一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用,具体涉及的生物标志物为LINC01979。
背景技术
胃癌(gastric cancer,GC)是危害人类生命健康的消化系统恶性肿瘤之一,同时肿瘤相关死亡率在全世界排在第三位。在中国胃癌的发病率和死亡率均为消化系统肿瘤前列,每年新发病例数约40多万。胃癌不仅给患者健康带来严重损害,同时也让社会家庭背负沉重的精神及经济负担。大多数胃癌患者确诊时己错失最佳诊断和治疗时机,丧失治愈机会,导致疾病进展、肿瘤转移,甚至步入终末期。在早期诊断、综合治疗及病情监测中缺之有效的分子标记物,是限制胃癌预后改善的重要障碍之一。对胃癌发生发展过程中分子机制的进一步研究,努力寻求重要调节分子,可为胃癌诊断、预后判断甚至靶向治疗提供新的方向。目前已有诸多研究探讨胃癌的生物学特性,但在胃癌的临床疗效改善上发挥的作用却微乎其微。缺乏早期诊断的生物标志物、预后指标以及有效的治疗靶点使得胃癌治疗始终存在瓶颈。因此,加强胃癌早期诊断研究,建立新的早期胃癌或转移性胃癌的诊断标准,进而探索新的干预措施,防止胃癌的进一步复发及转移,提髙胃癌术前术后的治疗效果,増加患者的存活率和生活质量对疾病的治疗和预防具有重大的意义。
非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA,其中包括rRNA,tRNA,sRNA,snoRNA,microRNA及长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等,其中miRNA及lncRNA是近期研究的热点。他们在肿瘤的发生中起着重要的调节作用。lncRNA参与人类多种疾病的发生和发展,尤其与恶性肿瘤的发生、发展关系密切。近年来的研究发现,lncRNA可通过多种机制进行调控:(1)编码基因上游转录调控下游基因;(2)与编码基因序列互补干扰mRNA加工;(3)抑制RNA聚合酶II或染色质重构影响基因表达;(4)与蛋白结合形成核酸-蛋白复合体调节蛋白活性;(5)改变蛋白细胞定位;(6)与基因序列形成互补链在DICER作用下生成源性siRNA;(7)作为小分子RNA前体转录。这些作用使lncRNA靶基因形成调控网络,共同参与生命。
随着科技的进步,如生物芯片技术、新一代高通量测序技术及生物信息学的发展,越来越多的研究提示lncRNA是肿瘤发生发展分子调控网络中不可或缺的一部分。随着对lncRNA在细胞生物学中的功能不断深入研究,lncRNA与疾病的关系得到越来越多的关注。尽管目前对lncRNA的致病机理还了解不多,但大量由临床观察和基础实验得来的证据显示,lncRNA的异常表达是疾病发生的重要原因之一。随着肿瘤基因表达谱的完善,越来越多的证据揭示了lncRNA的功能,并发现了大量肿瘤相关lncRNA分子。同时,已经在多种肿瘤中发现lncRNA的异常表达,如:ENSG00000271781、ENSG00000259153在肝癌患者组织中异常高表达(CN201710404209.8、CN201710522240.1),LOC105371720在肺腺癌组织中表达下调(CN201710128322.8),并且异常表达的lncRNA和肿瘤的复发、转移及预后有关。lncRNA作为非编码RNA家族的一员,日渐成为肿瘤分子生物学研宄领域的热点。lncRNA的优势在于大多数的lncRNA在组织分化发育过程中具有明显的时空表达特异性。此外,lncRNA在肿瘤等疾病中有特征性的表达方式,并且序列上保守性较低,只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。
本发明采用高通量检测和QRT-PCR验证筛选的策略,寻找在胃癌中异常表达的lncRNA,并发现LINC01979在胃癌患者中异常高表达,随后便开展一系列分子生物学实验,结合人群样本验证,揭示LINC01979在胃癌中异常表达的临床意义以及生物学功能,并进一步阐明LINC01979在胃癌发生过程中可能的分子机制,为评价LINC01979作为胃癌早期诊断、预后评估以及治疗靶标的生物标志物提供理论依据。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种与胃癌发生发展相关的lncRNA,从而为胃癌的诊断和治疗提供分子靶标,实现患者的个性化诊疗。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了一种lncRNA作为生物标志物在制备胃癌诊断产品中的应用,所述lncRNA是LINC01979。
进一步,所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LINC01979基因的表达水平的试剂。
本发明提供的LINC01979在胃癌患者中表达上调。
本发明提供了一种诊断胃癌的产品,产品包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条,产品包括检测样本中LINC01979水平的试剂。
进一步,所述产品能够通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LINC01979的表达水平。
进一步,所述试剂选自:
特异性识别LINC01979的探针;或特异性扩增LINC01979的引物。
进一步,特异性扩增LINC01979的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括有效量的LINC01979的抑制剂。所述抑制剂选自:以LINC01979或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01979表达或转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步,所述抑制剂为siRNA,优选的,siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。
在本发明中,所述药物组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料;本发明的药物还可与其他治疗胃癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
本发明提供了LINC01979的抑制剂在制备治疗胃癌的产品中的应用。
进一步,所述所述抑制剂为siRNA,优选的,siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。
进一步,所述胃癌包括原发性胃癌、转移性胃癌。
本发明提供了一种筛选治疗胃癌的候选药物的方法,所述方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有LINC01979基因的体系;和检测所述体系中LINC01979的表达;
其中,若所述待筛选的药物可以抑制LINC01979的表达水平(优选显著降低,如低20%以上,较佳的低50%以上;更佳的低80%以上),则表明该候选药物是治疗胃癌的候选药物。所述体系选自:细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
所述候选药物包括(但不限于):针对LINC01979或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01979在胃癌组织中的表达情况图;
图2是利用QPCR检测LINC01979在胃癌细胞系中的表达情况图;
图3是利用QPCR检测LINC01979在胃癌细胞中的转染情况图;
图4是MTS法检测LINC01979对胃癌细胞增殖的影响图;
图5-1是利用Transwell小室检测LINC01979对胃癌细胞迁移影响图;
图5-2是利用Transwell小室检测LINC01979对胃癌细胞侵袭影响图。
具体实施方式
实施例1筛选胃癌相关差异化表达的lncRNA
1、样品收集
分别收集12例胃癌癌旁组织和胃癌组织样本全部病例在手术前均未接收化疗和放疗,所有的患者均已知情同意,并取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取,按说明书的具体步骤进行操作。
3、总RNA定量与纯度分析
使用Bio-Red紫外分光光度计测定总RNA在280nm和260nm处的光密度值,当OD260/OD280的值在1.8~2.0时认为总RNA的纯度是可靠的,用于下一步的实验。
4、lncRNA表达芯片分析
利用Arraystar公司的Arraystar Human 1ncRNA Array检测胃癌组织和癌旁组织中lncRNA表达谱的差异。Arraystar 1ncRNA芯片设计探针为60nt长度的寡核苷酸,这些长寡核苷酸探针在高度严格的杂交条件下可以得到高灵敏度及特异性的理想实验结果。针对每条序列都设计了多条探针,增加了信号的可靠度。
5、数据分析
利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析,筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上,而且p<0.05)的lncRNA。
6、结果
结果显示,LINC01979在胃癌组织中的水平显著高于癌旁组织中的水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 QPCR测序验证LINC01979的差异表达
1、对LINC01979差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胃癌癌旁组织和胃癌组织各68例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取,按说明书的具体步骤进行操作。
3、逆转录
1)反应体系:
RNA模板1μl,随机引物1μl,双蒸水加至12μl,混匀,低转速离心,65℃5min,冰上冷却,继续加入下列成分:5×反应缓冲液4μl,RNA酶下调剂(20U/μl)1μl,10mM dNTP混合液2μl,AMV反转录酶(200U/μl)1μl;充分混匀并进行离心处理;
2)逆转录反应条件
25℃5min,42℃60min,70℃5min,4℃保温60min。
3)聚合酶链反应
引物设计:
根据Genebank中LINC01979和GAPDH的序列设计QPCR扩增引物,由上海生物工程有限公司合成。具体引物序列如下:
LINC01979:
正向引物为5’-TTCTAGCACAACAATAGC-3’(SEQ ID NO.1);
反向引物为5’-GAACAGACCAATCACAAT-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH:
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
配制PCR反应体系:
2×qPCR混合液12.5μl,基因引物2.0μl,反转录产物2.5μl,ddH2O 8.0μl。
PCR反应条件:95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×40个循环,60℃5min延伸反应。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,癌与癌旁组织的配对比较采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图1所示,与胃癌癌旁组织相比,LINC01979在胃癌组织中表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同芯片检测结果一致。
实施例3LINC01979在胃癌细胞中的表达情况
1、细胞培养
正常胃黏膜上皮细胞株:GES-1、人胃癌细胞系HGC-27、MGC-803和AGS(均购自中国科学院上海生命科学研究院)在含10%胎牛血清和1%P/S的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代,取处于对数生长期的细胞用于实验。
2、RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA,具体步骤详见说明书。
3、逆转录
具体步骤同实施例2.
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2所示,与胃粘膜上皮细胞相比,LINC01979在胃癌细胞HGC-27、MGC-803、AGS中表达均上调,差异具有统计学意义(P<0.05),其中在HGC-27细胞中的差异最为显著,因此选择HGC-27细胞进行后续的实验研究LINC01979对胃癌细胞的作用。
实施例4 LINC01979基因的沉默
1、细胞培养步骤同实施例3
2、siRNA的设计
针对LINC01979基因的序列设计siRNA,设计的siRNA序列如下所示:
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC):
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5),
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6);
siRNA1:
正义链:5’-UGAUAAGAAGGGAAUCUAGCA-3’(SEQ ID NO.7),
反义链:5’-CUAGAUUCCCUUCUUAUCACA-3’(SEQ ID NO.8);
siRNA2:
正义链:5’-ACAAUCAGCUAUUGUUGUGCU-3’(SEQ ID NO.9),
反义链:5’-CACAACAAUAGCUGAUUGUAC-3’(SEQ ID NO.10);
siRNA3:
正义链为5’-AUUAUAGUUCCAAAGAUACCA-3’(SEQ ID NO.11),
反义链为5’-GUAUCUUUGGAACUAUAAUGG-3’(SEQ ID NO.12)
siRNA4:
正义链为5’-AUCCAUUAUAGUUCCAAAGAU-3’(SEQ ID NO.13),
反义链为5’-CUUUGGAACUAUAAUGGAUCU-3’(SEQ ID NO.14)
3、转染
将HGC-27细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中,在37℃、5%CO2培养箱中细胞培养24h;在无双抗、含10%FBS的DMEM培养基中,转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HGC-27)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4),其中阴性对照组siRNA与LINC01979基因的序列无同源性,浓度为20nM/孔,同时分别进行转染。
4、QPCR检测LINC01979的转录水平
4.1细胞总RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA,具体步骤详见说明书。
4.2逆转录步骤同实施例2。
4.3 QPCR扩增步骤同实施例2。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件进行统计分析。
6、结果
结果如图3显示,与HGC-27和转染空载siRNA-NC组相比,实验组(siRNA1~4)能降低LINC01979的水平,其中siRNA2能显著降低LINC01979的水平,因此选择siRNA2进行后续实验。
实施例5 LINC01979对胃癌细胞增殖的影响
采用MTS实验检测LINC01979对胃癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例4。
2、各组处理的细胞经胰酶消化后重悬细胞、计数,调整细胞浓度为l×105/ml
按100μL/孔的密度接种于96孔板,即每孔细胞数为1×104个。
3、待细胞到达相应的检测时间点(0d、24h、48h、72h、96h)后,按10μL/孔加入CelITiter96AQ单溶液细胞增殖检测(MTS)试剂,微量振荡器振荡1~2min;置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中孵育4h。
4、酶标仪读板,在490nm波长测定其吸光度(A)值。
5、统计学分析
实验都是按照重复3次来完成的,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图4所示,与对照相比,实验组(siRNA2)的细胞生长速度明显低于对照组的细胞的生长速度,差异具有统计学意义(P<0.05),上述结果表明LINC01979的过表达促进胃癌细胞的增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctagcaca acaatagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacagacca atcacaat 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ugauaagaag ggaaucuagc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cuagauuccc uucuuaucac a 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaaucagcu auuguugugc u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacaacaaua gcugauugua c 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
auuauaguuc caaagauacc a 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
guaucuuugg aacuauaaug g 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
auccauuaua guuccaaaga u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cuuuggaacu auaauggauc u 21