WO2024091020A1 - 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024091020A1
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mir
mirna
recurrence
kit
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김승일
김지예
김민우
김용
이수지
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연세대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to extracellular vesicle-derived miRNA gene biomarkers and their use for breast cancer diagnosis or recurrence prediction, and more specifically, to breast cancer diagnosis or recurrence-related miRNA gene biomarkers, compositions and kits for breast cancer diagnosis or recurrence prediction, This provides a method of providing information for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer and a screening method for breast cancer treatment.
  • Patent Document 1 relates to breast cancer diagnosis technology using micro RNA, and specifically discloses a composition for breast cancer diagnosis containing an agent that measures miRNA-34a, but does not suggest the accuracy of diagnosis using this, thereby providing a more accurate diagnosis of breast cancer. Alternatively, the development of a recurrence prediction method is still required.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2022-0104897
  • the present invention aims to identify optimal microRNA (miRNA) signatures for predicting the presence of breast cancer through liquid biopsy.
  • miRNA microRNA
  • the purpose of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer containing a specific miRNA gene combination, a composition using the same for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer, a kit, an information provision method, and a breast cancer treatment screening method.
  • the present invention provides a biomarker composition for breast cancer diagnosis or recurrence prediction, including the miRNA genes: miR-21, MiR-106b, MiR-181a, MiR-484, and MiR-1260b.
  • the present invention provides a composition for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer, including an agent for measuring the expression level of the miRNA genes, and a breast cancer composition comprising the composition.
  • a kit for diagnosis or recurrence prediction is provided.
  • the expression level of the miRNA gene can be detected in breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles.
  • the breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles can be separated using antibodies that specifically bind to EpCAM, CD49b, and CD51, respectively.
  • an agent for measuring the expression level of the miRNA gene may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
  • the kit is selected from the group consisting of RT-PCR kit, competitive RT-PCR kit, real-time RT-PCR kit, DNA chip kit, microarray kit, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit, and gene chip kit. There may be more than one selected.
  • the present invention provides an information provision method for breast cancer diagnosis comprising the following steps:
  • step (b) Comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the same miRNA genes in biological samples isolated from individuals without breast cancer.
  • the biological sample may include breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles.
  • the breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles can be isolated using antibodies that specifically bind to EpCAM, CD49b, and CD51.
  • the method of providing information for the diagnosis of breast cancer is: (c) the expression levels of the five types of miRNA genes measured in the biological sample in step (a) are measured in the biological sample isolated from an individual without breast cancer. If the expression level of the same miRNA gene is higher, an additional step of diagnosing breast cancer may be included.
  • the present invention provides an information providing method for predicting breast cancer recurrence comprising the following steps:
  • step (b) Comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the same miRNA genes in biological samples isolated from patients whose breast cancer did not recur.
  • the information provision method for predicting breast cancer recurrence is: (c) the expression level of the miRNA gene measured in the biological sample in step (a) is measured in a biological sample isolated from a patient whose breast cancer did not recur. If the expression level of the same miRNA gene is higher, an additional step of determining that breast cancer has recurred may be included.
  • the present invention provides a screening method for a breast cancer therapeutic agent comprising the following steps:
  • the breast cancer treatment screening method is (c) when the expression level of the five types of miRNA genes measured in step (b) is suppressed compared to the sample not treated with the candidate substance, in step (b)
  • An additional step of determining the processed candidate material as a treatment for breast cancer may be included.
  • the biomarker composition containing five types of miRNA genes according to the present invention can not only diagnose breast cancer at an early stage, but is also useful in detecting minimal residual cancer that may be missed in imaging tests, thereby predicting recurrence of breast cancer. It can be helpful. In particular, when all five types of miRNA gene combinations are identified, high clinical sensitivity and specificity can be observed, making it possible to more accurately predict the onset or recurrence of breast cancer.
  • Figure 1 shows the benefits of BEV analysis for breast cancer diagnosis.
  • Figure 2 confirms the ratio of surface markers (EpCAM, ITGAV, and ITGA2) on BEV isolated from various breast cancer cell lines.
  • Figure 3 shows a schematic of the retrospective cohort study design and BEV isolation strategy, (A) showing differential differentiation in BEV using plasma samples from 211 patients, including 120 breast cancer patients, 46 patients with benign tumors, and 45 healthy controls. shows the analysis of the expressed miRNA profile, and (B) shows the BEV enrichment process by immunoprecipitation using magnetic beads coupled with anti-EpCAM, CD49b, and CD51.
  • Figures 4a and 4b show the selection of candidate reference genes using RefFinder, with Figure 4a showing the selection of 40 plasma samples according to the Delta Ct method (red), BestKeeper (green), NormFinder (blue), and GeNorm (magenta) statistical algorithms. The stability of nine candidate miRNAs was evaluated in BEV, and Figure 4b shows the ranking generated by RefFinder analysis. At this time, the highest reference genes are indicated in bold.
  • Figure 5A shows three different public data sets of differentially expressed miRNA candidates in TCGA with a Venn diagram showing 128 overlapping genes.
  • Figure 5b shows the results of qRT-PCR analysis of the expression profile of candidate miRNAs in BEVs isolated from various breast cancer cell lines.
  • Figure 5c compares the expression profiles of candidate miRNAs in the plasma of breast cancer patients and normal controls (Non-BC) by qRT-PCR.
  • Figure 5D is a graph showing the fold change of candidate miRNA expression in BEV compared to total EV (TEV) and tumor tissue, and the mean fold change (FC), standard error of the mean (SEM), and standard error of the mean (SEM) of candidate miRNA expression in BEV. This shows the P value.
  • Figure 5e shows the results of each ROC analysis for candidate miRNA expression in tumor tissue, TEV, and BEV.
  • Figure 6 shows the fold change in the expression of five breast cancer-specific miRNAs in TEV and BEV of 114 breast cancer patients, 45 patients with benign tumors, and 46 healthy controls.
  • Figure 7a shows the ROC analysis results for the five combinations (Combination 23, Combination 26, Combination 12, Combination 21, and Combination 1) with the highest AUC in Table 2.
  • Area under the curve (AUC) indicates diagnostic performance.
  • Figure 7b shows the ROC analysis results for Combination 26 (miRNA signature) (top left), the expected index of Combination 26 (top right) in breast cancer, breast benign tumor, and healthy donors, and the sensitivity and specificity of Combination 26.
  • ROC curve (top right) showing the recurrence prediction performance of (miRNA signature), graph (bottom left) showing fold changes for each of the five types of miRNAs in breast cancer patients without recurrence and breast cancer patients with recurrence (bottom left), and A graph (bottom right) showing the prediction index for the above five types of miRNA combinations (miRNA signatures) in breast cancer patients and breast cancer patients with recurrence is shown.
  • Figure 9 retrospectively tracks the clinical information of patients diagnosed as having benign breast tumors, confirms the results of mammography (BI-RADS), and then identifies five miRNA signatures (miR-21, miR-106b, and miR-181a). ,miR-484 andmiR-1260b) were used to analyze the probability of determining a patient who did not require tissue biopsy as a true negative.
  • Figure 10 shows the prediction score according to the increase in breast density using five miRNA signatures (miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b).
  • the present inventors sought a solution to the above-mentioned problem by identifying the optimal combination of miRNA genes for predicting the presence of breast cancer through liquid biopsy.
  • the present inventors used the TCGA public data set to identify the following 13 candidate miRNAs from breast cancer-derived extracellular vesicles (BEV). Derived:miR-9,miR-10b,miR-16,miR-21,miR-96,miR-106b,miR-128,miR-155,miR-181a,miR-484,miR-429,miR-1290 andmiR-1260b.
  • RT-qPCR Quantitative PCR
  • the fold change in candidate miRNA expression in BEV, TEV, and tumor tissues compared to breast cancer-free subjects the mean fold change (FC), standard error of the mean (SEM), and P value of candidate miRNAs in BEV were comprehensively considered. Therefore, five breast cancer-specific miRNAs upregulated in BEV were finally selected as follows: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b.
  • the five finally selected miRNA genes were compared to the clinical performance of TEV and BEV among the multiple miRNA panel combinations, and the top AUC with the highest AUC was found in BEV. Five were selected, and among them, combination 26 with the largest AUC difference between BEV and TEV was selected as the miRNA signature.
  • the combination of the five types of miRNA genes can be applied to distinguish between patients without breast cancer recurrence and patients with breast cancer recurrence, as shown in Figure 8, and as shown in Figures 9 and 10, diagnosis using existing mammography It was confirmed that it can be used as a useful diagnostic tool to reduce the false positive rate of results.
  • the first aspect of the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer, including the following miRNA genes: MiR-21, MiR-106b, MiR-181a, MiR-484, and MiR-1260b.
  • biomarker refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the existence of a biological phenomenon
  • the biomarker of the present invention refers to a miRNA gene that serves as a standard for predicting the occurrence or recurrence of breast cancer.
  • the biomarker is a miRNA, it includes a nucleic acid sequence complementary to or flanking the marker sequence, such as a nucleic acid used as a probe or primer pair capable of amplifying the marker sequence.
  • the term "miRNA” is transcribed as an RNA precursor with a hairpin-shaped structure, cleaved by a dsRNA cleavage enzyme with RNase III cleavage activity, introduced into a protein complex called RISC, and translated into mRNA. It is intended to be used as a non-coding RNA of 15 to 25 bases that is involved in inhibition.
  • the miRNA used in the present invention is not only the miRNA represented by a specific base sequence (or sequence number), but also the precursors (pre-miRNA, primiRNA) of the above-mentioned miRNA, miRNAs with equivalent biological functions, such as homologs (i.e.
  • homologs or orthologs include, specifically, miRNAs that can be identified by miRBase release 20 (http://www.mirbase.org/) and have a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of the miRNA under strict conditions. You can.
  • the miRNA mentioned in the present invention may be a gene product of a miR gene, and such a gene product may be a mature miRNA (e.g., a ratio of 15 to 25 bases or 19 to 25 bases involved in translational inhibition of the above-mentioned mRNA).
  • coding RNA or a miRNA precursor (e.g., pre-miRNA or pri-miRNA as above).
  • nucleic acid is used for nucleic acids including both RNA, DNA, and RNA/DNA (chimera). Additionally, the DNA includes all cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. Additionally, the RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, non-coding RNA, and synthetic RNA. In the present invention, “synthetic DNA” and “synthetic RNA” are artificially produced based on a predetermined base sequence (which may be either a natural sequence or a non-natural sequence), for example, using an automatic nucleic acid synthesizer. refers to DNA and RNA.
  • non-natural sequence is intended to be used in a broad sense, and is different from the natural sequence, for example, a sequence containing substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more nucleotides (i.e. , mutation sequence), a sequence containing one or more modified nucleotides (i.e., modified sequence), etc.
  • polynucleotides are used interchangeably with nucleic acids.
  • the term "prediction" means to guess in advance about medical consequences, and for the purpose of the present invention, it means to guess in advance whether breast cancer will develop or recur.
  • the present invention provides a composition for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer, comprising an agent for measuring the expression level of miRNA genes: A kit containing this is provided.
  • an agent for measuring the expression level of the miRNA gene may include a primer or probe that specifically binds to the gene.
  • the term "primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template. It refers to a short nucleic acid sequence that performs a function.
  • breast cancer can be diagnosed or recurrence predicted based on whether a desired product is produced by performing PCR amplification using sense and antisense primers of the miRNA gene. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
  • the primers used for amplifying the mRNA of the gene are prepared under appropriate conditions in an appropriate buffer (e.g., four different nucleoside triphosphates and a polymerization agent such as DNA, RNA polymerase or reverse transcriptase) and an appropriate temperature. It can be a single-stranded oligonucleotide that can act as a starting point for template-directed DNA synthesis, and the appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use.
  • the primer sequence does not need to be completely complementary to the polynucleotide of the miRNA gene biomarker or its complementary polynucleotide, but can be used as long as it is sufficiently complementary to hybridize.
  • probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several hundreds of bases and is capable of forming a specific binding to a miRNA, and is labeled. The presence or absence of specific miRNA can be confirmed. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc. In the present invention, hybridization is performed using a probe complementary to the miRNA gene, and breast cancer diagnosis or recurrence can be predicted based on hybridization. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
  • Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologues, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro). amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • uncharged linkages e.g., methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoro
  • charged linkages e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • the base sequence of the agent for measuring the expression level of the miRNA gene used in the present invention is also a sequence that shows substantial identity with the sequence that specifically binds to the miRNA gene. It is interpreted as including.
  • the term 'substantial identity' refers to an identity of at least 60% when a specific sequence and any other sequence are aligned to the maximum extent possible and the aligned sequences are analyzed using an algorithm commonly used in the art. , more specifically refers to a sequence exhibiting 70% identity, even more specifically 80% identity, and most specifically 90% identity.
  • composition and kit for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer of the present invention may include nucleic acids capable of specifically binding to each of the five types of miRNA genes described above.
  • the kit of the present invention is any selected from the group consisting of RT-PCR kit, competitive RT-PCR kit, real-time RT-PCR kit, DNA chip kit, microarray kit, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit, and gene chip kit.
  • RT-PCR kit competitive RT-PCR kit
  • real-time RT-PCR kit DNA chip kit
  • microarray kit microarray kit
  • SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit and gene chip kit.
  • the kit may be a kit containing essential elements required to perform RT-PCR.
  • an RT-PCR kit requires, in addition to each primer specific for a miRNA gene, test tubes or other suitable containers, reaction buffer (pH and magnesium concentration vary), deoxynucleotides (dNTPs), dideoxynucleotides (ddNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitor, DEPC-water, sterilized water, etc. Additionally, it may include a primer pair specific for DNA, RNA, or miRNA used as a quantitative control.
  • the kit of the present invention may include a kit for extracting nucleic acids (e.g., total RNA), a fluorescent substance for labeling, enzymes and media for nucleic acid amplification, instructions for use, etc.
  • nucleic acids e.g., total RNA
  • the kit of the present invention is a device for measuring biomarkers for pancreatic cancer in which the nucleic acid is bound or attached to a solid phase, for example.
  • solid materials include plastic, paper, glass, silicon, etc., and plastic is a preferable solid material due to ease of processing.
  • the shape of the solid phase is arbitrary, for example, square, circular, rectangular, film-shaped, etc.
  • the second aspect of the present invention is a method of providing information for breast cancer diagnosis using the miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b miRNA gene biomarkers, and the method for providing information for breast cancer diagnosis using the biomarkers of the genes such as the following: This relates to a method of providing information for predicting breast cancer recurrence using 181a,miR-484, andmiR-1260bmiRNA gene biomarkers.
  • the term "method for providing information” refers to a method of providing information regarding the diagnosis or recurrence prediction of breast cancer.
  • the method of providing information for breast cancer diagnosis uses the miRNA of BEV, It refers to a method of obtaining information on the occurrence or likelihood of developing breast cancer (risk) when the level of two or more types of miRNA according to the present invention is increased compared to a normal control group without breast cancer.
  • the information provision method for predicting breast cancer recurrence uses BEV miRNAs to provide information on the recurrence or possibility (risk) of breast cancer when the levels of the five types of miRNAs according to the present invention are increased compared to patients without breast cancer recurrence. means how to obtain.
  • a patient whose breast cancer did not recur refers to a patient whose breast cancer did not recur or metastasize based on radiological findings within 5 years after curative surgery.
  • the information provision method for breast cancer diagnosis of the present invention may include the following steps:
  • step (b) Comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the corresponding miRNA genes in biological samples isolated from individuals without breast cancer.
  • the information provision method for predicting breast cancer recurrence of the present invention may include the following steps:
  • step (b) Comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the same miRNA genes in biological samples isolated from patients whose breast cancer did not recur.
  • the term "individual” or “patient” refers to humans who are likely to develop breast cancer or have developed it, primates including chimpanzees, pets such as dogs and cats, cattle, horses, sheep, and goats. It is interpreted to include mammals such as livestock animals such as rodents such as mice and rats.
  • the “biological sample” used for analysis includes a biological sample capable of identifying a specific miRNA gene for breast cancer diagnosis or recurrence that can be distinguished from a normal state.
  • the biological sample may include breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles.
  • the breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles may be, for example, those separated from blood, plasma, cells, tissues, saliva, sputum, hair, urine, feces, or milk, but are not limited thereto.
  • the cells may be breast cancer cells
  • the tissue may be breast cancer tissue.
  • the miRNA can be isolated from blood or plasma.
  • liquid biopsy it is possible to diagnose a disease without causing pain to the examiner, unlike invasive methods such as biopsy.
  • the use of liquid biopsy has a great advantage over biopsy in conducting early diagnosis in potential patients who have not developed breast cancer or in periodically observing the treatment progress of patients who have already developed breast cancer.
  • the miRNA can be extracted from breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles (BEV) isolated from blood or plasma.
  • BEV extracellular vesicles
  • Extracellular vesicles can provide high concentrations of tumor-derived biomarkers, especially miRNAs, and protect their cargo in the blood.
  • EVs Extracellular vesicles
  • TEV isolation yields higher yields compared to immunocapture-based EV isolation techniques, TEV cannot capture cancer heterogeneity or reflect tumor characteristics. Therefore, in the present invention, candidate cancer surface markers EpCAM, CD49b, and CD51 were used to distinguish between TEV and BEV.
  • BEV has higher sensitivity and specificity than free circulating miRNA.
  • EpCAM is an existing surface marker for isolating extracellular vesicles such as exosomes, but the proportion of cells expressing EpCAM in mesenchymal type triple-negative breast cancer is very low, so targeting it alone can efficiently identify breast cancer-derived extracellular vesicles. It was confirmed that it could not be separated.
  • the expression level of the miRNA gene according to the present invention is preferably detected in breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles (BEV).
  • BEV breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles
  • the breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles can be separated using antibodies that specifically bind to EpCAM, CD49b, and CD51, for example, antibodies that specifically bind to EpCAM, CD49b, and CD51, respectively. It can be separated by immunocapture using magnetic beads, but is not limited to this.
  • the expression levels of the five types of miRNA genes measured in the biological samples in step (a) are higher than the expression levels of the same miRNA genes measured in biological samples isolated from individuals without breast cancer. If it is high, it can be diagnosed as breast cancer.
  • the expression levels of the five types of miRNA genes measured in the biological sample in step (a) were measured in biological samples isolated from patients whose breast cancer did not recur. If the expression level of the same miRNA gene is higher, it can be determined that breast cancer has recurred.
  • the expression level of the miRNA gene of the present invention can be measured according to methods commonly used in the biokit field, such as reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time It can be measured using reverse transcriptase polymerase reaction (Real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA), Northern blotting, or gene chip.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase reaction
  • Competitive RT-PCR competitive reverse transcriptase polymerase reaction
  • Real-time RT-PCR reverse transcriptase polymerase reaction
  • RPA RNase protection assay
  • Northern blotting or gene chip.
  • the expression level of the miRNA gene can be measured by hybridization or gene amplification method.
  • the hybridization method may confirm the presence of miRNA using a probe.
  • the above-described probe is used as a hybridizable array element and is immobilized on a substrate.
  • substrates include rigid or semi-rigid supports, such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries.
  • the hybridization array elements are arranged and immobilized on the substrate. This immobilization is carried out by a chemical bonding method or a covalent bonding method such as UV.
  • the hybridized array elements can be bonded to a glass surface modified to include epoxy compounds or aldehyde groups, and can also be bonded by UV to a polylysine coated surface.
  • the hybridization array elements can be coupled to substrates through linkers (eg, ethylene glycol oligomers and diamines).
  • sample DNA applied to the microarray of the present invention can be labeled and hybridized with array elements on the microarray.
  • Hybridization conditions can be changed in various ways. Additionally, detection and analysis of the degree of hybridization can be performed in various ways depending on the labeling substance.
  • the label of the probe can provide a signal to detect hybridization, which can be linked to an oligonucleotide.
  • Suitable labels include fluorophores (e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)), terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), chromophore, and chemiluminescence.
  • fluorophores e.g., fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5 (Pharmacia)
  • TdT terminal deoxynucleotidyl transferase
  • chromophore chromophore
  • chemiluminescence chemiluminescence
  • magnetic particles, radioactive isotopes P32 or S35
  • mass labels electron-dense particles
  • enzymes alkaline
  • Labeling can be performed using various methods commonly practiced in the art, such as the nick translation method, the random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham” (1989)), and the kination method (Maxam & Gilbert, Methods). in Enzymology, 65:499 (1986)). Labels provide signals that can be detected by fluorescence, radioactivity, colorimetry, gravimetry, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, high-frequency hybridization, and nanocrystals.
  • the nucleic acid sample to be analyzed in the hybridization method can be prepared using breast cancer-derived exosomes or extracellular vesicles isolated from plasma.
  • Hybridization reaction-based analysis can also be performed by labeling the cDNA to be analyzed instead of a probe.
  • a probe is used, the probe is hybridized with the cDNA molecule.
  • suitable hybridization conditions can be determined through a series of processes through an optimization procedure. These procedures are performed as a series by those skilled in the art to establish protocols for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing time, buffer components and their pH and ionic strength depend on various factors such as the length of the probe, the amount of GC, and the target nucleotide sequence.
  • Hybridization signals can be obtained in various ways, for example, depending on the type of label bound to the probe. For example, if the probe is labeled with an enzyme, hybridization can be confirmed by reacting the enzyme's substrate with the hybridization reaction product. Enzyme/substrate combinations that can be used include peroxidase (e.g., horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, and lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate).
  • peroxidase e.g., horseradish peroxidase
  • chloronaphthol aminoethylcarbazole
  • diaminobenzidine diaminobenzidine
  • D-luciferin D-luciferin
  • lucigenin bis-N-methylacridinium nitrate
  • breast cancer is diagnosed when the hybridization signal for the miRNA gene sequence is up-regulated compared to a biological sample isolated from an individual without breast cancer.
  • the hybridization signal for the miRNA gene sequence is up-regulated compared to a biological sample isolated from a patient whose breast cancer has not recurred, breast cancer recurs. It is diagnosed as having been done.
  • the third aspect of the present invention relates to a method of screening for breast cancer treatment using miRNA gene biomarkers: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b.
  • the screening method for breast cancer treatment of the present invention may include the following steps:
  • the “sample” used for analysis is separated from a breast cancer patient and is the same as the sample used in the information provision method for diagnosing or predicting recurrence of breast cancer described above.
  • carcinoma for breast cancer treatment refers to a substance expected to be able to prevent, improve or treat breast cancer. Any substance that is expected to directly or indirectly improve or improve breast cancer can be used without limitation. , includes all expected therapeutic substances such as compounds, genes, or proteins.
  • step (b) of measuring the expression level of the miRNA gene can be performed using any method known to those skilled in the art.
  • Specific examples include PCR, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification, self-sustaining sequence cloning, nucleic acid-based sequence amplification (NASBA), co-immunoprecipitation assay, and ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), real-time RT-PCR, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • the candidate material treated in step (b) is used. It can be considered a treatment for breast cancer.
  • the fourth aspect of the present invention is a method for diagnosing and treating breast cancer using miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b miRNA gene biomarkers, and methods for diagnosing and treating breast cancer, This relates to breast cancer recurrence prediction and treatment methods using the miR-484 and miR-1260b miRNA gene biomarkers.
  • the breast cancer diagnosis and treatment method of the present invention may include the following steps:
  • step (b) comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the corresponding miRNA genes in biological samples isolated from individuals without breast cancer;
  • step (c) diagnosing breast cancer when the expression level of the five types of miRNA genes measured in the biological sample in step (a) is higher than the expression level of the same miRNA gene measured in the biological sample isolated from an individual without breast cancer;
  • steps (a) to (c) are the same as described above, so the description thereof is omitted.
  • step (d) applies breast cancer treatment to an individual diagnosed with breast cancer, where appropriate treatment includes surgery to remove cancer tissue, radiation therapy, chemotherapy, and anti-hormones. It may include, but is not limited to, one or more treatments selected from the group consisting of therapy and targeted therapy, and the skilled artisan will be able to determine the condition of the individual diagnosed with breast cancer (i.e., the patient), for example, the type of breast cancer. Depending on the condition, stage, etc., various known treatments can be appropriately selected and applied.
  • Radiation therapy uses high-energy radiation to treat tumors and is used as an adjunctive treatment to treat cancer cells that may remain after surgery. Radiation therapy is applied to prevent cancer recurrence in the remaining breast tissue after partial mastectomy, or to prevent cancer recurrence in cases where the tumor is large or has many lymph node metastases after total mastectomy. It is applied for treatment in cases of local recurrence and to relieve pain and other symptoms of metastatic lesions.
  • Chemotherapy can be used to reduce the size of the tumor before surgery, to patients at high risk of recurrence after surgery, or to patients whose cancer has spread to other organs.
  • two or more drugs are administered in combination or sequentially, and the most commonly used drugs include cyclophosphamide, methotresate, 5-FU, doxorubicin (Adriamycin), epirubicin, paclitaxel, and docetaxel.
  • anti-hormone therapy is known to be an effective adjuvant therapy with fewer side effects for patients.
  • anti-hormone therapy prevents the production of female hormones (for postmenopausal women, aromatase inhibitors such as letrozole, anastrozole, and exemestane) or administering gonadotropin-releasing hormone agonists such as goserelin to premenopausal women), or preventing it from working (administering selective estrogen receptor modulators such as tamoxifen or selective estrogen receptor down-regulators such as fulvestrant). It's a method.
  • Adjuvant anti-hormone therapy is effective in breast cancer that has hormone receptors, and the drug can be selected depending on the status and progress of menopause.
  • Targeted therapy is a treatment that selectively acts on specific molecular targets involved in the development and progression of breast cancer and inhibits their function in order to overcome the non-specificity of chemotherapy, which does not discriminate between normal and cancer cells, and the side effects caused by drug toxicity. It is a cure.
  • Representative examples include treatments targeting human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) or proteins that are amplified or overexpressed in approximately 20-25% of invasive breast cancer patients. It is known that when HER2 is overexpressed, the prognosis is poor due to rapid recurrence of breast cancer and short survival period.
  • breast cancer treatments targeting the HER2 signaling system have been developed and used, and representative treatments include trastuzumab, pertuzumab, trastuzumab emtansine, and lapatinib.
  • the method for predicting and treating breast cancer recurrence of the present invention may include the following steps:
  • step (b) comparing the expression levels of the five types of miRNA genes measured in step (a) with the expression levels of the same miRNA genes in biological samples isolated from patients whose breast cancer did not recur;
  • step (c) If the expression level of the five types of miRNA genes measured in the biological sample in step (a) above is higher than the expression level of the same miRNA gene measured in the biological sample isolated from the patient whose breast cancer did not recur, the breast cancer has recurred. a step of determining that;
  • steps (a) to (c) are the same as described above, so the description thereof is omitted.
  • step (d) applies breast cancer treatment to an individual diagnosed as having recurrence of breast cancer.
  • the appropriate treatment is the same as described above, so the description thereof is omitted.
  • treatment used in the present invention refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of breast cancer.
  • the luminal breast cancer cell lines SK-BR-3 (ATCC HTB-30), MCF7 (ATCC HTB-22) and BT-474 (ATCC HTB-20), the basal type of triple negative breast cancer (TNBC).
  • Cell lines MDA-MB-453 (ATCC HTB-131), HCC1187 (ATCC CRL-2322), MDA-MB-468 (ATCC HTB-132), HCC70 (ATCC CRL-2315), and HCC1937 (ATCC CRL-2336);
  • MDA-MB-231 (ATCC HTB-26), HCC1395 (ATCC CRL-2324), and Hs578T (ATCC HTB-126)
  • TEV was obtained using a commercial precipitation-based Total Exosomes Isolation kit (Invitrogen, Pleasanton).
  • BEVs were isolated using an immunoaffinity-based method.
  • magnetic beads DynabeadsTM M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
  • biotinylated antibodies against EpCAM, CD49b, and CD51 were used.
  • EpCAM, CD49b (integrin A2, ITGA2) and CD51 (integrin AV, ITGAV) were accessed from the Human Protein Atlas (HPA, www.proteinatlas.org, accessed January 15, 2021, Fig.
  • the HPA program is an open database that aims to map all human proteins by integrating various omics technologies.
  • EpCAM is an existing surface marker for isolating extracellular vesicles such as exosomes, but the proportion of cells expressing EpCAM in mesenchymal type triple-negative breast cancer is very low, so targeting it alone can efficiently identify breast cancer-derived extracellular vesicles. It was confirmed that it could not be separated.
  • a total of 211 subjects (120 patients with breast cancer, 46 patients with benign breast disease, and 45 women without breast-related disease) were enrolled in this study. Subjects enrolled in this study received research consent for the use of blood samples, and clinical samples were reviewed by the Research Ethics Committee of Yonsei University College of Medicine (IRB No. 4-2020-1292, approved on January 4, 2021) . Samples were obtained by collecting blood from a breast cancer patient through an outpatient clinic before curative surgery. The criteria for selecting subjects for inclusion in the analysis were as follows: (1) no treatment such as chemotherapy or radiotherapy before blood collection, (2) radiological confirmation of breast cancer or benign breast disease for cancer cohort enrollment; Confirmation of pathological diagnosis results.
  • TEV isolation was classified into total EV (TEV) isolation and breast cancer-derived EV (BEV) isolation.
  • BEV breast cancer-derived EV
  • TEV was isolated from 200 ⁇ L of plasma using a commercial precipitation-based Total Exosomes Isolation kit (Invitrogen, Pleasanton, CA, USA), and BEV was isolated using an immunoaffinity-based method.
  • BEV was isolated using an immunoaffinity-based method.
  • magnetic beads DynabeadsTM M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
  • biotinylated antibodies against EpCAM, CD49b, and CD51 were used.
  • the present inventors speculated that the expression of miRNAs in BEVs isolated using breast cancer-specific membrane proteins may be different from total EVs (TEVs), and predicted that they would be more specific to breast cancer.
  • TEVs total EVs
  • qRT-PCR analysis and comparison were performed using plasma from a total of 40 people (20 breast cancer patients and 20 non-breast cancer women).
  • miR-21 and miR-1260b were highly expressed in breast cancer patients, showing a statistically significant difference
  • miR-106b, miR-155, and miR-181a miR-106b, miR-155, and miR-181a.
  • miR-484 andmiR-1260b were highly expressed, but there was no statistically significant difference.
  • each miRNA was found to be relatively overexpressed compared to TEV.
  • Expression of miR-106b was found to be higher in TEVs of benign patients than in BEVs, but expression was particularly high only in TEVs of benign patients, so this was judged to be a false positive result. Therefore, it is not appropriate to analyze the expression level of miR-106b using TEV, and it is judged that its performance as a breast cancer biomarker can be confirmed when BEV is used.
  • Table 1 shows the clinical performance of the miRNA multiplex panel in TEV
  • Table 2 shows the clinical performance of the miRNA multiplex panel in BEV.
  • Table 1 shows the clinical performance of the miRNA multiplex panel in TEV
  • Table 2 shows the clinical performance of the miRNA multiplex panel in BEV.
  • the miRNA signature of BEV was reanalyzed in 120 breast cancer patients, and the clinical performance showed sensitivity of 85.83% and specificity of 84.62% at a cutoff value of 0.508.
  • ROC analysis was performed on 120 cases of breast cancer patients using the BEV miRNA signature.
  • 120 breast cancer patients 44 patients had recurrence, and 76 patients had no recurrence.
  • the AUC values for each candidate miRNA (miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, and miR-1260b) were analyzed as 0.592, 0.560, 0.538, 0.551, and 0.560, respectively.
  • the AUC value was found to be 0.591.
  • the average predictive index values of the miRNA signature for breast cancer patients without recurrence and breast cancer patients with recurrence were 0.748 and 0.841, respectively, showing a statistically significant difference.
  • the miRNA signature is introduced in the diagnostic evaluation of breast cancer, it is expected that 90.24% of patients diagnosed with benign breast disease who underwent unnecessary biopsy due to breast ultrasound could be judged as true negative, thereby helping in diagnosis. It is expected.

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Abstract

본 발명은 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 진단 또는 재발과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법 및 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 다양한 조합의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 조기에 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 영상 검사에서 놓칠 수 있는 최소 잔류 암을 감지하는데에도 유용하여 유방암의 재발 여부를 예측하는 데 도움이 수 있다.

Description

유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
본 발명은 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 세포외 소포체 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유방암 진단 또는 재발과 관련된 miRNA 유전자 바이오마커, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법 및 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
수술 가능한 유방암(breast cancer, BC)은 특히 질병이 초기 단계에서 확인되고 수술 후에도 잔여 종양이 남아 있지 않은 경우, 다른 유형의 암에 비해 좋은 예후를 보인다. 따라서, 유방암이 불치의 단계에 도달하기 전에, 새로운 진단 바이오마커를 발견할 필요성이 분명히 있다.
특허문헌 1은 마이크로 RNA를 이용한 유방암 진단 기술에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA-34a를 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단용 조성물에 대해 개시하고 있으나, 이를 이용한 진단 정확도는 제시하고 있지 않아, 보다 정확한 유방암 진단 또는 재발 예측 방법에 대한 개발이 여전히 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제10-2022-0104897호
본 발명은 액체 생검을 통해 유방암의 존재를 예측하기 위한 최적의 마이크로 RNA(miRNA) 시그니처를 식별하는 것을 목적으로 한다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 특정 miRNA 유전자 조합을 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물, 이를 이용한 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물, 키트, 정보제공방법 및 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체에서 검출될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을, 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 진단을 위한 정보제공방법은: (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은: (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유방암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 유방암 치료제 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 5종의 miRNA 유전자를 포함하는 바이오마커 조성물은 조기에 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 영상 검사에서 놓칠 수 있는 최소 잔류 암을 감지하는데에도 유용하여 유방암의 재발 여부를 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 특히, 5종의 miRNA 유전자 조합을 모두 확인하는 경우, 높은 임상적 민감도와 특이도를 보이므로, 유방암의 발병 또는 재발 여부를 보다 정확하게 예측할 수 있다.
도 1은 유방암 진단을 위한 BEV 분석의 이점을 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 유방암 세포주로부터 분리된 BEV에 대한 표면 마커(EpCAM, ITGAV 및 ITGA2)의 비율을 확인한 것이다.
도 3은 회고적 코호트 연구 설계 및 BEV 분리 전략의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 120명의 유방암 환자, 46명의 양성 종양 환자 및 45명의 건강한 대조군을 포함한 211명의 혈장 샘플을 사용하여 BEV에서 차등적으로 발현된 miRNA 프로파일 분석을 나타낸 것이고, (B)는 항-EpCAM, CD49b 및 CD51과 결합된 자성 비드를 사용한 면역침전에 의한 BEV 농축 과정을 나타낸 것이다.
도 4a 및 4b는 RefFinder를 사용한 후보 기준 유전자의 선택을 나타낸 것으로, 도 4a는 Delta Ct 방법(빨간색), BestKeeper(녹색), NormFinder(파란색) 및 GeNorm(자홍색) 통계 알고리즘에 따른 40개 혈장 샘플의 BEV에서 9개의 후보 miRNA의 안정성을 평가한 것이고, 도 4b는 RefFinder 분석에 의해 생성된 순위를 나타낸 것이다. 이때, 최상위 기준 유전자는 굵게 표시하였다.
도 5a는 128개의 중첩된 유전자를 보여주는 벤 다이어그램으로 TCGA에서 차등적으로 발현된 miRNA 후보의 3가지 다른 공개 데이터 세트를 보여준다.
도 5b는 다양한 유방암 세포주로부터 분리된 BEV에서 후보 miRNA의 발현 프로파일을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 5c는 유방암 환자군과 정상 대조군(Non-BC)의 혈장에서 후보 miRNA의 발현 프로파일을 qRT-PCR로 분석하여 비교한 것이다.
도 5d는 총 EV(total EV, TEV) 및 종양 조직과 비교하여 BEV에서 후보 miRNA 발현의 배수 변화를 보여주는 그래프와 BEV에서 후보 miRNA 발현의 평균 배수 변화(FC), 평균의 표준 오차(SEM) 및 P 값을 나타낸 것이다.
도 5e는 종양 조직, TEV 및 BEV에서 후보 miRNA 발현에 대한 각 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 유방암 환자 114명, 양성 종양 환자 45명, 건강한 대조군 46명의 TEV 및 BEV에서 5종의 유방암 특이적 miRNA 발현의 배수 변화를 보여준다.
도 7a는 표 2에서 AUC가 가장 높은 5개 조합(조합 23, 조합 26, 조합 12, 조합 21 및 조합 1)에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다. 곡선 아래 면적(AUC)은 진단 성능을 나타낸다.
도 7b는 조합 26(miRNA 시그니처)에 대한 ROC 분석 결과(상단 왼쪽), 유방암, 유방 양성 종양 및 건강한 기증자에서 조합 26의 예상 지수(상단 오른쪽) 및 조합 26의 민감도와 특이도를 나타낸 것이다.
도 8은 5개의 miRNA (miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)를 이용한 유방암 재발 예측 분석 결과를 나타낸 것으로, 재발이 없는 유방암 환자(n = 40)와 재발이 있는 유방암 환자(n = 68)를 구별하는 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260 각각의 예측 성능을 나타내는 ROC 곡선(상단 왼쪽), 상기 5종의 miRNA 조합(miRNA 시그니처)의 재발 예측 성능을 나타내는 ROC 곡선(상단 오른쪽), 재발이 없는 유방암 환자와 재발이 있는 유방암 환자에서 상기 5종의 miRNA 각각에 대한 배수 변화를 나타내는 그래프(하단 왼쪽) 및 재발이 없는 유방암 환자와 재발이 있는 유방암 환자에서 상기 5종의 miRNA 조합(miRNA 시그니처)에 대한 예측 지수를 나타낸 그래프(하단 오른쪽)를 보여준다.
도 9는 유방 양성 종양을 가지는 것으로 진단된 환자의 임상 정보를 후향적으로 추적하여 유방촬영술의 결과(BI-RADS)를 확인한 다음, 5개의 miRNA 시그니처(miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)를 이용하여 조직생검이 불필요했던 환자를 진음성으로 판단할 확률을 분석하여 나타낸 것이다.
도 10은 5개의 miRNA 시그니처(miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b)를 이용하여 유방 치밀도의 증가에 따른 예측 점수를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
상술한 바와 같이, 유방암을 조기에 진단할 수 있는 새로운 진단 바이오마커의 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 액체 생검을 통해 유방암의 존재를 예측하기 위한 최적의 miRNA 유전자 조합을 확인함으로써, 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 유방암에 특이적인 miRNA 바이오마커를 발굴하기 위해, TCGA 공개 데이터 세트를 이용하여 유방암 유래 세포외 소포체 (Breast cancer-derived extracellular vesicles, BEV)에서 다음과 같이 13종의 후보 miRNA를 도출하였다: miR-9, miR-10b, miR-16, miR-21, miR-96, miR-106b, miR-128, miR-155, miR-181a, miR-484, miR-429, miR-1290 및 miR-1260b.
정상 대조군, 유방암 환자 및 재발 유방암 환자를 포함하여, 211명의 혈장 샘플에서 얻은 BEV에서 상기 도출된 13종의 후보 miRNA 중 내인성 대조군으로 사용한 miR-16을 제외한 나머지 12종의 후보 miRNA 발현 프로파일을 검증하기 위해 정량적 PCR(RT-qPCR)을 사용하였다. 이때, BEV는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 대한 항체로 표지된 자성 비드를 사용하여 면역 캡처(immuno-capture)로 분리하였다. 도 5c의 RT-qPCR 결과에 따라, ct>35인 4종의 miRNA(즉, miR-10b, miR-96, miR-128 및 miR-429)을 제외하였다. 추가로, 유방암이 없는 개체와 비교하여 BEV, TEV 및 종양 조직에서 후보 miRNA 발현의 배수 변화, BEV에서 후보 miRNA의 평균 배수 변화(FC), 평균의 표준 오차(SEM) 및 P 값을 종합적으로 고려하여, BEV에서 상향조절되는 유방암 특이적 miRNA 5종을 다음과 같이 최종 선별하였다: miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b.
최종 선별된 5종의 miRNA 유전자를, 표 1, 표 2, 도 7a 및 도 7b에 요약된 바와 같이, 다중 miRNA 패널 조합 중, TEV와 BEV의 임상적 성능을 비교하여 BEV에서 AUC가 가장 높은 상위 5개를 선택하였고, 이들 중 BEV와 TEV의 AUC 차이가 가장 큰 조합 26을 miRNA 시그니처(signature)로 선정하였다.
또한, 상기 5종의 miRNA 유전자 조합은 도 8에 나타난 바와 같이 유방암 재발이 없는 환자와 유방암이 재발된 환자를 구분하는데에도 적용할 수 있으며, 도 9 및 10에 나타난 바와 같이 기존 유방촬영술을 이용한 진단 결과의 위양성률을 줄일 수 있는 유용한 진단 도구로 활용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 유방암 발병 또는 재발 여부를 예측해내는 기준이 되는 miRNA 유전자를 지칭한다. 바이오마커가 miRNA인 경우 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "miRNA"는 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되어 RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기의 비코딩 RNA를 의도하여 사용된다. 또한, 본 발명에서 사용하는 miRNA는 특정 염기서열 (또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체 (pre-miRNA, primiRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체 (즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http:/www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 miRNA의 상보서열과 혼성화되는 염기서열을 갖는 miRNA를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 언급된 miRNA는 miR 유전자의 유전자 산물일 수 있고, 그러한 유전자산물은 성숙 miRNA (예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기 또는 19~25 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "핵산"이란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또한, 상기 DNA에는 cDNA, 게놈DNA, 및 합성DNA 모두가 포함된다. 또한, 상기 RNA에는 total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding) RNA 및 합성 RNA 모두가 포함된다. 본 발명에 있어서 "합성 DNA" 및 "합성 RNA"는 소정의 염기서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 중 어느 것이어도 좋음)에 의거하여, 예를 들면 자동핵산 합성기를 사용하여 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 발명에 있어서 "비천연형 서열"은 광의의 의미로 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 상이한, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한, 본 발명에서는 폴리뉴클레오티드는 핵산과 호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 유방암의 발병 또는 재발 여부를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
상기 제1 측면과 관련하여, 본 발명은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 miRNA 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 유방암을 진단하거나 재발을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 miRNA 유전자 바이오마커의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)"란 miRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 miRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 miRNA 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 유방암 진단 또는 재발을 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서 이용되는 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 염기서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, miRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 특정 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고(align), 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 동일성, 더욱 구체적으로 70%의 동일성, 더더욱 구체적으로 80%의 동일성, 가장 구체적으로 90%의 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물 및 키트는 전술한 5종의 miRNA 유전자에 각각 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양함), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트에는 핵산 (예를 들면, 총 RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 췌장암에 대한 바이오마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.
본 발명의 제2 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 진단을 위한 정보제공방법 및 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "정보제공방법(method for providing information)"이란, 유방암의 진단 또는 재발 예측에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 유방암 진단을 위한 정보제공방법은 BEV의 miRNA를 이용하여, 본 발명에 따른 2종 이상의 miRNA 수준이 유방암이 없는 정상 대조군에 비해 증가되었을 때, 유방암의 발병이나 발병 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은 BEV의 miRNA를 이용하여, 본 발명에 따른 5종의 miRNA 수준이 유방암이 재발되지 않은 환자에 비해 증가되었을 때, 유방암의 재발이나 재발 가능성(위험성)에 대한 정보를 획득하는 방법을 의미한다. 이때, 유방암이 재발되지 않은 환자는 근치적 수술 후 5년 이내에 영상의학적 진단 소견을 통해 유방암이 재발하거나 전이되지 않은 환자를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을, 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서의 해당 miRNA 유전자 발현 수준과 비교하는 단계.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체" 또는 "환자"는 유방암이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "생물학적 시료"는 정상적인 상태와 구별될 수 있는 유방암 진단 또는 재발에 특이적인 miRNA 유전자를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 구체적으로, 상기 생물학적 시료는 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 포함할 수 있다. 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는, 예를 들어 혈액, 혈장, 세포, 조직, 타액, 객담, 머리카락, 소변, 대변 또는 유즙으로부 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 세포는 유방암 세포일 수 있고, 상기 조직은 유방암 조직일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 miRNA는 혈액 또는 혈장으로부터 분리될 수 있다. 액체 생검(liquid biopsy)을 이용하면, 조직 검사와 같은 침습적인 방법과 달리 검사자에게 고통을 주지 않으면서 질병을 진단하는 것이 가능하다. 또한, 액체 생검을 이용하는 경우 유방암이 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로 조기 진단을 실시하거나, 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 있어 조직검사에 비하여 큰 이점을 가진다.
보다 구체적으로, 상기 miRNA는 혈액 또는 혈장으로부터 분리된 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체(BEV)로부터 추출될 수 있다.
세포외 소포체(extracellular vesicles, EV)는 종양 유래 바이오마커, 특히 고농도의 miRNA를 제공할 수 있고, 혈액에서 이들의 카르고(cargo)를 보호할 수 있다. 그러나, EV는 거의 모든 종류의 세포에서 방출되기 때문에 EV를 사용하는 생물학적 환경에서 상당한 이질성이 관찰될 수 있다. 현재 PEG 침전(Total Exosome Isolation kit 및 ExoQuick) 및 초원심분리(UC)를 기반으로 하는 여러 상용 EV 분리 키트가 TEV 분리에 사용된다. TEV 분리는 면역 포획 기반 EV 분리 기술에 비해 더 높은 수율을 나타내지만, TEV는 암 이질성을 포착하거나 종양 특성을 반영할 수 없다. 따라서, 본 발명에서는 후보 암 표면 마커 EpCAM, CD49b 및 CD51을 사용하여 TEV와 BEV를 구별하였다. BEV는 자유 순환 miRNA보다 더 높은 민감도와 특이도를 갖는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 다양한 유방암 세포주로부터 분리된 BEV에 대한 표면 마커를 확인하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 EpCAM을 발현하는 세포는 내강형 유방암과 기저형의 삼중음성유방암에서 높은 비율을 차지하지만, 중간엽 형태의 삼중음성유방암에서 매우 낮은 비율을 나타내었다. EpCAM은 엑소좀과 같은 세포외 소포체를 분리하기 위한 기존 표면 마커이나, 중간엽 형태의 삼중음성유방암에서 EpCAM을 발현하는 세포의 비율이 매우 낮아, 이를 단독으로 표적하는 경우 유방암 유래 세포외 소포체를 효율적으로 분리할 수 없음을 확인하였다. 이에 반해, 내강형 유방암과 기저형 및 중간엽 형태의 삼중음성유방암 모두에서 CD49b 및 CD51를 각각 발현하는 세포의 비율이 높아, EpCAM, CD49b 및 CD51를 각각 발현하는 세포를 표적하는 경우 유방암 유래 세포외 소포체를 효율적으로 분리할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 miRNA 유전자의 발현 수준은 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체(BEV)에서 검출되는 것이 바람직하다. 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리될 수 있으며, 예를 들어, EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 자성 비드를 이용하여 면역 포획으로 분리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기와 같이 분리된 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 시료로 하여 miRNA 유전자의 발현 수준을 확인하는 경우, 유방암 유형에 관계 없이, 즉 내강형 유방암과 기저형 및 중간엽 형태의 삼중음성유방암에서 모두 효과적으로 유방암을 진단하거나 유방암 재발을 예측할 수 있다.
본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 miRNA 유전자의 발현 수준은 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 혼성화법 또는 유전자 증폭방법으로 측정될 수 있다.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 miRNA의 존재를 확인하는 것일 수 있다.
본 발명의 정보제공방법이 혼성화 방식 중 마이크로어레이 방식으로 실시되는 경우, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화 된다. 바람직한 기질은 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있다. 또한, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 또는 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 방법에서 분석 대상이 되는 핵산 시료는 혈장에서 분리한 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이러한 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 유방암 진단을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 miRNA 유전자 서열에 대한 혼성화 시그널이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료보다 상향 조절(up-regulation)되는 경우에는 유방암으로 진단된다.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 miRNA 유전자 서열에 대한 혼성화 시그널이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료보다 상향 조절(up-regulation)되는 경우에는 유방암이 재발한 것으로 진단된다.
본 발명의 제3 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 치료제 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 유방암 환자로부터 분리된 것으로, 전술한 유방암 진단 또는 재발 예측을 위한 정보제공방법에 사용되는 시료와 동일하다.
본 발명의 용어, "유방암 치료제의 후보물질"은 유방암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로서, 직접 또는 간접적으로 유방암을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능한 예상 물질을 모두 포함한다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 상기 (b) 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료제 스크리닝 방법에 따르면, 상기 (b) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단할 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 진단 및 치료방법과 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자 바이오마커를 이용한 유방암 재발 예측 및 치료방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 유방암 진단 및 치료방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을, 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서의 해당 miRNA 유전자 발현 수준과 비교하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단하는 단계; 및
(d) 유방암으로 진단된 개체를 치료하는 단계.
본 발명의 유방암 진단 및 치료방법에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 유방암 진단 및 치료방법에 있어서, 상기 (d) 단계는 유방암으로 진단된 개체에게 유방암 치료를 적용하는 것으로, 여기서 적절한 치료는 암 조직을 떼어 내는 수술, 방사선 치료, 항암 화학 요법, 항호르몬 요법 및 표적 치료로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자는 유방암으로 진단된 개체(즉, 환자)의 상태, 예를 들어, 유방암의 종류, 병기 등에 따라 공지된 다양한 치료법을 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
암 조직을 떼어 내는 수술은 크게 유방부분절제술(유방보존술)과 유방전절제술로 나누어지며, 대부분 1차적으로 수술을 시행한 뒤 재발을 막기 위한 보조요법으로 방사선 치료, 항암 화학 요법, 항호르몬 요법, 표적 치료 등을 시행한다.
방사선 치료는 고에너지의 방사선을 이용하여 종양을 치료하는 것으로 수술 후에 남아 있을지 모를 암세포를 치료하기 위해 보조적 치료법으로 사용된다. 방사선 치료는 유방부분절제술 후에 남아 있는 유방 조직에서 암이 재발되는 것을 방지하기 위해 적용되거나, 유방전절제술 후에 종양의 크기가 크거나 림프절 전이가 많은 경우 암의 재발을 방지하기 위해, 수술 후에 암이 국소 재발한 경우에 치료를 위해, 전이 병소의 통증이나 기타 증상을 완화하기 위해 적용된다.
항암 화학 요법은 수술 전 종양의 크기를 줄이거나, 수술 후에 재발 위험이 높은 환자들 또는 다른 장기에 암이 전이된 환자들을 대상으로 시행할 수 있다. 보통 2가지 이상의 약제를 병합 또는 순차적으로 투여하며, 가장 많이 사용되는 약제로는 사이클로 포스파마이드, 메소트레세이트, 5-FU, 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀 등이 있다.
항호르몬 요법은 방사선 요법이나 항암 화학 요법과 달리 환자의 부작용이 적으면서도 효과적인 보조 요법으로 알려져 있다. 일반적으로 유방암의 약 70% 정도는 여성 호르몬의 영향으로 암세포가 성장하는데, 항호르몬 요법은 여성 호르몬이 생성되지 않게 하거나 (폐경 후 여성에게 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄 등의　아로마타제 억제제를 투여하거나 폐경 전 여성에게 고세렐린 등의 생식샘자극호르몬방출호르몬작용제를 투여함), 작용하지 못하게 (타목시펜　등의 선택적　에스트로겐 수용체　조절제나 풀베스트란트 등의 선택적 에스트로겐 수용체 하향조절제를 투여함) 하는 방법이다. 보조 항호르몬 요법은 호르몬 수용체를 가지고 잇는 유방암에서 효과적이며, 폐경 여부와 진행 정도에 따라 약제를 선택할 수 있다.
표적 치료는 항암 화학 요법이 가진 정상세포와 암세포를 가리지 않는 비특이성과 약물의 독성으로 인한 부작용 등을 극복하고자, 유방암의 발생과 진행에 관여하는 특정 분자 표적에 선택적으로 작용하여 그 기능을 억제하는 치료법이다. 대표적인 예로는　침윤성 유방암　환자의 약 20~25%에서 증폭 또는 과발현되는 인간 표피 성장인자 수용체 2 (HER2)나 단백질을 표적으로 하는 치료법이 있다. HER2가 과발현된 경우, 유방암의 재발이 빠르고 생존기간이 짧아 예후가 불량한 것으로 알려져 있다. 현재 이러한　HER2　신호전달계를 표적으로 한 유방암 치료제가 개발되어 사용되고 있는데, 대표적인 치료제로는　트라스투주맙,　퍼투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 라파티닙 등이 있다.
또한, 본 발명의 유방암 재발 예측 및 치료방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단하는 단계; 및
(d) 유방암이 재발된 것으로 판단된 개체를 치료하는 단계.
본 발명의 유방암 재발 예측 및 치료방법에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 유방암 재발 예측 및 치료방법에 있어서, 상기 (d) 단계는 유방암이 재발된 것으로 진단된 개체에게 유방암 치료를 적용하는 것으로, 여기서 적절한 치료는 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 유방암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
[실시예 1]
다양한 유방암 세포주로부터 분리된 BEV에 대한 표면 마커 확인
내강형(luminal) 유방암 세포주인 SK-BR-3(ATCC HTB-30), MCF7(ATCC HTB-22) 및 BT-474(ATCC HTB-20), 삼중음성유방암(TNBC)의 기저형(basal) 유방암 세포주인 MDA-MB-453(ATCC HTB-131), HCC1187(ATCC CRL-2322), MDA-MB-468(ATCC HTB-132), HCC70(ATCC CRL-2315) 및 HCC1937(ATCC CRL-2336), 중간엽(mesenchymal) 유방암 세포주인 MDA-MB-231(ATCC HTB-26), HCC1395(ATCC CRL-2324) 및 Hs578T(ATCC HTB-126)에 대해 TEV는 상용 침전 기반 Total Exosomes Isolation 키트(Invitrogen, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 200 μL의 혈장으로부터 분리하였고, BEV는 면역 친화성 기반 방법을 사용하여 분리하였다. BEV의 면역학적 포획을 위해, EpCAM, CD49b 및 CD51에 대한 비오티닐화된 항체와 결합된 자기 비드 (Dynabeads™ M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. EpCAM, CD49b(integrin A2, ITGA2) 및 CD51(integrin AV, ITGAV)는 Human Protein Atlas (HPA, www.proteinatlas.org, 2021년 1월 15일에 액세스, 도 1)에 접근하여 "예상된 막 단백질 (Predicted Membranous protein)", "모든 암에서 검출 (Detected in all cancer)" 및 "유방암 조직에서 강한/중간 발현"과 같은 분류 기준에 따라 후보 암 표면 마커로 선택되었다. HPA 프로그램은 다양한 오믹스 (omics) 기술을 통합하여 모든 인간 단백질을 맵핑하는 것을 목표로 하는 개방형 데이터베이스이다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, EpCAM을 발현하는 세포는 내강형 유방암과 기저형의 삼중음성유방암에서 높은 비율을 차지하지만, 중간엽 형태의 삼중음성유방암에서 매우 낮은 비율을 나타내었다. EpCAM은 엑소좀과 같은 세포외 소포체를 분리하기 위한 기존 표면 마커이나, 중간엽 형태의 삼중음성유방암에서 EpCAM을 발현하는 세포의 비율이 매우 낮아, 이를 단독으로 표적하는 경우 유방암 유래 세포외 소포체를 효율적으로 분리할 수 없음을 확인하였다.
이에 반해, 내강형 유방암과 기저형 및 중간엽 형태의 삼중음성유방암 모두에서 CD49b 및 CD51를 각각 발현하는 세포의 비율이 높아, EpCAM, CD49b 및 CD51를 각각 발현하는 세포를 표적하는 경우 유방암 유래 세포외 소포체를 효율적으로 분리할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
miRNA 바이오마커 발굴을 위한 샘플 준비
2-1. 임상 코호트 연구
총 211명의 대상자(유방암 환자 120명, 유방 양성 질환 환자 46명, 유방 관련 질환이 없는 여성 45명)가 본 연구에 등록되었다. 본 연구에 등록된 대상자들은 혈액 샘플 사용을 위한 연구 활용 동의를 받았으며, 임상 샘플은 연세대학교 의과대학 연구윤리위원회로부터 심의를 받았다(IRB No. 4-2020-1292, 2021년 1월 4일 승인). 유방암 환자 근치적 외과 수술 전, 외래를 통해 채혈하여 샘플을 확보하였다. 분석에 포함하기 위한 대상자 선정 기준은 다음과 같다: (1) 채혈 전, 화학 요법 또는 방사선 요법 등의 치료를 받지 않음, (2) 암 코호트 등록을 위한 유방암 또는 유방 양성 질환으로 확인된 영상의학적, 병리학적 진단 결과 확인.
1-2. 샘플 준비
임상 샘플을 사용하는 실험 세팅에서, EV 분리는 총 EV (TEV) 분리와 유방암 유래 EV(BEV) 분리로 분류되었다. 구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이 TEV는 상용 침전 기반 Total Exosomes Isolation 키트(Invitrogen, Pleasanton, CA, USA)를 사용하여 200 μL의 혈장으로부터 분리하였고, BEV는 면역 친화성 기반 방법을 사용하여 분리하였다. BEV의 면역학적 포획을 위해, EpCAM, CD49b 및 CD51에 대한 비오티닐화된 항체와 결합된 자기 비드 (Dynabeads™ M-270 Streptavidin, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다.
[실시예 3]
RefFinder를 이용한 후보 기준 유전자의 선별
BestKeeper, NormFinder, Delta Ct 방법 및 GeNorm을 포함한 통계 알고리즘을 사용하여 각 샘플 Cq 값에 대해 적절한 기준 miRNA 유전자를 확인하였다 (도 4a). 기준 유전자의 종합적인 순위는 RefFinder에 의해 생성되었으며, 이는 4가지 알고리즘에 의해 생성된 결과를 고려한다. 이 순위에 따라, miR-16은 혈장 샘플에서 유래한 세포외 소포체 내에서 가장 안정적인 기준 miRNA 유전자임을 확인하였다 (도 4b). 이러한 결과는 다른 기준 유전자 검증 연구와 일치하여 유전자 안정성 분석의 실험 설정이 신뢰할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 4]
유방암 특이적 miRNA의 발현 패턴 분석
4-1. 다양한 유방암 세포주에 대한 miRNA의 발현 패턴 분석
TCGA 공개 데이터베이스와 연구 문헌의 검토를 통해 도 5a에 나타낸 바와 같이 12종의 후보 miRNA를 선정하였다. 실시예 1의 11종의 유방암 세포주로부터 분리한 BEV에서 각각 후보군 miRNA의 발현 패턴을 분석하기 위해, qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 5b에서 확인되는 바와 같이 has-miR-181a, has-miR-155, has-miR-96-5p, has-miR-21-5p, has-miR-106b-5p, has-miR-1260b, has-miR-484, has-miR-1290 및 has-miR-429가 모든 상기 11종의 유방암 세포주에서 발현되었고, 특히 has-miR-181a 및 has-miR-106b-5p가 높게 발현되는 것으로 나타났다.
4-2. 다양한 유방암 세포주에 대한 miRNA의 발현 패턴 분석
본 발명자들은 유방암 특이적 막단백질을 이용하여 분리한 BEV 내 miRNA 발현이 총 EV(TEV)와 다를 수 있다고 추측하였고, 유방암에 보다 특이적일 것으로 예상하였다. 유방암 유래 BEV 내에서 상기 선정한 후보 miRNA의 발현 패턴을 분석하기 위해, 총 40명(유방암 환자 20명, 유방암이 아닌 여성 20명)의 혈장을 이용하여 qRT-PCR 분석 및 비교를 수행하였다. 12종의 후보 miRNA를 분석한 결과, 도 5c에서 확인되는 바와 같이 유방암 환자에서 miR-21, miR-1260b가 높게 발현하며, 통계적으로 유의미한 차이를 보였고, miR-106b, miR-155, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b가 높게 발현하였으나, 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다.
유방암 환자의 혈장을 이용한 사전 시험을 통해 유방암 환자에서 높게 발현하며 통계적으로 유의미한 차이를 보이는 miR-21, miR-1260b와 유방암 환자에서 높게 발현하였으나, 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았던 miR-106b, miR-155, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b의 발현을 유방암 환자의 조직, TEV, BEV를 통해 재시험하였다.
면역 친화적 방법으로 수득된 유방암 유래 BEV 내 miRNA, 면역 친화적 방법으로 수득된 TEV 및 조직 유래 면역 EV, 그리고 원심분리방법을 통해 수득된 EV 내 miRNA(유방암이 아닌 여성 유래 EV, 음성 대조군)의 발현 패턴을 비교 분석하였다.
분석 결과, 도 5d에서 확인되는 바와 같이 면역 친화적 방법으로 수득된 유방암 유래 BEV 내 12개의 후보 miRNA 중 7개 (miR-1290, miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, miR-1260b 및 miR-155)의 발현이 상향 조절되었고, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 조직, TEV, BEV에 대한 후보 miRNA 발현의 ROC 분석 결과는 도 5e에 나타내었다. 도 5e에서 확인되는 바와 같이, 조직에 대한 후보 miRNA 발현은 BEV에서 유래한 miRNA의 ROC 분석 패턴과 유사하였으며, TEV에서 유래한 miRNA의 ROC 분석 결과는 조직에 대한 후보 miRNA와 차이를 보였다.
[실시예 5]
유방암 특이적 miRNA 검증
91명의 유방암이 아닌 여성으로부터 유래된 대조군 샘플은 유방 양성 질환 환자 46명, 유방암 관련 질환이 없는 여성 45명으로 구성되어 있으므로, 세부 대조군 별 miRNA 발현 차이를 비교하였다. 이때, TEV 분석 시, 6명의 유방암 환자로부터 분리된 혈장의 볼륨이 부족하여, 대응(paired) 분석이 가능한 114명의 환자를 대상으로 사용하였다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, BEV를 분리하여 분석하는 경우, TEV에서보다 상대적으로 각 miRNA가 과발현하는 것을 알 수 있었다. 양성(benign) 환자의 TEV에서는 miR-106b의 발현이 BEV에서보다 높게 발현된 것으로 나타났으나, 양성 환자의 TEV에서만 유독 높게 발현되어 이는 위양성 결과로 판단되었다. 따라서, TEV를 이용하여 miR-106b의 발현 수준을 분석하는 것은 적절치 않으며, BEV를 사용하였을 때 유방암 바이오마커로서의 성능을 확인할 수 있는 것으로 판단된다.
[실시예 6]
다양한 miRNA 조합에 따른 진단 성능 확인
단독 miRNA의 유방암 진단 성능을 제고하기 위해, 로지스틱 회귀를 사용하여 miRNA 다중 패널의 성능을 평가하였다. 표 1은 TEV에서 miRNA 다중 패널의 임상적 성능을 나타낸 것이고, 표 2는 BEV에서 miRNA 다중 패널의 임상적 성능을 나타낸 것이다. 표 1, 표 2, 도 7a에 요약된 바와 같이, 다중 miRNA 패널 조합 중, TEV와 BEV의 임상적 성능을 비교하여 BEV에서 AUC가 가장 높은 상위 5개를 선택하였고, 이들 중 BEV와 TEV의 차이가 가장 큰 조합 26을 miRNA 시그니처(signature)로 선정하였다.
조합 민감도 특이도 AUC SE 95% CI
1 miR-21 miR-106b 　 　 　 86.84% 40.66% 0.703 0.0373 0.635 to 0.764
2 miR-21 miR-181a 　 　 　 85.96% 34.07% 0.668 0.0385 0.599 to 0.732
3 miR-21 miR-484 　 　 　 86.84% 15.38% 0.599 0.0392 0.529 to 0.667
4 miR-21 miR-1260b 　 　 　 87.72% 20.88% 0.567 0.0406 0.496 to 0.636
5 miR-106b miR-181a 　 　 　 81.58% 43.96% 0.691 0.0375 0.623 to 0.754
6 miR-106b miR-484 　 　 　 79.82% 42.86% 0.68 0.0377 0.612 to 0.743
7 miR-106b miR-1260b 　 　 　 82.46% 36.26% 0.693 0.0374 0.625 to 0.755
8 miR-181a miR-484 　 　 　 79.82% 37.36% 0.672 0.0375 0.603 to 0.736
9 miR-181a miR-1260b 　 　 　 81.58% 35.16% 0.669 0.0381 0.600 to 0.733
10 miR-484 miR-1260b 　 　 　 83.33% 17.58% 0.637 0.0387 0.567 to 0.703
11 miR-21 miR-106b miR-181a 　 　 86.84% 47.25% 0.696 0.0374 0.628 to 0.758
12 miR-21 miR-106b miR-484 　 　 82.46% 46.15% 0.684 0.0375 0.615 to 0.747
13 miR-21 miR-106b miR-1260b 　 　 86.84% 42.86% 0.696 0.0374 0.629 to 0.759
14 miR-21 miR-181a miR-484 　 　 84.21% 36.26% 0.668 0.0378 0.599 to 0.732
15 miR-21 miR-181a miR-1260b 　 　 85.96% 36.26% 0.661 0.0388 0.592 to 0.725
16 miR-21 miR-484 miR-1260b 　 　 83.33% 18.68% 0.609 0.0396 0.539 to 0.676
17 miR-106b miR-181a miR-484 　 　 78.95% 46.15% 0.68 0.0376 0.612 to 0.744
18 miR-106b miR-181a miR-1260b 　 　 80.70% 43.96% 0.689 0.0375 0.621 to 0.752
19 miR-106b miR-484 miR-1260b 　 　 80.70% 42.86% 0.682 0.0376 0.613 to 0.745
20 miR-181a miR-484 miR-1260b 　 　 79.82% 35.16% 0.672 0.0377 0.603 to 0.736
21 miR-21 miR-106b miR-181a miR-484 　 82.46% 46.15% 0.682 0.0375 0.613 to 0.745
22 miR-21 miR-106b miR-181a miR-1260b 　 85.09% 47.25% 0.693 0.0375 0.625 to 0.756
23 miR-21 miR-106b miR-484 miR-1260b 　 82.46% 47.25% 0.682 0.0375 0.614 to 0.745
24 miR-21 miR-181a miR-484 miR-1260b 　 82.46% 39.56% 0.663 0.038 0.593 to 0.727
25 miR-106b miR-181a miR-484 miR-1260b 　 78.95% 46.15% 0.683 0.0375 0.614 to 0.746
26 miR-21 miR-106b miR-181a miR-484 miR-1260b 80.70% 46.15% 0.68 0.0375 0.612 to 0.744
조합 민감도 특이도 AUC SE 95% CI
23 miR-21 miR-106b miR-484 miR-1260b 　 84.21% 82.42% 0.906 0.0212 0.857 to 0.942
26 miR-21 miR-106b miR-181a miR-484 miR-1260b 85.09% 84.62% 0.905 0.0213 0.856 to 0.941
12 miR-21 miR-106b miR-484 　 　 82.46% 80.22% 0.893 0.0224 0.842 to 0.931
21 miR-21 miR-106b miR-181a miR-484 　 82.46% 81.32% 0.892 0.0224 0.841 to 0.931
1 miR-21 miR-106b 　 　 　 81.58% 78.02% 0.881 0.0235 0.828 to 0.922
13 miR-21 miR-106b miR-1260b 　 　 81.58% 80.22% 0.881 0.0235 0.829 to 0.922
22 miR-21 miR-106b miR-181a miR-1260b 　 80.70% 80.22% 0.881 0.0236 0.829 to 0.922
11 miR-21 miR-106b miR-181a 　 　 79.82% 78.02% 0.880 0.0236 0.828 to 0.921
19 miR-106b miR-484 miR-1260b 　 　 80.70% 76.92% 0.870 0.025 0.816 to 0.913
25 miR-106b miR-181a miR-484 miR-1260b 　 80.70% 76.92% 0.870 0.0251 0.816 to 0.913
6 miR-106b miR-484 　 　 　 79.82% 78.02% 0.865 0.0253 0.810 to 0.909
16 miR-21 miR-484 miR-1260b 　 　 78.95% 79.12% 0.865 0.025 0.810 to 0.908
17 miR-106b miR-181a miR-484 　 　 79.82% 78.02% 0.864 0.0254 0.810 to 0.908
24 miR-21 miR-181a miR-484 miR-1260b 　 78.07% 79.12% 0.864 0.0251 0.809 to 0.908
3 miR-21 miR-484 　 　 　 78.07% 75.82% 0.846 0.0265 0.789 to 0.893
14 miR-21 miR-181a miR-484 　 　 74.56% 73.63% 0.844 0.0267 0.787 to 0.891
18 miR-106b miR-181a miR-1260b 　 　 75.44% 75.82% 0.842 0.0273 0.784 to 0.889
7 miR-106b miR-1260b 　 　 　 77.19% 74.73% 0.838 0.0275 0.781 to 0.886
5 miR-106b miR-181a 　 　 　 74.56% 78.02% 0.837 0.0275 0.779 to 0.884
20 miR-181a miR-484 miR-1260b 　 　 72.81% 71.43% 0.815 0.029 0.755 to 0.866
4 miR-21 miR-1260b 　 　 　 71.93% 80.22% 0.810 0.03 0.749 to 0.861
10 miR-484 miR-1260b 　 　 　 73.68% 72.53% 0.809 0.0297 0.749 to 0.861
8 miR-181a miR-484 　 　 　 72.81% 68.13% 0.808 0.0295 0.747 to 0.859
2 miR-21 miR-181a 　 　 　 70.18% 78.02% 0.806 0.0302 0.745 to 0.857
15 miR-21 miR-181a miR-1260b 　 　 70.18% 78.02% 0.806 0.0301 0.745 to 0.858
9 miR-181a miR-1260b 　 　 　 68.42% 65.93% 0.732 0.0347 0.666 to 0.792
도 7b에 나타낸 바와 같이, BEV의 miRNA 시그니처는 120명의 유방암 환자에서 재분석하였고, 임상적 성능은 판정 기준치 0.508에서 민감도 85.83%, 특이도 84.62%를 나타내었다.
[실시예 7]
miRNA 시그니처를 이용한 유방암 재발 예측 성능 확인
유방암이 재발된 환자와 재발이 없는 환자를 구별하여 진단할 수 있는지 확인하기 위해, BEV의 miRNA 시그니처를 이용하여 유방암 환자 120례에 대하여 ROC 분석을 수행하였다. 유방암 환자 120례 중 재발이 있는 환자는 44례이고, 재발이 없는 환자는 76례이었다. 도 8에 나타낸 바와 같이 후보 miRNA(miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484, miR-1260b) 별 AUC값은 각각 0.592, 0.560, 0.538, 0.551, 0.560으로 분석되었다. miRNA 시그니처의 경우, AUC값은 0.591로 확인되었다. 재발이 없는 유방암 환자와 재발이 있는 유방암 환자의 miRNA 시그니처의 예측 지수 평균값은 각각 0.748, 0.841이었으며, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다.
[실시예 8]
miRNA 시그니처를 이용한 유방암 진단 성능 확인
8-1. 유방초음파 진단 결과에 대한 보완
조직생검을 통해 유방 양성 질환으로 진단된 환자 41명의 임상정보를 후향적으로 추적하여 유방촬영술 결과를 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 29명은 유방초음파 상, BI-RADS 4이상으로 판독되어, 70.73%의 환자가 불필요한 조직검사를 받은 것으로 확인되었다.
임상적 유용성을 고려하여, miRNA 시그니처가 유방암 진단 평가에 도입된다면, 유방초음파로 인해 불필요한 조직검사를 받았던 유방 양성 질환으로 진단된 환자의 90.24%를 진음성으로 판정하여 진단에 도움을 줄 수 있을 것으로 예상된다.
8-2. 치밀유방에 대한 진단 성능 확인
치밀유방은 유방촬영술의 민감도를 낮게 하는 주요 요인이다. miRNA 시그니처를 통해 유방 치밀도의 증가에 따라 결과값을 분석한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 대부분이 판정 기준치 이상으로 분석되어, 유방촬영술을 보완할 수 있는 가능성을 확인하였다.
본 발명을 지원한 국가연구개발사업은 다음과 같다.
[과제고유번호] 1711171177
[과제번호] 2022R1F1A1074605
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 개인기초연구(과기정통부)
[연구과제명] 종양유래 세포밖소포체 담지 miRNA 분석기반 유방암 혈액진단법 개발
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 연세대학교
[연구기간] 2022.06.01 ~ 2024.02.29

Claims (20)

  1. miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자를 포함하는 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체에서 검출되는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리되는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 바이오마커 조성물.
  4. miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 miRNA 유전자의 발현 수준은 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체에서 검출되는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리되는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 조성물.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 키트, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트 및 유전자 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 유방암 진단 또는 재발 예측용 키트.
  10. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자 발현 수준을, 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리되는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
  13. 제10항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 진단을 위한 정보제공방법.
  14. (a) 유방암의 재발 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준을 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 포함하는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체는 EpCAM, CD49b 및 CD51에 각각 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 분리되는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
  17. 제14항에 있어서, (c) 상기 (a) 단계의 생물학적 시료에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 유방암이 재발하지 않은 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 동일한 miRNA 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 유방암이 재발된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 재발 예측을 위한 정보제공방법.
  18. (a) 시료에 유방암 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보물질이 처리된 시료에서 miR-21, miR-106b, miR-181a, miR-484 및 miR-1260b miRNA 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암 치료제의 스크리닝 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 유방암 유래 엑소좀 또는 세포외 소포체를 포함하는, 유방암 치료제의 스크리닝 방법.
  20. 제18항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 5종의 miRNA 유전자의 발현 수준이 후보물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 상기 (b) 단계에서 처리한 후보물질을 유방암 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 유방암 치료제의 스크리닝 방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010534480A (ja) * 2007-07-25 2010-11-11 ユニバーシティー オブ ルイヴィル リサーチ ファウンデーション，インコーポレーテッド 診断マーカーとしてのエキソソーム関連マイクロｒｎａ
KR20130056855A (ko) * 2010-03-01 2013-05-30 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 치료진단용 생물학적 지표들
KR20140067001A (ko) * 2011-08-08 2014-06-03 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스, 에스.에이.알.엘. 생물지표 조성물 및 방법
KR20200002809A (ko) * 2017-04-28 2020-01-08 도레이 카부시키가이샤 난소 종양의 검출을 위한 키트, 디바이스, 및 방법
KR102161733B1 (ko) * 2017-09-07 2020-10-05 인천대학교 산학협력단 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220104897A (ko) 2021-01-19 2022-07-26 숙명여자대학교산학협력단 유방암 진단용 조성물, 이를 포함하는 유방암 진단용 키트, 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 유방암의 발생 여부를 측정하는 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010534480A (ja) * 2007-07-25 2010-11-11 ユニバーシティー オブ ルイヴィル リサーチ ファウンデーション，インコーポレーテッド 診断マーカーとしてのエキソソーム関連マイクロｒｎａ
KR20130056855A (ko) * 2010-03-01 2013-05-30 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 치료진단용 생물학적 지표들
KR20140067001A (ko) * 2011-08-08 2014-06-03 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스, 에스.에이.알.엘. 생물지표 조성물 및 방법
KR20200002809A (ko) * 2017-04-28 2020-01-08 도레이 카부시키가이샤 난소 종양의 검출을 위한 키트, 디바이스, 및 방법
KR102161733B1 (ko) * 2017-09-07 2020-10-05 인천대학교 산학협력단 자성비드 및 분자비컨을 이용한 엑소좀의 다중검출방법

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