒篩查(screening)。
在被總稱為原發性免疫缺乏症(primary immunodeficiency)的病患中，存在著以SCID為代表，因為T細胞和/或B細胞異常新生，所造成之先天性呈現功能性T細胞及/或B細胞缺乏的症狀。
舉例來說，SCID係以功能性T細胞缺乏作為主症狀，且亦先天性地引起功能性B細胞及NK細胞的缺乏。再者，藉由此等淋巴細胞的異常，患者對於細菌、真菌及病毒呈現易感染性，故最遲在1歲之前，若不進行造血幹細胞的移植等的根治性治療，則預測會遭遇到致命的症狀。因此，冀望著能夠早期判斷疾病的症狀產生及症狀產生的可能性之技術。
在非專利文獻1中揭示一種方法，其係針對從新生兒的濾紙血提取之DNA檢體，藉由使用定量聚合酶連鎖反應(PCR, Polymerase chain reaction)法，擴增TREC及KREC的部分序列並進行絕對定量，而進行SCID等原發性免疫缺乏症患者的新生兒篩查。又，TREC係一種當T細胞新生於胸腺時，所出現之殘存於細胞內的環狀DNA，且為T細胞新生的指標。同樣地，KREC係一種當B細胞新生時，所出現之殘存於細胞內的環狀DNA，且為B細胞新生的指標。
[先前技術文獻] [非專利文獻] [非專利文獻1]Stephan Borte, Ulika von Dobeln et. al.，Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR, BLOOD, 15 MARCH 2012 vol.119 no. 11 p.2552-2555。
[發明概要] [發明所欲解決的課題] 在如同非專利文獻1所記載之習知技術中，為了進行TREC及/或KREC的絕對定量，必須製作檢量線。舉例來說，在非專利文獻1所記載之習知技術中，將含有一複製(Copy)的TREC-KREC-TRAC之構建體(construct)的質體(Plasmid)及含有一複製的β-肌動蛋白序列的質體，作為檢量線作成用的對照(control)DNA，且於製作該對照DNA的稀釋系列後，針對此等稀釋系列，適用定量PCR法並作成檢量線。在其他的習知技術中，作為檢量線作成用的對照DNA，亦有使用相當於TREC片段及/或KREC片段的寡核苷酸(Oligo DNA)之情形。
然而，起因於檢量線作成用的對照DNA之正確定量(分子量的決定)之難點，或起因於在製作稀釋系列之階段稀釋時所產生之稀釋誤差等，亦有使作成後之檢量線的正確性產生問題的情形。
又，就使用檢體與使用對照DNA而言，在供給至定量PCR法的DNA調製過程係不同的。換言之，在如上述之對照DNA中，雖然能夠藉由稀釋經精製後的質體(或寡核苷酸)，調製出供給至定量PCR法的DNA；但在檢體中，藉由從濾紙血提取DNA，能夠調製供給至定量PCR法的DNA。因此，舉例來說，即使在從濾紙血提取DNA的提取效率產生變化時，因為不會影響上述對照DNA，故與使用此對照DNA作成之檢量線進行比較而獲得之絕對定量的結果，係具有根據從濾紙血提取DNA的提取效率的變動，而產生變化的可能性。
此外，使用檢體與使用對照DNA，在供給至定量PCR法的DNA調製過程係為不同，且就此事實的原因之一而言，如果進行測定的設施不同，則即使是相同檢體的值，亦變得不能保持一致性。
本發明的一態樣係以提供一種新穎的粒子及其用途來作為目的，前述粒子係能夠作為，用於以更高精度的方式來進行TREC及/或KREC的量之評估的對照DNA等使用。
[用以解決課題之手段] 本發明的一態樣係包含一種粒子，其特徵在於：含有訊息接合(Signal joint)部份之T淋巴球受體切除環(TREC, T-cell Receptor Excision Circles)的核酸片段、及含有訊息接合部份之Kappa刪除受體切除環(KREC, Kappa-deleting Receptor Excision Circles)的核酸片段，其中的至少任一者被導入細胞內或脂質體內。 又，本發明的一態樣係一種核酸構建體，其係包含：具有訊息接合部份之TREC的核酸片段、及具有訊息接合部份之KREC的核酸片段，其中的至少任一者(但是，並不包含TREC的全長及KREC的全長)。
[發明之效果] 根據本發明的一態樣，能夠達成提供一種新穎的粒子及其用途的效果，且前述粒子係能夠作為，用於以更高精度的方式來進行TREC及/或KREC的量之評估的對照DNA等使用。
[用以實施發明之形態] 以下，針對本發明實施形態進行詳細說明。
又，本說明書中的「A及/或B」係A及B、A或B兩者的表現。
[1. 粒子] 本實施形態中的「粒子」係指，於「粒子的母體」，導入以下所說明之「核酸片段」者。又，「導入核酸片段」係指，只要是至少曾經經過從粒子的母體外導入至母體內的流程即可。當粒子的母體係細胞時，核酸片段被導入細胞內之後進行擴增，且核酸片段(被導入之核酸片段的複製物)係被包含在伴隨著細胞的增殖所產生之新生細胞的形態，亦被含在「被導入粒子的母體內」的概念。
(粒子的母體) 可導入核酸片段之粒子的母體，係細胞或脂質體。脂質體係指，磷脂雙層膜所構成的人造膜囊泡。脂質體除了顯示與細胞類似的舉動之外，並且已經建立了用於包封核酸片段的方法，故脂質體能夠作為核酸片段的容器，而與細胞進行相同地處理。
作為用於進行TREC等之量的評估的對照，而使用本發明一態樣的粒子時，粒子的母體較佳係不具有內在性(intrinsic)的TREC及KREC。脂質體本來就滿足此條件。除了朝向T細胞分化前後的細胞(新生之T細胞或其前驅細胞)及朝向B細胞分化前後的細胞(新生之B細胞或其前驅細胞)之外，大部分的細胞也本來就符合此條件。
相較於脂質體，粒子的母體較佳係細胞。此係因為，細胞一般具有以下特點：1)若培養條件齊備，則具有增殖性(建立能夠將被含於細胞之核酸片段的個數維持於特定數的殖株(clone)，且藉由使其大量增殖，亦能夠容易地大量獲得均質的粒子)；2)具有內在性的參考基因(RNaseP等)；及3)細胞一般較脂質體穩定。
若考慮於TREC及KREC的評估中使用血液檢體、以及新生後的T細胞或B細胞與細胞的類似性，則作為粒子母體而使用的細胞較佳係血液系統的細胞或免疫系統的細胞。就血液系統的細胞及免疫系統的細胞，可舉出例如，Jeko-1細胞、Raji細胞、Ramos細胞等的B細胞株；Jurkat細胞、MOLT-4細胞、TG40細胞、U-937細胞等的T細胞株；KU812‐F細胞、RBL-2H3細胞等的嗜鹼性粒細胞細胞株；HMC-1細胞、Ku812細胞、RBL細胞等的顆粒球細胞株；MCL-5細胞、MOLT-4細胞等的淋巴母細胞細胞株；NB-4細胞、THP-1細胞等的好中球様細胞株；416B細胞、MOLM-14細胞、THP-1細胞等的巨噬細胞株；BJAB細胞、CML細胞、Daudi細胞等的白血球細胞株；A20細胞、BC-3細胞、CA46細胞、HCT116細胞、ST-486細胞等的淋巴瘤細胞株；ESB細胞、TCLB細胞等的淋巴母細胞瘤細胞株；HL-60細胞、K562細胞等的白血病細胞株等。此等當中，較佳係白血病細胞株、淋巴母細胞瘤細胞株、淋巴瘤細胞株及白血球細胞株，且更佳係白血病細胞株及白血球細胞株。
(核酸片段) 就可導入粒子母體的核酸片段而言，可為含有訊息接合部份之TREC的核酸片段、及含有訊息接合部份之KREC的核酸片段，其中的至少任一者。又，環狀的TREC本身及環狀的KREC本身，係不被包含在核酸片段的範疇。於相同粒子的母體，導入此等核酸片段之兩者時，從亦能夠用於TREC及KREC之任一者的評估的觀點來看，此係較佳的。又，TREC的核酸片段及KREC的核酸片段係可作為各別核酸構建體而被導入粒子的母體，亦可作為連結有兩者之核酸構建體而被導入粒子的母體。此處，核酸構建體係指，上述核酸片段的本身、或由將該核酸片段作為一部份而含有之核酸而成的構造體(例如，插入有核酸片段的質體等)。
又，上述訊息接合部份係指，TREC及KREC各自中的環之結合部分。在TREC中，亦稱為δRec-ΨJα訊息接合；且在KREC中，亦稱為內含子(Intron)RSS-κde訊息接合。
在核酸片段的較佳態樣中，並非包含TREC全長的片段及包含KREC全長的片段，而是包含訊息接合部分的TREC部分片段及/或包含訊息接合部分的KREC部分片段。又，在較佳的態樣中，訊息接合部分並非在核酸片段的兩端被分開而被包含在核酸片段，而是被包含在一個連續片段的區域中。
雖然核酸片段的尺寸並未特別限定，但若考慮後述之基因擴增的充分必要尺寸，則其下限較佳係在200bp以上，更佳係在300bp以上，特佳係在400bp以上。就核酸片段的上限而言，較佳係在600bp以下，更佳係在550bp以下，特佳係在530bp以下。在一例子中，核酸片段的尺寸係在400bp以上且600bp以下的範圍內，較佳係在450bp以上且550bp以下的範圍內，更佳係在470bp以上且530bp以下的範圍內。
在將含有訊息接合部份之區域進行基因擴增時，被含於核酸片段之訊息接合部份的位置較佳係該核酸片段的相對中央部分。舉例來說，從該核酸片段的兩端部至訊息接合部份較佳係至少距離50bp以上，更佳係至少距離80bp以上，特佳係至少距離100bp以上。又，被含於核酸片段之訊息接合部份的位置係該核酸片段的相對中央部分，且該核酸片段的尺寸在上述範圍(特別是400bp以上且600bp以下的範圍內)內時，實際上能夠就這樣直接使用所有既有的TREC檢測用/KREC檢測用的引子(Primer)‧探針(Probe)試劑盒(Kit)，進行該核酸片段的基因擴增及檢測。也就是說，不論是對於既有的測定系統或創新設計的測定系統，此核酸片段係能夠泛用於其評估方法(例如，使用引子‧探針試劑盒之擴增效率、擴增的特異性等之探討)及作為後述之標準試料等。
又，在野生型中，被含於核酸片段的訊息接合部份，係包含來自鹼基插入與缺失所造成之基因突變之具有個體間差異的區域。在核酸片段的特佳態樣中，其包含去除具有個體間差異的區域後之訊息接合部份(相當於序列編號1及2)。藉此，除了能夠以統一的規格調製核酸片段之外，在使用相同之引子試劑盒進行核酸片段的擴增時，理論上，變得能夠經常獲得相同的擴增片段，且不論是對於既有的測定系統或創新設計的測定系統，此核酸片段係特別適用於作為後述之標準試料等。
雖然並未特別限定，但核酸片段的較佳態樣係雙股DNA片段。核酸片段係可作為呈現被插入至質體等載體之狀態的核酸構建體，而被導入粒子的母體內。
就從更容易進行TREC及KREC之正確定量的觀點來看，核酸片段之粒子母體內的複製，較佳係被限制。核酸片段在呈現被插入至質體等載體之狀態時，因應質體與粒子的母體(宿主細胞)之組合，而能夠限制該質體的複製數量。
就從更容易進行TREC及KREC之正確定量的觀點來看，核酸片段較佳係以特定的個數(例如僅為一複製)被包含在粒子的母體內。此外，如上述般，若核酸片段被限制其在粒子母體內的複製，則被含於粒子母體內的核酸片段的數量變得難以隨著時間變化，故為較佳。
就從更容易進行TREC及KREC之正確定量的觀點來看，核酸片段較佳係不在粒子母體內引起轉錄(Transcription)。核酸片段在呈現被插入至質體等載體之狀態時，舉例來說，若設置與該核酸片段的表達控制相關之啟動子或增強子等，則能夠防止核酸片段的轉錄。但此載體亦可插入抗藥性基因等，以便轉錄及轉譯。
就具有訊息接合部份之TREC的核酸片段之特佳例而言，可舉出：1)於序列編號1顯示鹼基序列的核酸片段；2)於序列編號1顯示鹼基序列的核酸片段，且具有400bp以上、450bp以上或470bp以上尺寸的核酸片段；3)與前述1)或2)的核酸片段相比，鹼基序列相同性為90%以上，更佳為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上的核酸片段等。
就具有訊息接合部份之KREC的核酸片段之特佳例而言，可舉出：1)於序列編號2顯示鹼基序列的核酸片段；2)於序列編號2顯示鹼基序列的核酸片段，且具有400bp以上、450bp以上或470bp以上尺寸的核酸片段；3)與前述1)或2)的核酸片段相比，鹼基序列相同性為90%以上，更佳為95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上的核酸片段等。
在既存的測定系統中，TREC及KREC在每個報告的擴增序列都不同。根據所使用的裝置或方法，最佳之擴增序列係不同的，並且在引子及探針序列的設計中，有必要評估使用含有全長序列的基因組DNA所設計之擴增序列的擴增效率及特異性。又，由於絕對定量是實際判斷的主流，因此有必要為每個特定的擴增序列製備寡核苷酸或將其組合而成的質體DNA(對照DNA)。藉由使用本發明一實施形態的核酸片段，能夠解決此等既存的測定系統所存在之問題點。
(粒子的製作方法) 就粒子的製作方法而言，例如將上述核酸片段(亦可為含有該核酸片段的核酸構建物之形態)導入粒子的母體。就將核酸片段導入粒子母體的方法而言，舉例來說，雖然能夠從電穿孔法、顯微注射法、乙酸鋰法、磷酸鈣法、脂質轉染法及粒子槍法等基因導入法之中適當的選擇，但較佳係電穿孔法。
在進行於粒子的母體導入核酸片段之操作後，亦可因應必要，進行是否成功導入核酸片段的確認(舉例來說，使用包含插入有核酸片段之載體的抗藥性基因等)及導入之核酸片段的複製數量的確認。
經製作的粒子，可依據細胞或脂質體的保存方法進行保存。粒子係例如能夠以懸浮於因應粒子種類之適當液體(生理食鹽水、液體培養基)的狀態，被保存在容器中。在長期保存此粒子的情況下，可進行例如凍結乾燥等。
[2. 使用粒子，評估TREC及/或KREC的量] (標準試料) 上述粒子，係能夠作為評估血液檢體中TREC及/或KREC的量時的基準試料(標準試料)來使用。標準試料係能夠例如作為檢量線作成用的試料、陰性對照用的試料或基準值(門檻值)提示用的試料等，來使用。
上述粒子與核酸片段的本身不同，其係能夠使用例如光學顯微鏡系統等進行計數。因此，基於被含於粒子之核酸片段的個數(當粒子的母體為脂質體時，其亦可指將核酸片段包封到脂質體中的效率)與被含於系統中之粒子個數的關係，變得能夠更容易控制被含於系統中之核酸片段的總數。因此，若使質體或寡核苷酸本身作為對照DNA時，能夠降低以下所產生之問題1)及2)。1)對照DNA正確定量的難點；或2)在製作稀釋系列時的階段稀釋中所產生之稀釋誤差等，所造成之檢量線之正確性的問題等。
標準試料的一形態(液體試料)係以特定的濃度(粒子的個數/粒子的體積)，來包含上述粒子的液體。標準試料亦可為以互為不同之特定的濃度(粒子的個數/粒子的體積)，來包含上述粒子的液體組合。用於調製標準試料之液體並未特別限定，雖然可例如為生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS, Phosphate buffered saline)等，但從模擬血液試料的觀點來看，該液體較佳係至少包含紅血球及血漿的至少任一者，更佳係包含兩者。舉例來說，就將紅血球濃厚液與血漿混合而得之紅血球液而言，其較佳係作為混合粒子的液體。又，從模擬血液試料的觀點來看，該液體較佳係調整至與血液同等的黏稠度(例如，相對於血液為0.8倍~1.2倍左右，更佳係0.9倍~1.1倍左右的黏稠度)。
就標準試料的其他形態而言，可為將上述液體試料浸漬於纖維體而成之物。雖然纖維體只要是能夠使液體浸漬之纖維的集合體即可，並未特別限定，但較佳係可舉出例如，濾紙等的紙；織布；不織布等。此等當中，較佳係濾紙，且在濾紙中，較佳係血液採取用濾紙。雖然將液體試料浸漬於纖維體的方法並未特別限制，但可舉出一種方法，其係以移液管等採取液體試料，並將液體試料滴(spot)在纖維體上的方法等。又，被液體試料浸漬的纖維體亦可被乾燥且進行保存。
在標準試料的上述其他形態中，纖維體可具有藉由浸漬液體試料而成的複數個斑點(spot)。雖然複數個斑點可以是浸漬有含有相同濃度粒子之液體試料的斑點，但複數個斑點較佳係包括浸漬有含有不同濃度粒子之液體試料的斑點。具有使含有不同特定濃度之粒子的液體試料浸漬於纖維體之複數個斑點的標準試料，係適用於作為檢量線作成用試料。
又，標準試料的形態，係能夠因應成為TREC及/或KREC的量之評估對象的檢體形態，而選擇最適當之形態。舉例來說，在檢體為血液檢體(未浸漬於纖維體)的情況下，可採用液體試料來作為標準試料。當檢體係將血液浸漬於纖維體而成之檢體時，作為標準試料，亦可採用將液體試料浸漬於纖維體(較佳係與檢體相同的纖維體)而成之物。當檢體係將血液浸漬於濾紙(較佳係採血用濾紙)而成之檢體時，作為標準試料，亦可採用將液體試料浸漬於濾紙(較佳係採血用濾紙)而成之物。藉由使標準試料的形態與檢體的形態相似，並基於共通之方法，能夠進行DNA的提取及擴增提取後之DNA，故變得較容易且正確地獲得結果。因此，以相同設施，針對相同檢體進行複數回測定時，係當然能夠保持值的一貫性；且就連以不同設施，針對相同檢體進行測定時，亦能夠保持值的一貫性。
(檢體與其調製方法) 成為TREC及/或KREC之量的評估對象之檢體，雖然只要是包含TREC及KREC之至少任一者的檢體即可，並未特別限定，但較佳係血液檢體，且更佳係將血液浸漬於纖維體而成之檢體；此等當中，更佳係濾紙(特別是採血用濾紙)血檢體。檢體係來自人或人以外的哺乳動物，較佳係人，更佳係新生兒。又，「新生兒」係指出生後30日以內的嬰兒。纖維體係能夠適當地利用與在上述(標準試料)的欄位所說明過之纖維體相同者。就特別有必要進行TREC及/或KREC之量的評估之新生兒而言，特佳係使用濾紙(特別是採血用濾紙)血檢體。
以下，針對從新生兒調製作為檢體較佳態樣之濾紙(採血用濾紙)血檢體的方法，進行說明。就濾紙血檢體的調製方法而言，可舉出一種方法，其係從新生兒採取少量的血，並將此血液滴在濾紙上，在室溫下進行乾燥。具體而言，此方法係使用針等，於新生兒的腳後跟施加輕微傷痕，使血液直接從毛細血管浸漬於濾紙上。
(TREC及/或KREC的定量方法) =檢量線作成用試料= 就檢量線作成用試料而言，在上述標準試料中，可舉出例如：1)含有不同的特定濃度之粒子的液體試料的組合；或者，2)浸漬有含有不同特定濃度之粒子的液體試料之複數個斑點的纖維體。又，「含有不同的特定濃度之粒子的液體試料」係指，例如，相當於以必要濃度含有用於作成檢量線的粒子之特定倍數的稀釋系列者。
=陰性對照及陽性對照= 陽性對照係包含特定濃度之用於粒子製作之粒子母體(未導入TREC的核酸片段及KREC的核酸片段者)的液體，或將該液體浸漬於纖維體者。就「液體」及「纖維體」而言，係如同於上述(標準試料)欄中的說明所述。粒子母體的濃度係等同於0個月的健康嬰兒之白血球數量的下限，較佳係5000個(粒子母體)/ μl。在陽性對照中，不會檢測出TREC及KREC。
陰性對照係例如在上述的陽性對照中，將粒子母體的一部分，置換成含有TREC的核酸片段及/或KREC的核酸片段之粒子(本發明的粒子)者。換言之，陰性對照係相當於上述標準試料的一個形態。
又，陽性對照的形態亦與標準試料相同，可因應作為TREC及/或KREC之量的評估對象之檢體形態，而選擇最適當者。舉例來說，在檢體是血液檢體(未浸漬於纖維體)的情況下，作為陽性對照，可採用液體的形態。在檢體為將血液浸漬於纖維體而成之檢體的情況下，作為陽性對照，可採用將液體浸漬於纖維體(較佳係與檢體相同種類的纖維體)而成者。若檢體為將血液浸漬於濾紙而成之檢體的情況下，作為陽性對照，可採用將液體浸漬於濾紙(較佳係採血用濾紙)而成者。
又，陰性對照及陽性對照係可為在相同纖維體上，各自作為斑點而浸漬的形態，又，亦可為將陰性對照、陽性對照及檢量線作成用試料，全部在相同纖維體上，各自作為斑點而浸漬的形態。
=DNA的提取與定量= 以因應檢量線作成用試料、陽性對照、陰性對照及檢體形態(液體形態或浸漬於纖維體的形態)的方法，進行DNA的提取。舉例來說，只要是浸漬於濾紙般之纖維體形態的試料即可，例如以一定尺寸的沖頭(Punch)從纖維體沖出沖頭片，並洗淨經沖出之沖頭片，再經過DNA的提取，獲得DNA溶出液。雖然此沖頭的直徑較佳係3毫米左右，但可大於此或小於此。又，因為使檢量線作成用試料、陽性對照、陰性對照及檢體各自的形態統一，且基於相同手法針對全部試料進行DNA的提取，係能夠更正確地進行定量，故較佳。
接著，針對被含於DNA溶出液中之TREC及KREC的至少任一者，且較佳係針對兩者，藉由基因擴增法進行擴增，並進行擴增片段的定量。又，基因擴增法較佳係定量PCR法。
進行定量PCR法時，引子試劑盒可以根據被導入粒子母體之TREC核酸片段及/或KREC的序列來決定。構成引子試劑盒之正向引子與反向引子的長度係例如在15鹼基長度以上，較佳係在15鹼基長度以上且50鹼基長度以下的範圍內，更佳係在17鹼基長度以上且35鹼基長度以下的範圍內，特佳係在17鹼基長度以上且30鹼基長度以下的範圍內，最佳係在17鹼基長度以上且25鹼基長度以下的範圍內。正向引子與反向引子之從PCR結果而獲得的擴增片段，係包含訊息接合部分，且以使其尺寸被設計在約80bp~500bp左右，或80bp~200bp左右，或100bp~150bp左右的情形為較佳。
雖然被含於引子試劑盒之正向引子與反向引子的數量比(與莫爾比實質同義)並未特別限定，但較佳為，正向引子的濃度係在反向引子的濃度之0.7倍~1.3倍的範圍內，更佳係0.9倍~1.1倍的範圍內。
能夠依據通常方法來合成此引子試劑盒。又，使用此引子試劑盒之PCR的反應條件並未特別限定。變性步驟的溫度係例如可設定在93℃~96℃的範圍內，較佳係可設定在94℃~95℃的範圍內。退火步驟的溫度係例如可設定在58℃~69℃的範圍內，較佳係設定在59℃~63℃的範圍內。延伸步驟的溫度係例如可設定在60℃~79℃的範圍內，較佳係設定在65℃~75℃的範圍內。變性步驟的反應時間係例如可設定在8秒~25秒的範圍內，較佳係設定在8秒~20秒的範圍內。退火步驟的反應時間係例如可設定在25秒~1分鐘的範圍內，較佳係設定在28秒~35秒的範圍內。延伸步驟的溫度係例如可設定在1秒~20秒的範圍內，較佳係設定在1秒~10秒的範圍內。又，循環數係例如可設定在20~100循環的範圍內，較佳係設定在30~85循環的範圍內，更佳係設定在35~65循環的範圍內。
雖然用於PCR擴增片段定量之探針(通常為螢光標記核酸探針)係可設計為能夠與PCR擴增片段混成(Hybridizing)，但其核酸部份較佳係15鹼基長度以上，更佳係在15鹼基長度以上且50鹼基長度以下的範圍內，特佳係在17鹼基長度以上且35鹼基長度以下的範圍內。
又，於構成上述各引子及探針之核苷酸(Nucleotide)中，除了DNA之外，亦可含有肽核酸(PNA, Peptide nucleic acid)及/或鎖核酸(LNA, locked nucleic acid)等人造核酸。
能夠依據一般之定量PCR的方法，進行PCR反應後之TREC及/或KREC的定量。在具體的一例中，首先，從陽性對照及陰性對照所獲得之PCR反應的結果來看，確認到適當地進行了定量PCR反應。接著，將從檢量線作成用試料所獲得之PCR反應的Ct值，繪製於橫軸為各細胞濃度之座標上，而作成檢量線。將作成之檢量線作為基準來使用，且能夠決定被含於檢體中之TREC及/或KREC的總量(或是血液中的濃度換算值)。
又，在進行上述之絕對定量的態樣之外，針對被含於檢體中之TREC及/或KREC的量，進行相對定量的態樣，亦包含在本發明的範疇中。舉例來說，作為標準試料，準備包含特定濃度(粒子的個數/液體的體積)之上述粒子的一種以上的試料。接著，與進行絕對定量時相同，從標準試料與檢體獲得DNA溶出液，並基於定量PCR法進行基因擴增，且進行獲得之擴增片段的定量。接著，比較PCR反應的各Ct值(或是由此而得之各換算值)，並決定被含於檢體中之TREC及/或KREC的量，是否多於標準試料中的量。換言之，標準試料係可作為基準值(門檻值)提示用的試料使用。
(TREC及/或KREC之定量結果的利用) 檢體中之TREC及/或KREC的定量結果，係能夠被利用作為判斷來自此檢體之人或人以外的哺乳動物中，是否具有T細胞及/或B細胞之異常新生的可能性的指標。舉例來說，在濃度基準(Base)的比較中，與特定之基準值(門檻值)相比，若檢體中TREC的定量結果較低，則判斷具有T細胞的異常新生之可能性。同樣地，在濃度基準的比較中，與特定之基準值(門檻值)相比，若檢體中KREC的定量結果較低，則判斷具有B細胞的異常新生之可能性。此處，特定之基準值(門檻值)係指，例如70複製(TREC)/ul(血液)以下的值，50複製(TREC)/ul(血液)以下的值，40複製(TREC)/ul(血液)以下的值，或10複製(TREC)/ul(血液)以下的值。特定之基準值(門檻值)係指，70複製(KREC)/ul(血液)以下的值，50複製(KREC)/ul(血液)以下的值，40複製(KREC)/ul(血液)以下的值，或10複製(KREC)/ul(血液)以下的值
在本發明的一態樣中，在人或人以外的哺乳動物，具有T細胞及/或B細胞之異常新生的可能性時，能夠判斷此些人等個體，是否罹患T細胞及/或B細胞之異常新生所伴隨的原發性免疫缺乏症，或者能夠判斷原發性免疫缺乏症的罹患可能性。又，T細胞及/或B細胞之異常新生所伴隨之原發性免疫缺乏症係指，例如腺苷脫氨酶缺乏症、X連鎖型SCID、JAK3缺乏症、RAG缺乏症等嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)；X連鎖性丙種球蛋白血症等抗體產生缺乏症；迪喬治症候群(DiGeorge syndrome)等其他原發性免疫缺乏症等。此等當中，因為SCID係需要早期治療的疾病，故較佳係作為新生兒篩查的對象。
又，若個體被判斷為罹患上述原發性免疫缺乏症或具有罹患可能性，則可因應必要，在接受醫師(個體為人的情形)或獸醫師(個體為哺乳動物的情形)的診斷後，因應原發性免疫缺乏症的種類，而接受治療。舉例來說，在SCID的情況下，目前適當的治療方法係在早期(最遲在1歲)接受造血幹細胞移植；而在X連鎖性丙種球蛋白血症的情況下，目前適當的治療方法係給予免疫球蛋白製劑等。
[3. TREC及/或KREC的定量試劑盒] 本發明一實施形態的定量試劑盒係藉由包含：1)上述粒子；或，2)上述標準試料而成者。此定量試劑盒較佳係藉由包含：3)用於將被含於粒子之TREC核酸片段進行基因擴增的引子(特別是PCR引子試劑盒)；4)用於將被含於粒子之KREC核酸片段進行基因擴增的引子(特別是PCR引子試劑盒)；5)針對被含於粒子之TREC核酸片段的探針；及，6)針對被含於粒子之KREC核酸片段的探針，所組成之群中至少任一者而成者。5)及6)係可各自為使用3)及4)所獲得之擴增片段的探針。因此，試劑盒的較佳態樣係，3)與5)成為一個組合，且4)與6)成為一個組合，而被含於試劑盒中。
又，因應必要，試劑盒係還可包含以下之至少任一者：7)用於使血液浸漬並收集血液的纖維體；8)沖壓纖維體的沖頭；9)用於PCR等基因擴增的各種試藥及器具(聚合酶、PCR緩衝液、各dNTP、移液管等)；10)用於調製供給至基因擴增之含有DNA試料的各種試藥及器具(試驗管、緩衝液等)；11)用於解析基因擴增片段之各種試藥及器具(電泳凝膠材料、移液管等)；12)試劑盒的使用說明書；13)用於將被含於上述粒子母體之內在性參考基因進行基因增幅的引子；及14)針對參考基因的探針等。
此定量試劑盒係用於檢體中TREC及/或KREC的定量。此定量試劑盒係用於判斷來自此檢體之人或人以外的哺乳動物中，是否具有伴隨著T細胞及/或B細胞之異常新生而罹患原發性免疫缺乏症，或者，判斷罹患原發性免疫缺乏症的可能性。此定量試劑盒係用於新生兒篩查，判斷人類新生兒是否罹患SCID或者具有罹患SCID的可能性。 [4.總結] 由上述可知，本發明係例如包含以下事項。 1)一種粒子，其特徵在於：含有訊息接合部份之T淋巴球受體切除環(TREC, T-cell Receptor Excision Circles)的核酸片段、及含有訊息接合部份之Kappa刪除受體切除環(KREC, Kappa-deleting Receptor Excision Circles)的核酸片段，其中的至少任一者被導入細胞內或脂質體內。 2)如1)所述之粒子，其中，含有訊息接合部份之TREC的上述核酸片段及含有訊息接合部份之KREC的上述核酸片段係皆被導入。 3)如1)或2)所述之粒子，其中，上述核酸片段皆在400bp以上且600bp以下的範圍內，且從該核酸片段的兩端部至上述訊息接合部份係至少距離80bp以上。 4)如1)~3)中任一者所述之粒子，其中，上述核酸片段被導入至上述細胞。 5)如4)所述之粒子，其中，上述細胞不包含內在性的TREC及KREC。 6)如1)~5)中任一者所述之粒子，其中，含有特定個數的上述核酸片段。 7)一種標準試料，其特徵在於：其係一種液體，以特定的濃度(粒子的個數/液體的體積)含有如1)~6)中任一者所述之粒子；或者，其係將該液體浸漬於纖維體而成者。 8)如7)所述之標準試料，其中，上述液體係藉由包含紅血球及血漿的至少任一者而成者。 9)如7)或8)所述之標準試料，其中，具有複數個由將上述液體浸漬於上述纖維體所形成的斑點，且在該斑點間，上述粒子的濃度不同。 10)一種試劑盒，其係由包含如上述1)~6)中任一者所述之粒子或如7)~9)中任一者所述之標準試料而成者。 11)如10)所述之試劑盒，其係藉由包含選自：用於將TREC的上述核酸片段進行基因擴增的引子、用於將KREC的上述核酸片段進行基因擴增的引子、針對TREC的上述核酸片段的探針、針對KREC的上述核酸片段的探針，所組成之群中至少任一者而成者。 12)一種方法，其係藉由使用基因擴增法，來評估被含於血液檢體中TREC或KREC至少任一者的量之方法，其特徵在於：將如7)~9)中任一者所述之標準試料，作為對照試料或檢量線作成用試料，來使用。 13)如12)所述之方法，其中，上述血液檢體係新生兒的濾紙血檢體。 14)如13)所述之方法，其中，基於使用如上述13)所述之方法進行評估TREC或KREC至少任一者的量之結果，來評估上述新生兒罹患嚴重複合型免疫缺乏症(SCID, severe combined immunodeficiency)的可能性。 15) 一種核酸構建體，其係包含：具有訊息接合部份之TREC的核酸片段、及具有訊息接合部份之KREC的核酸片段，其中的至少任一者(但是，並不包含TREC的全長及KREC的全長)。
[實施例] 針對本發明一實施例進行說明，如下所述。
[實施例1] ＜K562-TREC、K562-KREC、K562-TREC-KREC的製作＞ 1. 序列的擴增與質體的製作 1-1. TREC500與KREC500的序列識別 使用QIAGEN DNeasy血液與組織試劑盒(blood and tissue kit)或QIAmp DNA血液迷你試劑盒，從6個人(0歲到成人)的血液中，提取基因組檢體，並藉由使用PCR方法，獲得包含作為TREC(T-cell Receptor Excision Circles)結合部份之δRec-ΨJα及其周圍部位的DNA片段。使用DNA測序儀，解析獲得之DNA片段的鹼基序列。具體而言，從數據庫中，設計了來自δRec-ΨJα之約300bp的上游及下游引子，且使用此引子擴增約550bp，並通過Sanger序列來確認序列。使用ATGC序列組裝軟體(Genetics)，比較此等DNA片段的各鹼基序列，並識別去除來自鹼基插入與缺失所造之基因突變之具有個體間差異的區域之結合部的共有序列。又，識別了總共約500bp的鹼基序列，其範圍從結合部的共有序列之正中間到其左右的約250bp為止，並將其用作TREC500序列。將TREC500序列顯示於序列編號1。以下，亦將TREC500序列所顯示之DNA稱作TREC500。
使用QIAGEN DNeasy血液與組織試劑盒或QIAmp DNA血液迷你試劑盒，從6個人(0歲到成人)的血液中，提取基因組檢體，並藉由使用PCR方法，獲得包含作為KREC(Kappa-deleting Receptor Excision Circles)結合部份之intron RSS-κde signal joint及其周圍部位的DNA片段。使用DNA測序儀，解析獲得之DNA片段的鹼基序列。具體而言，從數據庫中，設計了來自intron RSS-κde signal joint之約300bp的上游及下游引子，且使用此引子擴增約550bp，並通過Sanger序列來確認序列。使用ATGC序列組裝軟體(Genetics)，比較此等DNA片段的各鹼基序列，並識別去除來自鹼基插入與缺失所造之基因突變之具有個體間差異的區域之結合部的共有序列。又，識別了總共約500bp的鹼基序列，其範圍從結合部的共有序列之正中間到其左右的約250bp為止，並將其用作KREC500序列。將KREC500序列的鹼基序列資訊顯示於序列編號2。以下，亦將KREC500序列所顯示之DNA稱作KREC500。
1-2. 質體的製作 使用DNA合成機，合成TREC500序列與KREC500序列的寡核苷酸。藉由TA選殖(TA cloning)將每個寡核苷酸摻入不同的pCR2.1載體(Invitrogen)中，並將獲得之質體分別命名為pCR-TREC500和pCR-KREC500。接著，藉由使用限制酶EcoRI，從這些質體中切下含有TREC500的DNA片段及含有KREC500的DNA片段，並插入不同的pcDNA 3.1質體(Invitrogen)的多選殖位點(multiple cloning site)的EcoRI識別部位。此外，為了不引起插入之DNA片段的轉錄，使用Bgl II及BamHI，刪除pcDNA3.1質體的CMV啟動子序列，並將獲得之質體各自命名為pTREC500和pKREC500。
接著，在pTREC500中，藉由將含有KREC500的DNA片段摻入pcDNA 3.1質體之多選殖位點的NotI識別位點，製作含有TREC500及KREC500的質體pTREC-KREC。又，藉由使用限制酶BamHI及NotI，從pCR-KREC500切除，進而調製含有KREC500的DNA片段。
2. 基因導入細胞的製作 2-1. 基因導入 針對源自脊髓白血病的細胞株K562，藉由電穿孔(Biorad Gene pulsar)，各自進行pTREC500、pKREC500及pTREC-KREC的基因導入。
於基因導入3日後，針對各細胞群，進行使用新黴素(neomycin)的篩選。接著，針對具有新黴素耐性的細胞群，進行單細胞選殖，且藉由螢光原位雜交(FISH, fluorescent in situ hybridization)法，篩選TREC500及/或KREC500係一複製的殖株。
2-2. 複製數的確認 使用QIAGEN DNeasy血液與組織試劑盒(QIAGEN公司)，針對從細胞群所各自選出的殖株，進行基因組DNA提取。為了確認TREC500及KREC500的複製數，使用每個細胞中所含有之兩個複製的RNaseP及RPP30(核糖核酸酶(Ribonuclease)P/MRP亞基(Subunit)P30)的引子與探針，進行液滴數字PCR。從液滴數字PCR的結果來看，在被選出之殖株中，確認到TREC500/RPP30的比率及KREC500/RPP30的比率係皆為0.5，且RNaseP/RPP30的比率係1。
將如以上般所製作之針對細胞株K562含有一複製的TREC500之細胞，稱為K562-TREC500。同樣地，針對細胞株K562含有一複製的KREC500之細胞，稱為K562-KREC500，針對細胞株K562各含有一複製的TREC500及KREC500之細胞，稱為K562-TREC-KREC。
＜濾紙血的製作＞ 1.檢量線作成用之濾紙血的製作 將新鮮冷凍血漿混合至紅血球濃厚液，調製血細胞比容值為62％的紅血球液。接著，將K562-TREC500、K562-KREC500及K562-TREC-KREC，混合至不同的紅血球液，且以使其成為特定細胞濃度(0、10、20、50、100、200、500、1000及10000個檢量線作成用之濾紙血，共9種)的方式，獲得紅血球-細胞混合液。以每次50μl的方式，將紅血球-細胞混合液滴在濾紙(型號：09800010‧Advantec 東洋股份有限公司)上，並在室溫下乾燥。在此9種細胞濃度下，將含有各細胞之共9個斑點作為一個組合，並製作針對各細胞的檢量線作成用之濾紙血。
2.對照濾紙血的製作 考量到0個月嬰兒的白血球數量下限係5000個/μl，調製以下(A)及(B)所示之紅血球-細胞混合液。又，混合細胞前的紅血球液係以與上述「1. 檢量線作成用之濾紙血的製作」中所說明過之相同方法，進行調製。
(A)陽性對照 以5000個/μl的細胞濃度，包含僅有作為紅血球以外的細胞之細胞株K562的紅血球-細胞混合液(無法檢測出TREC及KREC)。
(B)陰性對照 以細胞株K562與來自該細胞株之細胞的總數為5000個/μl的細胞濃度，調製以下所示之3種的紅血球-細胞混合液。 包含作為紅血球以外的細胞之200個/μl的K562-TREC500、與4800個/μl的細胞株K562之紅血球-細胞混合液(陰性對照1)； 包含作為紅血球以外的細胞之200個/μl的K562-KREC500、與4800個/μl的細胞株K562之紅血球-細胞混合液(陰性對照2)； 包含作為紅血球以外的細胞之200個/μl的K562-TREC-KREC、與4800個/μl的細胞株K562之紅血球-細胞混合液(陰性對照3)。
接著，以每次50μl的方式，將紅血球-細胞混合液滴在濾紙(型號：09800010‧Advantec 東洋股份有限公司)上，並在室溫下乾燥。將陽性對照的斑點與陰性對照1~3中任一者的斑點作為一個組合，並製作針對各細胞(K562-TREC500、K562-KREC500或K562-TREC-KREC)的對照濾紙血。
3.新生兒濾紙血的製作 除了早產兒及未成熟兒之外，在國家兒童健康與發育研究中心，針對出生的約22名新生兒，經代理人書面同意，用針等在腳後跟施加輕微傷痕，以使血液直接從毛細血管被吸入濾紙(型號：09800010‧Advantec 東洋股份有限公司)的方式，進行採血。在室溫下進行乾燥，且針對各新生兒製作新生兒濾紙血。一般而言，一個斑點係含有50μL左右的血液。
＜Ct值的測定與TREC及KREC濃度的算出＞ 使用3.2mm的沖頭，針對一個組合的檢量線作成用濾紙血、一個組合的對照濾紙血及新生兒濾紙血，每個斑點沖出一個沖頭片，將每一個沖頭片放入96孔板(96-well plate)的每個孔中。又，針對每個板，準備檢量線作成用濾紙血及對照濾紙血的組合。
1. 洗淨 於各孔添加淨化溶液(purification solution)(QIAGEN公司)80μl，並將孔板以2125✕g進行離心分離30秒。將此孔板在室溫下靜置10分鐘，並在以25℃、3500rpm進行離心分離5分鐘後，儘可能地捨棄上清液。於各孔添加淨化溶液80μl，並將孔板以25℃、3500rpm進行離心分離30秒。將此孔板在室溫下靜置10分鐘，並在以25℃、3500rpm進行離心分離5分鐘後，儘可能地捨棄上清液。於各孔添加超純水(Mili Q water)80μl，並將孔板以25℃、3500rpm進行離心分離30秒後，儘可能地捨棄上清液。
2. 溶出 於經過上述洗淨步驟之孔板的各孔，加入了添加有10μg/ml濃度的yeast　tRNA(invitrogen公司)之洗脫液(elution solution)(QIAGEN公司)20μl。於此孔板施加密封，並使用熱循環儀(Thermal cycler)，在99℃下，進行30分鐘的溶出操作。將孔板冷卻至室溫，並以渦旋混合器攪拌後，以25℃、3500rpm進行離心分離30秒。 將各孔中所獲得之DNA溶出液(20μl)個別地移至試管(Tube)。
3. 定量PRC反應 使用獲得之各DNA溶出液20μl中的2μl(相當於表1中的模板(Template)DNA)，且使用LightCycler(登錄商標)480II(Roche公司)，進行定量PCR反應。定量PCR反應之反應液的組成(每1孔)係如表1所示，以雙重重複試驗(duplicate)進行定量PCR反應。引子及探針的序列係如以下所示。
=TREC引子及探針的序列= ･TREC Fw引子：CCATGCTGACACCTCTGGTT(序列編號3) ･TREC Rv引子：TCGTGAGAACGGTGAATGAAG(序列編號4) ･TREC探針：5’-FAM-CACGGTGATGCATAGGCACCTGC-MGB-3’(序列編號5) =KREC引子及探針的序列= ･KREC Fw引子：TCAGCGCCCATTACGTTCT(序列編號6) ･KREC Rv引子：GTGAGGGACACGCAGCC(序列編號7) ･KREC探針：5’-FAM-CCAGCTCTTACCCTAGAG-MGB-3’(序列編號8)
[表1] 表1：TREC及KREC檢測用的反應液之組成(包含TREC引子/探針的組合或KREC引子/探針的組合，其中的至少任一者) 首先，定量PCR反應係在95℃且5分鐘的條件下，進行1循環的初期變性反應。接著，以變性反應(95℃、10秒)、退火反應(60℃、30秒)及延伸反應(72℃、1秒)的順序，重複進行45個循環。從獲得之擴增曲線，算出各DNA溶出液的Ct值。又，就從使用由對照濾血紙所獲得之DNA溶出液，進行定量PCR反應的結果來看，亦能夠確認定量PCR反應是否適當地進行。
4. TREC及KREC濃度的算出 針對每個TREC及KREC，將對應於檢量線作成用濾紙血之各細胞濃度為10至1000個/μl的Ct值，繪製在座標上，並作成檢量線。將各檢量線顯示於圖1、圖2。又，圖1係顯示從下述反應結果所獲得之檢量線者：針對包含K562-TREC500的濾紙血以及由包含K562-TREC-KREC的濾紙血而獲得之DNA溶出液，進行TREC500的定量PCR反應；圖2係顯示從下述反應結果所獲得之檢量線者：針對包含K562-KREC500的濾紙血以及由包含K562-TREC-KREC的濾紙血而獲得之DNA溶出液，進行KREC500的定量PCR反應。在圖1及圖2中，縱軸是Ct值，橫軸係檢量線作成用濾紙血所使用之紅血球-細胞混合液的細胞濃度(個/μl)，且此與該混合液中的TREC濃度或KREC濃度(複製數/μl)同義。橫軸係以對數刻度表示。圖1之檢量線的式子係能夠以y = -1.238ln(X)+41.85表示，圖2之檢量線的式子係能夠以y = -1.211ln(X)+37.186表示。從圖1、2能夠得知，在本實施例中所作成之檢量線係穩定的直線形。
圖3係顯示，針對從22人份之新生兒濾紙血(檢體)所獲得之DNA洗脫液，將以TREC的定量PCR反應所決定之Ct值，於圖1的檢量線上繪製的狀態。縱軸及橫軸的定義係與圖1相同。從圖3能夠發現，雖然22人中，18人的篩查陰性(檢測到TREC)檢體之圖案係以三角形表示，但它們都排列在檢量線上，由此可知檢量線的穩定性。此時，因為4人的檢體係篩查陽性(未檢測到TREC)，未進行PCR的擴增而未獲得Ct值，故未圖示其圖案。又，圖中的篩查陰性檢體中，Ct值為極端低之圖案(以塗黑的三角形表示)，係罹患短暫性淋巴細胞減少症之患者的檢體。
接著，藉由以對照濾紙血所獲得之DNA溶出液的定量PCR反應所決定之Ct值，並根據以下計算式，算出新生兒濾紙血的TREC濃度及KREC濃度。在濾紙血的3.2mm沖頭片含有約3μl的血液，且因為從此血液獲得20μl的DNA溶出液，而成為以下計算式(1)。 ‧新生兒濾紙血的TREC濃度(複製/μl) = 經決定之Ct值在檢量線上對應的TREC濃度(複製/μl)x20/3 ‧新生兒濾紙血的KREC濃度(複製/μl) = 經決定之Ct值在檢量線上對應的KREC濃度(複製/μl)x20/3 [參考例1] 1. 來自新生兒檢體之DNA溶出液的調製 依據實施例1＜濾紙血的製作＞欄中「3. 新生兒濾紙血的製作」的記載，除了早產兒及未成熟兒之外，在國家兒童健康與發育研究中心，針對出生的103名新生兒，製作個人的新生兒濾紙血。接著，依據實施例1＜ Ct值的測定與TREC及KREC濃度的算出＞之欄中「1. 洗淨」及「2. 溶出」的記載，將在孔板之各孔中所獲得之DNA溶出液(20μl)個別地移至試管。
2. 檢量線用標準稀釋系列的製作 作為針對TREC的檢量線用質體，使用藉由實施例1所使用之TREC引子，將來自健康人基因組DNA之進行擴增後的序列，插入pCR2.1而作成的質體(TREC質體)。又，作為針對ACTB(β肌動蛋白)的檢量線用質體，使用藉由(後述之)ACTB引子進行擴增後的序列，插入pCR2.1而作成的質體(ACTB質體)。以使各自的檢量線用質體的濃度成為22ng/μl(5x109 複製/μl)的方式，調製檢量線用質體的原液。接著，將簡單稀釋液(EASY dilution)(Takara Bio公司)作為溶媒使用，在ACTB用中，係製作濃度至5x100 複製/μl為止的10倍稀釋系列；在TREC用中，係製作濃度至5x102 複製/μl為止的10倍稀釋系列，再製作成濃度從5x102 複製/μl至7.82複製/μl為止的2倍稀釋系列。
3. 定量PCR反應 針對TREC之定量PCR反應之反應液的組成(每1孔)係如實施例1中的表1所示，且針對ACTB之定量PCR反應之反應液的組成(每1孔)係如以下的表2所示。作為表1~2中的模板(Template)DNA，使用上述1.所獲得之DNA溶出液(從相同DNA溶出液取得TREC檢測用2μl與ACTB檢測用2μl)、上述2.所獲得之TREC用的檢量線用標準稀釋系列、及ACTB用的檢量線用標準稀釋系列。ACTB用的檢量線用標準稀釋系列係使用5×105 、5×104 、5×103 、5×102 、5×101 、5×100 複製/μl等6個濃度。TREC用的檢量線用標準稀釋系列係使用5×105 、5×104 、5×103 、5×102 複製/μl的10倍稀釋系列，以及濃度從5×102 至7.82複製/μl為止的2倍稀釋系列，共合計10個濃度。又，作為沒有模板的陰性對照(Non-template control(NTC))，使用簡單稀釋液(EASY dilution)來置換表1及表2的模板(Template)DNA者。定量PCR反應係進行雙重重複試驗(duplicate)。
=ACTB引子及探針的序列= ･ACTB Fw引子：ATTTCCCTCTCAGGCATGGA(序列編號9) ･ACTB Rv引子：CGTCACACTTCATGATGGAGTTG(序列編號10) ･ACTB探針：5’-HEX-GTGGCATCCACGAAACTA-MGB-3’(序列編號11)
[表2] 表2：ACTB檢測用之反應液的組成 在表2中，ACTB引子係Fw引子與Rv引子的等量混合物。 定量PCR反應的其他反應條件係如同實施例1之＜Ct值的測定與TREC及KREC濃度的算出＞欄中「3. 定量PCR反應」的記載。
4. TREC濃度的算出 針對作為溶出對照之ACTB，從檢量線用標準稀釋系列的各複製數及Ct值，作成檢量線。藉由作成之檢量線，算出各DNA溶出液中的ACTB複製數。將複製數為5000複製/μl以上者作為條件，確認到並未引起DNA溶出不良。
因此，針對TREC，根據檢量線用標準的各複製數及Ct值，作成檢量線，並針對各DNA溶出液，算出檢量線上的TREC濃度(複製/μl)。又，依照實施例1的計算式(1)，亦能夠算出新生兒濾紙血的TREC濃度(複製/μl)。
[參考例2] 1.來自新生兒檢體之DNA溶出液的調製 與參考例1之「1. 來自新生兒檢體之DNA溶出液的調製」欄所記載者相同，獲得來自新生兒濾紙血的DNA溶出液(20μl)。又，參考例1與參考例2係使用相同的新生兒檢體。
2. 檢量線用標準稀釋系列的製作 作為針對ACTB(β肌動蛋白)的檢量線用質體，使用藉由(後述之)ACTB引子，將來自健康人基因組DNA之進行擴增後的序列，插入pCR2.1而作成的質體(ACTB質體)。以使檢量線用質體的濃度成為22ng/μl(5x109 複製/μl)的方式，調製檢量線用質體的原液。接著，將簡單稀釋液(EASY dilution)(Takara Bio公司)作為溶媒使用，製作10倍稀釋系列。
又，為了作成針對TREC之檢量線，使用附屬於LightMix(註冊商標)Modular Kit之TREC(Roche公司)的陽性對照(Positive Control)(200複製/μl)，製作6個濃度(200、100、50、25、12.5、6.25複製/μl)的2倍稀釋系列。
3. 定量PCR反應 針對TREC之定量PCR反應之反應液的組成(每1孔)係如表3所示，且針對ACTB之定量PCR反應之反應液的組成(每1孔)係如以下的表4所示。作為表3~4中的模板DNA，使用上述1.所獲得之DNA溶出液(從相同DNA溶出液取得TREC檢測用1μl與ACTB檢測用1μl)，上述2.所獲得之TREC用的檢量線用標準稀釋系列及ACTB用的檢量線用標準稀釋系列。TREC用的檢量線用標準稀釋系列係使用200、100、50、25、12.5、6.25複製/μl等6個濃度。ATCB用的檢量線用標準稀釋系列係使用5×105 、5×104 、5×103 、5×102 、5×101 、5×100 、5×10-1 複製/μl等7個濃度。又，作為沒有模板的陰性對照(NTC)，使用簡單稀釋液(EASY dilution)來置換表3及表4的模板(Template)DNA者。定量PCR反應係進行雙重重複試驗(duplicate)。
=TREC引子及探針的序列= 使用LightMix(註冊商標)Modular Kit之TREC所內附之物
=ACTB引子及探針的序列= 使用與參考例1相同之ACTB Fw引子、ACTB Rv引子及ACTB探針的組合。
[表3] 表3：ACTB檢測用之反應液的組成(每1孔的分量是一半的量)
[表4] 表4：TREC檢測用之反應液的組成(每1孔的分量是一半的量)
接著，使用ABI7500(Applied Biosystems公司)進行定量PCR反應。首先，在63℃下進行逆轉錄反應1循環，且在95℃下進行初期變性反應1循環。接著，以變性反應(95℃)、退火反應(60℃)及延伸反應(72℃)的順序，重複進行45個循環。從獲得之擴增曲線，算出各反應溶液的Ct值。
4. TREC濃度的算出 依照參考例1之「4. TREC濃度的算出」所載的方法，獲得本參考例的檢量線，並算出新生兒濾紙血的TREC濃度(複製/μl)。
5. 參考例1與參考例2結果的比較 以不同方法，針對相同檢體進行TREC值之測定的結果，發現即使使用相同檢體，換算值(新生兒濾紙血的TREC濃度(複製/μl))亦有很大的不同。具體而言，相較於參考例1的換算值，參考例2的換算值係明顯具有變小的傾向。另一方面，若比較用於求得此換算值的Ct值，則能夠發現，相較於參考例1的Ct值，參考例2的Ct值係具有明顯變小之看似矛盾的趨勢。由此可知，在兩個方法中，具有因為檢量線的差異而產生換算值的差異之情形，更具體而言，若在相同座標上，繪製於參考例1及2所獲得之檢量線，則相較於參考例1，參考例2的檢量線係具有位於離原點更近的位置之可能性；換言之，其係被認為，參考例2中所獲得之擴增曲線的上升速度，係較參考例1快。
6. 實施例1與參考例1之結果的比較 比較實施例1的檢量線與參考例1的檢量線。將結果顯示於圖4。塗黑之圓圈係實施例1的結果，中空的四角形係參考例1的結果。又，雖然圖中的人造濾紙血之圖形係與圖1的檢量線相同，但為了與參考例1的結果進行比較，橫軸的細胞濃度(TREC濃度)係根據下式，從每個紅血球-細胞混合液的值(圖1的值)，換算為每個人造濾紙血的值(圖4的值。但表示為對數(log)值)。
人造濾紙血中的濃度(複製/μl) = 紅血球-細胞混合液的濃度(/μl)x3/20
[產業利用性] 本發明係能夠用於評估新生兒罹患嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)的可能性。
無
［圖1］係顯示從進行TREC500的定量PCR反應之結果所獲得之檢量線。 ［圖2］係顯示從進行KREC500的定量PCR反應之結果所獲得之檢量線。 ［圖3］係顯示將以TRCE的定量PCR反應所決定之Ct值，繪製於圖1的檢量線之狀態。 ［圖4］係顯示實施例1的檢量線及參考例1的檢量線。

Claims (16)

  1. 一種粒子，其特徵在於： 含有訊息接合部份之T淋巴球受體切除環(TREC, T-cell Receptor Excision Circles)的核酸片段、及含有訊息接合部份之Kappa刪除受體切除環(KREC, Kappa-deleting Receptor Excision Circles)的核酸片段，其中的至少任一者被導入細胞內或脂質體內。
  2. 如請求項1所述之粒子，其中，含有訊息接合部份之TREC的上述核酸片段及含有訊息接合部份之KREC的上述核酸片段係皆被導入。
  3. 如請求項1所述之粒子，其中，上述核酸片段皆在400bp以上且600bp以下的範圍內，且從上述核酸片段的兩端部至上述訊息接合部份係至少距離80bp以上。
  4. 如請求項2所述之粒子，其中，上述核酸片段皆在400bp以上且600bp以下的範圍內，且從上述核酸片段的兩端部至上述訊息接合部份係至少距離80bp以上。
  5. 如請求項1~4中任一項所述之粒子，其中，上述核酸片段被導入至上述細胞。
  6. 如請求項5所述之粒子，其中，上述細胞不包含內在性的TREC及KREC。
  7. 如請求項1~4中任一項所述之粒子，其中，含有特定個數的上述核酸片段。
  8. 一種試料，其特徵在於： 其係一種液體，以特定的濃度(粒子的個數/液體的體積)含有如請求項1~4中任一項所述之粒子；或者，其係將該液體浸漬於纖維體而成者。
  9. 如請求項8所述之試料，其中，上述液體係包含紅血球及血漿的至少任一者而成者。
  10. 如請求項8所述之試料，其中，具有複數個由將上述液體浸漬於上述纖維體所形成的斑點，且在該斑點間，上述粒子的濃度不同。
  11. 一種試劑盒，其係由包含如請求項1~4任一項所述之粒子或如請求項8所述之試料而成者。
  12. 如請求項11所述之試劑盒，其係藉由包含選自：用於將TREC的上述核酸片段進行基因擴增的引子、用於將KREC的上述核酸片段進行基因擴增的引子、針對TREC的上述核酸片段的探針、針對KREC的上述核酸片段的探針，所組成之群中至少任一者而成者。
  13. 一種方法，其係藉由使用基因擴增法，來評估被含於血液檢體中TREC或KREC至少任一者的量之方法，其特徵在於：將如請求項8所述之試料，作為對照試料或檢量線作成用試料，來使用。
  14. 如請求項13所述之方法，其中，上述血液檢體係新生兒的濾紙血檢體。
  15. 如請求項14所述之方法，其中，基於使用如請求項14所述之方法進行評估TREC或KREC至少任一者的量之結果，來評估上述新生兒罹患嚴重複合型免疫缺乏症(SCID, severe combined immunodeficiency)的可能性。
  16. 一種核酸構建體，其係包含：具有訊息接合部份之TREC的核酸片段、及具有訊息接合部份之KREC的核酸片段，其中的至少任一者(但是，並不包含TREC的全長及KREC的全長)。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110408713A (zh) * 2019-05-16 2019-11-05 重庆医科大学附属儿童医院 一种检测新生儿trec和krec的试剂盒及方法
CN110468193A (zh) * 2019-08-03 2019-11-19 北京致谱医学检验实验室有限公司 一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒
CN112725439A (zh) * 2021-02-05 2021-04-30 苏州赛福医学检验有限公司 高通量测量方法、引物及组合、试剂盒和样本判断方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6761093B1 (ja) * 2019-09-12 2020-09-23 積水メディカル株式会社 リアルタイムｐｃｒによる核酸検出方法
RU2756979C2 (ru) * 2019-12-17 2021-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов
CN115449549B (zh) * 2022-10-27 2023-12-26 上海捷易生物科技有限公司 一种用于新生儿免疫缺陷病筛查的试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7803397B2 (en) * 2003-09-15 2010-09-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
AU2005306075A1 (en) * 2004-11-19 2006-05-26 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions for local administration
JP2006167521A (ja) * 2004-12-13 2006-06-29 Hokkaido Univ Ｓｕｖ型リポソームの膜融合を利用した遺伝子等の新規封入技術

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110408713A (zh) * 2019-05-16 2019-11-05 重庆医科大学附属儿童医院 一种检测新生儿trec和krec的试剂盒及方法
CN110468193A (zh) * 2019-08-03 2019-11-19 北京致谱医学检验实验室有限公司 一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒
CN110468193B (zh) * 2019-08-03 2020-09-25 北京致谱医学检验实验室有限公司 一种用于免疫缺陷病检测的试剂盒
CN112725439A (zh) * 2021-02-05 2021-04-30 苏州赛福医学检验有限公司 高通量测量方法、引物及组合、试剂盒和样本判断方法

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