KR20240058548A - 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 진단 또는 재발과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법 및 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 조기에 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 영상 검사에서 놓칠 수 있는 최소 잔류 암을 감지하는데에도 유용하여 유방암의 재발 여부를 예측하는 데 도움이 수 있다.
Description
본 발명은 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 진단 또는 재발과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법 및 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
수술 가능한 유방암(breast cancer, BC)은 특히 질병이 초기 단계에서 확인되고 수술 후에도 잔여 종양이 남아 있지 않은 경우, 다른 유형의 암에 비해 좋은 예후를 보인다. 따라서, 유방암이 불치의 단계에 도달하기 전에, 새로운 진단 바이오마커를 발견할 필요성이 분명히 있다.
특허문헌 1은 마이크로 RNA를 이용한 유방암 진단 기술에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA-34a를 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물에 대해 개시하고 있으나, 이를 이용한 진단 정확도는 제시하고 있지 않아, 보다 정확한 유방암 진단 또는 재발 예측 방법에 대한 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 액체 생검을 통해 유방암의 존재를 예측하기 위한 최적의 마이크로 RNA(miRNA) 시그니처를 식별하는 것을 목적으로 한다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 특정 miRNA 유전자 조합을 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 정보제공방법 및 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 조합을 포함하는 유방암 재발 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 조합을 포함하는 유방암 재발 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 유방암 진단용 조성물에서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외될 수 있고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외될 수 있고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외될 수 있고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있다.
또한, 상기 유방암 진단용 조성물은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b를 모두 포함할 수 있다.
또한, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 전술한 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물을 포함하는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트를 제공한다.
또한, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계.
또한, 상기 (a) 단계에서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외될 수 있고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외될 수 있고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외될 수 있고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있다.
추가로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계.
또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 또는 세포외 소포체일 수 있다.
또한, 상기 유방암 진단을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
또한, 상기 (a) 단계의 시료는 유방암 환자 또는 유방암 재발 환자로부터 분리된 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 또는 세포외 소포체일 수 있다.
또한, 상기 유방암 치료제 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 조기에 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 영상 검사에서 놓칠 수 있는 최소 잔류 암을 감지하는데에도 유용하여 유방암의 재발 여부를 예측하는 데 도움이 수 있다. 특히, 5종의 miRNA 유전자 조합을 모두 확인하는 경우, 높은 임상적 민감도와 특이도를 보이므로, 유방암의 발병 또는 재발 여부를 보다 정확하게 예측할 수 있다.
도 1은 유방암 진단을 위한 BEV 분석의 이점을 나타낸 것이다.
도 2는 회고적 코호트 연구 설계 및 BEV 분리 전략의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 108명의 유방암 환자, 46명의 양성 종양 환자 및 46명의 건강한 대조군을 포함한 200명의 혈장 샘플을 사용하여 BEV에서 차등적으로 발현된 miRNA 프로파일 분석을 나타낸 것이고, (B)는 항-EpCAM, CD49b 및 CD51과 결합된 자성 비드를 사용한 면역침전에 의한 BEV 농축 과정을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 RefFinder를 사용한 후보 기준 유전자의 선택을 나타낸 것으로, (A)는 Delta Ct 방법(빨간색), BestKeeper(녹색), NormFinder(파란색) 및 GeNorm(자홍색) 통계 알고리즘에 따른 40개 혈장 샘플의 BEV에서 9개의 후보 miRNA의 안정성을 평가한 것이고, (B)는 RefFinder 분석에 의해 생성된 순위를 나타낸 것이다. 이때, 최상위 기준 유전자는 굵게 표시하였다.
도 4a 내지 4d는 20명의 정상 대조군과 비교하여 20명의 유방암 환자로부터 조절되지 않은 microRNA를 식별한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a의 128개의 중첩된 유전자를 보여주는 벤 다이어그램은 TCGA에서 차등적으로 발현된 miRNA 후보의 3가지 다른 공개 데이터 세트를 보여준다. 도 4b는 유방암 환자군과 정상 대조군(Non-BC)의 BEV에서 후보 miRNA의 발현 프로파일을 qRT-PCR로 분석하여 비교한 것이다. 도 4c는 정상 대조군과 비교하여 BEV, 총 EV(total EV, TEV) 및 종양 조직에서 후보 miRNA 발현의 배수 변화를 보여준다. 도 4d는 평균 배수 변화(FC), 평균의 표준 오차(SEM) 및 BEV에서 후보 miRNA의 P 값을 나타낸 것이다. 이때, BEV에서 상향조절된 선택된 유방암 특이적 miRNA는 굵게 표시하였다.
도 5의 (A)는 유방암 환자 108명, 양성 종양 환자 46명, 건강한 대조군 46명의 혈장 샘플에서 5종의 유방암 특이적 miRNA의 검증 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 내부 대조군으로 miR-16에 대해 정규화되었다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. *P adj < 0.05; **P adj < 0.01; ***P adj < 0.001. 도 5의 (B)는 유방암이 없는 개체(양성 및 정상)와 유방암 샘플을 구별하는 5종(miR-21, miR-106, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)의 miRNA 시그니처에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이다. 곡선 아래 면적(AUC)은 진단 성능을 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 표 1에 나타낸 5종의 miRNA의 26가지 조합에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 5개의 miRNA 시그니처로 구성된 예측 지수 점수의 산점도 및 RUC 분석 결과를 나타낸 것으로, (A)는 유방암 환자(n = 108)를 유방암이 없는 대조군(n = 92)과 구별하는 예측 지수 점수의 진단 능력을 나타낸 것이다(조합 1: miR-21 및 miR-106b; 조합 2: miR-21 및 miR-484; 조합 3: miR-21, miR-106b 및 miR-484; 조합 4: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b). (B)는 재발이 없는 유방암 환자(n = 40)와 재발이 있는 유방암 환자(n = 68)를 구별하는 5종의 miRNA 조합의 진단 능력을 나타낸 것이다.
도 2는 회고적 코호트 연구 설계 및 BEV 분리 전략의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 108명의 유방암 환자, 46명의 양성 종양 환자 및 46명의 건강한 대조군을 포함한 200명의 혈장 샘플을 사용하여 BEV에서 차등적으로 발현된 miRNA 프로파일 분석을 나타낸 것이고, (B)는 항-EpCAM, CD49b 및 CD51과 결합된 자성 비드를 사용한 면역침전에 의한 BEV 농축 과정을 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 RefFinder를 사용한 후보 기준 유전자의 선택을 나타낸 것으로, (A)는 Delta Ct 방법(빨간색), BestKeeper(녹색), NormFinder(파란색) 및 GeNorm(자홍색) 통계 알고리즘에 따른 40개 혈장 샘플의 BEV에서 9개의 후보 miRNA의 안정성을 평가한 것이고, (B)는 RefFinder 분석에 의해 생성된 순위를 나타낸 것이다. 이때, 최상위 기준 유전자는 굵게 표시하였다.
도 4a 내지 4d는 20명의 정상 대조군과 비교하여 20명의 유방암 환자로부터 조절되지 않은 microRNA를 식별한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a의 128개의 중첩된 유전자를 보여주는 벤 다이어그램은 TCGA에서 차등적으로 발현된 miRNA 후보의 3가지 다른 공개 데이터 세트를 보여준다. 도 4b는 유방암 환자군과 정상 대조군(Non-BC)의 BEV에서 후보 miRNA의 발현 프로파일을 qRT-PCR로 분석하여 비교한 것이다. 도 4c는 정상 대조군과 비교하여 BEV, 총 EV(total EV, TEV) 및 종양 조직에서 후보 miRNA 발현의 배수 변화를 보여준다. 도 4d는 평균 배수 변화(FC), 평균의 표준 오차(SEM) 및 BEV에서 후보 miRNA의 P 값을 나타낸 것이다. 이때, BEV에서 상향조절된 선택된 유방암 특이적 miRNA는 굵게 표시하였다.
도 5의 (A)는 유방암 환자 108명, 양성 종양 환자 46명, 건강한 대조군 46명의 혈장 샘플에서 5종의 유방암 특이적 miRNA의 검증 결과를 나타낸 것이다. 데이터는 내부 대조군으로 miR-16에 대해 정규화되었다. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. *P adj < 0.05; **P adj < 0.01; ***P adj < 0.001. 도 5의 (B)는 유방암이 없는 개체(양성 및 정상)와 유방암 샘플을 구별하는 5종(miR-21, miR-106, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)의 miRNA 시그니처에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이다. 곡선 아래 면적(AUC)은 진단 성능을 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 표 1에 나타낸 5종의 miRNA의 26가지 조합에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 5개의 miRNA 시그니처로 구성된 예측 지수 점수의 산점도 및 RUC 분석 결과를 나타낸 것으로, (A)는 유방암 환자(n = 108)를 유방암이 없는 대조군(n = 92)과 구별하는 예측 지수 점수의 진단 능력을 나타낸 것이다(조합 1: miR-21 및 miR-106b; 조합 2: miR-21 및 miR-484; 조합 3: miR-21, miR-106b 및 miR-484; 조합 4: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b). (B)는 재발이 없는 유방암 환자(n = 40)와 재발이 있는 유방암 환자(n = 68)를 구별하는 5종의 miRNA 조합의 진단 능력을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
상술한 바와 같이, 유방암을 조기에 진단할 수 있는 새로운 진단 바이오마커의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 액체 생검을 통해 유방암의 존재를 예측하기 위한 최적의 miRNA 유전자 조합을 확인함으로써, 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 유방암에 특이적인 miRNA 바이오마커를 발굴하기 위해, TCGA 공개 데이터 세트를 이용하여 유방암 유래 세포외 소포체 (Breast cancer-derived extracellular vesicles, BEV)에서 다음과 같이 13종의 후보 miRNA를 도출하였다: miR-9, miR-10b, miR-21, miR-96, miR-106b, miR-128, miR-155, miR-181a, miR-484, miR-429, miR-1290 및 miR-1260b.
정상 대조군, 유방암 환자 및 재발 유방암 환자를 포함하여, 200명의 혈장 샘플에서 얻은 BEV에서 상기 도출된 13종의 후보 miRNA 중 내인성 대조군으로 사용한 miR-16을 제외한 나머지 12종의 후보 miRNA 발현 프로파일을 검증하기 위해 정량적 PCR(RT-qPCR)을 사용하였다. 이때, BEV는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 대한 항체로 표지된 자성 비드를 사용하여 면역 캡처(immuno-capture)로 분리하였다. 도 4b의 RT-qPCR 결과에 따라, ct>35인 4종의 miRNA(즉, miR-10b, miR-96, miR-128 및 miR-429)을 제외하였다. 추가로, 유방암이 없는 개체와 비교하여 BEV, TEV 및 종양 조직에서 후보 miRNA 발현의 배수 변화, BEV에서 후보 miRNA의 평균 배수 변화(FC), 평균의 표준 오차(SEM) 및 P 값을 종합적으로 고려하여, BEV에서 상향조절되는 유방암 특이적 miRNA 5종을 다음과 같이 최종 선별하였다: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b.
최종 선별된 5종의 miRNA 유전자를 표 1 및 도 6a 내지 6c에 나타난 바와 같이 다양하게 조합하여 조합별 진단 성적을 분석한 결과, 조합 5, 6, 8 내지 10, 17, 20 및 22를 제외한 나머지 모든 조합에서 0.9 < AUC ≤ 1.0의 우수한 진단 성능을 나타내었다.
또한, 상기 5종의 miRNA 유전자 조합은 도 7에 나타난 바와 같이 유방암 재발이 없는 환자와 유방암이 재발된 환자를 구분하는데에도 적용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물 및 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b 5종의 miRNA 유전자를 포함하는 유방암 재발 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 유방암 발병 또는 재발 여부를 예측해내는 기준이 되는 miRNA 유전자를 지칭한다. 바이오마커가 miRNA인 경우 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "miRNA"는 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어 RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 miRNA는 특정 염기서열 (또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체 (pre-miRNA, primiRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체 (즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 miRNA의 상보서열과 혼성화되는 염기서열을 갖는 miRNA를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 언급된 miRNA는 miR 유전자의 유전자 산물일 수 있고, 그러한 유전자산물은 성숙 miRNA (예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기 또는 19~25 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "핵산"이란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈DNA, 및 합성DNA 모두가 포함된다. 또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding) RNA 및 합성 RNA 모두가 포함된다. 본 발명에 있어서 "합성 DNA" 및 "합성 RNA"는 소정의 염기서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 좋음)에 의거하여, 예를 들면 자동핵산 합성기를 사용하여 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 발명에 있어서 "비천연형 서열"은 광의의 의미로 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 상이한, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 유방암의 발병 또는 재발 여부를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명의 유방암 진단용 바이오마커 조성물에 있어서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외되고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외되고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외되고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외되고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있다.
상기 제1 측면과 관련하여, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 상기 제1 측면과 관련하여, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 재발 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 유방암 진단용 바이오마커 조성물에서 상기 (i) 내지 (v)에 정의된 miRNA 유전자 조합은 제외되므로, 이들을 제외한 나머지 다른 miRNA 유전자 조합의 발현 수준을 측정하는 제제가 본 발명의 유방암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 포함된다.
마찬가지로, 상기 유방암 재발 예측용 바이오마커 조성물은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 조합을 포함하므로, 이들 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 모두 측정하는 제제가 본 발명의 유방암 재발 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 포함된다.
본 발명의 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물 및 키트에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 miRNA 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 유방암을 진단하거나 재발을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 miRNA 유전자 바이오마커의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 miRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 miRNA 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 유방암 진단 또는 재발을 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 이용되는 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, miRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 특정 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고(align), 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 동일성, 더욱 구체적으로 70%의 동일성, 더더욱 구체적으로 80%의 동일성, 가장 구체적으로 90%의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 유방암 진단용 조성물 및 키트는 전술한 5종의 miRNA 유전자 중 적어도 2종 이상에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 유방암 재발 예측용 조성물 및 키트는 전술한 5종의 miRNA 유전자에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양함), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 핵산 (예를 들면, 총 RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 췌장암에 대한 바이오마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.
본 발명의 제2 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 진단을 위한 정보제공방법 및 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 5종의 miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, 유방암의 진단 또는 재발 예측에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 유방암 진단을 위한 정보제공방법은 BEV의 miRNA를 이용하여, 본 발명에 따른 2종 이상의 miRNA 수준이 유방암이 없는 정상 대조군에 비해 증가되었을 때, 유방암의 발병이나 발병 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은 BEV의 miRNA를 이용하여, 본 발명에 따른 5종의 miRNA 수준이 유방암이 재발되지 않은 환자에 비해 증가되었을 때, 유방암의 재발이나 재발 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 이때, 유방암이 재발되지 않은 환자는 근치적 수술 후 5년 이내에 영상의학적 진단 소견을 통해 유방암이 재발하거나 전이되지 않은 환자를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계.
본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법의 (a) 단계에서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외되고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외되고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외되고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외되고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외될 수 있다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체" 또는 "환자"는 유방암이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "생물학적 시료"는 정상적인 상태와 구별될 수 있는 유방암 진단 또는 재발에 특이적인 miRNA 유전자를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 예를 들어, 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 또는 세포외 소포체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 세포는 유방 세포일 수 있고, 상기 조직은 유방 조직일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 miRNA는 혈액 또는 혈장으로부터 분리될 수 있다. 액체 생검(liquid biopsy)을 이용하면, 조직 검사와 같은 침습적인 방법과 달리 검사자에게 고통을 주지 않으면서 질병을 진단하는 것이 가능하다. 또한, 액체 생검을 이용하는 경우 유방암이 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로 조기 진단을 실시하거나, 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 있어 조직검사에 비하여 큰 이점을 가진다.
보다 구체적으로, 상기 miRNA는 혈액 또는 혈장으로부터 분리된 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체(BEV)로부터 추출될 수 있다.
세포외 소포체(extracellular vesicles, EV)는 종양 유래 바이오마커, 특히 고농도의 miRNA를 제공할 수 있고, 혈액에서 이들의 카르고(cargo)를 보호할 수 있다. 그러나, EV는 거의 모든 종류의 세포에서 방출되기 때문에 EV를 사용하는 생물학적 환경에서 상당한 이질성이 관찰될 수 있다. 현재 PEG 침전(Total Exosome Isolation kit 및 ExoQuick) 및 초원심분리(UC)를 기반으로 하는 여러 상용 EV 분리 키트가 TEV 분리에 사용된다. TEV 분리는 면역 포획 기반 EV 분리 기술에 비해 더 높은 수율을 나타내지만, TEV는 암 이질성을 포착하거나 종양 특성을 반영할 수 없다. 따라서, 본 발명에서는 후보 암 표면 마커 EpCAM, CD49b 및 CD51을 사용하여 TEV와 BEV를 구별하였다. BEV는 자유 순환 miRNA보다 더 높은 민감도와 특이도를 갖는다.
본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 miRNA 유전자의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 혼성화법 또는 유전자 증폭방법으로 측정될 수 있다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 miRNA의 존재를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 혈장에서 분리한 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이러한 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 miRNA 유전자 서열에 대한 혼성화 시그널이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료보다 상향 조절(up-regulation)되는 경우에는 유방암으로 진단된다.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 miRNA 유전자 서열에 대한 혼성화 시그널이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료보다 상향 조절(up-regulation)되는 경우에는 유방암이 재발한 것으로 진단된다.
본 발명의 제3 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 치료제 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 유방암 환자로부터 분리된 것으로, 전술한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법에 사용되는 시료와 동일하다.
본 발명의 용어, "유방암 치료제의 후보물질"은 유방암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 유방암을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능한 예상 물질을 모두 포함한다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 따르면, 상기 (b) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
miRNA 바이오마커 발굴을 위한 샘플 준비
1-1. 임상 코호트 연구
총 200명의 대상자(유방암 환자 108명, 유방 양성 질환 환자 46명, 유방 관련 질환이 없는 여성 46명)이 본 연구에 등록되었다. 본 연구에 등록된 대상자들은 혈액 샘플 사용을 위한 연구 활용 동의를 받았으며, 임상 샘플은 연세대학교 의과대학 연구윤리위원회로부터 심의를 받았다(IRB No. 4-2020-1292, 2021년 1월 4일 승인). 유방암 환자 근치적 외과 수술 전, 외래를 통해 채혈하여 샘플을 확보하였다. 분석에 포함하기 위한 대상자 선정 기준은 다음과 같다: (1) 채혈 전, 화학 요법 또는 방사선 요법 등의 치료를 받지 않음, (2) 암 코호트 등록을 위한 유방암 또는 유방 양성 질환으로 확인된 영상의학적, 병리학적 진단 결과 확인.
1-2. 샘플 준비
임상 샘플을 사용하는 실험 세팅에서, EV 분리는 총 EV (TEV) 분리와 유방암 유래 EV(BEV) 분리로 분류되었다. 구체적으로, 도 2에 나타낸 바와 같이 TEV는 상용 침전 기반 Total Exosomes Isolation 키트(Invitrogen, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 200 μL의 혈장으로부터 분리하였고, BEV는 면역 친화성 기반 방법을 사용하여 분리하였다. BEV의 면역학적 포획을 위해, EpCAM, CD49b 및 CD51에 대한 비오티닐화된 항체와 결합된 자기 비드 (Dynabeads? M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. EpCAM, CD49b 및 CD51는 Human Protein Atlas (HPA, www.proteinatlas.org, 2021년 1월 15일에 액세스, 도 1)에 접근하여 "예상된 막 단백질 (Predicted Membranous protein)", "모든 암에서 검출 (Detected in all cancer)" 및 "유방암 조직에서 강한/중간 발현"과 같은 분류 기준에 따라 후보 암 표면 마커로 선택되었다. HPA 프로그램은 다양한 오믹스 (omics) 기술을 통합하여 모든 인간 단백질을 맵핑하는 것을 목표로 하는 개방형 데이터베이스이다.
RefFinder를 이용한 후보 기준 유전자의 선별
BestKeeper, NormFinder, Delta Ct 방법 및 GeNorm을 포함한 통계 알고리즘을 사용하여 각 샘플 Cq 값에 대해 적절한 기준 miRNA 유전자를 확인하였다 (도 3a). 기준 유전자의 종합적인 순위는 RefFinder에 의해 생성되었으며, 이는 4가지 알고리즘에 의해 생성된 결과를 고려한다. 이 순위에 따라, miR-16은 혈장 샘플에서 유래한 세포외 소포체 내에서 가장 안정적인 기준 miRNA 유전자임을 확인하였다 (도 3b). 이러한 결과는 다른 기준 유전자 검증 연구와 일치하여 유전자 안정성 분석의 실험 설정이 신뢰할 수 있음을 나타낸다.
유방암 특이적 miRNA의 발현 패턴 분석
본 발명자들은 유방암 특이적 막단백질을 이용하여 분리한 BEV 내 miRNA 발현이 총 EV(TEV)와 다를 수 있다고 추측하였고, 유방암에 보다 특이적일 것으로 예상하였다. TCGA 공개 데이터베이스와 연구 문헌의 검토를 통해 12종의 후보 miRNA를 선정하였다. 유방암 유래 BEV 내 선정한 후보 miRNA의 발현 패턴을 분석하기 위해, 총 40명(유방암 환자 20명, 유방암이 아닌 여성 20명)의 혈장을 이용하여 qRT-PCR 분석 및 비교를 수행하였다. 도 4a는 최종 결과물을 요약한 것이다. 12종의 후보 miRNA를 분석한 결과, 도 4b에서 확인되는 바와 같이 유방암 환자에서 miR-21, miR-106b, miR-108a, miR-484 및 miR-1260b가 높게 발현하며, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
면역 친화적 방법으로 수득된 유방암 유래 BEV 내 miRNA, 면역 친화적 방법으로 수득된 TEV 및 조직 유래 면역 EV, 그리고 원심분리방법을 통해 수득된 EV 내 miRNA(유방암이 아닌 여성 유래 EV, 음성 대조군)의 발현 패턴을 비교 분석하였다. 분석 결과, 도 4c 및 4d에서 확인되는 바와 같이 면역 친화적 방법으로 수득된 유방암 유래 BEV 내 12개의 후보 miRNA 중 5개 (miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)의 발현이 상향 조절되었고, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
결론적으로, 도 4d에 나타낸 바와 같이 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 발현은 유방암이 아닌 여성(음성 대조군) 유래 EV에 비해 유방암 환자에서 6.08, 1.73, 2.05, 1.72 및 2.31배 더 높았다.
유방암 특이적 miRNA 검증
92명의 유방암이 아닌 여성으로부터 유래된 대조군 샘플은 유방 양성 질환 환자 46명, 유방암 관련 질환이 없는 여성 46명으로 구성되어 있으므로, 세부 대조군 별 miRNA 발현 차이를 비교하였다. 도 5에서 확인되는 바와 같이 miR-21, miR-106b 및 miR-484 각각은 전체 대조군 대비 유방암 환자에서 상향 조절되었으며 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 또한, miR-181a 및 miR-1260b는 유방 관련 질환이 없는 여성과 유방암 환자에서만 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 각각의 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 곡선 아래 면적 (AUC) 값은 0.77, 0.78, 0.63, 0.68 및 0.64으로 분석되었다. 따라서, 상기 5개의 miRNA는 다중 패널 분석을 위해 추가로 검증되었다.
다양한 miRNA 조합에 따른 진단 성능 확인
단독 miRNA의 유방암 진단 성능을 제고하기 위해, 로지스틱 회귀를 사용하여 miRNA 다중 패널의 성능을 평가하였다. 표 1 및 도 6a 내지 6c에 요약된 바와 같이, 다중 miRNA 패널 조합 중, 곡선 아래 면적이 0.9 이상으로 확인되는 조합을 선정하였다. 곡선 아래 면적이 0.9이상인 다중 miRNA 패널 조합은 다음과 같다. 패널 1: miR-21 및 miR-106b; 패널 2: miR-21 및 miR-181a; 패널 3: miR-21 및 miR-484; 패널 4: miR-21 및 miR-1260b; 패널 7: miR-106b 및 miR-1260b; 패널 11: miR-21, miR-106b 및 miR-181a; 패널 12: miR-21, miR-106b 및 miR-484; 패널 13: miR-21, miR-106b 및 miR-1260b; 패널 14: miR-21, miR-181a 및 miR-484; 패널 15: miR-21, miR-181a 및 miR-1260b; 패널 16: miR-21, miR-484 및 miR-1260b; 패널 18: miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b; 패널 19: miR-106b, miR-484 및 miR-1260b; 패널 21: miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-484; 패널 23: miR-21, miR-106b, miR-484 및 miR-1260b; 패널 25: miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b; 패널 26: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b.
| No. | 조합 | 분석 여부 | AUC | SE | 95% CI | ||||
| 1 | miR-21 | miR-106b | A | 0.995 | 0.00607 | 0.983 to 1.000 | |||
| 2 | miR-21 | miR-181a | A | 0.987 | 0.0119 | 0.964 to 1.000 | |||
| 3 | miR-21 | miR-484 | A | 0.987 | 0.0119 | 0.964 to 1.000 | |||
| 4 | miR-21 | miR-1260b | A | 0.99 | 0.00973 | 0.971 to 1.000 | |||
| 5 | miR-106b | miR-181a | A | 0.833 | 0.0624 | 0.710 to 0.955 | |||
| 6 | miR-106b | miR-484 | A | 0.842 | 0.0615 | 0.722 to 0.963 | |||
| 7 | miR-106b | miR-1260b | A | 0.963 | 0.0243 | 0.915 to 1.000 | |||
| 8 | miR-181a | miR-484 | A | 0.808 | 0.0736 | 0.663 to 0.952 | |||
| 9 | miR-181a | miR-1260b | A | 0.88 | 0.0522 | 0.778 to 0.982 | |||
| 10 | miR-484 | miR-1260b | A | 0.87 | 0.0546 | 0.763 to 0.977 | |||
| 11 | miR-21 | miR-106b | miR-181a | A | 0.992 | 0.00855 | 0.976 to 1.000 | ||
| 12 | miR-21 | miR-106b | miR-484 | A | 0.998 | 0.00354 | 0.991 to 1.000 | ||
| 13 | miR-21 | miR-106b | miR-1260b | A | 0.995 | 0.00607 | 0.983 to 1.000 | ||
| 14 | miR-21 | miR-181a | miR-484 | A | 0.99 | 0.011 | 0.968 to 1.000 | ||
| 15 | miR-21 | miR-181a | miR-1260b | A | 0.988 | 0.0113 | 0.965 to 1.000 | ||
| 16 | miR-21 | miR-484 | miR-1260b | A | 0.99 | 0.00973 | 0.971 to 1.000 | ||
| 17 | miR-106b | miR-181a | miR-484 | A | 0.845 | 0.061 | 0.725 to 0.965 | ||
| 18 | miR-106b | miR-181a | miR-1260b | A | 0.968 | 0.0219 | 0.925 to 1.000 | ||
| 19 | miR-106b | miR-484 | miR-1260b | A | 0.967 | 0.0242 | 0.920 to 1.000 | ||
| 20 | miR-181a | miR-484 | miR-1260b | A | 0.878 | 0.0529 | 0.774 to 0.981 | ||
| 21 | miR-21 | miR-106b | miR-181a | miR-484 | A | 0.998 | 0.00354 | 0.991 to 1.000 | |
| 22 | miR-21 | miR-106b | miR-181a | miR-1260b | NA | ||||
| 23 | miR-21 | miR-106b | miR-484 | miR-1260b | A | 1 | 0 | 1.000 to 1.000 | |
| 24 | miR-21 | miR-181a | miR-484 | miR-1260b | A | 0.992 | 0.00855 | 0.976 to 1.000 | |
| 25 | miR-106b | miR-181a | miR-484 | miR-1260b | A | 0.967 | 0.0242 | 0.920 to 1.000 | |
| 26 | miR-21 | miR-106b | miR-181a | miR-484 | miR-1260b | A | 1 | 0 | 1.000 to 1.000 |
Claims (20)
- miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외되고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외되고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외되고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외되고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외되는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물. - miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 조합을 포함하는 유방암 재발 예측용 바이오마커 조성물.
- miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외되고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외되고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외되고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외되고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외되는, 유방암 진단용 조성물. - miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 재발 예측용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 유방암 진단용 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 유방암 재발 예측용 조성물.
- 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트.
- 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트.
- (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법. - 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계에서,
(i) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-106b를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-181a 또는 miR-484는 제외되고,
(ii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-181a를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-484 또는 miR-1260b는 제외되고,
(iii) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 miR-484를 포함하는 2종의 miRNA 유전자 조합인 경우, 나머지 선택되는 다른 하나의 miRNA 유전자로 miR-1260b는 제외되고,
(iv) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 3종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-106b, miR-181a 및 miR-484의 조합 및 miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 조합은 제외되고,
(v) 상기 선택되는 miRNA 유전자가 4종의 miRNA 유전자 조합인 경우, miR-21, miR-106b, miR-181a 및 miR-1260b의 조합은 제외되는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법. - 제11항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 및 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
- 제11항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
- (a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법. - 제15항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 및 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
- 제15항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
- (a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제의 스크리닝 방법. - 제18항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 유방암 환자 또는 유방암 재발 환자로부터 분리된 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변, 유즙, 이들로부터 유래된 엑소좀 및 세포외 소포체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 유방암 치료제의 스크리닝 방법.
- 제18항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 2종 이상의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 치료제의 스크리닝 방법.
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