KR20180029936A - 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 간암 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, Mir-18a, Mir-221, Mir-222, Mir-224, Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA를 포함하는 신규한 간암 바이오 마커; 상기 바이오 마커를 포함하는 간암 진단용 조성물; 및 상기 바이오 마커를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

Description

신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도{Novel Biomarkers For Diagnosing Liver Cancer and Uses Thereof}
본 발명은 신규한 간암 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 엑소좀 miRNA를 포함하는 간암 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
간세포암(hepatocellular carcinoma; HCC)의 확진은 조직검사를 통해 이루어 지며 만성간염, 간경변 환자들은 간암 발생 위험이 높으므로 간암의 조기진단을 위한 선별검사(surveillancetest)가 권장되고 있다. 간세포암 바이오마커 또는 종양표지자는 혈액검사를 통하여 간암의 진단 및 예후 예측에 도움을 줄수 있는 인자를 말한다. 현재 혈청 알파태아단백(alpha-fetoprotein)이 간세포암의 혈액 바이오마커 또는 종양표지자로 가장 널리 사용되고 있다. 그러나 간세포암 환자의 약 40-60%에서만 혈청 알파태아단백이 상승되어 있으며 작은 크기의 간세포암에서는 양성율이 현저히 떨어진다. 또한 혈청태아단백은 간세포암이 없는 만성간염 또는 간경변과 같은 상태의 만성간질환 환자에서도 양성으로 나타나는 위양성(false positive)의 문제도 있다.
22개의 핵산으로 만들어진 microRNA는 non-coding RNA로서 단백질을 만들지 않지만 유전자의 발현 조절에 핵심적인 역할을 하며 종양의 형성에도 관여한다는 사실이 밝혀졌으며 간암을 포함한 다양한 종류의 악성종양에서 몇몇 microRNA의 발현 증가 또는 감소가 보고되었다.
종양 유래 엑소좀(Exosome)은 암세포에서 만들어져 혈청내로 분비되는 매우 작은 (50-100nm) 막구조 물질로서 내부에 여러 가지 단백질을 포함하지만 특히 종양 유래 microRNA를 포함하고 있는 것으로 알려졌다. 혈청내의 Exosomal microRNA 발현양상은 종양 세포내의 microRNA 발현을 반영하여 양자 간에 의미있는 상관관계가 보고되었다(Taylor D et al., 2008). 혈청내 exosomal microRNA는 또한 상당한 안정성으로 띄고 있어 혈청내 exosomal microRNA 는 새로운 종양 바이오마커로서 개발될 가능성이 매우 높다.
현재까지 간암의 바이오마커로서 혈청 microRNA에 대한 연구들은 대부분 적은 환자 샘플을 대상으로 하고 있으며, 혈중에서 검출되는 microRNA들을 분석하는 데 그치고 있다. 아직까지 간암에서 혈중으로 분비되는 exosomal microRNA를 이용한 간암 바이오마커는 없는 상태이다. 따라서, 간암 바이오마커로서 유용한 혈청 microRNA를 발굴하기 위해서는 혈청 샘플 획득 당시의 임상적 상태가 정확하게 파악된 간암 및 만성간질환 환자들의 대규모 혈청 샘플을 대상으로 한 체계적인 분석 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 간암 진단을 위한 신규한 바이오 마커를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 인간 혈액(혈청)으로부터 분리한 엑소좀에서 발현되는 특정 microRNA들의 발현 양상이 간암 환자에서 상이함을 발견하였고, 이를 신규한 간암의 바이오 마커로서 이용하여, 간암의 진단 또는 예측에 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Mir-101(GenBank Accession Number: NR_029516), Mir-106b(GenBank Accession Number: NR_029831), Mir-122(GenBank Accession Number: NR_029667), Mir-195(GenBank Accession Number: NR_029712), Mir-150-5p(GenBank Accession Number: LM379069), Mir-342-3p(GenBank Accession Number: LM379258), Mir-16-5p(GenBank Accession Number: LM378756), Mir-26b-5p(GenBank Accession Number: LM378770) 및 Mir-22-3p(GenBank Accession Number: LM378764)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀(exosomal) miRNA를 포함하는 간암 진단용 바이오 마커 조성물 및 상기 엑소좀(exosomal) miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 Mir-18a(GenBank Accession Number: NR_029488), Mir-221(GenBank Accession Number: LM608366), Mir-222(GenBank Accession Number: LM608367) 및 Mir-224(GenBank Accession Number: LM608369)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함할 수 있다.
즉, 본 발명의 가장 큰 특징은 상기 엑소좀 miRNAs를 바이오 마커로 이용하여 간암에 대한 발병 여부를 진단 및 예측하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "miRNA(microRNA)"는, mRNA의 3' 비번역 영역(UTR) 부위와의 염기결합을 통해 전사후 억제자 역할을 하는 대략 22 nt의 비번역 RNA를 의미한다.
본 발명의 바이오 마커는 간암에 대한 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 "엑소좀 miRNA의 발현 수준 측정"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 대상을 검출하는 것을 의미한다.
본 발명에서는, 그 검출하고자 하는 대상은 시료 내 해당 엑소좀 miRNAs이다. 즉, 엑소좀 miRNAs을 검출함으로써 상기 간암의 발병 여부를 확인 할 수 있다.
엑소좀 miRNAs의 검출은 통상적으로는 시료부터 엑소좀을 추출하여, 추출물 중의 엑소좀 miRNAs을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 엑소좀 miRNAs의 검출은 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준은 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 측정한다.
본 발명은 간암인 경우가 그렇지 않은 경우(만성 간염 및/또는 간경변)에 비해 혈청에서의 Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p의 발현 수준이 유의적으로 감소한다는 점을 확인한 것에 기초하여, Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p는 간암의 발병 여부에 대한 진단 마커로 사용된다.
또한, 추가적으로, 본 발명은 간암인 경우가 그렇지 않은 경우(만성 간염 및/또는 간경변)에 비해 혈액에서의 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224의 발현 수준이 유의적으로 증가한다는 점을 확인한 것에 기초하여, 본 발명에서 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224는 간암의 발병 여부에 대한 진단 마커로 사용된다.
상술한 만성 간염 및/또는 간경변은 당업계에서 간암에 대한 비교대조군으로서 공지된 것으로서 간암은 만성간염 및/또는 간경변이 있는 환자에서 발생하므로 간암의 진단마커 개발시 만성간염 및/또는 간경변 환자군이 간암 환자군의 대조군으로서 사용되어야 한다.
즉, 본 발명의 바이오 마커는 특정 엑소좀 miRNA이 발현되지 않거나 저발현되고; 특정 엑소좀 miRNA이 고발현되는 암세포 또는 암을 갖는 객체를 대상으로 하여, 엑소좀 내 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 확인한다.
본 발명의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 간암이 발병한 경우 대상의 생물학적 시료의 검체에서 발현 수준이 감소되는 마커인 엑소좀 miRNA 및 추가적으로 발현 수준이 증가되는 마커인 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 1 종 이상의 엑소좀 miRNAs 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 엑소좀 miRNAs에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.
즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.
예컨대, 프라이머를 이용한 엑소좀 miRNAs의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 간암 발병 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 간암 발병 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.
예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
miRNA의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등이 포함되며 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 간암의 진단 키트로 사용되기에 적합하도록 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.
상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
예컨대 본 발명의 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 miRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커 및 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다:
(a) 대상의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(b) 상기 엑소좀 내 Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 비교대조군 시료의 해당 엑소좀 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명에서 (b) 상기 엑소좀 내 Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 저발현인 경우, 상기 대상은 간암인 것으로 판정한다.
또한, 상기 조성물은 상기 엑소좀 내 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 엑소좀 내 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준은 비교대조군에 비하여 고발현인 경우, 상기 대상은 간암인 것으로 판정한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "대조군"은 간경화 또는 만성 간염 환자의 시료 내 상술한 엑소좀 miRNA 발현 수준을 의미한다.
본 발명의 예측 방법은, 대상 환자로부터 생물학적 시료를 획득하고, 상기 시료 내에서 엑소좀 miRNA 발현 수준을 측정한 후, 대조군 시료와 비교하여, 상술한 엑소좀 miRNA의 발현이 고발현(증가) 및 저발현(감소)된 경우에, 당해 시료가 간암 세포 또는 조직이 있다라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.
본 명세서에서 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "저발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 낮은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.
본 명세서에서 상기 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어 "고발현"은 바이오 마커가 비정상 프로세스, 질환 혹은 개체 내 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 경우, 건강하거나 정상인 개체 또는 비교 대상인 개체로부터 획득된 생물학적 시료에서 검출되는 바이오 마커의 값 혹은 수준 범위 보다 높은 생물학적 시료 내의 바이오 마커의 값 혹은 수준을 지칭한다.
또한, 상기 유전자들의 발현 수준을 언급하면서 사용되는 용어들은 바이오 마커의 "정상" 발현 수준 혹은 값과 비교해서 "차동(differential) 수준" 혹은 "차동 값"을 지니거나 "상이하게 발현된" 것으로서 지칭될 수 있으며, 발현에 있어서 정량적 차이뿐만 아니라 정성적 차이의 둘 모두를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 혈청이며, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
본 방법에서 대조구 시료의 상술한 엑소좀 miRNA의 발현 수준에 비해 간암의 발병 또는 진행이 의심되는 환자의 시료에서 상술한 Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 유의적으로 낮게 측정되면 간암이 발병하였다는 정보를 제공할 수 있게 된다.
또한, 추가적으로 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 유의적으로 높게 측정되면간암이 발병하였다는 정보를 제공할 수 있게 된다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 간암의 발병을 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 간질환 환자의 혈청 엑소좀에서 분리한 microRNAs는 간암 환자에서 특이적인 발현 양상을 나타내는 바, 간암 바이오마커로서 사용될 수 있다. 간암의 경우 현재까지 민감도와 특이도가 높은 혈청 바이오 마커가 없어 간암 선별검사로 이용될 마커가 없는 상태로서 본 발명을 통하여 개발된 간암세포에서 혈청으로 분비되는 exosomal microRNA 바이오마커는 치명률이 매우 높은 간암의 진단법으로 활용될 수 있을 것이다. 또한, 현재 간암 환자의 수술 후 재발 예측이나 소라페닙 등 항암치료 후 반응을 예측할 수 있는 예후 예측 바이오 마커가 전혀 없는 상태이므로 본 발명에서 개발된 바이오마커가 간암 예후 예측 인자로 사용될 가능성도 있으며 환자의 치료방법의 결정과 예후 예측에 따른 간암의 개인별 맞춤형 치료법 (Personalized medicine)에 사용될 수 있다.
도 1은 B형 간염에 의한 만성간염(CHB), 간경변(LC), 간암(HCC)환자의 혈청 엑소좀 microRNA 발현의 차이를 나타낸다.
도 2는 만성간염(CH) 및 간암(HCC) 환자에서 나노스트링 어레이를 이용한 혈청 엑소좀 microRNA 어레이를 나타낸다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 엑소좀 miRNA(exosomal microRNA)의 선별
본 발명자들은 B형 간염바이러스에 의한 만성간염, 간경변, 간암 환자 각각 20 명의 혈청에서 엑소좀 miRNA를 분리하여 간암에서 증가 또는 감소된 엑소좀 miRNA를 선별하였다.
먼저, 총 10 개의 혈청 microRNA(Mir-18a, Mir-21, Mir-93, Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-221, Mir-222, Mir-224) 발현양을 qPCR을 이용하여 정량한 후, 각각의 만성간염 환자군, 간경변 환자군, 간암 환자군에서 비교하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 혈청 엑소좀 microRNA 중 Mir-18a, Mir-221, Mir-222과 Mir-224의 발현이 만성 간염 또는 간경변 환자군에 비해 간암 환자군에서 유의하게 증가되는 것(P<0.05)을 확인하였으며, Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195의 발현은 만성 간염 환자군에 비하여 간암 환자군에서 유의하게 감소된 결과(P<0.05)를 얻었다. 혈청 내 Mir-21, Mir-93 발현양은 간암 환자군과 만성 간염 환자군 사이에는 유의한 차이가 없었다(P=0.925, P=0.355)(도 1)(Sohn W, et al. Exp Mol Med 2015;47:e184).
이러한 결과는 혈청 엑소좀 miRNA가 간암의 혈액 바이오마커로서 사용될 수 있다는 가능성을 제시한다.
실시예 2. 엑소좀 miRNA(exosomal microRNA)의 추가 선별
본 발명자들은 상기 실시예 1에서의 결과를 기반으로 하여 나노스트링 어레이(Nanostring microRNA) 어레이를 이용한 간암 엑소좀 miRNA 발현 분석방법을 확립하고 이를 이용하여 간염 및 간암 환자에서 추가적으로 혈청 엑소좀 miRNA 발현을 비교분석하였다.
혈청 엑소좀 miRNA 발현양상을 분석하는 방법으로 기존에 free circulating microRNA에 사용되는 chip-based array가 일부 연구에서 보고되고 있으나 엑소좀 miRNA의 낮은 농도로 인하여 기존방법으로 정확한 분석이 어렵다. 반면, 본 발명에 이용되는 Nanostring사의 nCounter miRNA expression assay 기기는 현재까지 알려진 700여 종류의 microRNA 유전자들의 발현 양을 한번의 실험으로 확인가능한 장점을 갖고 있으며, 특히, RNA 증폭과정이 없어 불필요한 유전자들의 증폭으로 인한 masking 효과를 줄여 더 정밀한 결과를 얻을 수 있다.
이에, 여러 차례의 실험과 Nanostring 본사 연구팀의 자문 끝에 Nanostring을 이용한 만성간질환 환자 혈청 엑소좀 miRNA 발현 프로파일 분석방법을 최초로 확립하였다.
Figure pat00001
(만성간염(CH) 및 간암(HCC) 환자에서 나노스트링 어레이를 이용한 혈청 엑소좀 miRNA 발현량에서 1.5배 이상 차이를 보이는 마커를 붉은 색으로 표시하였다)
그 결과, 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이, Nanostring array를 이용하여 만성 B형 간염에 의한 만성 간염(n=5) 및 간암(n=6) 환자에서 혈청 엑소좀 miRNA 발현 프로파일을 비교 분석하여 총 5 가지의 miRNAs (Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p, Mir-22-3p)가 비교대조군인 간염 환자에 비해 간암 환자에서 보다 의미있게 발현이 감소됨을 확인하였다.
따라서, 이들 혈청 엑소좀 miRNA는 새로운 간암의 혈청 바이오마커로서 이용할 수 있음을 제시한다.
결론적으로, 본 발명의 실시예에서 확보한 혈청 엑소좀(exosomal) microRNA 분리 기술 및 최초로 확립한 Nanostring 기반 혈청 엑소좀 microRNA 어레이 분석기술은 향후 간암의 진단 뿐 아니라 치료 후 재발 예측 등 예후와 관련된 바이오마커 발굴에 이용될 가치가 크고, 간암 이외에 다양한 악성종양의 liquid biopsy 바이오마커 연구에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. Mir-101(GenBank Accession Number: NR_029516), Mir-106b(GenBank Accession Number: NR_029831), Mir-122(GenBank Accession Number: NR_029667), Mir-195(GenBank Accession Number: NR_029712), Mir-150-5p(GenBank Accession Number: LM379069), Mir-342-3p(GenBank Accession Number: LM379258), Mir-16-5p(GenBank Accession Number: LM378756), Mir-26b-5p(GenBank Accession Number: LM378770) 및 Mir-22-3p(GenBank Accession Number: LM378764)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀(exosomal) miRNA를 포함하는 간암 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. Mir-101(GenBank Accession Number: NR_029516), Mir-106b(GenBank Accession Number: NR_029831), Mir-122(GenBank Accession Number: NR_029667), Mir-195(GenBank Accession Number: NR_029712), Mir-150-5p(GenBank Accession Number: LM379069), Mir-342-3p(GenBank Accession Number: LM379258), Mir-16-5p(GenBank Accession Number: LM378756), Mir-26b-5p(GenBank Accession Number: LM378770) 및 Mir-22-3p(GenBank Accession Number: LM378764)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀(exosomal) miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 Mir-18a(GenBank Accession Number: NR_029488), Mir-221(GenBank Accession Number: LM608366), Mir-222(GenBank Accession Number: LM608367) 및 Mir-224(GenBank Accession Number: LM608369)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 엑소좀 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트.
  6. 다음 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공 방법:
    (a) 대상의 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 엑소좀 내 Mir-101(GenBank Accession Number: NR_029516), Mir-106b(GenBank Accession Number: NR_029831), Mir-122(GenBank Accession Number: NR_029667), Mir-195(GenBank Accession Number: NR_029712), Mir-150-5p(GenBank Accession Number: LM379069), Mir-342-3p(GenBank Accession Number: LM379258), Mir-16-5p(GenBank Accession Number: LM378756), Mir-26b-5p(GenBank Accession Number: LM378770) 및 Mir-22-3p(GenBank Accession Number: LM378764)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 비교대조군 시료의 해당 엑소좀 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, (b) 상기 엑소좀 내 Mir-101, Mir-106b, Mir-122, Mir-195, Mir-150-5p, Mir-342-3p, Mir-16-5p, Mir-26b-5p 및 Mir-22-3p로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 저발현인 경우, 상기 대상은 간암인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 엑소좀 내 Mir-18a(GenBank Accession Number: NR_029488), Mir-221(GenBank Accession Number: LM608366), Mir-222(GenBank Accession Number: LM608367) 및 Mir-224(GenBank Accession Number: LM608369)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 엑소좀 내 Mir-18a, Mir-221, Mir-222 및 Mir-224로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 엑소좀 miRNA의 발현 수준이 비교대조군에 비하여 고발현인 경우, 상기 대상은 간암인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 타액(saliva), 생검(biopsy), 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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