JPWO2018212247A1 - Egfr変異非小細胞肺がんにおけるegfrチロシンキナーゼ阻害剤の治療奏功性の予測方法 - Google Patents
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Abstract
Description
即ち、本発明は下記のとおりである。
[1]非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
[2]EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、[1]に記載の早期予測方法。
[3]EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T>GまたはEGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失の少なくとも1つを含む、[1]または[2]に記載の早期予測方法。
[4]確認する工程が、配列番号1で表されるプライマーおよび配列番号2で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を増幅することを含む、[3]に記載の早期予測方法。
[5]確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を配列番号8で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、[4]に記載の早期予測方法。
[6]確認する工程が、配列番号3で表されるプライマーおよび配列番号4で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、[3]〜[5]のいずれか1つに記載の早期予測方法。
[7]確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号10で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、[6]に記載の早期予測方法。
[8]確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の早期予測方法。
[9]EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の早期予測方法。
[10]EGFR阻害薬がアファチニブである、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の早期予測方法。
[11]EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
[12]EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、[11]に記載の早期予測用キット。
[13]EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T>GまたはEGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失の少なくとも1つである、[11]または[12]に記載の早期予測用キット。
[14]EGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号1で表されるプライマーおよび配列番号2で表されるプライマーからなるプライマーセットである、[13]に記載の早期予測用キット。
[15]配列番号8で表される標識されたプローブをさらに含む、[14]に記載の早期予測用キット。
[16]EGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号3で表されるプライマーおよび配列番号4で表されるプライマーからなるプライマーセットである、[13]〜[15]のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
[17]配列番号10で表される標識されたプローブをさらに含む、[16]に記載の早期予測用キット。
[18]EGFR阻害薬がアファチニブである、[11]〜[17]のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
試料回収
全被験者からBD BiosciencesのVacutainer EDTA採血管に全血を採取した。該血液を4℃で10分間、1500×gで遠心分離し、血漿上清(2〜3.5 mL)を50mLコニカルチューブ(BD Falcon)に移し、使用まで-80℃で保存した。血漿DNAを製造元の指示に従い、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、単離した。血漿DNAをAVEバッファー(45 μL)に溶解した。血漿DNA約20μLをSpeedVac (Thermo Scientific)によって約10μLに濃縮した。
3つの共通EGFR変異および対応する各野生型配列を同定するためにマルチプレックスアッセイを開発した。簡潔には、TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0μLを10μMのフォワードおよびリバースプライマー2.0μL、4μM FAMおよびTET標識プローブ2.0μL、Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0μL、DNaseおよびRNase不含滅菌水4.0μLを含むアッセイ試薬と混合した。最終反応量は患者由来の血漿DNA試料8μLを含む40μLだった。プライマー、プローブおよびクエンチャーの配列を、その濃度とともに表2および表3に示す。
液滴イベントデータを製造元の指示に従いRainDrop Analystソフトウェア(RainDance Technologies)で解析した。簡潔には、試料データを液滴サイズゲートテンプレート(RainDance Technologies)でロードした。ポジティブコントロール試料由来のデータを用いて、RainDrop Analystソフトウェア内に補正マトリクスを作成した。補正マトリクスを各試料由来のデータに適用し、TETおよびFAM蛍光分子からのクロストーク蛍光シグナルを除いた。ポジティブコントロールにおける野生型または変異型クラスターを含むエリアの手動選別によって野生型および変異型ゲートのサイズと位置を決定した。
各未知試料については、PCR陽性液滴イベントの数を各ゲート内でカウントした。各ゲート内のイベントの数を未処理液滴の総数を用いて、アッセイごとのイベントの数に変換した。臨床試料を解析する場合、組織試料におけるEGFR変異ステータスの結果を、血漿試料中のEGFR変異ステータスの結果が表れるまで隠した。
本実施例では55名の患者を検証した(図3)。アファチニブの有効性は以前の報告と同程度であった(全寛解率:78.6%、無増悪期間中央値(mPFS):14.2ヶ月)。投与開始時において、患者の62.5%(35/56)において血漿中のEGFR変異が陽性であった。血漿中のEGFR変異陽性患者は、陰性患者よりもわずかに短いPFSを有したが、有意ではなかった(p = 0.24, log-rank)(図4)。投与開始時において血漿中のEGFR変異が陽性であった患者のうち、60.6%が2週間で、87.5%が4週間でそれぞれCMRに達した(図5)。2週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、2週間でCMRとなった患者は、2週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 7.5ヶ月, p = 0.0001)。4週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、4週間でCMRとなった患者もまた、4週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 5.1ヶ月, p < 0.0001)。4週間までにCMRとなった患者のうち、CMRに達するまでの時間はPFSに影響を与えなかった(p = 0.59)。
本出願は、米国仮特許出願番号62/507,010を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (18)
- 非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
- EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、請求項1に記載の早期予測方法。
- EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T>GまたはEGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失の少なくとも1つを含む、請求項1または2に記載の早期予測方法。
- 確認する工程が、配列番号1で表されるプライマーおよび配列番号2で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を増幅することを含む、請求項3に記載の早期予測方法。
- 確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を配列番号8で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項4に記載の早期予測方法。
- 確認する工程が、配列番号3で表されるプライマーおよび配列番号4で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、請求項3〜5のいずれか1項に記載の早期予測方法。
- 確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号10で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項6に記載の早期予測方法。
- 確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の早期予測方法。
- EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の早期予測方法。
- EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の早期予測方法。
- EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
- EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、請求項11に記載の早期予測用キット。
- EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T>GまたはEGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失の少なくとも1つである、請求項11または12に記載の早期予測用キット。
- EGFR遺伝子のc.2573T>Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号1で表されるプライマーおよび配列番号2で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項13に記載の早期予測用キット。
- 配列番号8で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項14に記載の早期予測用キット。
- EGFR遺伝子の19番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号3で表されるプライマーおよび配列番号4で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項13〜15のいずれか1項に記載の早期予測用キット。
- 配列番号10で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項16に記載の早期予測用キット。
- EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項11〜17のいずれか1項に記載の早期予測用キット。
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