CN111996250B

CN111996250B - 用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物

Info

Publication number: CN111996250B
Application number: CN202010486707.3A
Authority: CN
Inventors: 李群; 朱平; 刘晓峰
Original assignee: 960th Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA
Current assignee: 960th Hospital of the Joint Logistics Support Force of PLA
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2040-06-01
Also published as: CN111996250A; CN110172514A

Abstract

本发明公开了用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物，所述分子标志物为RP11‑626H12.2。本发明首次发现了RP11‑626H12.2在胃腺癌患者中表达水平上调，且通过ROC曲线分析，发现RP11‑626H12.2具有较高的AUC值，提示RP11‑626H12.2应用于胃腺癌的诊断具有较高的准确性和特异性。

Description

用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物，具体的涉及分子标志物为RP11-626H12.2。

背景技术

胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一，预后相对较差，严重威胁人类健康。我国是胃癌高发国家，每年胃癌新发病例占世界新发病例40％以上，死亡率居于第二位，是严重危害中国居民健康的主要疾病。由于我国进展期胃癌患者比例较高，即使接受了手术为主的综合治疗，5年生存率仍低于30％。为了扩展胃癌的治疗手段和提高胃癌患者的生存期，探索胃癌发病的分子机制、寻找诊断及预后的生物标志物以及治疗靶点的研究是目前亟待解决的课题。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，不具有开放阅读框，无蛋白翻译功能。1ncRNA可以按照与距离最近的编码蛋白基因关系分为5类:(1)正义1ncRNA，即与编码蛋白基因链相同；(2)反义1ncRNA，即与编码蛋白基因链不同；(3)双向1ncRNA，即转录时向编码蛋白基因最近的1ncRNA方向分散或聚集；(4)内含子1ncRNA，即位于编码蛋白基因内含子内；(5)基因间1ncRNA，即位于2个编码蛋白基因间区域长期以来，1ncRNA被认为是基因组转录的“噪音”，无生物学功能。目前越来越多的研究结果显示1ncRNA在调节基因表达的过程中起到了重要的作用，在多种肿瘤如胃癌、胃腺癌、结肠癌、肝癌的发生、发展、转移以及复发过程中的重要作用也得到了证实。尽管已经取得一些进展，有关1ncRNA在胃癌中所起的作用的研究还处于起步阶段，胃癌相关的1ncRNA表达谱并未明了，1ncRNA在胃癌病理机制中的具体作用了解较少。深入研究lncRNA在胃癌中的作用，找到有效调控胃癌发生发展的重要分子，对于指导研发临床胃癌分子诊断及分子靶向药物具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与胃癌发生发展相关的lncRNA，从而为胃癌的诊断和治疗提供分子靶标，实现患者的个性化诊疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测样本中RP11-626H12.2基因的水平。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别RP11-626H12.2的探针；或

特异性扩增RP11-626H12.2的引物。

进一步，特异性扩增RP11-626H12.2基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二发面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测RP11-626H12.2基因的水平。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测能够检测RP11-626H12.2基因的水平。

本发明的第四方面提供了一种试纸，所述试纸包括本发明第一方面所述的试剂，所述试剂能够检测能够检测RP11-626H12.2基因的水平。

本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述组合物包括有效量的RP11-626H12.2的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为降低RP11-626H12.2表达水平的试剂。所述抑制剂选自：以RP11-626H12.2或其转录本为靶序列、且能够抑制RP11-626H12.2基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。优选的，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的药物还可与其他治疗胃癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的第六方面提供了一种筛选治疗胃癌的候选物质的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RP11-626H12.2基因的培养体系；和

检测所述体系中RP11-626H12.2基因的水平；

其中，若所述待筛选物质可抑制RP11-626H12.2基因的水平，则表明该筛选物质是治疗胃癌的候选物质。

本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断胃腺癌的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断胃腺癌的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的试纸在制备诊断胃腺癌的产品中的应用；

e.RP11-626H12.2构建预测胃腺癌的计算模型中的应用；

f.本发明第五方面所述的药物组合物在制备治疗胃腺癌的产品中的应用。

本发明的优点与有益效果：

本发明首次发现了RP11-626H12.2的差异表达与胃腺癌的发生发展相关，通过检测RP11-626H12.2的表达水平可以判断受试者是否患有胃腺癌，为胃腺癌的诊断和治疗提供了分子靶标。

附图说明

图1是RP11-626H12.2作为检测变量的ROC曲线图。

图2是利用QPCR检测RP11-626H12.2基因在胃癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过深入挖掘TCGA数据库胃腺癌高通量数据包括lncRNA，用机器学习算法筛选出在胃腺癌发生发展中关键的lncRNA，深入了解胃腺癌发生发展机制，筛选可用于胃腺癌诊断的潜在lncRNA，同时，进一步对相关lncRNA进行验证，寻找真正的可用于胃腺癌诊断和治疗的分子标志物。本发明通过生物信息学分析，首次发现了RP11-626H12.2在胃腺癌中表达上调，并通过QPCR实验进一步证明了RP11-626H12.2在胃腺癌中的表达水平显著高于癌旁组织，RP11-626H12.2的发现进一步丰富了胃腺癌的发病机制的研究，同时为胃腺癌的诊断和治疗提供了新的分子手段。

RP11-626H12.2基因

RP11-626H12.2是位于人11号染色上，本发明中的RP11-626H12.2包括野生型、突变型或其片段。目前RP11-626H12.2存在两个转录本，转录本ID分别为：ENST00000528507.1和ENST00000533170.1。一种代表性的RP11-626H12.2基因序列如ENST00000528507.1所示。

本领域技术人员知道，在对原始测序结果进行生物信息学分析时，通常会将测序结果和已知的基因进行比对，只要测序片段可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本同时包含在本发明中。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、试剂盒、试纸

本发明提供了检测中RP11-626H12.2基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、试纸。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于RP11-626H12.2所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记(Labeling)作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA(singlestrandedDNA)探针、双链DNA(doublestrandedDNA)探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测胃癌预后。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

“杂交”或“核酸杂交”或“杂交”通常指两个具有互补碱基序列，在适当条件下将形成热力学上稳定的双链结构的单链核酸分子的杂交。如本文所用的术语“杂交”可指在严格或非严格条件下的杂交。条件的设置在本领域技术人员的技术范围内，可根据本领域中说明的实验方案确定。

术语“杂交序列”优选地指显示至少40％，优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，特别优选地至少80％，更特别优选地至少90％，更特别优选地至少95％，和最优选地至少97％同一性的序列同一性的序列。在杂交到硝化纤维素滤器(或其他此类支撑物例如尼龙)的情况下，例如众所周知的Southern印迹过程，硝化纤维素滤器可在代表所需严格度条件(高严格度60-65℃，中等严格度50-60℃，低严格度40-45℃)的温度下用溶于含高盐(6×SSC或5×SSPE)、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA(例如鲑鱼精子DNA)温育过夜的溶液中的经标记的探针。非特异性结合的探针可通过在0.2×SSC/0.1％SDS中在根据所需严格度选择的温度：室温(低严格度)、42℃(中严格度)或65℃(高严格度)下洗涤数次从滤器上洗脱。也可调整洗涤溶液的盐和SDS浓度以适应所需严格度。所选的温度和盐浓度基于DNA杂交物的熔化温度(Tm)。当然，RNA-DNA杂交物也可形成并被检测。在此类情况下，杂交和洗涤的条件可由本领域技术人员根据众所周知的方法改变，优选地使用严格条件。如本领域所熟知，也可使用利用了不同退火和洗涤溶液的其他实验方案或市售可得的杂交试剂盒(例如来自BD Biosciences Clonetech的ExpressHybTM)。众所周知，探针的长度和要确定的核酸的组成决定杂交条件的其他参数。值得注意的是，通过用于抑制杂交实验中背景的备选封闭试剂的加入和/或取代可实现上述条件的变型。常见的封闭试剂包括Denhardt试剂、BLOTTO、肝素、变性鲑鱼精子DNA和市售可得的专有制剂。由于相容性问题，加入具体封闭试剂可能需要修改上述杂交条件。杂交核酸分子也包括上述分子的片段。此外，与上述核酸分子的任何一个杂交的核酸分子也包括这些分子的互补片段、衍生物和等位基因变体。此外，杂交复合物指两个核酸序列之间依靠互补的G和C碱基之间和互补的A和T碱基之间形成氢键的复合物；这些氢键可通过碱基堆叠相互作用进一步稳定。两个互补核酸序列以反向平行的构型形成氢键。杂交复合物可在溶液(例如Cot或Rot分析)中，或在一个存在于溶液中的核酸序列和另一个固定于固体支撑物(例如，已经例如固定了细胞的膜、滤器、芯片、针脚或载玻片)上的核酸序列之间形成。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测RP11-626H12.2的表达。所述试剂盒包括用于扩增RP11-626H12.2的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。

作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

本发明提供了一种试纸，所述试纸可用于检测RP11-626H12.2的表达；所述试纸包括特异性识别RP11-626H12.2的探针或特异性扩增RP11-626H12.2的引物对。

作为一种优选的实施方案，所述试纸还包括纤维膜，纤维膜包括但不限于硝酸纤维素膜或尼龙膜。

在一个更为优选的实施方案，纤维膜上还设有检测线和质控线。

抑制剂和药物组合物

基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含RP11-626H12.2的抑制剂。

所述的RP11-626H12.2的抑制剂是指任何可降低RP11-626H12.2基因水平的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调RP11-626H12.2基因的表达有用的物质，从而可用于治疗胃癌。举例来说，本发明的抑制剂可以是以RP11-626H12.2基因为靶序列、且能够抑制RP11-626H12.2基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

本发明中的药物组合物包括有效量的RP11-626H12.2的抑制剂、和/或与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。

药物筛选

本发明提供了一种筛选治疗胃癌药物的方法，即：

在实验组中，向培养体系中加入待测化合物，并测定RP11-626H12.2的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定RP11-626H12.2的表达水平；其中，如果实验组中RP11-626H12.2的表达水平小于对照组，则说明该待筛选的物质为RP11-626H12.2的候选物质。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选物质进一步测试其抑制胃癌的效果，若测试化合物对胃癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为治疗胃癌的候选物质。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与胃癌相关的基因标志物

1、在TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载胃腺癌患者的转录组数据，其中包括375例肿瘤case；35例正常case。

2、转录组数据整合分析

1)预处理

删除不易检测到的lncRNA(即该lncRNA的read counts值在case中为0的样本数大于总的case样本量的20％或该lncRNA的read counts值在normal中为0的样本数大于总的normal样本量的20％)后，将4610个lncRNA用于差异表达分析。并对这些lncRNA进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。

2)差异表达分析

采用R-3.3.3工具中的DESeq2进行差异表达分析，差异表达lncRNA筛选标准：FDR<0.05，abs(log2FC)>2。

3)ROC分析

对差异表达基因绘制ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)以评价差异表达基因对于胃腺癌的诊断价值，AUC及其95％可信区间通过MedCalc进行评估，根据AUC值不同可以划分为无预测性能(AUC＜0.5)，低预测性能(0.5≤AUC≤0.7)，中度预测性能(0.7≤AUC≤0.9)和高预测性能(0.9≤AUC≤1)，P＜0.05为差异有统计学意义。

3、结果

数据分析结果显示，RP11-626H12.2在胃腺癌患者中表达上调，对RP11-626H12.2进行ROC曲线分析(图1)，线下曲线面积为0.9039，在最佳临界值处的特异性为0.844，敏感性为0.8455，说明该基因具有较高的预测性能，提示可将RP11-626H12.2应用于胃腺癌的诊断。

实施例2 QPCR测序验证RP11-626H12.2基因的差异表达

1、对RP11-626H12.2基因差异表达进行大样本QPCR验证。收集30例胃腺癌患者的癌组织以及相应的癌旁组织。

2、RNA提取

Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，具体操作详见说明书。

3、QPCR

根据RP11-626H12.2和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如表1所示。

表1 扩增引物序列

使用TaKaRa One Step TB Green^TM Prime Script^TM RT-PCR试剂盒(CodeNo.RR066A)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表2所示。在Thermal Cycler

Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

表2 QPCR反应体系和反应条件

4、结果

QPCR结果如图2所示，与正常组织相比，RP11-626H12.2在胃腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示可通过检测RP11-626H12.2的水平判断受试者是否患有胃腺癌，当RP11-626H12.2的水平显著增加时，受试者患有胃腺癌或者存在患有胃腺癌的风险，通过RP11-626H12.2与胃腺癌之间的关系可以设计降低RP11-626H12.2水平的shRNA、siRNA等治疗胃腺癌。

实施例3 RP11-626H12.2调控胃癌细胞的增殖、迁移

1、细胞培养

从液氮中取出冻存的胃腺癌细胞SGC-7901，将其置于37℃水浴锅中快速解冻，将解冻后的细胞移入含培养基的离心管中，离心3min，弃上清，2m1完全培养基重悬细胞混匀后转移至培养瓶内，于37℃,5％CO₂的培养箱内培养。24h后，观察细胞生长状态及细胞形态，细胞更换培养液。传代3次后，选择呈对数状态生长的细胞进行后续的实验。

2、细胞转染

将实验分为三组，分别为对照组(SGC-7901)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-RP11-626H12.2)。按照实验分组，细胞计数后，将细胞接种于六孔板内，培养过夜，细胞密度达70％，使用Lipofectamine3000与DMEM按比例配置溶液1，将siRNA或NC按与DMEM比例配置溶液2，将二者混合后室温孵育15min，然后加入对应细胞培养孔内，5h后加入完全培养基进行培养。

其中，本申请所用的通用siRNA-NC、siRNA-RP11-626H12.2购自上海吉码制药技术有限公司，沉默RP11-626H12.2的siRNA-RP11-626H12.2序列如表3所示。

表3 siRNA的序列

3、qRT-PCR

使用Trizol法提取细胞总RNA，按照实施例2中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

4、CCK-8细胞增殖实验

取对数期的细胞按每孔4000个细胞接种到96孔板中，当96孔板细胞达80％的融合度时，对细胞进行转染。当转染时间达到24小时，将该时间点作为检测的起始点，标记为0小时，分别在培养48小时后，吸去培养液，每孔加入100μl的完全培养基和10μl CCK-8试剂，培养箱孵育1小时后，将酶标仪光度调至450nm，测定各组的吸光值。

5、Transwell细胞迁移实验

培养各组细胞达90％融合度，胰酶消化、离心去掉上清液。无血清培养基吹打均匀，细胞计数。按每个小室200μl培养基、5×10⁴细胞的标准，分别加入对应小室。下室内加入含10％FBS的培养基750μl，放入培养箱培养24小时，显微镜观察下室细胞贴壁情况。取出小室，倒掉培养液，4％的多聚甲醛固定细胞，随后0.1％的结晶紫染色20min。显微镜下进行细胞计数，统计学分析。

6、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

qRT-PCR结果如表4所示，与对照组相比，siRNA-RP11-626H12.2组的RP11-626H12.2相对表达量显著降低(P<0.05)；而阴性对照组的RP11-626H12.2相对表达量则无显著变化(P>0.05)。

表4 RP11-626H12.2相对表达量

CCK-8细胞增殖实验结果如表5所示，与阴性对照组相比，实验组的细胞增殖受到显著的抑制，说明降低RP11-626H12.2的表达，可以抑制癌细胞的生长，从而为胃癌发展的治疗提供了新的手段。

表5 OD值

Transwell细胞迁移结果如表6所示，与阴性对照组相比，实验组的细胞迁移数显著降低，说明降低RP11-626H12.2的表达，可以抑制癌细胞的迁移，从而为胃癌转移的治疗提供了新的策略。

表6 迁移细胞数

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军联勤保障部队第九六0医院

<120> 用于开发胃腺癌诊疗产品的分子标志物

<150> 201910480351X

<151> 2019-06-04

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacgatgact acgaatgaga 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgggcaaca gaatgaga 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ucauucguag ucaucguucg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaacgaugac uacgaaugag a 21

Claims

1.一种筛选治疗胃腺癌的候选物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有RP11-626H12.2 基因的培养体系；和

检测所述体系中RP11-626H12.2 基因的表达水平；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制RP11-626H12.2基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗胃腺癌的候选物质。

2.如下任一项所述的应用：

a.试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂能够检测样本中RP11-626H12.2基因的表达水平；

b.试剂盒在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测样本中RP11-626H12.2基因的表达水平的试剂；

c.芯片在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述芯片包括能够检测样本中RP11-626H12.2基因的表达水平的试剂；

d. 试纸在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试纸包括能够检测样本中RP11-626H12.2基因的表达水平的试剂；

e. RP11-626H12.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的应用；

f.药物组合物在制备治疗胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括RP11-626H12.2的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a-d中所述的试剂包括：

特异性识别RP11-626H12.2的探针；或

特异性扩增RP11-626H12.2的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增RP11-626H12.2的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为降低RP11-626H12.2基因表达水平的试剂。