CN108384858B

CN108384858B - 肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用

Info

Publication number: CN108384858B
Application number: CN201810498936.XA
Authority: CN
Inventors: 董东; 任静
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN108384858A

Abstract

本发明公开了肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用，所述基因为BPIFA2。本发明公开了BPIFA2在制备诊断肺癌的产品中的应用以及包括检测BPIFA2试剂的产品，同时本发明公开了BPIFA2在制备治疗肺癌的药物中的应用以及包括BPIFA2下调剂的药物组合物。

Description

肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用，具体的涉及基因BPIFA2。

背景技术

肺癌是全世界范围内发病率和死亡率比较高的一种恶性肿瘤，占每年新发恶性肿瘤的12.9％，排在男性恶性肿瘤发病率第一位，死亡率居所有恶性肿瘤之首。肺癌的分类以发生部位可以分为中央型、周围型和弥散型肺癌，以组织病理结果可以分为鳞癌、腺癌、腺鳞癌、支气管腺癌、未分化癌和类癌等类型，由于小细胞肺癌的生物学行为与其他类型肺癌显著不同，故目前临床上习惯以小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)来划分肺癌。目前临床上仍根据分期采用手术、放疗及化疗等主要方式进行治疗。尽管随着医学科技的不断发展，肺癌治疗手段也有了显著进步，在现有常规治疗的基础上，生物治疗、靶向治疗及免疫治疗在临床已广泛被应用，并取得了一定效果，但是肺癌5年生存率仍旧维持在15％左右，严重危害着人类的身心健康。其主要原因，一是肺癌早期常无明显的症状体征，难以早期诊断及治疗；另一个重要原因是，肺癌即使经过常规综合治疗后，常会发生耐药、局部复发、远处转移，最终导致患者死亡。故对肺癌的发生发展相关分子机制进行研究，对可能的肺癌治疗分子靶点进行探讨，可以为治疗肺癌提供新思路。

目前对肺癌的精准治疗及分子靶向治疗作为癌症治疗的新手段，以其低毒副作用和高效率的治疗效果正成为癌症治疗研究的热点，前景广阔，如专利CN201610202285.6、CN201610201289.2、CN201710111869.7就公开了与肺癌相关的基因及其应用。目前常用的治疗NSCLC的一线化疗药物种类繁多，常用的药物包括血管内皮生长因子受体靶向治疗药物如贝伐单抗、格非替尼、帕哩帕尼等；治疗表皮生长因子受体突变阳性的NSCLC药物如厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼等；针对间变性淋巴瘤激酶阳性患者的药物如克唑替尼、Crizotinib等；此外还有程序性死亡蛋白-1单抗及程序性死亡分子配体1抑制物等免疫治疗药物。癌症的分子靶向治疗给患者带来更多希望、更多选择，因此寻找影响肺癌发生发展的关键分子进行靶向治疗，已成为肿瘤研究领域的重要课题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种与肺癌发生发展相关的分子标志物，通过检测分子标志物的表达水平来特异性和敏感性的判断患者是否患有肺癌或者患肺癌的风险，通过靶向分子标志物，改变其表达水平来治疗肺癌。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测BPIFA2水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用，其中，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂或试剂盒。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、免疫测定检测样本中BPIFA2水平的试剂；其中，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

本发明提供了一种诊断肺癌的产品，所述产品包括检测BPIFA2水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别BPIFA2的探针；或

特异性扩增BPIFA2的引物；或

特异性结合BPIFA2编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，特异性扩增BPIFA2的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明提供了BPIFA2的下调剂在制备预防或治疗肺癌的药物组合物中的应用。

一方面，所述下调剂选自：核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调BPIFA2基因或其编码的蛋白的表达或活性。

另一方面，所述的BPIFA2基因或其编码的蛋白的下调剂选自：以BPIFA2基因或其转录本为靶序列、且能够抑制BPIFA2基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(SiRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与BPIFA2编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制DNAH1蛋白活性的抗体或配体)。

进一步，所述下调剂为siRNA，优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明提供了一种治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物包括：

抑制BPIFA2水平的下调剂，和/或

与所述下调剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

一方面所述下调剂选自：核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调BPIFA2基因或其编码的蛋白的表达或活性。

进一步，所述的下调剂为siRNA；优选的所述siRNA序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明提供了BPIFA2在筛选治疗肺癌的潜在物质中的应用。

进一步，筛选治疗肺癌的潜在物质的步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有BPIFA2基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中BPIFA2基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若所述待筛选物质可降低BPIFA2基因和/或编码的蛋白的表达或活性，(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肺癌的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述潜在物质包括(但不限于)：针对BPIFA2基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。

进一步，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从潜在物质中进一步选择和确定对治疗肺癌有用的物质。

附图说明

图1是检测BPIFA2基因在肺癌组织中的表达情况图；

图2是检测BPIFA2蛋白在肺癌组织中的表达情况图；

图3是检测BPIFA2在肺癌细胞中的转染情况图；

图4是检测BPIFA2基因对肺癌细胞增殖的影响图；

图5是检测BPIFA2对肺癌细胞迁移和侵袭的影响图；其中，图A迁移；图B侵袭。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测肺癌标本中基因在癌组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的基因，探讨其与肺癌的发生之间的关系，从而为肺癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肺癌中BPIFA2显著性上调。实验证明，干扰BPIFA2的表达水平，能够有效地抑制肺癌细胞的增殖和侵袭，为肺癌的个性化治疗提供了新途径。

BPIFA2基因

BPIFA2基因位于人20号染色体长臂1区1号带上，在本发明的上下文中，“BPIFA2基因”包括人BPIFA2基因以及人BPIFA2基因的任何功能等同物的多核苷酸。一种代表性的BPIFA2基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中BPIFA2基因(NM_001319164.1)所示。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、免疫检测技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNAISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

术语“微阵列”，包括但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白质微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列和抗体微阵列。通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片的DNA 微阵列是微观DNA点的集合，这些点连接到固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的DNA片段称为探针，其数千个可用于单个DNA微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如，ncRNA)。微阵列可使用多种技术加以制造，包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

免疫检测技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

诊断产品

本发明提供了检测中BPIFA2基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)制剂、芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于BPIFA2所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测BPIFA2的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒包括检测有效量的检测BPIFA2基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测BPIFA2：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

下调剂和药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了一种BPIFA2的下调剂的用途，用于制备抑制肺癌的药物组合物。如本文所用，所述的BPIFA2的下调剂包括但不限于抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。

所述的BPIFA2基因或蛋白的下调剂是指任何可降低BPIFA2蛋白的活性、降低BPIFA2基因或蛋白的稳定性、下调BPIFA2蛋白的表达、减少BPIFA2蛋白有效作用时间、或抑制BPIFA2基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调BPIFA2有用的物质，从而可用于预防或治疗肺癌。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调BPIFA2蛋白或其编码基因的表达，这些物质作为对于下调BPIFA2有用的物质，可用于预防或治疗肺癌。

作为本发明的一种选择方式，所述的BPIFA2的下调剂是一种特异性与BPIFA2结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用BPIFA2蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达BPIFA2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。抗体的“特异性”是指抗体能结合于BPIFA2基因产物或片段。较佳地，指那些能与BPIFA2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。抗BPIFA2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的BPIFA2蛋白含量，还可以作为用于预防肺癌转移和侵袭的特异性治疗剂。血样或尿液中的BPIFA2蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过ELISA、Western Blot印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。

作为本发明的一种优选方式，所述BPIFA2的下调剂是一种BPIFA2特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中BPIFA2基因的表达水平，以及肺癌细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的BPIFA2的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肺癌。任何前述的BPIFA2的下调剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将BPIFA2的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带BPIFA2的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的BPIFA2下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制BPIFA2基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的方法的化疗剂，包括但不限于，DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。

可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明中，术语“样本”包括(但不限于)，可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自患者或对象直接使用，或者进行预处理，如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理，以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。在本发明的具体实施例中，所述“样本”为组织。

术语“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集病理明确诊断的8例肺癌患者的癌组织和癌旁组织，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况，患者均签知情同意书，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

使用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作参照说明书。

3、RNA样品的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析及处理，差异基因的筛选标准为fdr<0.05，两组的fpkm平均值之差大于5。

6、结果

结果显示，BPIFA2在肺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证BPIFA2基因的差异表达

1、对BPIFA2基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肺癌癌旁组织和肺癌组织各50例。

2、RNA提取

3、逆转录

1)反应体系：

RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却，加入5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

引物设计：

根据Genebank中BPIFA2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

BPIFA2基因：

正向引物为5’-AACAAGTTCGTGAATAGC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-GTGGACATATCTCCTTCT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

配制PCR反应体系：

2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH₂O 8.0μl。

PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与肺癌癌旁组织相比，BPIFA2mRNA在肺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同测序结果一致，其中，与癌旁组织相比，肺癌组织中表达上调的有45例，表达下调的有1例，无明显差异的有4例，阳性检出率为90％；提示BPIFA2基因可作为分子标志物应用于肺癌的临床诊断。

实施例3蛋白免疫印记实验检测BPIFA2蛋白的差异表达

1、组织总蛋白的提取

用剪刀剪碎组织后将其放入置于冰内的玻璃匀浆器内，RIPA裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，按照每20mg组织标本加入100μl裂解液的比例加入相应量的RIPA裂解液，玻璃匀浆器碾碎组织直至其充分裂解，将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min，收集上清。

2、总蛋白浓度测定

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3、SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4、western检测

1)电转移

将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中，切下相应的PAGE胶，按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干的转膜仪中，恒压25V转膜1.5h；

2)免疫杂交

取出PVDF膜，PBS冲洗后置于5％BSA溶液中室温下摇动封闭2h，将PVDF膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，再加入相应的二抗，室温下孵育2h，TBST缓冲液洗涤。

3)DAB显色

PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液，PVDF膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照，采用Quantity One凝胶成像分析系统对条带进行半定量灰度分析，实验重复3次，结果取平均灰度值。

5、结果

结果如图2所示，与癌旁组织相比，BPIFA2蛋白在肺癌组织中的表达水平显著升高，差异具有统计学意义，表达水平的差异情况同mRNA的一致，提示BPIFA2蛋白可作为蛋白标志物应用于肺癌的临床诊断。

实施例4 BPIFA2基因的沉默

1、细胞培养

人肺癌细胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×10⁵个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。

2、siRNA的设计

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)

反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)

siRNA-1：

正义链为5’-AUAAUCUGGCCAAUGAUGGGC-3’(SEQ ID NO.7)

反义链为5’-CCAUCAUUGGCCAGAUUAUCA-3’(SEQ ID NO.8)

siRNA-2：

正义链为5’-UGAUUUGGCUGUGUUUGUCCA-3’(SEQ ID NO.9)

反义链为5’-GACAAACACAGCCAAAUCAUC-3’(SEQ ID NO.10)

siRNA-3：

正义链为5’-AACUUGUUGAUGAUUUGGCUG-3’(SEQ ID NO.11)

反义链为5’-GCCAAAUCAUCAACAAGUUCG-3’(SEQ ID NO.12)

3、转染

将实验分为三组：对照组(A549)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，其中阴性对照组siRNA与BPIFA2基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染，转染采用Invitrogen公司的脂质体Lipofectamine 3000，具体操作详见试剂盒说明书。

4、QPCR检测BPIFA2基因的转录水平

4.1细胞总RNA的提取

采用Qiagen的细胞RNA提取试剂盒对细胞中的RNA进行提取，实验操作按照说明书进行。

4.2逆转录步骤同实施例2。

4.3QPCR扩增步骤同实施例2。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，BPIFA2基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图3显示，与非转染组与转染siRNA-NC组相比，实验组中的BPIFA2的表达水平显著降低，而转染siRNA-1的差异最为显著，因此选择siRNA-1进行后续的实验。

实施例5 BPIFA2基因对肺癌细胞增殖的影响

采用CCK-8实验检测BPIFA2基因对肺癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3，转染后6h换液，放置细胞培养箱过夜。

2、第二天将细胞取出，加入胰酶消化，加入细胞培养基混匀使细胞悬浮，计数。

3、将稀释后的细胞悬液在96孔板中进行接种，3000个细胞/200μl/孔，接种8个复孔。设置siRNA-1实验组和siRNA-NC对照组。共铺4块96孔板分别用于24h、48h、72h、96h 4个检测时间点。

4、24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据。

5、在48h、72h、96h后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。

6、统计学分析

采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图4所示，与对照相比，实验组在转染siRNA-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明BPIFA2的过表达促进细胞的增殖。

实施例6细胞迁移及侵袭实验

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2、配置细胞悬液

细胞撤血清饥饿处理12-24h，对细胞进行消化处理，终止消化后进行离心，去除上层培养液。用PBS对沉淀细胞进行清洗，加入含有BSA的无血清培养基对其进行重悬。调整细胞的密度至5×l0⁵个/ml。

3、细胞接种

取细胞悬液200μl加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含FBS的1640培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

4、染色

细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

5、结果

结果如图5所示，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明BPIFA2的过表达能够促进肺癌的迁移及侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacaagttcg tgaatagc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggacatat ctccttct 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

auaaucuggc caaugauggg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaucauugg ccagauuauc a 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ugauuuggcu guguuugucc a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacaaacaca gccaaaucau c 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacuuguuga ugauuuggcu g 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gccaaaucau caacaaguuc g 21

Claims

1.检测BPIFA2基因mRNA或蛋白表达水平的试剂在制备诊断肺癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、免疫测定检测样本中BPIFA2 基因mRNA或蛋白表达水平的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别BPIFA2 的探针；或

特异性扩增BPIFA2 的引物；或

特异性结合BPIFA2 编码的蛋白的抗体或配体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增BPIFA2 的引物序列如SEQ IDNO.1~2所示。

5.BPIFA2 的下调剂在制备预防或治疗肺癌的药物组合物中的应用，其特征在于，所述下调剂下调BPIFA2基因mRNA和/或蛋白水平。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，下调剂为siRNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，下调剂的序列如SEQ ID NO.7~8所示。

8.BPIFA2 基因在筛选治疗肺癌的潜在物质中的应用。