CN111394458A - Ptbp1作为诊断和治疗骨肉瘤化疗耐药的标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诊断和治疗骨肉瘤化疗耐药生成的蛋白标志物，具体所述蛋为PTBP1。本发明公开了PTBP1在制备诊断骨肉瘤化疗耐药生成的产品以及治疗骨肉瘤化疗耐药生成的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断骨肉瘤化疗耐药生成的试剂盒以及治疗骨肉瘤化疗耐药生成的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为骨肉瘤化疗耐药生成诊断的手段之一。本发明的药物组合物对骨肉瘤化疗耐药生成有较好的抑制作用，在骨肉瘤化疗耐药生成以及胃癌的治疗中具有重要的参考和现实意义。

Description

PTBP1作为诊断和治疗骨肉瘤化疗耐药的标志物的应用

技术领域

本发明涉及一种与骨肉瘤的化疗耐药相关的蛋白及其在骨肉瘤的化疗耐药中的应用，所述的蛋白为PTBP1。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是最常见的原发性骨恶性肿瘤，发病部位多见于股骨远端和胫骨近端，多数患者在15～19岁发病。阿霉素(Adriamycin,ADR)早在20世纪70年代就已开始用于治疗骨肉瘤，也是目前治疗骨肉瘤最有效的药物。基于阿霉素的联合化疗(与甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺)是骨髓瘤患者的标准一线治疗方案。然而，尽管以阿霉素为基础的化疗、放疗和外科消融术在原发性肿瘤的多学科中的应用方面取得了较大进展，但耐药性的频繁发生以及高的肺转移率，限制了阿霉素的治疗效果。

骨肉瘤中肿瘤细胞与成骨细胞相似，均呈现出成骨细胞分化并产生恶性类骨质的病症，不仅有成骨细胞区域，也有成软骨细胞或成纤维细胞区域。这些特征表明骨肉瘤细胞可能起源于间充质干细胞。研究表明，包括以原发性(无潜在性骨病理学)和继发性(发生恶性变性/转化的潜在病理学)的形式，来源于原始成骨间充质细胞的骨肉瘤大约占所有原发性骨肿瘤的20％之多。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的发现被认为是造成肿瘤异质性的主要原因。近些年来，研究者们也在异质性骨肉瘤中发现可以增强肿瘤致瘤性和耐药性的骨肉瘤干细胞(Osteosarcoma stem cells,OSCs)。

骨肉瘤干细胞可来源于正常干细胞的癌变转化，或非干细胞对微环境信号的作用下去分化，这些细胞具有自我更新的能力和多项分化潜能，可以促进肿瘤生长、转移、耐药以及导致化疗后的复发，是导致骨肉瘤临床化疗失败的主要原因之一。由于骨肉瘤干细胞相关疗法的发现、发展潜力以及对调控骨肉瘤干细胞独特性质的关键分子的鉴定，人们对骨肉瘤干细胞的特性研究越来越受到关注。因此，直接靶向骨肉瘤干细胞或提高骨肉瘤干细胞对化疗方案敏感性的药物有望应用于骨肉瘤患者的临床治疗。

Krüppel-like factor 4(KLF4)是一种锌指转录因子，调节机体内多种生物学过程，包括细胞周期进程、分化、增殖、炎症、凋亡以及干细胞再生。它是将成纤维细胞重组诱导多功能干细胞的四个因子之一，表明其在调节癌症干细胞中可能发挥着重要的作用。研究表明，根据组织类型的不同，KLF4可作为抑癌基因或癌基因发挥作用。在胃肠道癌、食管癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、B淋巴细胞癌和膀胱癌中，KLF4表达量显著降低，这表明其在上述癌症中发挥着抑癌基因的作用；然而，在乳腺癌、口腔鳞状细胞癌以及头颈部鳞状细胞癌中，KLF4的表达量显著增加，说明其也可作为癌基因发挥作用。在头颈部鳞状细胞癌中的SAS细胞中，KLF4的高表达显著增加多药耐药性。此外，KLF4已被证实可以维持乳腺癌细胞的生长，而KLF4表达降低也可以减弱肿瘤的形成能力。最新的研究表明，KLF4在人原发性骨肉瘤中高表达，并特异性地结合CRYAB基因的启动子，促进CRYAB的表达进而促进了体外细胞的增殖、集落形成和细胞迁移，加速了体内肿瘤的生长。抑制骨肉瘤细胞miR-10b表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。

越来越多的证据表明，KLF4与癌细胞化疗抵抗有关。KLF4基因的蛋白和mRNA水平在抗骨肉瘤药物的作用下，表达量显著增加。并抑制该基因的表达后，增加了化疗的敏感性。Huang等的研究也表明，阿霉素可诱导KLF4在骨髓瘤细胞中高表达，当KLF4的表达受到抑制后可显著提高体外化疗的敏感性；此外，KLF4还可以通过直接结合HMGB1启动子，在体外对骨肉瘤细胞HMGB1的表达起到一定的正调控作用。Li等最近的研究表明ADR通过上调KLF4的表达，增强对紫杉醇的耐受性、转移特性和交叉耐药性；体内外研究也表明辛伐他汀可以通过下调KLF4的表达来有效地抵抗ADR诱导的干细胞增多。

在KLF4表达量高的骨肉瘤细胞表现出OSCs的特点：球体形成能力增强，干细胞相关基因高表达，对阿霉素和CDDP有较强的耐药性以及高的转移潜能。KLF4基因缺失不仅影响ADR治疗的干细胞表型，而且还影响未经ADR治疗的骨髓瘤细胞中CD133⁺细胞的富集和干细胞相关标志基因的表达，如：CD133,ABCG2,和ALDH1A1。

Wnt/β-catenin或典型Wnt通路是高度保守的信号通路，在维持CSCs自我更新方面和维持干细胞多能性特中发挥着重要的作用。近期研究表明，阿霉素化疗可通过WNT/β-CATENIN信号通路诱导表型干细胞转分化为骨肉瘤细胞。研究者们发现薯蓣皂苷以及盐霉素可通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制骨肉瘤CSCs的干细胞特性。此外，在骨肉瘤组织中，β-catenin表达量显著增加增高,当β-catenin的表达受到抑制后,OSCs的自我更新能力及骨肉瘤细胞干细胞样特性被明显抑制^[9]。Qi等人通过基因表达谱分析表明，在KLF4表达的人骨髓瘤细胞中，许多与Wnt、Notch和Hedgehog相关的基因高表达，并且与p38 MAPK信号通路相关的基因在KLF4表达细胞中上调；进一步研究发现KLF4激活p38 MAPK信号通路来增强球体的形成以及细胞的迁移能力。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种蛋白标志物在筛选治疗骨肉瘤化疗耐药的候选药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种评价该蛋白表达水平的试剂盒。

为了研究与骨肉瘤化疗耐药相关的蛋白在骨肉瘤化疗耐药中的作用，从而筛选合适的蛋白。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从子宫内膜异位综合症组织中找到了可以作为骨肉瘤化疗耐药标志物的PTBP1。

因此，本发明一方面提供了一种蛋白，所述蛋白为PTBP1，其特征在于，检测PTBP1表达水平的试剂在制备诊断骨肉瘤化疗耐药的产品中的应用。

优选地，本发明所述试剂为特异性扩增PTBP1的引物。

再一方面，本发明还提供了一种诊断骨肉瘤化疗耐药的试剂盒，所述试剂盒包括检测PTBP1表达水平的试剂。

优选地，本发明所述试剂为特异性扩增PTBP1的引物。

优选地，本发明所述特异性扩增PTBP1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

再一方面，本发明还提供了一种PTBP1基因的用途，所述PTBP1基因用于制备治疗骨肉瘤化疗耐药的药物组合物。

优选地，本发明所述药物组合物包括PTBP1基因的抑制剂。

再一方面，本发明还提供了一种治疗骨肉瘤化疗耐药的药物组合物，所述药物组合物包括PTBP1基因的抑制剂。

优选地，本发明所述PTBP1基因的抑制剂为si-PTBP1。

优选地，本发明所述si-PTBP1的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8所示。

优选地，本发明所述的PTBP1基因的抑制剂为sh-PTBP1，所述的sh-PTBP1的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，本发明所述的药物组合物还包括miR-134基因。

优选地，本发明所述的miR-134基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，本发明所述的药物组合物还包括KLF4的抑制剂。

优选地，本发明所述的KLF4的抑制剂为si-KLF4。

优选地，本发明所述的si-KLF4的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，筛选到用于骨肉瘤化疗耐药诊断和治疗的标志物PTBP1(PTBP1在骨肉瘤中高表达)。在此基础上，本发明提供了检测PTBP1的试剂在制备诊断骨肉瘤化疗耐药的产品中的应用。该应用包括诊断骨肉瘤化疗耐药的试剂盒以及制备治疗骨肉瘤化疗耐药的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为骨肉瘤化疗耐药诊断的手段之一。本发明的药物组合物对骨肉瘤化疗耐药有较好的抑制作用，在骨肉瘤化疗耐药治疗中具有重要的参考和现实意义。

附图说明

图1骨肉瘤基因芯片差异分析和预测。图中A所示PTBP1在骨肉瘤基因芯片GSE12805中的表达箱型图；图中B所示StarBase数据库预测PTBP1的上游调控miRNA的预测结果与GSE28423差异分析结果的交集；图中C所示miR-134在骨肉瘤基因芯片GSE28423中的表达箱型图；图中D所示miR-134和PTBP1的结合位点图。

图2PTBP1在阿霉素耐药的骨肉瘤细胞和组织中高表达并与预后不良相关。图中A所示qRT-PCR检测不同细胞系中PTBP1的表达效率，图中*均表示与hFOB组比较P<0.05，#均表示与DXR组比较P<0.05；图中B所示qRT-PCR检测不同组织中PTBP1的表达效率；图中C所示高/低表达PTBP1患者的总生存期；图中D所示高/低表达PTBP1患者的无病生存期。

图3PTBP1在体外提高骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性。图中A：qRT-PCR检测U2OS/DXR中si-PTBP1的表达效率，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05；B：Western Blot检测U2OS/DXR中PTBP1的表达，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05；C：CCK8法检测耐药细胞系中的细胞活力和IC50的表达；D：CCK8法检测敏感细胞系中的细胞活力和IC50的表达；E：EDU检测细胞增殖情况，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05；图中数值为计量资料，采用均值±标准差表示，两组间数据比较采用非配对T检验，多组间比较采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验，不同时间点的各组间数据比较，采用重复测量方差分析，事后检验采用Bonferroni，以P<0.05表示差异有统计学意义，实验重复3次。

图4 PTBP1通过增强耐药细胞中的有氧糖酵解来提高骨肉瘤细胞的耐药性。图中A：检测耐药和敏感细胞中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率,图中*均表示与U2OS组比较P<0.05；B：检测过表达or干扰PTBP1后细胞葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05；C：Western Blot检测过表达or干扰PTBP1后GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达水平，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05；D：CCK8法检测过表达or干扰PTBP1后细胞活力和IC50，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05，&均表示与OE-PTBP1+si-NC组比较P<0.05；图中数值为计量资料，采用均值±标准差表示，两组间数据比较采用非配对T检验，多组间比较采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验，实验重复3次。

图5敲低PTBP1可改善体内骨肉瘤细胞对阿霉素的体内敏感性。图中注：A：测量瘤块大小，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05，#均表示与sh-NC组比较P<0.05；B：qRT-PCR检测PTBP1的表达，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05，#均表示与sh-NC组比较P<0.05；C：Western Blot检测PTBP1的表达，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05，#均表示与si-NC组比较P<0.05；图中数值为计量资料，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对t检验，n＝12。

图6KLF4通过抑制miR-134调控PTBP1的表达提高阿霉素抗性。图中A：生物信息学的方法预测miR-134靶向PTBP1；B：双荧光素酶活性检测，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05；C：生物信息学方法预测KLF4与miR-134结合位点示意图；D：双荧光素酶活性检测，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05；E：ChIP检测测转录因子KLF4与miR-134启动子间的交互作用；F：qRT-PCR检测si-KLF4的表达效率，图中*均表示与si-NC组比较P<0.05；G：qRT-PCR检测过表达/干扰KLF4后KLF4、miR-134、PTBP1的表达，图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05，*均表示与si-NC组比较P<0.05；H：qRT-PCR检测过表达/干扰miR-134再过表达/干扰PTBP1，KLF4、miR-134、PTBP1的表达，图中*均表示与mimic NC组比较P<0.05，#均表示与inhibitor NC组比较P<0.05，@均表示与miR-134 inhibitor+si-NC组比较P<0.05；&均表示与miR-134 mimic+OE-PTBP1组比较P<0.05；I：qRT-PCR检测过表达KLF4且过表达miR-134后KLF4、miR-134、PTBP1的表达，图中*均表示与OE-KLF4组比较P<0.05；J：CCK8法检测IC50；K：EDU法检测细胞活力；图中数值为计量资料，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对T检验，多组间比较采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验，不同时间点的各组间数据比较，采用重复测量方差分析，事后检验采用Bonferroni，实验重复3次。

图7KLF4通过miR-134/PTBP1信号轴有效调控耐药细胞中的有氧糖酵解以提高骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性。图中A:检测过表达or干扰KLF4和miR-134后细胞葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率；B：Western Blot检测过表达or干扰KLF4和miR-134后GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达水平；C：CCK8法检测IC50；D：EDU法检测细胞活力；以上图中*均表示与OE-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05，#均表示与OE-NC组比较P<0.05，！均表示与mimic NC组比较P<0.05，&均表示与inhibitor NC组比较P<0.05，@均表示与si-KLF4+inhibitor NC组比较P<0.05，％均表示与miR-134 mimic+OE；图中数值为计量资料，采用均值±标准差表示，两组间比较采用非配对T检验，实验重复3次。其中1表示OE-NC；2表示OE-KLF4；3表示si-NC；4表示si-KLF4；5表示mimic NC；6表示miR-134 mimic；7表示inhibitorNC；8表示miR-134 inhibitor；9表示si-KLF4+inhibitor NC；10表示si-KLF4+miR-134inhibitor；11表示miR-134 mimic+OE-NC；12表示miR-134 mimic+OE-PTBP1。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。

本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，发现其中具有明显表达差异的蛋白，探讨其与骨肉瘤化疗耐药的发生之间的关系，从而为骨肉瘤化疗耐药的检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现骨肉瘤中PTBP1显著性上调，并且通过大量实验证明，采用该蛋白具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变PTBP1的表达水平可以影响骨肉瘤的生长，提示PTBP1可以作为药物靶标用于骨肉瘤化疗耐药的精准治疗。

“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与骨肉瘤化疗耐药相关联的基因、基因的片段或变体。

在本发明的实施例中，一种代表性的人PTBP1基因的核苷酸序列SEQ ID NO.7所示。本发明的PTBP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的蛋白基因使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测PTBP1的表达。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测PTBP1的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测PTBP1表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。

这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。

基于发明人的发现，本发明提供了一种PTBP1的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制PTBP1基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以PTBP1基因为靶序列、且能够抑制PTBP1基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调PTBP1有用的物质，可用于治疗骨肉瘤化疗耐药。

作为本发明的一种优选方式，所述PTBP1的抑制剂是一种PTBP1特异性的siRNA或shRNA。在本发明的实施例中，该si-PTBP1或sh-PTBP1在骨肉瘤细胞中能够特异性的抑制PTBP1的表达，从而达到抑制骨肉瘤化疗耐药的发生和发展。

另外，本发明所述的药物组合物中还含有miR-134的基因，所述的miR-134的基因的性质对本发明来说并不重要，只要它上调miR-134基因的功能性表达即可。

另外，本发明本发明所述的药物组合物中还可以含有KLF4的抑制剂，所述的KLF4的抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它能下调KLF4基因(KLF4基因序列如SEQ IDNO.6所示)的功能性表达即可。优选地，所述的KLF4的抑制剂为si-KLF4。

当然，在本发明中，在骨肉瘤化疗耐药中，si-PTBP1(或sh-PTBP1)、miR-134和si-KLF4的作用是一致的，所以，本领域的技术人员，很容易就能想到，将3者联合起来使用，会起到更好的疗效。因此，本发明人认为，在骨肉瘤化疗耐药的治疗中，si-PTBP1(或sh-PTBP1)、miR-134和si-KLF4单独使用或两两结合使用或三者联合使用，也应属于本发明的保护范围之内。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明的药物组合物包括PTBP1的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。在本发明的实施例中，在裸鼠成瘤模型中，本发明的药物组合物具有良好的抑制骨肉瘤化疗耐药发生和发展的作用。

当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗骨肉瘤化疗耐药的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

一、实验方法

1.生物信息学分析

使用GEO数据库下载骨肉瘤的基因表达数据芯片GSE12805和miRNA表达数据芯片GSE28423，GSE12805芯片中包含骨肉瘤细胞样本40个和正常组织样本13个，GSE28423芯片中包含骨肉瘤细胞样本有19个和正常样本4个。使用“limma”包，设置|log2FC|>1,p-value<0.05为阈值，筛选出骨肉瘤差异基因。通过StarBase数据库对差异基因的上游调控miRNA进行预测，将预测结果与芯片GSE28423的差异分析结果取交集，筛选得到差异基因的上游调控miRNA，最后通过GSE12805和GSE28423芯片验证基因和miRNA的表达趋势。

2.临床样本与组织学反应评估

将2009年10月至2015年4月于我院就诊的原发性骨肉瘤患者46例取肿瘤组织，年龄13～42岁，平均年龄(29.98±8.86)岁。将组织分为阿霉素耐药组(n＝23)和阿霉素敏感组(n＝23)。该研究得到了医院伦理委员会的批准，并获得了所有患者的书面知情同意书。此外，该研究严格按照赫尔辛基原则宣言进行。所有样品立即保存在液氮中直至使用。对患者进行随访，随访截止时间为2018年4月。

3.耐药细胞系的培养

从中国科学院上海细胞研究所获得的人骨肉瘤细胞系(MG-63，U2OS和HOS)和人成骨细胞系(hFOB)在含有10％胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle's培养基(LifeTechnologies，USA)中培养。在37℃，5％CO 2气氛下，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。通过将DXR敏感的MG-63细胞暴露于增加剂量的DXR来获得阿霉素(DXR)抗性细胞系MG-63/DXR，同样的方法得到阿霉素抗性细胞系HOS/DXR、U2OS/DXR。此外，将1.000μg/mL DXR加入MG-63/DXR培养基中以保留DXR抗性表型。

4.体外药物敏感性实验

在96孔板中转染48小时后，加入新鲜制备的含有几种最终浓度的阿霉素(MG63/DXR、HOS/DXR和U2OS/DXR 0,2,4,8,16,32和64mg/mL)的培养基。这些孔，每个浓度有三个重复孔。再孵育48小时后，根据制造商的说明，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8，Dojindo，Japan)测量细胞活力。

5.qRT-PCR

采用Trizol(15596026，Invitrogen,Car，USA)提取总RNA,使用逆转录试剂盒(RR047A，Takara，Japan)将RNA反转录成cDNA，体系20ul，反应条件为：37℃，15min；85℃，5s；使用SYBR Premix EX Taq试剂盒(RR420A,Takara)进行加样，样品在实时荧光定量PCR仪(ABI7500,ABI,Foster City，CA，USA)中进行qRT-PCR反应，反应体系：SYBR Mix 9ul，正引物0.5ul，负引物0.5ul，cDNA 2ul，RNase Free dH2O 8ul。反应条件：95℃10min，95℃15s，60℃1min，连续进行40个循环。每个样品设置三个重复孔。

LINC00284,NFKB1,MEST,VEGF,CD31，GAPDH的引物由上海生工合成(引物序列见表1)。记录各孔Ct值，以KLF4,PTBP1以GAPDH为内参，miR-134以U6为内参，采用公式2-ΔΔCt法计算产物相对表达量。ΔΔCt＝(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)。

表1 RT-PCR(荧光定量PCR)引物序列

6.Western Blot

严格按照说明书采用高效RIPA裂解液(R0010，Solarbio)提取组织或细胞总蛋白。4℃裂解15min后15000r/min离心15min，提取上清液采用BCA试剂盒(20201ES76，翊圣生物科技有限公司，上海)测定每个样品的蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5％BSA室温下封闭1h。滴加稀释的一抗：兔抗人PTBP1(ab133734，1：1000，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗人GLUT3(ab41525，1：1000，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗人HK2(ab209847，1：1000，Abcam，Cambridge，UK)、兔抗人PDK1(ab207450，1：1000，Abcam，Cambridge，UK),4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(ab205718，1:20000，Abcam，Cambridge，UK)稀释液室温下1h。TBST洗膜5min×3次，加入显影液，显影。ImageJ 1.48u软件(National Institutes ofHealth)进行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度比值进行蛋白定量分析。每次实验重复三次。

7.小鼠成瘤实验

将所有BALB/c裸鼠共48只，体重为12～18g。(3～5周龄，8e10g，雌性)维持在无病原体条件下，并且所有小鼠实验程序均由上海第十医院动物实验伦理委员会批准。将约1.0×10⁷个U2OS细胞悬浮于100ml PBS中并用OE-PTBP1或sh-PTBP1稳定转染，皮下注射到裸鼠后侧的右侧。每隔一天用游标卡尺检查肿瘤生长。使用以下等式计算肿瘤体积：V＝a*b²/2(mm3)，其中a是最大直径，b是垂直直径。当平均肿瘤大小达到约50mm³时，每隔一天通过尾静脉注射施用5.0mg/kg阿霉素，总共三次剂量。四周后，处死所有小鼠，并进行尸检。在腹膜内注射4.0mg荧光素(Gold Biotechnology，Inc.，St.Louis，MO)100mL后，用指定时间用IVIS@Lumina II系统(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)对小鼠拍照。

8.CCK8法

将细胞以2×103/孔的密度接种到96孔板中，设置只加培养基不加细胞的空白对照组用于调零，细胞转染24小时后，在0,24,48,72小时，向每个孔中加入10μL CCK8溶液于37℃下再孵育2小时进行检测细胞增殖情况，使用酶标仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测量450nm处的吸光度。实验重复三次计算平均结果。

9.双荧光素酶报告实验

构建miR-134启动子区域和PTBP1 3’UTR区域含结合位点的的野生和突变型报告质粒(pGL3-miR-134-promoter-WT、pGL3-miR-134-promoter-MUTPmirGLO-PTBP1-WT、PmirGLO-PTBP1-MUT)由上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma，上海，中国)设计提供。mimics NC、miR-134 mimics分别与PmirGLO-PTBP1-WT、PmirGLO-PTBP1-MUT；OE-NC、OE-KLF4分别与pGL3-miR-134-promoter-WT、pGL3-miR-134-promoter-MUT转染至HEK293T细胞培养48h收集细胞。按照的双荧光素酶检测试剂盒(D0010，北京索莱宝科技有限公司，China)提供的操作方法检测荧光素酶活性的改变。用Promega公司的GLomax20/20Luminometer荧光检测仪(E5311，陕西众美生物科技有限公司，China)检测荧光强度。实验重复三次。

10.ChIP

用甲醛固定骨肉瘤细胞10min以产生DNA-蛋白质交联，超声破碎仪(UP-250，Scientz，China)设置为每次超声10s，间隔10s，循环15次来破碎细胞打断染色质成片段，之后4℃12000rpm离心10min收集上清分成两管，分别加入阴性对照兔IgG(ab109489，1：300，Abcam，UK)和KLF4抗体(1:100,ab32106，abcam,UK),4℃下孵育过夜充分结合。用ProteinAgarose/Sepharose沉淀DNA-蛋白复合物，12000g离心5min后丢弃上清，洗涤非特异性复合物，65℃过夜解交联，酚/氯仿抽提纯化回收DNA片段。以miR-134特异性引物进行qRT-PCR检测KLF4与miR-134结合情况。

11.Edu法

取对数期生长的细胞，以每孔2×10³～4×10⁴个细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。24h后细胞贴壁，对细胞进行转染，每组3个复孔。转染后48h的细胞进行EDU标记，100μL/孔加入EDU培养基孵育2h；PBS洗涤2次；100μL/孔加入细胞固定液，室温孵育30min；加入2mg/mL甘氨酸，孵育5min；100μL/孔PBS洗涤5min；100μL/孔渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)孵育10min；PBS清洗。加入1×Apollo染色反应液，避光、孵育30min；加渗透剂；甲醇清洗。100μL/孔加入1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟；100μL/孔PBS清洗3次。染色完成后100μL/孔加入抗荧光淬灭封片剂。荧光显微镜下拍摄图片，统计数据，记录Edu标记的细胞数。细胞核被染成红色者为阳性标记细胞，显微镜下计数任意3个视野下的阳性和阴性细胞数。Edu标记率(％)＝阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100％。每次实验重复3次。

12.葡萄糖消耗检测

根据葡萄糖试剂盒测定试剂盒(Sigma)说明进行操作。取对数生长期细胞，调整细胞浓度至1.2×10⁸/L，于细胞培养瓶培养，无酚红RPMI1640培养液中培养48h后离心收集培养液，混匀，用于葡糖糖消耗量的测定。根据试剂盒说明，96孔板中加入相应试剂，37℃，孵育15min，于505nm波长下，全自动酶标仪(ELx800，BioTek，USA)测i的那个各孔吸光度值。葡糖糖消耗量＝(无细胞培养基中葡萄糖浓度－细胞培养液中葡萄糖浓度)×培养基体积。相对葡萄糖消耗抑制率/％＝(不加药组葡萄糖消耗量－加药组葡萄糖消耗量)/不加药组葡萄糖消耗量×100％。

13.ATP水平检测

根据ATP水平检测试剂盒(Promega)说明进行操作。调整细胞浓度至3×10⁵个/mL，以2mL/孔接种于6孔板中，并设空白培养基为调零组；ATP浓度(mmol/grot)＝(实验组吸光度值－对照组吸光度值)/(标准品吸光度值－调零组吸光度值)×标准浓度(10³μmoL/L)×样品稀释比例/总蛋白浓度(gprot/L)。

14.乳酸产生检测

根据乳酸测定试剂盒(Biovision)说明进行操作。对待测培养液进行5、10、20倍稀释，选取A值在0.05～0.35的理想取值范围，实验采用20倍稀释结果，530nm条件下自动酶标仪测定标准品和样品吸光度。相对乳酸产量抑制率/％＝(不加药组乳酸产量－加药组乳酸产量)/不加药组乳酸产量×100％。

15.统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件(USA)进行处理，计量资料采用均值±标准差的形式表示，服从正态分布及方差齐的非配对设计的两组资料比较，采用非配对t检验，多组间的比较应采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验。P<0.05表示差异具有显著性统计学意义。

二、实验结果

1.生物信息学分析结果

已有研究报道，在许多不同类型的癌症中，PTBP1过表达，这种高表达与增殖增加和预后不良有关，PTBP1的上调能使癌细胞产生耐药性，但是PTBP1在骨肉瘤中的机制尚不明确，因此我们选取PTBP1进行后续研究。通过对骨肉瘤芯片数据GSE12805差异分析，我们得到PTBP1在骨肉瘤中高表达(如图1A)。通过StarBase数据库对PTBP1的上游调控miRNA进行预测，将预测结果与芯片GSE28423的差异分析结果取交集，我们得到4个miRNA(hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-137)(如图1B)。其中，miR-134已被证明与血管生成和骨肉瘤的进展有关，miR-134的过表达抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移，miR-134的表达能增加癌症的化疗敏感性。进一步对GSE28423差异分析验证，我们发现miR-134在骨肉瘤中低表达(如图1C)，与文献结果一致。通过StarBase数据库我们得到miR-134与PTBP1的结合位点图(如图1D)。为了进一步了解miR-134的上游调控机制，我们查阅相关文献，发现转录因子KLF4抑制miR-134的表达。以上结果暗示，转录因子KLF4抑制miR-134调控PTBP1的表达参与骨肉瘤的化疗耐药。

2.PTBP1在阿霉素耐药的骨肉瘤细胞和组织中高表达并与预后不良相关

通过文献发现PTBP1与多种癌症的发生和耐药性相关。为了探究PTBP1与耐药的骨肉瘤细胞中的关系，我们通过qRT-PCR检测1个人成骨细胞系(hFOB)、3个阿霉素耐药的骨肉瘤细胞系(U2OS/DXR，MG63/DXR，HOS/DXR)和3个阿霉素敏感的细胞系(U2OS，MG63，HOS)中PTBP1的表达水平(如图2A)，发现与hFOB组相比，PTBP1在骨肉瘤细胞系(U2OS/DXR，MG63/DXR，HOS/DXR，U2OS，MG63，HOS)表达明显增加；在DXR抗性细胞系(U2OS/DXR，MG63/DXR，HOS/DXR)中，PTBP1的表达明显高于DXR敏感细胞系(U2OS，MG63，HOS)(均P<0.05)。在46个骨肉瘤组织中所述分组为耐药组(Chemoresistant group)(N＝24)和药物敏感组(Chemosensitive group)(N＝22)通过qRT-PCR检测PTBP1的表达水平(如图2B)，发现与Chemosensitive group组相比，Chemoresistant group组中PTBP1的表达显著提高(均P<0.05)。我们进一步检测PTBP1的表达是否与骨肉瘤预后相关。Kaplan-Meier生存分析表明(如图2C、图2D)骨肉瘤组织中高PTBP1表达的患者拥有更差的总生存期和和无病生存期。以上结果充分证明PTBP1在阿霉素耐药的骨肉瘤细胞和组织中高表达并与预后不良相关。

3.PTBP1在体外提高骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性

为了进一步深入探究PTBP1对骨肉瘤细胞化疗耐受性的影响。我们在骨肉瘤耐受细胞U2OS/DXR中qRT-PCR验证si-PTBP1的干扰效率(图3A)，取si-PTBP1-1组作为后续干扰组描述为si-PTBP1组。接着在阿霉素敏感骨肉瘤细胞U2OS，MG63，HOS中过表达PTBP1，在骨肉瘤耐受细胞U2OS/DXR，MG63/DXR，HOS/DXR中干扰PTBP1。通过Western Blot检测PTBP1的蛋白表达水平(图3B)，显示在骨肉瘤敏感细胞中，对比OE-NC，OE-PTBP1组中PTBP1的蛋白水平显著增加；在阿霉素耐药骨肉瘤细胞中，对比si-NC，si-PTBP1组中PTBP1的蛋白水平显著降低(均P<0.05)。将转染后的骨肉瘤细胞暴露于不同梯度浓度(0，2，4，8，16，32，64ug/ml)的阿霉素后，CCK8法检测细胞活力与IC50(图3C、3D)，显示在阿霉素敏感骨肉瘤细胞中，对比OE-NC，OE-PTBP1组暴露于高浓度阿霉素中的细胞活力明显增加，且IC50明显增加；在阿霉素耐药骨肉瘤细胞中，对比si-NC，si-PTBP1组中暴露于高浓度阿霉素中的细胞活力明显降低，且IC50明显降低(均P<0.05)。Edu法检测细胞增殖(图3E)，在阿霉素敏感骨肉瘤细胞中，对比OE-NC，OE-PTBP1组中细胞增殖明显增多；在阿霉素耐药骨肉瘤细胞中，对比si-NC，si-PTBP1组中细胞增殖明显降低(均P<0.05)。以上结果充分证明PTBP1在体外提高骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性。

4.PTBP1通过增强耐药细胞中的有氧糖酵解来提高骨肉瘤细胞的耐药性

有氧糖酵解是癌细胞中糖代谢的异常特征，已发现与化疗药物的耐药性相关。为了探究有氧糖酵解与骨肉瘤细胞耐受性的关系，我们分别检测耐药细胞(U2OS/DXR)和敏感细胞(U2OS)中葡萄糖和乳酸的消耗和ATP产生的比率(图4A)，结果显示较敏感细胞U2OS，耐药细胞U2OS/DXR中，葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率显著增加。干扰耐药细胞U2OS/DXR中PTBP1，过表达敏感细胞U2OS中PTBP1检测葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率(图4B)，结果显示较较si-NC组，si-PTBP1组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率都显著降低，较OE-NC组，OE-PTBP1组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率都显著增加。

进一步干扰耐药细胞U2OS/DXR和过表达敏感细胞U2OS中PTBP1，Western Blot检测糖酵解相关蛋白GLUT3，HK2，PDK1的表达(图4C)，结果显示较si-NC(U2OS/DXR)组，si-PTBP1组中GLUT3，HK2，PDK1的表达均显著降低，较OE-NC(U2OS)组，OE-PTBP1组中GLUT3，HK2，PDK1的表达均显著增加(均P<0.05)。为了深入探究PTBP1表达水平的升高所引起的细胞内有氧糖酵解增强是与骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性相关，用16ug/ml阿霉素处理U2OS/DXR细胞，并在细胞中分别过表达PTBP1、干扰PTBP1表达、同时过表达PTBP1和干扰GLUT3表达，CCK8法检测细胞活力和IC50(图4D)，结果显示较NC组，OE-PTBP1组细胞活力及IC50均显著增加，si-PTBP1组细胞活力及IC50显著降低，较OE-PTBP1+si-NC组，OE-PTBP1+si-GLUT3组细胞活力及IC50显著降低(均P<0.05)。以上结果充分证明PTBP1通过增强耐药细胞中的有氧糖酵解来提高骨肉瘤细胞的耐药性。

5.敲低PTBP1可改善体内骨肉瘤细胞对阿霉素的体内敏感性

为了进一步探究PTBP1在体内增强阿霉素抗性的作用。将过表达or干扰PTBP1的U2OS细胞接种皮下注射接种到裸鼠中。待肿瘤形成(达到50mm³)后用阿霉素处理。处死小鼠，取出瘤块测量肿瘤体积(图5A)结果显示较OE-NC组，OE-PTBP1组中肿瘤体积显著增加，较sh-NC组，sh-PTBP1组中肿瘤体积显著减少。qRT-PCR和Western Blot检测肿瘤组织中PTBP1的表达(图5B-C)，结果显示：qRT-PCR和Western Blot趋势相同，与OE-NC组相比，OE-PTBP1组中PTBP1的表达显著提高；与sh-NC组相比，sh-PTBP1组中PTBP1表达显著降低。以上实验充分证明敲低PTBP1可改善体内骨肉瘤细胞对阿霉素的体内敏感性。

6.KLF4通过抑制miR-134调控PTBP1的表达提高阿霉素抗性

为了探究PTBP1对阿霉素抗性的基因调控通路。我们利用生物信息学网站mircroRNA(http://www.microrna.org/microrna/home.do)预测发现miR-134与PTBP1具有靶向关系并预测结合位点(图6A)。双荧光素酶实验验证miR-134靶向调控PTBP1(图6B)。

继续探究miR-134的上游调控基因，利用生物信息学网站PROMO8.3(http://alggen.lsi.upc.es/)预测发现KLF4可能与miR-134存在靶向关系(图6C)。通过双荧光素酶实验验证KLF4靶向调控miR-134(图6D)。ChIP检测转录因子KLF4与miR-134启动子间的交互作用(图6E)，结果显示KLF4在miR-134启动子上的富集显著增加。

进一步验证KLF4、miR-134和PTBP1的上下游关系，我们在U2OS细胞中过表达or干扰KLF4，首先我们qRT-PCR验证si-KLF4的干扰效率(图6F)，取si-KLF4-2组作为后续干扰组描述为si-KLF4组。qRT-PCR检测KLF4,miR-134,PTBP1的表达(图6G)，结果显示较OE-NC组，OE-KLF4组中miR-134表达显著降低，KLF4，PTBP1表达显著增加；较si-NC组，si-KLF4组中miR-134表达显著增加，KLF4，PTBP1表达显著降低。在U2OS细胞中过表达/干扰miR-134后再过表达/干扰PTBP1，qRT-PCR检测KLF4，miR-134，PTBP1的表达(图6H)，结果显示较mimic NC组，miR-134 mimic组中KLF4表达无显著变化，PTBP1表达显著降低，miR-134表达显著增加；较inhibitor NC组，miR-134 inhibitor组中KLF4表达无显著变化，miR-134表达显著降低，PTBP1表达显著增加；较miR-134 inhibitor+si-NC组，miR-134 inhibitor+si-PTBP1组中KLF4和miR-134表达无显著变化，PTBP1表达显著减少；较miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134mimic+OE-PTBP1组中KLF4和miR-134表达无显著变化，PTBP1表达显著增加。在U2OS细胞中过表达KLF4同时过表达miR-134检测KLF4，miR-134,PTBP1的表达(图6I)，结果显示较OE-KLF4+mimic NC组，OE-KLF4+miR-134 mimic组中KLF4，miR-134表达显著提高，PTBP1表达显著降低。

为了检测对阿霉素抗性的影响，我们将OE-KLF4，miR-134 mimic，OE-PTBP1分别组合转染至细胞U2OS中，经过阿霉素处理后。CCK8法检测IC50(图6J)，结果显示较OE-NC组，OE-KLF4组中IC50明显增加，OE-KLF4+miR-134 mimic组中IC50明显减少；较mimic NC组，miR-134 mimic组中IC50明显减少，miR-134 mimic+OE PTBP1组中IC50表达显著增加。EDU法检测细胞活力(图6K)，结果显示较OE-NC组，OE-KLF4组中细胞活力显著增加，较OE-KLF4+mimic NC组，OE-KLF4+miR-134 mimic组中细胞活力显著减少；较mimic NC组，miR-134mimic组中细胞活力明显减少，较miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134 mimic+OE PTBP1组中细胞活力明显增加。

7.KLF4通过miR-134/PTBP1信号轴有效调控耐药细胞中的有氧糖酵解以提高骨肉瘤细胞对阿霉素耐受性

为了验证KLF4/miR-134/PTBP1对耐药细胞有氧糖酵解调控后的阿霉素耐受性的影响。我们在U2OS/DXR细胞中过表达or干扰KLF4和miR-134后检测葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生的比率(图7A)，结果显示较NC组，OE-KLF4组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著增加，si-KLF4组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著减少；miR-134 mimic组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著减少，miR-134 inhibitor组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著增加。对比si-KLF4+inhibitor NC组，si-KLF4+miR-134 inhibitor组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著增加。对比miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134 mimic+OE-PTBP1组中葡萄糖和乳酸消耗和ATP产生显著增加。Western Blot检测过表达or干扰KLF4和miR-134后GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达(图7B)，结果显示较NC组OE-KLF4组中GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著增加，si-KLF4组中GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著减少；miR-134 mimic组中GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著减少，miR-134 inhibitor组中GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著增加。对比si-KLF4+inhibitor NC组，OE-KLF4+miR-134 mimic组中GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著增加。对比miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134 mimic+OE-PTBP1组GLUT3，HK2，PDK1的蛋白表达显著增加。各组细胞用16ug/ml阿霉素处理，CCK8法检测IC50(图7C)，结果显示较NC组OE-KLF4组中IC50显著增加，si-KLF4组中IC50显著减少；miR-134 mimic组中IC50显著减少，miR-134 inhibitor组中IC50显著增加。对比si-KLF4+inhibitor NC组，si-KLF4+miR-134inhibitor组中IC50显著增加。对比miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134 mimic+OE-PTBP1组中IC50显著增加。EDU法检测细胞活力(图7D)，结果显示较NC组，OE-KLF4组中细胞活力显著增加，si-KLF4组中细胞活力显著减少；miR-134 mimic组中细胞活力显著减少，miR-134inhibitor组中细胞活力显著增加。对比si-KLF4+inhibitor NC组，si-KLF4+miR-134inhibitor组中细胞活力显著增加。对比miR-134 mimic+OE-NC组，miR-134 mimic+OE-PTBP1组中细胞活力显著增加。

综上所述，耐药骨肉瘤组织中PTBP1呈高表达，miR-134可以靶向结合并上调PTBP1表达，进而促进有氧糖酵解来提高骨肉瘤的化疗耐药，而转录因子KLF4可通过抑制miR-134的表达从而上调PTBP1表达。因此转录因子KLF4的表达量高低可作为诊断预示骨肉瘤化疗耐药的候选靶指标，其具有精准性高、检测成本低和操作流程简便等特点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 湖南科域创想文化传媒有限公司

<120> PTBP1作为诊断和治疗骨肉瘤化疗耐药的标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgugaagau ccuguucaau u 21

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uugaacagga ucuucacgcu u 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> si-PTBP1核苷酸序列

<400> 3

gcctcaacgt caagtacaa 19

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> miR-134基因序列

<400> 4

cagggtgtgt gactggttga ccagaggggc atgcactgtg ttcaccctgt gggccaccta 60

gtcaccaacc ctc 73

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> si-KLF4核苷酸序列

<400> 5

cctggacctg gactttatt 19

<210> 6

<211> 2936

<212> DNA

<213> KLF4基因序列

<400> 6

ggcagtttcc cgaccagaga gaacgaacgt gtctgcgggc gcgcggggag cagaggcggt 60

ggcgggcggc ggcggcaccg ggagccgccg agtgaccctc ccccgcccct ctggcccccc 120

accctcccac ccgcccgtgg cccgcgccca tggccgcgcg cgctccacac aactcaccgg 180

agtccgcgcc ttgcgccgcc gaccagttcg cagctccgcg ccacggcagc cagtctcacc 240

tggcggcacc gcccgcccac cgccccggcc acagcccctg cgcccacggc agcactcgag 300

gcgaccgcga cagtggtggg ggacgctgct gagtggaaga gagcgcagcc cggccaccgg 360

acctacttac tcgccttgct gattgtctat ttttgcgttt acaacttttc taagaacttt 420

tgtatacaaa ggaacttttt aaaaaagacg cttccaagtt atatttaatc caaagaagaa 480

ggatctcggc caatttgggg ttttgggttt tggcttcgtt tcttctcttc gttgactttg 540

gggttcaggt gccccagctg cttcgggctg ccgaggacct tctgggcccc cacattaatg 600

aggcagccac ctggcgagtc tgacatggct gtcagcgacg cgctgctccc atctttctcc 660

acgttcgcgt ctggcccggc gggaagggag aagacactgc gtcaagcagg tgccccgaat 720

aaccgctggc gggaggagct ctcccacatg aagcgacttc ccccagtgct tcccggccgc 780

ccctatgacc tggcggcggc gaccgtggcc acagacctgg agagcggcgg agccggtgcg 840

gcttgcggcg gtagcaacct ggcgccccta cctcggagag agaccgagga gttcaacgat 900

ctcctggacc tggactttat tctctccaat tcgctgaccc atcctccgga gtcagtggcc 960

gccaccgtgt cctcgtcagc gtcagcctcc tcttcgtcgt cgccgtcgag cagcggccct 1020

gccagcgcgc cctccacctg cagcttcacc tatccgatcc gggccgggaa cgacccgggc 1080

gtggcgccgg gcggcacggg cggaggcctc ctctatggca gggagtccgc tccccctccg 1140

acggctccct tcaacctggc ggacatcaac gacgtgagcc cctcgggcgg cttcgtggcc 1200

gagctcctgc ggccagaatt ggacccggtg tacattccgc cgcagcagcc gcagccgcca 1260

ggtggcgggc tgatgggcaa gttcgtgctg aaggcgtcgc tgagcgcccc tggcagcgag 1320

tacggcagcc cgtcggtcat cagcgtcagc aaaggcagcc ctgacggcag ccacccggtg 1380

gtggtggcgc cctacaacgg cgggccgccg cgcacgtgcc ccaagatcaa gcaggaggcg 1440

gtctcttcgt gcacccactt gggcgctgga ccccctctca gcaatggcca ccggccggct 1500

gcacacgact tccccctggg gcggcagctc cccagcagga ctaccccgac cctgggtctt 1560

gaggaagtgc tgagcagcag ggactgtcac cctgccctgc cgcttcctcc cggcttccat 1620

ccccacccgg ggcccaatta cccatccttc ctgcccgatc agatgcagcc gcaagtcccg 1680

ccgctccatt accaagagct catgccaccc ggttcctgca tgccagagga gcccaagcca 1740

aagaggggaa gacgatcgtg gccccggaaa aggaccgcca cccacacttg tgattacgcg 1800

ggctgcggca aaacctacac aaagagttcc catctcaagg cacacctgcg aacccacaca 1860

ggtgagaaac cttaccactg tgactgggac ggctgtggat ggaaattcgc ccgctcagat 1920

gaactgacca ggcactaccg taaacacacg gggcaccgcc cgttccagtg ccaaaaatgc 1980

gaccgagcat tttccaggtc ggaccacctc gccttacaca tgaagaggca tttttaaatc 2040

ccagacagtg gatatgaccc acactgccag aagagaattc agtatttttt acttttcaca 2100

ctgtcttccc gatgagggaa ggagcccagc cagaaagcac tacaatcatg gtcaagttcc 2160

caactgagtc atcttgtgag tggataatca ggaaaaatga ggaatccaaa agacaaaaat 2220

caaagaacag atggggtctg tgactggatc ttctatcatt ccaattctaa atccgacttg 2280

aatattcctg gacttacaaa atgccaaggg ggtgactgga agttgtggat atcagggtat 2340

aaattatatc cgtgagttgg gggagggaag accagaattc ccttgaattg tgtattgatg 2400

caatataagc ataaaagatc accttgtatt ctctttacct tctaaaagcc attattatga 2460

tgttagaaga agaggaagaa attcaggtac agaaaacatg tttaaatagc ctaaatgatg 2520

gtgcttggtg agtcttggtt ctaaaggtac caaacaagga agccaaagtt ttcaaactgc 2580

tgcatacttt gacaaggaaa atctatattt gtcttccgat caacatttat gacctaagtc 2640

aggtaatata cctggtttac ttctttagca tttttatgca gacagtctgt tatgcactgt 2700

ggtttcagat gtgcaataat ttgtacaatg gtttattccc aagtatgcct taagcagaac 2760

aaatgtgttt ttctatatag ttccttgcct taataaatat gtaatataaa tttaagcaaa 2820

cgtctatttt gtatatttgt aaactacaaa gtaaaatgaa cattttgtgg agtttgtatt 2880

ttgcatactc aaggtgagaa ttaagtttta aataaaccta taatatttta tctgaa 2936

<210> 7

<211> 3206

<212> DNA

<213> PTBP1基因序列

<400> 7

attccggcgc ctccactccg tcccccgcgg gtctgctctg tgtgccatgg acggcattgt 60

cccagatata gccgttggta caaagcgggg atctgacgag cttttctcta cttgtgtcac 120

taacggaccg tttatcatga gcagcaactc ggcttctgca gcaaacggaa atgacagcaa 180

gaagttcaaa ggtgacagcc gaagtgcagg cgtcccctct agagtgatcc acatccggaa 240

gctccccatc gacgtcacgg agggggaagt catctccctg gggctgccct ttgggaaggt 300

caccaacctc ctgatgctga aggggaaaaa ccaggccttc atcgagatga acacggagga 360

ggctgccaac accatggtga actactacac ctcggtgacc cctgtgctgc gcggccagcc 420

catctacatc cagttctcca accacaagga gctgaagacc gacagctctc ccaaccaggc 480

gcgggcccag gcggccctgc aggcggtgaa ctcggtccag tcggggaacc tggccttggc 540

tgcctcggcg gcggccgtgg acgcagggat ggcgatggcc gggcagagcc ccgtgctcag 600

gatcatcgtg gagaacctct tctaccctgt gaccctggat gtgctgcacc agattttctc 660

caagttcggc acagtgttga agatcatcac cttcaccaag aacaaccagt tccaggccct 720

gctgcagtat gcggaccccg tgagcgccca gcacgccaag ctgtcgctgg acgggcagaa 780

catctacaac gcctgctgca cgctgcgcat cgacttttcc aagctcacca gcctcaacgt 840

caagtacaac aatgacaaga gccgtgacta cacacgccca gacctgcctt ccggggacag 900

ccagccctcg ctggaccaga ccatggccgc ggccttcggt gcacctggta taatctcagc 960

ctctccgtat gcaggagctg gtttccctcc cacctttgcc attcctcaag ctgcaggcct 1020

ttccgttccg aacgtccacg gcgccctggc ccccctggcc atcccctcgg cggcggcggc 1080

agctgcggcg gcaggtcgga tcgccatccc gggcctggcg ggggcaggaa attctgtatt 1140

gctggtcagc aacctcaacc cagagagagt cacaccccaa agcctcttta ttcttttcgg 1200

cgtctacggt gacgtgcagc gcgtgaagat cctgttcaat aagaaggaga acgccctagt 1260

gcagatggcg gacggcaacc aggcccagct ggccatgagc cacctgaacg ggcacaagct 1320

gcacgggaag cccatccgca tcacgctctc gaagcaccag aacgtgcagc tgccccgcga 1380

gggccaggag gaccagggcc tgaccaagga ctacggcaac tcacccctgc accgcttcaa 1440

gaagccgggc tccaagaact tccagaacat attcccgccc tcggccacgc tgcacctctc 1500

caacatcccg ccctcagtct ccgaggagga tctcaaggtc ctgttttcca gcaatggggg 1560

cgtcgtcaaa ggattcaagt tcttccagaa ggaccgcaag atggcactga tccagatggg 1620

ctccgtggag gaggcggtcc aggccctcat tgacctgcac aaccacgacc tcggggagaa 1680

ccaccacctg cgggtctcct tctccaagtc caccatctag gggcacaggc ccccacggcc 1740

gggccccctg gcgacaactt ccatcattcc agagaaaagc cactttaaaa acagctgaag 1800

tgaccttagc agaccagaga ttttattttt ttaaagagaa atcagtttac ctgtttttaa 1860

aaaaattaaa tctagttcac cttgctcacc ctgcggtgac agggacagct caggctcttg 1920

gtgactgtgg cagcgggagt tcccggccct ccacacccgg ggccagaccc tcggggccat 1980

gccttggtgg ggcctgtgtc gggcgtgggg cctgcaggtg ggcgccccga ccacgacttg 2040

gcttccttgt gccttaaaaa acctgccttc ctgcagccac acacccaccc ggggtgtcct 2100

ggggacccaa ggggtggggg ggtcacacca gagagaggca gggggcctgg ccggctcctg 2160

caggatcatg cagctggggc gcggcggccg cggctgcgac accccaaccc cagccctcta 2220

atcaagtcac gtgattctcc cttcaccccg cccccagggc cttcccttct gcccccaggc 2280

gggctccccg ctgctccagc tgcggagctg gtcgacataa tctctgtatt atatactttg 2340

cagttgcaga cgtctgtgcc tagcaatatt tccagttgac caaatattct aatctttttt 2400

catttatatg caaaagaaat agttttaagt aactttttat agcaagatga tacaatggta 2460

tgagtgtaat ctaaacttcc ttgtggtatt accttgtatg ctgttacttt tattttattc 2520

cttgtaatta agtcacaggc aggacccagt ttccagagag caggcggggc cgcccagtgg 2580

gtcaggcaca gggagccccg gtcctatctt agagcccctg agcttcaggg aaggggcggg 2640

cgtgtcgccg cctctggcat cgcctccggt tgccttacac cacgccttca cctgcagtcg 2700

cctagaaaac ttgctctcaa acttcagggt tttttcttcc ttcaaatttt ggaccaaagt 2760

ctcatttctg tgttttgcct gcctctgatg ctgggacccg gaaggcgggc gctcctcctg 2820

tcttctctgt gctctttcta ccgcccccgc gtcctgtccc gggggctctc ctaggatccc 2880

ctttccgtaa aagcgtgtaa caagggtgta aatatttata attttttata cctgttgtga 2940

gacccgaggg gcggcggcgc ggttttttat ggtgacacaa atgtatattt tgctaacagc 3000

aattccaggc tcagtattgt gaccgcggag ccacagggga ccccacgcac attccgttgc 3060

cttacccgat ggcttgtgac gcggagagaa ccgattaaaa ccgtttgaga aactcctccc 3120

ttgtctagcc ctgtgttcgc tgtggacgct gtagaggcag gttggccagt ctgtacctgg 3180

acttcgaata aatcttctgt atcctc 3206

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> si-PTBP1核苷酸序列

<400> 8

ccaacctcct gatgctgaa 19

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> sh-PTBP1核苷酸序列

<400> 9

gatccgccaa cctcctgatg ctgaattcaa gagattcagc atcaggaggt tggtttttt 60

acgcgtg 66

Claims (12)

1.一种蛋白，所述蛋白为PTBP1，其特征在于，检测PTBP1表达水平的试剂在制备诊断骨肉瘤化疗耐药的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性扩增PTBP1的引物。

3.一种诊断骨肉瘤化疗耐药的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测PTBP1表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增PTBP1的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增PTBP1的引物序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.一种PTBP1基因的用途，其特征在于，用于制备治疗骨肉瘤化疗耐药的药物组合物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括PTBP1基因的抑制剂。

8.一种治疗骨肉瘤化疗耐药的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括PTBP1基因的抑制剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述PTBP1基因的抑制剂为si-PTBP1，所述si-PTBP1的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8所示。

10.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的PTBP1基因的抑制剂为sh-PTBP1，所述的sh-PTBP1的序列如SEQ ID NO.9所示。

11.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括miR-134基因，所述的miR-134基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

12.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括KLF4基因的抑制剂，所述的KLF4基因的抑制剂为si-KLF4，所述的si-KLF4的序列如SEQ ID NO.5所示。

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