CN109161593B - 环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供对生物样品中的直肠结肠癌细胞进行筛查诊断的检测方法,所述的方法包括检测肿瘤组织或粪便样品中RNA序列的检验步骤,所述RNA包括环状RNA(hsa_circ_0006859、hsa_circ_0051240a、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000267和hsa_circ_0001190)和microRNA(miR‑21和miR‑135b)。circRNA和microRNA结构稳定且能反映细胞基因表达信息,为结直肠癌筛查诊断以及预后监测提供方便、快捷、准确的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于细胞核糖核酸(RNA)的应用,具体涉及多种环状RNA(circRNA)和microRNA,及其相关的基因表达检测方法和试剂盒,用于对结直肠组织以及肠道排泄物进行分析,以作为结直肠癌筛查诊断的特异生物学标志分子。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC,也称为结肠直肠癌或大肠癌)是癌症相关死亡的主要原因之一。CRC患者如果能够在疾病发生早期得到及时诊断和治疗,将会显著改善CRC生存率。由于大部分CRC患者早期阶段无症状表现,因而开发一种能够及早对CRC进行检测诊断的肿瘤筛查方法对于降低CRC发病率和死亡率至关重要(Force USPST等JAMA.2016;315:2564-2575)。虽然目前推荐结肠镜检查作为CRC的筛查方法,但由于其应用不便,尚未被人们广泛接受。另外,粪便潜血试验(FOBT)的灵敏度较低,需要细致的饮食限制。因此,从患者样品中检测CRC相关的生物标志物(Biomarker)是一种方便有效的肿瘤筛查和诊断方法。然而,缺乏稳定的生物标志物是目前癌症早期筛查的主要挑战之一,理想的CRC筛查和诊断的生物标志物尚未完全确定。因此,面对CRC早期检测灵敏度严重不足、CRC相关生物标志物缺乏稳定性的现状,急需开发出一种能够用于CRC早期检测的、具有高度灵敏度的、并且能够被稳定检测的理想生物标志物,从而为及早对CRC进行检测诊断提供手段。
目前研究发现CRC的病因较为复杂,除了遗传因素,还涉及年龄、环境和饮食等。多种基因或表观遗传改变引起致癌基因激活和肿瘤抑制基因失活,导致结肠上皮细胞周期异常,出现无限增生。这些细胞遗传学改变反映了肿瘤发展的生物学过程,被认为是潜在的肿瘤细胞分子标记,能为临床医师提供诊断、预后和预测治疗反应信息。按照分子生物学中心法则,大量研究工作针对肿瘤细胞来源的DNA、RNA或蛋白质信息进行开发,以期获得新颖的生物标志物检测方法。与传统检测方法相比,分子生物学检测技术是一种灵敏度、准确度、特异性极高的检测方式。基因转录产生的RNA携带了细胞遗传信息,除了进一步编码成蛋白质,还能够直接与某些分子相互作用,已证明其参与了与肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移相关的关键信号传导途径。在人转录组中,能翻译成蛋白质的mRNA比例很小,大部分为非编码RNA,例如长非编码RNA、核糖体RNA和microRNA等等。非编码RNA的检测可发展作为CRC发病机制相关的表观遗传标记,它们的表达模式揭示细胞行为和状态,是肿瘤细胞生物学研究的重要信息。
随着RNA测序技术和生物信息学的发展,一种非编码RNA——环状RNA(circRNA)的发现已成为一个新研究热点。circRNA的生物学特性使其成为一类重要的临床诊断指标(Barrett SP等,Development.2016;143:1838-1847)。circRNA是一种非线型的环状核糖核酸。多种肿瘤组织表达不同丰度的circRNA。circRNA同时具有细胞类型特异性和生物学保守性。区别于其他RNA分子,circRNA的5’和3’首末端形成共价连接,并不被普通RNA酶降解,因此具有非常稳定的半衰期(>48小时)。本研究通过对CRC标本进行高通量RNA测序分析,新发现数个与CRC相关的circRNA(SEQ-ID.1至5)。肿瘤相关基因转录环化拼接(Backsplicing)产生的circRNA可作为CRC的发生和发展的标志物。我们首次发现这些circRNA在CRC组织表达升高,然而circRNA的产生机制与肿瘤细胞的基因突变的联系需进一步研究。circRNA与其宿主基因表达水平不一定成正相关,但其联合检测可以为肿瘤细胞的发现提供更多实验证据。
同时,大量研究发现其他非编码RNA例如microRNA也是一种重要的肿瘤细胞标志物。microRNA(miRNA)是长度为18至25个核苷酸的内源性小型非编码RNA,可调节特定蛋白质编码基因的翻译,参与了肿瘤的发生和发展(Hollis M等,World iournal ofgastroenterology.2015;21:8284-8292)。其中,miR-21和miR-135b在CRC患者及其粪便样品中的表达水平显著增加(Wu CW等,Clin Cancer Res.2014;20:2994-3002;Wu CW等,Gut.2012;61:739-745)。MiR-21的高表达能提高多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵入能力,并提示疾病预后不良(Lu Z等,Oncogene.2008;27:4373-4379;Xia X等,PLoS One.2013;8:e80426)。研究表明,miR-135b高表达可以调节多种信号通路从而促进肿瘤细胞的恶化和发展,是肿瘤发生的重要机制(Valeri N等,Cancer Cell.2014;25:469-483)。鉴于CRC癌细胞转化机制的复杂性,本发明联合检测miR-21和miR-135b在活检组织和粪便样品中的表达水平,以增加CRC筛查诊断的准确性。
另外,CRC样品的选择也是筛查试验的一个关键步骤。如上所述,结肠镜活检是CRC诊断的重要标准,但由于其侵入性而难以成为理想的常规筛查方法。人结直肠上皮细胞约以每小时1%的速度更新,细胞脱落至肠腔中并随粪便排出体外,而恶性上皮细胞更新和脱落的速度更快。因此,粪便样品中含有的上皮细胞的分泌因子和核酸为在体外条件下检测肿瘤细胞提供了可定量的方法。粪便样品的获取简便,检测成本较低,提高了患者肿瘤筛查依从性。美国预防医学工作组(USPSTF)向50至75岁人群推荐多种基于粪便样品的免疫组化和DNA检测试剂盒,并建议每年至少进行一次CRC筛查(Force USPST等,JAMA.2016;315:2564-2575)。多种RNA检测试剂盒尚处于开发和验证阶段,有望向受试人群提供更高准确度和灵敏度的CRC筛查方法。本发明旨在为CRC筛查诊断提供新的标志分子circRNA,其生物学结构特性可使其在肿瘤组织、粪便等生物样品中稳定保存,其检测结果为肿瘤细胞的发现提供更多更准确的实验证据。本发明用于CRC检测的circRNA和microRNA组合应用未见国内外有文献报道和相关的专利申请。
发明内容
本发明旨在建立用于结直肠癌筛查诊断的高灵敏度、高稳定性的方法,所述方法包括检测人体生物样品的hsa_circ_0006859、hsa_circ_0051240a、hsa_circ_0000722、hsa_circ_0000267和hsa_circ_0001190及其相应的宿主基因,同时检测miR-21和miR-135b的表达水平。其中,SEQ-ID.1对应于hsa_circ_0006859序列,SEQ-ID.2对应于hsa_circ_0051240a序列,SEQ-ID.3对应于hsa_circ_0000722序列,SEQ-ID.4对应于hsa_circ_0000267序列,SEQ-ID.5对应于hsa_circ_0001190序列,SEQ-ID.6对应于miR-21,SEQ-ID.7对应于miR-135b。
在一些实施方案中,本发明涉及circRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途,所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述一种或更多种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至5之一的序列具有至少95%同一性的序列,并且所述一种或更多种cirRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。
在一些实施方案中,所述circRNA检测剂包含用于检测1、2、3、4或5种所述circRNA的序列的一种或更多种检测剂。
在一些实施方案中,所述circRNA检测剂包含用于对2、3、4或5种所述circRNA或其任意组合进行联合检测的一种或更多种检测剂。
在一些实施方案中,所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的2种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述2种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至2之一的序列具有至少95%同一性的序列。在另一些实施方案中,所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的3种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述3种circRNA分别包含与SEQ-ID.3至5之一的序列具有至少95%同一性的序列。
在一些实施方案中,所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。
在一些实施方案中,其中通过以下方法对circRNA检测进行评价:
对每种所检测的circRNA,将表达阳性记1分,表达阴性记0分,将总和作为circRNA评分;并且
以circRNA评分>0.5或>1.5作为将对象诊断为患有或有风险患有结直肠癌的诊断界点。
在一些实施方案中,本发明涉及microRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途,所述microRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种microRNA的一种或更多种检测剂,其中所述一种或更多种microRNA分别包含与SEQ-ID.6至7之一的序列具有至少95%同一性的序列,并且所述一种或更多种microRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。
在一些实施方案中,所述microRNA检测剂包含用于检测1或2种所述microRNA的序列的一种或更多种检测剂。
在一些实施方案中,所述microRNA检测剂包含用于对2种所述microRNA进行联合检测的一种或更多种检测剂。
在一些实施方案中,所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。
本发明还旨在提供基于本方法所衍生的试剂盒,其可用于对人体生物样品包括肠道活检组织细胞和粪便等进行针对circRNA和microRNA的检测。所述试剂盒主要包含用于检测SEQ-ID.1至7的杂交探针核酸分子、引物核酸或其组合,适用于原位杂交、Northern印迹、免疫组化和PCR等分子生物学实验。通过检测SEQ-ID.1至7的表达水平,建立相应的实验评分标准,可判断所述的样品中存在癌细胞或者发生CRC的倾向。
在一些实施方案中,本发明涉及用于检测circRNA的试剂盒,其包含用于检测一种或更多种circRNA的一种或更多种探针、引物或其组合,其中所述一种或更多种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至5之一的序列具有至少95%同一性的序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测2种circRNA的一种或更多种探针、引物或其组合,其中所述2种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至2之一的序列具有至少95%同一性的序列。在另一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测3种circRNA的一种或更多种探针、引物或其组合,其中所述3种circRNA分别包含与SEQ-ID.3至5之一的序列具有至少95%同一性的序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测所述一种或更多种circRNA的杂交探针核酸分子。在另一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测所述一种或更多种circRNA之cDNA的引物核酸。
在一些实施方案中,所述一种或更多种探针、引物或其组合的碱基序列分别与所述一种或更多种circRNA之一的序列具有至少95%同一性。
在一些实施方案中,本发明涉及用于检测microRNA的试剂盒,其包含用于检测1或2种microRNA的一种或更多种探针、引物或其组合,其中所述1或2种microRNA分别包含与SEQ-ID.6至7之一的序列具有至少95%同一性的序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测所述1或2种microRNA的杂交探针核酸分子。在另一些实施方案中,所述试剂盒包含用于检测所述1或2种microRNA之cDNA的引物核酸。
在一些实施方案中,所述一种或更多种探针、引物或其组合的碱基序列分别与所述1或2种microRNA的序列之一具有至少95%同一性。
在一些实施方案中,本发明涉及用于结肠直肠癌筛查诊断的方法,所述方法包括检测人体生物样品中的一种或更多种circRNA,其中所述一种或更多种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至5之一的序列具有至少95%同一性的序列,并且所述一种或更多种cirRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。
在一些实施方案中,所述方法包括检测1、2、3、4或5种所述circRNA的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括对2、3、4或5种所述circRNA或其任意组合进行联合检测。
在一些实施方案中,所述方法包括检测人体生物样品中的2种circRNA,其中所述2种circRNA分别包含与SEQ-ID.1至2之一的序列具有至少95%同一性的序列。在另一些实施方案中,所述方法包括检测人体生物样品中的3种circRNA,其中所述3种circRNA分别包含与SEQ-ID.3至5之一的序列具有至少95%同一性的序列。
在一些实施方案中,所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。
在一些实施方案中,其中通过以下方法对circRNA检测进行评价:
对每种所检测的circRNA,将表达阳性记1分,表达阴性记0分,将总和作为circRNA评分;并且
以circRNA评分>0.5或>1.5作为将对象诊断为患有或有风险患有结直肠癌的诊断界点。
在一些实施方案中,本发明涉及用于结肠直肠癌筛查诊断的方法,所述方法包括检测人体生物样品中的一种或更多种microRNA,其中所述一种或更多种microRNA分别包含与SEQ-ID.6至7之一的序列具有至少95%同一性的序列,并且所述一种或更多种microRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。
在一些实施方案中,所述方法包括检测1或2种所述microRNA的序列。
在一些实施方案中,所述方法包括对2种所述microRNA进行联合检测。
在一些实施方案中,所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。
有益效果
通过本发明的一些示例性实施方案,展现了多种与结直肠癌相关的circRNA和microRNA,所研制的circRNA和microRNA检测试剂盒有助于判断人体组织或生物样品如粪便中是否存在恶变细胞。相较于传统的肿瘤基因检测方法,circRNA和microRNA结构稳定且能反映细胞基因表达信息,为结直肠癌筛查诊断以及预后监测提供具有更高灵敏度的方便、快捷、准确的检测手段,其作为肿瘤生物标志物的应用前景广阔。
附图说明
图1.多种circRNA在CRC肿瘤组织和对应癌旁组织中的表达。(A):热图显示相对表达水平,红色为高表达,绿色为低表达。(B):多种circRNA在不同CRC患者肿瘤组织与癌旁组织中的相对表达倍数变化(n=5)。
图2.多种circRNA的环化拼接位点。Sanger测序峰图显示碱基位点,不同颜色的峰位确定相应的碱基序列(A为绿线,T为红线,G为黑线,C为蓝线)。
图3.多种circRNA在粪便样品中的表达。PCR扩增曲线显示各circRNA和内参RNU6分别在正常人(红线)和CRC患者(蓝线)粪便中的表达水平。循环数越高(右移),表达水平越低。
图4.circRNA表达的ROC(受试者工作特征,receiver operatingcharacteristic)诊断特征曲线。正常受试者(n=48)和CRC患者(n=60)。红线为ROC曲线,黑虚线为标准参照线。ROC在参照线左上方,离其越远说明诊断效果越好。其中,2 circRNA组合为hsa_circ_0006859+hsa_circ_0051240a。3 circRNA组合为hsa_circ_0001190+hsa_circ_0000722+hsa_circ_0000267。
图5.miR-21和miR-135b在多种活检组织中的相对表达水平。(A):通过qPCR检测miR-21和miR-135b的表达水平。(B)miR-21和miR-135b表达的ROC诊断特征曲线。正常对照组(n=53);腺瘤组(n=78);肠癌早期(I至II期)的CRC病灶组(n=80)及癌旁组(n=80)。
图6.miR-21和miR-135b在粪便细胞中的探针检测。图中标尺为100μm
图7.PCR检测CRC患者的术前和术后粪便miR-21和miR-135b表达水平变化。
具体实施方式
实施例1
本实施例主要以PCR反应体系设计为例说明如何在CRC细胞系(株)、CRC患者肿瘤组织和患者粪便排泄物中检测circRNA SEQ-ID.1至5的表达水平,并对其诊断价值进行统计学分析。
1.标本收集:两株CRC细胞系——C2BBe1(CRL-2102)和HT-29(HTB-38)均购自ATCC(American Type Culture Collection)。20例CRC患者液氮冻存肿瘤组织(TMN,IIA期)及其癌旁组织由美国辛辛那提大学肿瘤研究中心提供。60例CRC患者粪便样品以及48例健康受试者粪便样品由郑州大学第一附属医院提供。每例患者标本均有明确的诊断记录,并通过伦理委员会同意。
2.总RNA提取:所有实验均使用无RNA酶Eppendorf管和吸管。CRC细胞株(细胞数约105)经离心去除冻存液,迅速加入1mL TRIzol(InvitrogenTM)裂解细胞,充分吹打,加入1/5体积的氯仿,震荡混匀约10秒,室温下静置5分钟,离心(12,000rpm,4℃)15分钟,小心吸取上层水相约400μL。取50mg组织,剪碎,加入1mL TRIzol,用匀浆机匀浆,加入1/5体积的氯仿,震荡混匀约10秒,室温下静置5分钟,离心(12,000rpm,4℃)15分钟,小心吸取上层水相约400μL。取1g粪便样品,加入2mL TRIzol LS(InvitrogenTM),用匀浆机匀浆,离心后取1mL上清,加入1/5体积的氯仿,震荡混匀约10秒,室温下静置5分钟,离心(12,000rpm,4℃)15分钟,小心吸取上层水相约400μL。将所收集的上层水相移至一个新Eppendorf管种,加入等体积的乙醇,反复颠倒混匀,用RNA Mini试剂盒(Ambion)进行RNA分离纯化和洗涤,最后加入30μL无核酶水洗脱。RNA溶液用NanoDrop2000检测纯度及浓度,-80℃保存备用,总质量大于1μg的样品可用于进一步实验。
3.逆转录:用Reverse Transcriptase System试剂盒(Promega)将总RNA逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。按照试剂盒说明,反应体系(20μl)为:4μl MgCl2(25mM),2μlReverse Transcription 10X缓冲剂,2μl dNTP混合物(10mM),0.5μl核糖核酸酶抑制剂,0.5μl AMV反转录酶(高浓度),1μl随机引物,0.5μg总RNA和无核酶水。反应在普通PCR仪中进行,反应条件为:循环1:25℃ 5分钟;循环2:42℃ 60分钟;循环3:95℃ 5分钟;循环4:4℃结束。逆转录产物于-20℃保存备用。
4.定量PCR:用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)检测样品中circRNA的表达水平。PCR引物由Eurofins Genomics合成。hsa_circ_0006859上下游异向引物(divergent primers)分别是5’CTGCATTTGTCAGCACCTGG3’和5’GCGTAGGAGGACTTGTGAAA3’。hsa_circ_0051240a上下游引物分别是5’TAAGTGTTGACCACAGCGACC3’和5’GTGGCAGGAGAGGTTCAGAT3’。hsa_circ_0000722上下游引物分别是5’CGCAAGCTCGCCAAACAG3’和5’GAGGGGGTGAGGGGGTT3’。Hsa_circ_0001190上下游引物分别是5’TGGGCGCTATACTGCACATT3’和5’GAGTCACCTGTATGCATCGTCT3’。CircFAM58B上下游引物分别是5’AACGACAAGAAGGTCGGTGT3’和5’TTTTCAGGCAGGCATTCCCA3’。内参基因RNU6上下游引物分别是5’CTCGCTTCGGCAGCACA3’和5’AACGCTTCACGAATTTGCGT3’。按照试剂盒说明,反应体系(20μl)为:0.5μl上游引物(10μM),0.5μl下游引物(10μM),1μl cDNA,10μl 2x QuantiTect SYBRMix和8μl无RNA酶水。PCR扩增在定量PCR仪(Bio-Rad)中进行,反应条件为:循环1:95℃ 15分钟;循环2:95℃ 15秒;循环3:56℃ 30秒;循环4:70℃ 30秒;循环5:重复循环2至4×50;循环6:熔解曲线-56℃至95℃(1℃每15秒);结束。设定PCR扩增曲线阈值,获取Ct值。
5.基因表达水平计算:定量PCR程序结束后,设定荧光阈值,设置的原则是要大于样本的荧光背景值(前15个循环信号),同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,使真正的信号是超过域值的荧光信号,从而得到各组PCR扩增反应的Ct值。如果表达水平过低(Ct超出50检测限),Ct按50计算。采用参照基因ΔCt法分析,以细胞内看家基因RNU6表达PCR反应的Ct值作为相对标准,目的基因circRNA相对表达水平计算公式为:2-ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。以ΔCt(circRNA-内参基因)差值界定circRNA表达阴(ΔCt>20)阳(ΔCt<20)性。
6.circ评分方法:所选的粪便样品经PCR检测后,各circRNA表达阳性记1分,而表达阴性则为0分,总和作为circRNA评分。因而,样品中circRNA阳性表达数量越多,circRNA评分越高。在一些具体的实施方案中,以circRNA评分>0.5(对于单一circRNA、2 circRNA组或3 circRNA组)或者>1.5(对于5 circRNA组)作为将对象诊断为患有或有风险患有CRC的诊断界点。
7.PCR产物纯化与序列验证:PCR反应完成后,可进行1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭5μg/ml)电泳以确证PCR产物。电泳(100mA,30分钟)结束后,将位于DNA标记100至200bp范围的PCR条带切下,然后转入2mL EP管中用Qiagen胶纯化试剂盒进行DNA提取。具体纯化步骤按说明书进行,经过胶溶解(50℃,20分钟),离心过柱,洗涤,然后用3μL无核酶水进行洗脱,以NanoDrop2000检测DNA纯度及浓度。取100ng PCR纯化产物加入25pmol引物进行Sanger测序(GENEWIZ公司)。
8.统计分析:利用SPSS 13.0软件统计进行数据分析。同一患者肿瘤组织和癌旁组织的差异采用配对t检验。正常受试者和CRC患者的circRNA检测率比较采用χ2检验。对circRNA肿瘤诊断价值采用受试者工作特征(ROC)曲线:以Circ评分作为检验变量,以诊断结果作为状态变量,选择SPSS的ROC Curve进行作图,分析曲线下面积。P≤0.05认为有统计学差异。
9.研究结果:利用Find_circ对测序信号(read)进行circRNA生物信息学分析(Memczak,S.等,Nature.2013,495:333-338),初期的筛选结果见表1。
表1.RNA测序信号
*经circBase数据库比对所筛选的circRNA
通过circBase数据库,经由大规模筛选,得到了大量在正常组织和CRC组织之间具有差异表达的候选标志物。但该结果并不意味着所有候选标志物均具有可用于CRC诊断的生物标志物的潜力,因为适合的标志物在具有明显差异表达的基础上,关键的特性还在于较高的灵敏度、稳定性和可检测性。为此,必须对所得到的筛选结果进行进一步研究和排除,以得到具有高灵敏度、稳定性以及可接受特异性的候选物。
因此,利用患者样本和细胞样本,对获得的上述结果进行了进一步的关于表达水平、可检测性、相关性等方面的研究,并对CRC诊断的灵敏度、特异度等进行对比分析,确认了以下这些circRNA:combined_circ_002256确认为hsa_circ_0001190,combined_circ_000696确认为hsa_circ_0006859,combined_circ_007006确认为hsa_circ_0051240a,combined_circ_004136确认为hsa_circ_0000722,combined_circ_000365确认为hsa_circ_0000267(序列见SEQ-ID.1至5)。
在此基础上,本研究进一步用CRC组织验证SEQ-ID.1至5的表达水平。如RNA测序热图(heatmap)所示(图1A),CRC患者(TNM分期均为T3N0M0)肿瘤组织的circRNA(SEQ-ID.1至5)表达比癌旁组织高。PCR检测发现circRNA(SEQ-ID.1至5)在20例CRC患者(TNM分期均为T3N0M0)组织表达水平表达比均癌旁组织高(图1B),表达差异可能与肿瘤细胞基因突变程度有关。
circRNA(SEQ-ID.1至5)在CRC细胞株中表达,经PCR扩增后,产物通过电泳分离纯化,以Sanger测序鉴定circRNA特异的环化拼接位点(图2)。值得注意的是,经典的基因转录线性信使RNA不存在这些结构位点。
另外,circRNA(SEQ-ID.1至5)在粪便样品的表达也可通过PCR检测,其PCR扩增曲线如图3所示。其中正常受试者粪便中几乎不表达circRNA(SEQ-ID.1至5,ΔCt>20),而CRC患者粪便中可检测多个circRNA(SEQ-ID.1至5)的表达(ΔCt<20)。在此基础上,为了进一步优化检测系统的灵敏度,我们对这5种circRNA的不同组合和CRC之间的关系进行了进一步研究,并且惊讶地发现,对不同的circRNA进行联合检测,可以得到针对CRC的显著更良好的检测灵敏度结果。
表2总结了各受试者的粪便circRNA评分情况。
表2.单一或者CircRNA组合评分灵敏度和特异度
a 2 circRNA组合为hsa_circ_0006859+hsa_circ_0051240a。b 3 circRNA组合为hsa_circ_0001190+hsa_circ_0000722+hsa_circ_0000267。正常受试者(n=48)和CRC患者(n=60)。
由表2中结果可见,利用这5种circRNA分别针对患者和健康人组织进行CRC检测,均得到良好的特异度,和可接受的灵敏度;不仅如此,我们惊讶地发现,对于在2 circRNA组、3 circRNA组和5 circRNA组分别进行联合检测的情况下,所得的检测结果相比于单一circRNA检测均具有明显更优异的灵敏度,即检出率明显高于单一circRNA的检测效果。
如图4的ROC曲线所示,五个circRNA组合评分的ROC曲线下面积(AUC)为0.930,此外2 circRNA组AUC为0.814,3 circRNA组AUC为0.891,均大于单个circRNA评分AUC(总面积为1),说明circRNA组合评分具有较高的CRC诊断价值,并具有统计学差异(P<0.001),即评分越高提示CRC的可能性越大。与此相比,单个circRNA的诊断灵敏度较低,且ROC曲线AUC较小。如表2所示,粪便的五个circRNA组合评分>1.5可作为判断存在肿瘤细胞的指标,灵敏度为86.7%,特异度为91.7%。
以上结果说明,上述五种circRNA均具有针对CRC组织进行检测的诊断价值,不仅如此,以2 circRNA组、3 circRNA组或5 circRNA组进行联合诊断的情况下,均可得到比单一circRNA更高的CRC诊断灵敏度,具有优秀的作为诊断标志物的潜力。
实施例2
本实施例以PCR反应体系设计为例说明如何在CRC患者肿瘤组织和患者粪便排泄物中检测SEQ-ID.6至7的表达水平,并对其诊断价值进行统计学分析。
1.标本收集:CRC患者液氮冻存肿瘤组织及其癌旁组织由美国辛辛那提大学肿瘤研究中心提供。样品分为4组:正常对照组(n=53);腺瘤组(n=78);肠癌早期(I至II期)的CRC病灶组(n=80)及癌旁组(n=80)。6例CRC患者手术前后的粪便样品由郑州大学第一附属医院提供。每例患者标本均有明确的诊断记录,并通过伦理委员会同意。
2.总RNA提取:所有实验均使用无RNA酶Eppendorf管和吸管。取50mg组织,剪碎,加入1mL TRIzol(InvitrogenTM),用匀浆机匀浆,加入1/5体积的氯仿,震荡混匀约10秒,室温下静置5分钟,离心(12,000rpm,4℃)15分钟,小心吸取上层水相约400μL。取1g粪便样品,加入2mL TRIzol LS(InvitrogenTM),用匀浆机匀浆,离心后取1mL上清,加入1/5体积的氯仿,震荡混匀约10秒,室温下静置5分钟,离心(12,000rpm,4℃)15分钟,小心吸取上层水相约400μL。将所收集的上层水相移至一个新Eppendorf管中,加入等体积的乙醇,反复颠倒混匀,用RNA Mini试剂盒(Ambion)进行RNA分离纯化和洗涤,最后加入30μL无核酶水洗脱。RNA溶液用NanoDrop2000检测纯度及浓度,-80℃保存备用,总质量大于1μg的样品可用于进一步实验。
3.基于荧光的原位杂交技术(Fluorescence based in situ hybridization,FISH):从Affymetrix公司订购标记为不同颜色的miR-21与miR-135b的即用型分子探针(ViewRNATM miRNA ISH Cell Assay)。合成的探针为一种单分子、非放射性寡核苷酸,通过与细胞内靶核酸分子结合,从而标记microRNA。根据说明书要求及操作步骤,在避光条件下将探针与固定化的细胞玻片进行孵育,细胞核染色,洗涤、封片后,在荧光显微镜下进行检测。
4.逆转录:用miScript PCR Starter试剂盒(Qiagen)将总RNA逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。按照试剂盒说明,反应体系(20μl)为:4μl miScript HiFlex缓冲剂,2μlmiScript Nucleics Mix,2μl miScript反转录酶Mix,0.5μg总RNA和无核酶水。反应在普通PCR仪进行,反应条件为:循环1:37℃ 60分钟;循环2:95℃ 5分钟;循环3:4℃结束。逆转录产物于-20℃保存备用。
5.定量PCR:用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)检测样品中microRNA的表达水平。PCR引物由Eurofins Genomics合成。miR-135b上游引物为5’TATGGCTTTTCATTCCTATGTGA3’,miR-21的上游引物为5’TAGCTTATCAGACTGATGTTGA3’,而下游通用引物由Qiagen提供。内参基因RNU6上下游引物分别是5’CTCGCTTCGGCAGCACA3’和5’AACGCTTCACGAATTTGCGT3’。按照试剂盒说明,反应体系(20μl)为:0.5μl上游引物(10μM),0.5μl下游引物(10μM),1μl cDNA,10μl 2x QuantiTect SYBR Mix和8μl无RNA酶水。PCR扩增在定量PCR仪(Bio-Rad)中进行,反应条件为:循环1:95℃ 15分钟;循环2:95℃ 15秒;循环3:56℃ 30秒;循环4:70℃ 30秒;循环5:重复循环2至4×50;循环6:熔解曲线-56℃至95℃(1℃每15秒);结束。设定PCR扩增曲线阈值,获取Ct值。
6.基因表达水平计算:定量PCR程序结束后,设定荧光阈值,设置的原则是要大于样本的荧光背景值(前15个循环信号),同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,使真正的信号是超过域值的荧光信号,从而得到各组PCR扩增反应的Ct值。采用参照基因ΔCt法分析,以细胞内看家基因RNU6表达PCR反应的Ct值作为相对标准,目的基因circRNA相对表达水平计算公式为:2-ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。如果表达水平过低(Ct>50),Ct按50计算。以ΔCt(circRNA-内参基因)差值界定circRNA表达呈阴(ΔCt>20)或阳(ΔCt<20)性。
7.统计分析:利用SPSS 13.0软件统计进行数据分析。患者肿瘤组织和癌旁组织的差异采用配对t检验。患者术前和术后粪便microRNA表达差异采用配对t检验。microRNA检测率采用ROC曲线分析。P≤0.05认为有统计学差异。
8.研究结果:如图5A所示,miR-21和miR-135b在腺瘤组(分别升高3.8倍和4.2倍)及肠癌早期组(分别升高4.7倍和9.1倍)中显著升高,并且在正常组与癌旁组之间也没有显著差异。
进一步通过ROC曲线分析microRNA诊断效果(图5B)。我们惊讶地发现,如果将这两个miRNA组合作为检测指标,曲线下面积(AUC)可达0.96,比单个miR-21或miR-135b的诊断灵敏度更高。当特异度为90%时,miRNA组合的诊断灵敏度可达93%,但单个miR-21或miR-135b的诊断灵敏度均低于60%(图5B)。由此可见,将miR-21和miR-135b作为联合诊断的靶标,可以获得相比于单一microRNA显著更好的诊断效果。
另外,我们从结直肠癌患者粪便中提取脱落细胞,进行双荧光探针标记检测。如图6所示,视野中心的细胞这两个miRNA均存在较高的表达;而右上角的细胞中,miR-21的表达略有降低,而miR-135b则几乎不表达。该结果提示,使用双色荧光探针的方法,能够通过统计双色阳性的细胞比例,从而对筛查者进行判断,然而单一miRNA染色检测的灵敏性较差。
对6例CRC患者的术前和术后粪便进行microRNA检测(图7),PCR结果显示,患者在肿瘤切除后,miR-21和miR-135b的表达水平显著降低,提示它们是CRC肿瘤细胞的特异性标志物。
本发明的范围不受本文中所述的具体实施方案限制。实际上,根据前述描述和附图,本发明中除本文所述的那些之外的不同修改方案对于本领域技术人员将是显而易见的。这样的修改方案旨在落入所附权利要求书的范围内。此外,本文中所述的所有实施方案被认为是广泛适用的,并且在适当时可以与任何和所有其他一致实施方案组合。
本文中引用了多个出版物,其公开内容通过引用整体并入。
Claims (13)
1.circRNA检测剂在制备用于结直肠癌筛查诊断的试剂中的用途,所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的一种或更多种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述一种或更多种circRNA分别对应于SEQ-ID.1至5之一所示的序列,并且所述一种或更多种cirRNA的存在提示所述样品中存在癌细胞。
2.权利要求1所述的用途,其中所述circRNA检测剂包含用于检测1、2、3、4或5种所述circRNA序列的一种或更多种检测剂。
3.权利要求2所述的用途,其中所述circRNA检测剂包含用于对2、3、4或5种所述circRNA组合进行联合检测的一种或更多种检测剂。
4.权利要求3所述的用途,其中所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的2种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述2种circRNA分别对应于SEQ-ID.1至2之一所示的序列。
5.权利要求3所述的用途,其中所述circRNA检测剂包含用于检测人体生物样品中的3种circRNA的一种或更多种检测剂,其中所述3种circRNA分别对应于SEQ-ID.3至5之一的序列。
6.权利要求1至5中任一项所述的用途,其中所述人体生物样品包括肠道活检组织、粪便和血液样品。
7.权利要求1至5中任一项所述的用途,其中通过以下方法对circRNA检测进行评价:
对每种所检测的circRNA,将表达阳性记1分,表达阴性记0分,将总和作为circRNA评分;并且
以circRNA评分>0.5或>1.5作为将对象诊断为患有或有风险患有结直肠癌的诊断界点。
8.用于检测circRNA的试剂盒,其包含用于联合检测分别对应于SEQ-ID.1至2的circRNA的试剂,所述试剂选自探针、引物或其组合。
9.用于检测circRNA的试剂盒,其包含用于联合检测分别对应于SEQ-ID.3至5的circRNA的试剂,所述试剂选自探针、引物或其组合。
10.用于检测circRNA的试剂盒,其包含用于联合检测分别对应于SEQ-ID.1至5的circRNA的试剂,所述试剂选自探针、引物或其组合。
11.权利要求8至10中任一项所述的试剂盒,其包含用于检测所述circRNA的杂交探针核酸分子。
12.权利要求8至10中任一项所述的试剂盒,其包含用于检测所述circRNA之cDNA的引物核酸。
13.权利要求8至10中任一项所述的试剂盒,其中所述探针、引物或其组合的碱基序列对应于所述circRNA之一的序列。
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