KR20070116567A - 위 암종으로부터의 림프절 전이의 검출법 - Google Patents

Abstract

위 암종으로부터의 림프절 전이를 진단하고, 음성 림프절과 위 암종으로부터의 전이를 갖는 림프절을 구별하고, 위 암종 시기를 결정하기 위해 조직 샘플을 시험하기 위한 방법, 조성물 및 제품에 관한 것이다.

위 암종, 림프절 전이

Description

위 암종으로부터의 림프절 전이의 검출법{Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma}

전세계적으로 매해 약 876,000건의 신규 위암이 발생한다[참조: Shibuya, Mathers et al. 2002]. 미국에서, 2005년에 신규 위암 건수 및 위암 사망은 각각 21,860건 및 11,550건으로 추산된다[참조: Jemal, Murray et al. 2005]. 위 암종은 위암의 가장 흔한 유형(90% 내지 95%)이며, 이는 순위상 림프종, 유암종 및 중간엽 방추형 세포 종양(mesenchymal spindle cell tumor)의 발생율 다음이다[참조: Kumar, Cotran et al. 2003].

완전한 국소적 지역적 조절은 위암 환자의 생존을 위한 주요 치료법으로서, 전체적 또는 부분적 위절제술, 전초림프절(sentinel lymph node) 절제술, 확장된 림프절 절제술 및 전이에 의해 영향을 받은 인근 조직의 절제술, 예를 들면, 비장절제술 및 췌장절제술을 포함한다[참조: Hartgrink and van de Velde 2005; Kitagawa, Fujii et al. 2005]. 근치적 수술 후 재발로 고생하는 모든 환자 가운데, 최대 87.5%는 국소 재발 또는 잔존된 지역적 림프절 전이에 의해 유발된다[참 조: Songun, Bonenkamp et al. 1996].

위식도접합부(GEJ) 암종을 갖는 148명의 환자를 포함한 연구에서, 국소 림프절내 미세 전이의 존재가 불량한 예후의 주요 지표인 것으로 결론이 내려졌다[참조: Heeren, Kelder et al. 2005]. 현재 통상적으로 사용되는, 위암으로부터 림프절 전이의 시기결정법/진단법은 촉진 및 수술중 동결된 절편 검사에 의해 달성된다. 림프절의 동결된 절편 검사는 74%의 민감성을 나타낼 수 있다[참조: Kitagawa, Fujii et al. 2005].

적절한 유전자 마커를 이용하여, 유전자 발현 분석 및 검출 기술, 예를 들면, RT-PCR 또는 정량적 PCR은 위암의 대안적 진단 또는 예후 방법을 제공할 수 있다. 이들 방법은 전이 검출 시험에 대해 보다 우수한 민감성 및 정확성을 제공할 수 있다는 가능성을 갖고 있다. 이미 보고된 유전자 마커에는 CK19[참조: Matsuda, Kitagawa et al. 2004], 암배아 항원(CEA), 사이토케라틴-20(CK-20) 및 MAGE-3[참조: Okada, Fujiwara et al. 2001], CK18, MUC1, hTRT[참조: Ajisaka and Miwa 2003]가 포함된다. 불행히도, 공개된 데이타는 이러한 유전자 마커 대부분이 시험된 모든 종양 조직 및 종양 세포주에서 일관되게 발현되지 않음을 보여준다. 마커는, 조직학적 검사로 확인된 위암으로부터의 전이를 갖는 림프절의 15%(CEA) 내지 70% 이상(MAGE-3)에서 RT-PCR에 의해 검출될 수 없었다[참조: Okada, Fujiwara et al. 2001]. CK20은 췌장, 결장, 위 및 폐 암종으로부터 전이된 혈중 암세포에 대한 RT-PCR 시험을 위한 마커로서 사용되었다[참조: Chausovsky, Luchansky et al. 1999; Chen, Chen et al. 2004].

본원에서는, 위 암종으로부터의 전이를 갖는 림프절에서 용이하게 검출가능한 수준으로 일관되게 발현되어 정상 림프절에서의 배경 발현과 구별될 수 있는 마커의 배합물을 동정한다. 이러한 마커의 배합물은 위 암종 또는 유사한 세포 기원의 암종, 예를 들면, 식도, 췌장 및 장의 암종으로부터 전이된 암종 세포를 검출하는데 유용하다.

본 발명의 한 측면에서, 위 암종으로부터의 림프절 전이를 검출하기 위해 한 세트의 마커가 배합되어 사용된다. 위 암종으로부터의 전이를 갖는 림프절에서, 이들 유전자 마커의 발현 수준은 정상 림프절의 수준보다 명백하게 높다. 마커의 배합물은 CK19, CEA 및 MUC-2 마커이다.

본 발명의 다른 측면에서, 위 암종로부터의 림프절 전이를 검출하는 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 마커 그룹으로부터 선택된 유전자의 발현 수준을 측정함을 포함하며, 여기서 미리 결정된 컷-오프(cut-off) 수준을 초과하는 유전자 발현 수준은 위 암종으로부터의 전이의 지표가 된다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 림프절 샘플이다.

본 발명의 다른 측면에서, 마커는 위 암종으로부터의 림프절 전이를 검출하기 위한 검정에서 배합되어 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 마커는 수술중에(intraoperatively) 검정될 수 있다. 수술중 검정은 위로부터 유출되는 림프절로부터 RNA를 제조하는 단계; 하나 이상의 마커에 특이적인 정량적 RT-PCR 방법을 수행하는 단계; 및 마커의 존재가 미리 결정된 컷-오프를 초과하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 본원에 제공된 방법을 수행하기 위한 마이크로어레이 또는 유전자 칩 뿐만 아니라 당해 검정 수행용 키트 및 제품을 포함한다.

본 명세서에 기술되고 청구된 본 발명의 방법, 조성물, 제품 및 키트는 마커의 배합물을 포함한다. "마커"는 본 명세서 전반에 걸쳐서,

(a) 유전자 및 유전자 발현 산물, 예를 들면, mRNA 및 상응하는 cDNA, 펩타이드, 단백질, 단편 및 상기한 것들 각각의 상보체, 및

(b) (a)와의 물리적 또는 화학적 상호작용을 통해서 유전자의 발현 또는 유전자 발현 산물의 존재를 나타내는 프로브, 항체, 리간드, 합텐 및 표지와 같은 조성물을 지칭하기 위해 사용되며, 여기서, 유전자, 유전자 발현 산물 또는 조성물은 서열번호 NM_002276, 서열번호 NM_002457 및 서열번호 M17303과 상응한다.

유전자는 서열번호로 지정된 서열을 함유하는 경우 당해 서열에 상응한다. 유전자 절편 또는 단편은 이러한 유전자의 서열이라고 구별할 수 있을 정도로 충분한, 참조된 서열 또는 이의 상보체의 일부분을 함유하는 경우 이러한 유전자의 서열에 해당한다. 유전자 발현 산물은 이의 RNA, mRNA 또는 cDNA가 이러한 서열을 갖는 조성물(예: 프로브)에 하이브리드화하는 경우 이러한 서열에 상응하며, 유전 자 발현 산물이 펩타이드 또는 단백질인 경우에 이는 mRNA에 의해 암호화된다. 유전자 발현 산물의 절편 또는 단편은 이러한 유전자 또는 유전자 발현 산물의 서열이라고 구별할 수 있을 정도로 충분한, 참조된 유전자 발현 산물 또는 이의 상보체의 일부분을 함유하는 경우, 이러한 유전자 또는 유전자 발현 산물의 서열에 상응한다.

본 발명의 마커는 다음의 세가지 널리 공지된 단백질을 암호화하는 유전자에 상응한다: 암배아 항원(서열번호 M17303), 뮤신 2(서열번호 NM_002457) 및 사이토케라틴 19(서열번호 NM_002276). 개별적으로, 상기 유전자들은 암 마커로서 사용되는 경우, 특히 수술중 사용과 관련하여 검정을 만족스럽게 수행할 수 없었다. 그러나, 본 실시예에서 나타난 바와 같이, 배합될 경우에 당해 마커는 위 암종 전이를 측정하는 민감하고 특이적인 시험을 제공한다. 검정의 잘못된 수행으로 인해 음성 결과가 발생하지 않음을 보장하기 위해 일반적으로 대조군 또한 검정된다. PBGD(서열번호 NM_000190)과 같은 구성적으로(constitutively) 발현되는 유전자는 이러한 점에서 유용하고, 이들을 검정하기 위한 시약은 바람직하게는 키트 성분내에 포함된다. PGBD는 특히, 사람의 공지된 유사유전자(pseudogene)를 함유하지 않고, 사람 조직에서 구성적으로 발현되며 비교적 낮은 수준으로 발현되고 이에 따라 관심대상의 표적 서열의 증폭을 억제할 가능성이 적기 때문에 바람직하다.

샘플 제조는 일반적으로 절제된 조직, 바람직하게는 림프절 조직으로 작업함을 포함한다. 조직내 전이 및 미세전이의 분포는 결절 또는 다른 조직에서는 균일하지 않다. 따라서, 전이를 놓치지 않도록 충분히 큰 샘플이 수득되어야 한다. 본 발명의 방법에서 조직을 샘플링하는 한가지 접근법은 거대 조직 샘플을 균질화한 다음, 균질물의 적절한 일부분을 분자적 시험용 RNA를 제조하는데 사용하는 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 샘플은 위로부터 배출되는 림프절로부터의 림프절 샘플이다. RT-PCR 검정용 샘플의 유용한 제조방법은 다음과 같다: Omni 균질화기 및 균질화용 1회용 프로브를 사용한 후에 RNA를 RNeasy(Qiagen) 키트 시약을 이용하여 RNA를 정제한다.

a) 미리 기록하지 않았다면, 샘플 중량을 밀리그램 단위로 측정한다. 새로운 파라핀지 조각을 자체중량이 측정된 저울 위에 놓고 샘플을 칭량한다. 바람직하게는, 림프절 샘플은 30mg을 초과한다.

b) 새로운 메스를 이용하여, 상기 림프절로부터의 모든 조직을 직경이 약 4mm인 조각으로 잘게 절단한다. 처리 동안 조직의 오염이 없도록 주의를 기울인다.

c) 균질화(RLT) 완충액을 폴리프로필렌 균질화 튜브에 부가한다. 바람직하게는 조직 100mg당 2mL 균질화 완충액을 사용한다.

d) 깨끗한 핀셋을 이용하여 상기 조직을 균질화 완충액으로 옮긴다.

e) 새로운 균질화 프로브를 수동 균질화기상에 위치시킨다.

f) 각 림프절을 철저히 균질화시킨다.

g) RNA 정제 과정마다 균질화물을 표준 Qiagen 프로토콜로 처리하고, RNA를 사용 전에 -65℃ 이하에서 저장한다.

h) 상기 균질화 프로브를 폐기시킨다.

i) 모든 남은 균질화물을 가능한 이후의 사용을 위해 -65℃ 이하에서 저장한다.

이어서, 진단 검정을 수행할 수 있다. 본 발명의 마커는 위 암종이 림프절로 전이되었는지의 여부와 같은 중요한 임상 정보를 제공하는데 유용하며, 이러한 정보는 위 암종의 임상적 시기결정 및 환자의 진단에 대한 지표가 된다.

종합하면, 이러한 정보는 본 명세서에서 "진단학적 정보"로 지칭된다. 또한, 이러한 진단학적 정보는 치료법을 제공하는데 있어서 성분으로서의 이의 사용을 포함한다. 예를 들면, 이러한 진단학적 정보를 갖고 있는 내과의는 암이 림프절로 전이되었다는 징후에 근거하여 그의 치료법(예: 보조 치료법)을 결정할 수 있다.

본 발명의 마커를 검정하기에 바람직한 방법은 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있는 유전자에 의해 생산되는 mRNA의 양을 측정함을 포함한다. 이는 경쟁적 역전사효소 PCR(RT-PCR), 실시간 RT-PCR, 노던 블롯 분석 또는 유사한 성능을 갖는 기타 시험으로 달성할 수 있다. 또한, 증폭된 상보적 RNA(cRNA)를 mRNA(RNA)로부터 생성시킨 다음, 이를 DNA 마이크로어레이 및 시험 및 분석용 기타 전개성 검정 포맷에 적용하는 것이 바람직하다. 수많은 상이한 어레이 구조 및 이의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있으며 미국 특허 제5,445,934호; 제5,532,128호; 제5,556,752호; 제5,242,974호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,472,672호; 제5,527,681호; 제 5,529,756호; 제5,545,531호; 제5,554,501호; 제5,561,071호; 제5,571,639호; 제5,593,839호; 제5,599,695호; 제5,624,711호; 제5,658,734호; 및 제5,700,637호와 같은 미국 특허에 기술되어 있다. PCR의 결과를 정량하는데 사용되는 가장 널리 채택된 측정법은 Ct(역치 사이클) 결정으로서, Ct는 형광 방출이 고정된 역치를 초과하는 사이클 횟수로서 정의된다. 이는 대부분의 PCR 분석기의 소프트웨어에서 Ct 설정치를 결정하기 위해 알고리듬을 사용하는 널리 공지된 과정에 따라서 용이하게 결정될 수 있다. 이의 예는 바람직한 분석 플랫폼인 SmartCycler PCR 장치(제조원: Cepheid Corporation)에서 구현된다.

마이크로어레이 기술은 여러 유전자의 일정상태의 mRNA 수준을 측정할 수 있게 한다. 이러한 분석법의 결과물은 전형적으로 마이크로어레이 상의 공지된 위치에 있는 핵산 서열에 하이브리드화하는 샘플로부터 제조된 표적 서열을 검출하는데 사용되는 프로브 셋트로부터 수신되는 시그날 강도의 측정치이다. 전형적으로, 시그날 강도는 제조된 표적의 양에 비례하고, 따라서 샘플 세포에서 발현된 mRNA에 비례한다. 이러한 다수의 기법이 이용가능하며 유용하다. 유전자 발현의 바람직한 측정 방법은 미국 특허 제6,271,002호; 제6,218,122호; 제6,218,114호; 및 제6,004,755호에서 찾아볼 수 있다.

유전자의 발현 수준의 분석은 마이크로어레이의 시그날 강도를 비교함으로써 실시할 수 있다. 이는 시험 샘플내 유전자의 발현 강도 대 대조 샘플내 유전자의 발현 강도의 비율 행렬을 생성시킴으써 가장 적절하게 실시된다. 예를 들면, 질병이 걸린 조직으로부터의 유전자 발현 강도를 동일한 유형의 양성 또는 정상 조직으 로부터 생성된 발현 강도와 비교할 수 있다. 이들 발현 강도의 비율은 시험 샘플과 대조 샘플 간의 유전자 발현에서의 배수-변화를 나타낸다. 본 발명은 또한 발현 패턴의 비교를 패턴 인식 방법으로 실시하는 상기 방법을 포함한다.

상향조절 및 하향 조절의 수준은 하이브리드화된 마이크로어레이 프로브의 강도 측정치의 배수 변화에 기초하여 구별된다. 1.5배 차이가 이러한 구별을 위해 바람직하다(또는 0.05 미만의 p-값). 즉, 유전자가 정상 세포와 비교해 질병에 걸린 세포에서 차등적으로 발현된다고 단정하기 전에, 질병에 걸린 세포는 정상 세포에 비해서 약 1.5배 이상 또는 1.5배 미만의 강도를 산출하는 것으로 확인된다. 배수 차이가 커질수록, 진단 또는 예후 도구로서 유전자를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 유전자 발현 프로필을 위해 선별된 유전자는, 임상적 실험 기기를 사용하여 정상 또는 비조절된 유전자의 발현 수준과 배경값을 초과하는 양으로 구별할 수 있는 시그날을 생성시키는 발현 수준을 갖는다. 본 발명은 본원에 제공된 방법을 수행하기 위한 마이크로어레이 또는 유전자 칩을 포함한다. 마이크로어레이는 마커에 상응하는 분리된 핵산 서열, 이의 상보체 또는 이의 일부분을 포함하며, 여기서 배합은 생물학적 샘플 중에서 위암 또는 재발 위험을 특성화하기에 충분하다. 마이크로어레이는 바람직하게는 약 1.5배 이상의 과발현 또는 저발현을 측정 또는 특성화하고, 통계학적으로 유의적인 p-값 과발현 또는 저발현을 제공하거나, p-값은 0.05 미만이다. 바람직하게는, 마이크로어레이는 cDNA 어레이 또는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 함유할 수 있으며 하나 이상의 내부 대조 시약을 함유할 수 있다.

유전자 마커는 전이 상태 부재하의 림프절과 비교해서 위 암종으로부터의 전이를 갖는 림프절에서 상향 조절됨에 따라 차등적으로 발현된다. 상향 조절은 일부 기준선과 비교해서 유전자의 발현양에서의 검출가능한 차이(이를 측정하기 위해 사용되는 시스템에서 노이즈의 기여도를 넘어서는)가 발견됨을 의미하는 상대적 용어이다. 이러한 경우에, 기준선은 위 암종으로부터의 전이를 갖지 않는 정상 림프절에서 측정된 마커의 유전자 발현이다. 이어서, 시험된 림프절 샘플중의 관심대상의 유전자는 동일한 측정 방법을 사용한 경우 기준선 수준과 비교해 상향 조절되거나 변화되지 않는다. 진단 또는 예후는 재발 가능성 또는 치료법의 유형을 결정하는 것과 같은 질병/상태 문제를 결정함을 포함한다. 재발 가능성의 결정은 패턴을 공지된 재발 및/또는 공지된 비-재발 사건과 관련되거나 이러한 차이에 대해 제시된 컷오프 값(PCR의 경우 일반적으로 Ct)을 초과하는 패턴과 비교함을 포함한다.

본 발명의 일부 양태에서, 본 발명의 마커 배합물은 다른 유전자 기반 마커, 및 암 진단, 예후 또는 치료 모니터링에서 유용한 비-유전자 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 상황에서는, 상기한 유전자 발현 기반 방법의 진단력을 혈청 단백질 마커(예를 들면, 암 항원 27.29("CA 27.29"))와 같은 통상적인 마커로부터의 데이타와 결합시키는 것이 유리하다. 이러한 접근법은 다른 시험이 모호한 결과를 산출한 경우에 특히 유용할 수 있다.

본 발명은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하고; 상기 샘플의 유전자 발현을 측정하고; 이로써 수득된 결과를 사용하여 보고서를 작성함에 의해, 위암 진단 환자 보고서 및 보고서들을 작성하는 방법을 포함한다. 보고서는 환자 집단과 비 교한 환자 결과 및/또는 위험 확률의 평가를 또한 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 마커에 상응하는 마이크로어레이 프로브 세트 또는 PCR 프라이머/프로브 세트를 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 제품은 유전자 발현 정보를 밝혀내는데 유용한 매체 또는 포맷화된 검정을 또한 포함한다. 이들은 예를 들면, 관심있는 유전자를 나타내는 서열이 조합되어진 매트릭스에 서열 상보체 또는 프로브가 부착되어 이의 존재에 대한 판독가능한 결정인자를 생성시키는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 제품은 암을 검출하기 위해, 하이브리드화, 증폭 및 관심대상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 시그날 생성을 실시하기 위한 시약 키트로 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 키트는 포맷화 검정을 포함한다. 이는 시약 및 지침서, 및 핵산 서열, 이의 상보체 또는 일부분이 검정되도록 하는 매체와 같은 검정을 수행하는데 필요한 모든 또는 일부 물질을 포함할 수 있다. 검정이 다른 포맷으로 수행되는 경우, 키트는 당해 포맷 특유의 성분을 가질 것이다. 예를 들면, 포맷이 PCR, 롤링 서클 증폭 방법(RCA), 리가제 연쇄반응 방법(LCR), 표준 치환 증폭 방법(SDA), 핵산 서열 기반 증폭 방법(NASBA)과 같은 증폭 포맷인 경우, 키트는 이러한 기술에 적절한 시약 및 물질을 함유할 것이다. 임의로, 키트는 림프절 조직과 같은 조직으로부터 핵산을 추출하기 위해 샘플 제조 시약 및/또는 제품(예; 튜브)를 포함한다. 키트는 또한 샘플의 오염 위험성을 최소화하는 제품을 포함할 수 있다(예를 들면, 림프절 절제 및 준비를 위한 1회용 메스 및 표면)

바람직한 키트에는, 역전사효소, 역전사효소 프라이머, 상응하는 PCR 프라이 머 셋트(바람직하게는 마커 및 대조군용), 열안정성 DNA 폴리머라제(예를 들면, Taq 폴리머라제) 및 적합한 검출 시약(들)(예를 들면, 제한됨이 없이, 스콜피온 프로브, 형광 5' 뉴클레아제 검정용 프로브, 분자적 비컨(beacon) 프로브, 단일 염료 프라이머 또는 이본쇄 DNA에 특이적인 형광 염료(예: 에티디움 브로마이드))와 같은 원-튜브(one-tube) QRT-PCR 과정에 필수적인 시약이 포함된다. 프라이머는 바람직하게는 고 농도를 산출하는 양이다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 통상적이며 다양한 제조업체로부터 시판되고 있다. 키트 내의 부가적 물질에는 QRT-PCR 반응의 역전사효소 및/또는 PCR 단계에서 사용될 수 있는, 적합한 반응 튜브 또는 바이알, 임의로 마그네슘을 포함하는 왁스 비이드와 같은 장벽 조성물; 필수적 완충액 및 시약(예: dNTP)을 포함하는 역전사효소 및 PCR 단계를 위한 반응 혼합물(전형적으로 10X); 뉴클레아제- 또는 RNase-비함유 물; RNase 억제제; 대조 핵산(들) 및/또는 임의의 부가적 완충액, 화합물, 보조인자, 이온성 성분, 단백질 및 효소, 중합체 등이 포함된다. 임의로, 키트는 핵산 추출 시약 및 물질을 포함한다.

하기 실시예는 청구된 발명을 설명하기 위한 것이지 이를 제한하는 것이 아니다. 본원에서 언급된 모든 참조문헌은 본원에 참고 인용되어 있다.

실시예 1

본 실시예는 실시간 RT-PCR의 사용에 기초한다. 실시간 PCR에서, 폴리머라제 연쇄 반응의 생성물은 종결점 측정에 의해서가 아니라 PCR의 대수기 동안 실시간으로 모니터링된다. 따라서, DNA 및 RNA의 정량은 훨씬 더욱 정확하고 재현성이 있다. 형광 값은 매 사이클 동안 기록되고 증폭 반응에서 일정 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 반응 시작시에 존재하는 주형이 많을 수록, 형광 시그날이 배경값보다 통계학적으로 유의적으로 높은 시점에 도달하는데 소요되는 사이클의 횟수(Ct 값의 정의)가 적어진다. 역치 사이클(Ct)의 개념은 형광 기반 RT-PCR을 사용하여 정확하고 재현성 있게 정량할 수 있도록 한다. PCR 생성물의 균일한 검출은 바람직하게는 (a) 이본쇄 DNA 결합 염료(예: SYBR 그린), (b) 형광발생성 프로브(예: Taq Man 프로브, 분자적 비컨) 및 (c) 직접 표지된 프라이머(예: Amplifluor 프라이머)에 기초하여 수행된다.

총 24개의 H&E 전이 양성 림프절 및 18개의 H&E 전이 음성 림프절을 위 암종으로 진단된 환자로부터 수득하였다. 림프절들은 위로부터 배출된 것들로서 선별하였다. 30mg의 조직 조각을 각 림프절로부터 절단해냈다.

각 림프절 조각 30mg을 다음과 같이 처리하였다:

1. 조직 조각을 완충액 RLT 2ml에 부가하고 1회용 조직 분쇄기를 사용하여 20 내지 40초 동안 수동으로 균질화시켰다.

2. 균질화물 400㎕을 10초 동안 와동(vortexing)시켜 4.5ml 튜브 내의 70% 에탄올 400㎕과 혼합한다.

3. 각 샘플에 대해, VacValve를 진공 매니폴드에 부착시키고 1회용 VacConnector를 각 밸브에 부착시킨다.

4. RNeasy 미니 컬럼을 VacConnector에 부착시켜 캡을 개방된 상태로 남겨놓는다.

5. 단계 2로부터의 균질화물/에탄올 혼합물 700㎕을 RNA 스핀 컬럼에 분취해 넣는다.

6. VacValve를 작동(On) 상태가 되게 하고 샘플이 여과될 때까지(약 30초) 진공(800 내지 1200 mbar)을 가한다.

7. 진공을 멈춘다; 700㎕의 세척 완충액 1을 컬럼에 부가한다. 진공을 시작하고 용액을 컬럼을 통해 여과한다. 진공을 멈춘다.

8. 700㎕의 세척 완충액 2를 컬럼에 부가한다. 진공을 시작하고 용액을 컬럼을 통해 여과한다. 진공을 멈춘다.

9. 진공 매니폴드로부터 각각의 컬럼을 제거하여 2ml 수집관(컬럼이 보충됨) 내에 놓는다.

10. RNA 스핀 컬럼을 포함하는 튜브를 미세 원심분리기내에서 >10,000 RPM에서 30초 동안 원심분리한다.

11. 수집관을 폐기한다. 컬럼을 새로운 신선한 수집관(1.5 내지 1.7mL 폴리프로필렌 미세원심분리관)내에 놓는다.

12. 50㎕의 RNase 비함유 물을 컬럼의 필터 막에 직접 부가한다.

13. 미세 원심분리기내에서 >10,000 RPM에서 30초 동안 원심분리한다.

14. 단계 14 전에, 수집관이 공급 표본이 확인될 수 있도록 표지되었음을 확실히 한다(예: 환자 식별번호 및 림프절 식별번호).

15. 컬럼을 폐기한다. 약 50㎕의 용출된 RNA 용액은 수집관내에 함유된다.

추출된 RNA를 Cepheid Smart Cycler II에서 1단계 RT-PCR 증폭에 적용시켰 다. 반응물은 다음 성분을 함유한다: 50mM 바이신 / KOH, pH 8.2, 115mM 칼륨 아세테이트, 8% v/v 글리세롤, 0.2mg/ml BSA, 150mM 트레할로스, 0.2% v/v Tween 20, 0.2mM Tris-Cl pH 8, 3.5mM MnSO₄ 또는 Mn (아세테이트), 0.3mM dATP, 0.3mM dCTP, 0.3mM dGTP, 0.3mM TTP, 100 U/ml Tth, 20㎍/ml 항체 TP6-25.3, 0.4-0.8μM 각각의 프로브 및 프라이머, 프로브 및 프라이머 서열은, 비특이적 프라이밍 반응이 최소화되고 이들이 다음의 신속 RT-PCR 프로파일을 사용한 다중 증폭/검출과 양립하도록 고안한다: 95℃에서 30초, 60℃에서 3분, 이어서 95℃에서 1초, 65℃에서 6초^* 및 72℃에서 3초의 32회 사이클 - 총 증폭 시간 = 16분.

본 실시예에서 사용된 프라이머 및 프로브는 다음과 같았다:

샘플 및 검정 결과는 표 1에 요약되어 있다. 수득된 Ct 값을 사용하여 시험된 모든 샘플에 걸쳐서 유전자의 상대적 발현을 측정하였다. 확립된 Ct 값은 마커에 대해서는 27이고, 내부 대조군(PBGD)에 대해서는 35였다. 3개의 마커중 어느 하나에 대한 Ct가 27 이하인 샘플은 전이에 대해 양성으로 고려되는 한편, 모든 3개의 마커에 대한 Ct가 27을 초과하는 샘플은 전이에 대해 음성으로 고려된다. 음 성 진단 결과가 유효하기 위해서 내부 대조군에 대한 Ct 값은 35 미만이여야 한다. 이러한 컷-오프 값들에 기초하여, 당해 검정을 사용하여 18개의 음성 림프절 가운데 17개(94.4% 특이성) 및 24개의 모든 양성 림프절(100% 민감성)이 정확하게 평가되었다.

본 발명은 여러 마커를 배합 사용하여 위 암종으로부터 전이를 갖는 림프절과 정상 림프절을 쉽게 구별하여 전이된 암종 세포를 용이하게 검출할 수 있다.

Claims (32)

1. a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계 및

   b) 당해 샘플 중에서 마커 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 미리 결정된 컷오프(cut-off) 수준을 초과하는 수준이 위 암종으로부터 림프절 전이의 지표가 되는, 위 암종으로부터 림프절 전이를 진단하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 마커가 유전자, 유전자 단편 또는 이의 상보체인 방법.
3. 제1항에 있어서, 마커가 단백질, 단백질 단편 또는 폴리펩타이드인 방법.
4. 제1항에 있어서, 다른 진단 방법의 사용을 추가로 포함하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 다른 진단 방법이 혈청 검정의 수행을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 구성적으로(constitutively) 발현되는 유전자의 측정을 추가로 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 80% 이상의 민감성을 갖는 방법.
8. 제1항에 있어서, 70% 이상의 특이성을 갖는 방법.
9. 제1항에 있어서, 샘플이 림프절 조직을 포함하는 방법.
10. a. 위암 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및

    b. 당해 샘플 중에서 마커의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 컷오프 수준을 초과하거나 이하인 수준이, 치료법의 결정 또는 조정 대상인 질환의 경과 또는 신체 상태와 일치하는, 위 암종 환자에 대한 치료법을 결정하거나 조정하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 마커가 유전자, 유전자 단편 또는 이의 상보체인 방법.
12. 제10항에 있어서, 마커가 단백질, 단백질 단편 또는 폴리펩타이드인 방법.
13. 제10항에 있어서, 구성적으로 발현되는 유전자의 측정을 추가로 포함하는 방법.
14. 제10항에 있어서, 특이성이 70% 이상인 방법.
15. 제10항에 있어서, 민감성이 약 80% 이상인 방법.
16. 제1항에 있어서, 마이크로어레이(microarray)로 수행되는 방법.
17. 제10항에 있어서, 마이크로어레이로 수행되는 방법.
18. 제1항에 있어서, 증폭 과정을 사용함으로써 수행되는 방법.
19. 제18항에 있어서, 증폭 과정이 PCR인 방법.
20. 제19항에 있어서, PCR이 RT-PCR인 방법.
21. 제10항에 있어서, 증폭 과정을 사용함으로써 수행되는 방법.
22. 마커 검출용 물질을 포함하는, 생물학적 샘플 중에서 위암 진단 결정을 위한 검정을 수행하기 위한 키트.
23. 제22항에 있어서, 마이크로어레이 및 시약을 포함하는 키트.
24. 제22항에 있어서, PCR 시약을 포함하는 키트.
25. 제22항에 있어서, 지침서를 포함하는 키트.
26. 제22항에 있어서, 마커가 CEA, MUC2 및 CK-19로 이루어진 키트.
27. a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계 및

    b) 당해 샘플 중에서 CEA, MUC2 및 CK-19로 이루어진 마커 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 미리 결정된 컷오프(cut-off) 수준을 초과하는 수준이 위 암종으로부터 림프절 전이의 지표가 되는, 위 암종으로부터 림프절 전이를 진단하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 다른 진단 방법의 사용을 추가로 포함하는 방법.
29. 제27항에 있어서, 다른 진단 방법이 혈청 검정의 수행을 포함하는 방법.
30. 제27항에 있어서, 구성적으로 발현되는 유전자의 측정을 추가로 포함하는 방법.
31. 제27항에 있어서, 80% 이상의 민감성을 갖는 방법.
32. 제27항에 있어서, 70% 이상의 특이성을 갖는 방법.