CN110452989A

CN110452989A - 生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用

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Publication number: CN110452989A
Application number: CN201910914547.5A
Authority: CN
Inventors: 张永生; 李文梅
Original assignee: Sishui People's Hospital
Current assignee: Sishui People's Hospital
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110452989B; CN110358835A

Abstract

本发明公开了生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用，所述生物标志物为lncRNA。本发明首次发现了AC074117.10和AC073283.7在胃癌中表达上调，通过对AC074117.10和AC073283.7进行AUC分析，发现AC074117.10和AC073283.7具有较高的诊断价值，提示通过检测AC074117.10和AC073283.7的表达水平可以判断受试者是否患有胃癌以及患胃癌的风险，本发明同时为胃癌的治疗提供了基因靶点。

Description

生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用。

背景技术

胃癌(Gastric Cancer GC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居肿瘤相关死亡的第三位(Jemal A,Bray F,Center MM，Ferlay J,Ward E,Forman D.Global cancerstatistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)。诸多因素与胃癌发生发展相关，包括遗传因素、幽门螺杆菌感染、不健康饮食(例如盐和硝酸盐的高剂量摄入)和吸烟、烟酒等。由于缺乏典型的早期症状，胃癌的早期诊断比较困难，胃癌患者确诊时大多已经处于中晚期，错过肿瘤最佳治疗时机。目前，手术治疗和放化疗是胃癌的主要治疗方法(MacdonaldJS,Smalley SR,et al.Chemoradiotherapy after surgery compared with surgeryalone for adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction.N Engl JMed,2001,345(10):725-730.)，但由于缺乏早期诊断的生物标记物、预后指标以及有效的治疗靶点，且胃癌复发、远处转移以及化疗抵抗的频繁发生等等因素使胃癌总体预后差，胃癌5年存活率约为40％。尽管已有很多研究探讨了癌症的生物学特性，但其在改善胃癌临床疗效所发挥的作用却是微乎其微。因此，关于胃癌发生发展的生物学机制的研究具有积极的意义。

在过去的几十年里，胃癌的研究主要集中在关键蛋白编码基因的突变参与胃癌的发病机制方面(Nagarajan N,Bertrand D,Hillmer AM,et al.Whole-genomereconstruction and mutational signatures in gastric cancer.Genome Biol,2012,13(12):R115.)。随着测序技术和基因组分析技术的进展，人们发现蛋白质编码基因仅占总转录基因的2％，而大多数的基因被转录为非蛋白质编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)。根据其编码长度的不同可分为两类，一类为小非编码RNA，即长度小于200个核苷酸(nt)的短链RNA，包括微RNA(miRNAs)，小干扰RNA(siRNAs)和Piwi相关RNA(piRNAs)；另外一类非编码RNA，其长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA，称为长链非编码RNA(long non-codingRNA,1ncRNA)，近年来长链非编码RNA吸引了越来越多研究者的注意，越来越多的证据已经表明，lncRNAs可以通过转录水平、转录后水平以及表观遗传学层面局部或全局的调控基因表达(Mercer TR,Dinger ME,Mattick JS.Long non-coding RNAs:insights intofunctions.Nat Rev Genet,2009,10(3):155-159.)。鉴于lncRNA在基因表达过程中发挥的重要作用，在胃癌中异常lncRNA表达具有组织特异性，这使得lncRNA具有胃癌诊断标识物的潜力。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与胃癌相关的生物标志物，通过检测生物标志物的水平可以判断受试者是否患有胃癌以及患胃癌的风险；同时生物标志物可以作为胃癌的治疗靶标，应用于治疗药物的筛选以及治疗药物的制备。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测样本中分子标志物的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用，所述分子标志物选自AC074117.10或AC073283.7的一种或两种。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别AC074117.10或AC073283.7的探针；或

特异性扩增AC074117.10或AC073283.7的引物。

进一步，当AC074117.10或AC073283.7表达上调时，受试者患有胃癌。

本发明提供了一种诊断胃癌的产品，所述产品包括检测样本中的AC074117.10或AC073283.7的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。

进一步，所述试剂包括反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测AC074117.10或AC073283.7的试剂。

进一步，通过实时定量PCR检测AC074117.10或AC073283.7的试剂至少包括一对特异性扩增AC074117.10或AC073283.7的引物。

进一步，所述特异性扩增AC074117.10的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增AC073283.7的引物如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在构建预测胃癌的计算模型中的应用。

本发明提供了一种胃癌的检测系统，包含：

1)用于测定样本中分子标志物特征值的工具；

2)比较样本中分子标志物特征值的工具；

3)数据存储介质。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在筛选治疗胃癌的药物中的应用。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在制备治疗胃癌的药物中的应用。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在制备治疗胃癌转移的药物中的应用。

本发明提供了AC074117.10在制备治疗胃癌侵袭的药物中的应用。

进一步，所述药物包括AC074117.10、AC073283.7的抑制剂。所述抑制剂选自能够抑制基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

本发明提供了一种治疗胃癌的药物组合物，所述药物组合物包括AC074117.10或AC073283.7的抑制剂。所述抑制剂选自能够抑制基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

附图说明

图1是利用QPCR检测AC074117.10或AC073283.7基因在胃癌组织中的表达情况图，其中图A为AC074117.10，图B为AC073283.7。

图2是不同基因的ROC曲线图，其中图A为AC074117.10，图B为AC073283.7，图C为AC074117.10和AC073283.7；

图3是siRNA干扰基因效果图；

图4是CCK-8检测细胞增殖能力图；

图5是Transwell检测胃癌细胞迁移和侵袭图。

具体的实施方式

本发明通过检测胃癌组织和癌旁组织中的lncRNA的表达水平，首次发现了AC074117.10和AC073283.7在胃癌中表达上调，通过检测AC074117.10和AC073283.7的表达水平，可以判断受试者是否患有胃癌或者患胃癌的风险，为胃癌的诊断和治疗提供新的策略，同时为揭示胃癌的发病机理提供了理论依据。

AC074117.10基因位于2号染色体上，包括AC074117.10基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的AC074117.10，以及源自细胞中加工的任何形式的AC074117.10。该术语涵盖AC074117.10的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。作为非限制性的实施方案，AC074117.10具有如ENST00000447070.1、ENST00000453289.1或ENST00000412749.1所示的序列。作为一种代表性的实施方案，AC074117.10具有如ENST00000447070.1所示的序列。

AC073283.7基因位于2号染色体上，包括AC073283.7基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的AC073283.7，以及源自细胞中加工的任何形式的AC073283.7。该术语涵盖AC073283.7的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的AC073283.7的序列如ENST00000421759.1所示。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定LncRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物lncRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。

“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的RNA的表达相比，从以患有胃癌为特征的个体分离的样本中RNA表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的样本相比，从以患有胃癌为特征的个体分离的样本中RNA表达水平降低的基因。

本发明中的正常个体是相对于胃癌患者或癌组织而言，相对于胃癌患者，非癌症患者为正常个体；相对于癌组织，任何正常的组织包括来自健康人的组织(血液，胃组织等)、以及来自胃癌患者的癌旁组织为正常个体。

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，包括但不限于反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台。

所述用反转录PCR进行检测至少包括一对特异扩增AC074117.10或AC073283.7基因的引物；所述用实时定量PCR进行检测至少包括一对特异扩增AC074117.10或AC073283.7基因的引物；所述用原位杂交进行检测包括：与AC074117.10或AC073283.7基因的核酸序列杂交的探针；所述用northern blot进行检测至少包括与AC074117.10或AC073283.7基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片进行检测包括：与AC074117.10或AC073283.7基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明中，术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

术语“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因维持标记(Labeling)作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA(singlestrandedDNA)探针、双链DNA(doublestrandedDNA)探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测胃癌。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在制备预测胃癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于胃癌的风险或与有助于评估胃癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有胃癌风险的个体、具有胃癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估胃癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在筛选治疗胃癌的候选药物中的应用，包括如下步骤：

用待筛选物质处理表达或含有AC074117.10或AC073283.7基因的体系；和

检测所述体系中AC074117.10或AC073283.7基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制AC074117.10或AC073283.7基因的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是治疗胃癌的候选药物。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对AC074117.10或AC073283.7基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了AC074117.10或AC073283.7在制备治疗胃癌的药物中的应用。所述药物包括了AC074117.10或AC073283.7的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

本发明提供了一种胃癌的检测系统，包含：

1)用于测定样本中分子标志物特征值的工具；

2)比较样本中分子标志物特征值的工具；

3)数据存储介质。

本发明中的数据存储介质存储数据集合，术语“数据集合”指在物理上和/或逻辑上集合的数据集合。因此，数据集合可落实到单个数据存储介质中或彼此有效连接的物理上分离的数据存储介质中。优选地，数据集合落实到数据库中。因此，如此处所用的数据库包含在合适的存储介质上的数据集合。此外，数据库优选还包含数据库管理系统。数据库管理系统优选为基于因特网的分级数据库管理系统或面对对象数据库管理系统。此外，数据库可以是联合数据库或集成数据库。更优选地，数据库将落实为分布式(联合)系统，例如Client-Server-System。更优选地，构造数据库以允许搜索算法来比较试验数据组和包含数据集合的数据组。尤其是，通过使用此类算法，可以搜索数据库(即查询搜索)得到指示胃癌的相似或相同数据组。因此，如果可以在数据集合中鉴定到相同的或相似的数据组，试验数据组将与胃癌相关。结果，从数据集合中获得的信息可以基于从受试者获得的试验数据组用于诊断胃癌。更优选地，数据集合包含任何一组包含的标志物的特征值。

术语“数据存储介质”包括基于单个物理实体如CD、CD-ROM、硬盘、光存储介质或磁盘的数据存储介质或者云盘。此外，所述术语还包括由物理分离实体组成的数据存储介质，所述物理分离实体以提供上述数据集合的方式，优选以查询搜索的合适方式彼此有效连接。

本发明中的“系统”涉及彼此有效连接的不同工具。所述工具可落实到单个装置中或可以是彼此有效连接的物理上分离的装置。用于比较标志物特征值的工具优选基于用于比较的算法而进行运作。数据存储介质优选包含上述数据集合或数据库，其中存储数据组的每一组指示断胃癌。因此，本发明的系统允许鉴定存储在数据存储介质中数据集合是否包含试验数据组。结果，本发明的系统可用作诊断胃癌的诊断工具。

在系统的优选实施方案中，包含用于测定样品标志物特征值的工具。

术语“用于测定标志物特征值的工具”优选涉及用于测定标志物的如核酸扩增装置、核酸杂交装置。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 QPCR检测AC074117.10、AC073283.7在胃癌中的表达情况

1、样品收集

收集35例胃腺癌患者的癌组织和相应的癌旁组织，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、逆转录：

使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

1)去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将Buffer 2 4.0μl，RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据AC074117.10、AC073283.7和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

AC074117.10基因：

正向引物为5’-CAGCCTCCTGAATAGTTG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-GCAATATAGCAAGACCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

AC073283.7基因：

正向引物为5’-ACCTCTGATGAGATGATT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TTTCGTCTCCTCTACTTT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。

2)QPCR扩增检验

用Premix Ex Taq^TM II(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal CyclerReal Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认RealTime PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

5、使用pROC R包计算AC074117.10和AC073283.7的AUC值，判断AC074117.10和AC073283.7在胃癌中的诊断价值。

6、结果

QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，AC074117.10和AC073283.7在胃癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，AC074117.10上调约1.91倍，AC073283.7上调约4.52倍。

生物信息学分析发现，AC074117.10和AC073283.7具有较高的诊断价值(图2所示)，其中AC074117.10的AUC值为0.902，AC073283.7的AUC值为0.888，两者联合的AUC值为0.912，说明AC074117.10与AC073283.7单独或者联合诊断都具有较高的应用价值。

同时根据AC074117.10和AC073283.7与胃癌发生之间的相关性，设计靶向于AC074117.10或AC073283.7的siRNA、shRNA应用于胃癌的治疗和药物制品的制备。

实施例2 siRNA沉默基因的效果检测

1、细胞培养

人胃癌细胞系HGC-27在含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

待细胞长满后去上清，加入0.25％的胰酶消化，1-2min，轻轻晃动，待细胞脱壁，去掉胰酶，加入含有血清的培养液中和终止消化；将细胞吹打均匀，取1/4-1/3量细胞进行传代，置37℃下继续培养。

2、siRNA瞬时转染

HGC-27细胞瞬时转染AC074117.10和AC073283.7的siRNA及scramble siRNA，相关siRNA由上海吉码制药有限公司合成，其中AC074117.10的siRNA序列为正义链：5’-AACAAGAUUUCGUCAUAAGAC-3’(SEQ ID NO.7)，反义链：5’-CUUAUGACGAAAUCUUGUUAG-3’(SEQID NO.8)；AC073283.7的siRNA序列为正义链：5’-ACAGAUUACCCAAGGUAUCUC-3’(SEQ IDNO.9)，反义链：5’-GAUACCUUGGGUAAUCUGUGC-3’(SEQ ID NO.10)。

转染前一天，将生长状态良好的2×10⁵个细胞接种到六孔细胞培养板中，每孔加2ml完全培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养20h；在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，使用无血清培养液培养4-6h后，换用完全培养基继续培养。实验分为对照组(scramble siRNA，C1)、实验组(AC074117.10siRNA，E1；AC073283.7siRNA，E2)。

3、RNA的提取与浓度测定

使用PBS洗涤细胞2次，6孔板中每孔加入1ml Trizol溶液，反复吹打5-10次，使细胞裂解，转移到1.5ml Eppendorf管，室温放置5min，其他操作同实施例1。

4、逆转录和QPCR扩增步骤同实施例1

5、结果

结果如图3所示，与对照相比，实验组中的AC074117.10和AC073283.7基因，均呈现显著性下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，因此选择前述siRNA进行基因的功能性检测。

实施例3基因对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

1、CCK-8法检测胃癌细胞增殖能力

细胞培养与转染同前，分别将转染siRNA的HGC-27细胞系及相应对照细胞系制成的细胞悬液接种于96孔板培养，每孔细胞数为5000个，48h加入CCK8试剂，于5％CO₂，37℃孵育1h，在酶标仪450nmOD处检测各孔的吸光度值，根据所得吸光值判断AC074117.10和AC073283.7干扰状态下对细胞增殖能力的影响。并绘制细胞生长曲线。

2、Transwell检测细胞迁移和侵袭

在细胞转染48h后进行消化，使用无血清培养基进行重悬，调整细胞密度为1×l0⁶个/ml，将上述细胞按照每孔100μl的体积接种于Transwell小室上层(侵袭实验，在Transwell小室底部加入一层Matrigel基质胶)，小室下层加入含有血清的培养基，将小室置于24孔板的孔中，5％CO₂，37℃培养24h后收集Transwell小室，用棉签将上室的细胞擦净，PBS清洗3遍后甲醇固定20min，结晶紫染色15分钟，光镜下进行计数，实验重复三遍。

3、实验统计及分析

两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)或重复测量方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义，统计图用GraphPad prism软件绘制。

4、结果

1)CCK-8检测结果如图4所示，在敲低AC074117.10和AC073283.7会抑制胃癌细胞的增殖能力。

2)Transwell小室检测结果如图5所示，敲低AC074117.10之后，迁移和侵袭的胃癌细胞数显著降低，而敲低AC073283.7之后迁移的胃癌细胞数显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)而细胞侵袭能力的变化则无显著变化，提示可以将AC074117.10和AC073283.7应用于胃癌及其转移的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 泗水县人民医院

<120> 生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用

<150> 2019106842877

<151> 2019-07-26

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcctcctg aatagttg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaatatagc aagacctcat 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acctctgatg agatgatt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcgtctcc tctacttt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacaagauuu cgucauaaga c 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuuaugacga aaucuuguua g 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagauuacc caagguaucu c 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gauaccuugg guaaucugug c 21

Claims

1.检测样本中分子标志物的试剂在制备诊断胃癌的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物选自AC074117.10或AC073283.7的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别AC074117.10或AC073283.7的探针；或

特异性扩增AC074117.10或AC073283.7的引物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，当AC074117.10或AC073283.7表达上调时，受试者患有胃癌。

4.一种诊断胃癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测样本中的AC074117.10或AC073283.7的试剂，优选的，所述产品包括芯片、试剂盒。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、northern blotting、芯片或高通量测序平台检测AC074117.10或AC073283.7的试剂；优选的，通过实时定量PCR检测AC074117.10或AC073283.7的试剂至少包括一对特异性扩增AC074117.10或AC073283.7的引物；优选的，所述特异性扩增AC074117.10的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增AC073283.7的引物如SEQ IDNO.3～4所示。

6.AC074117.10或AC073283.7在构建预测胃癌的计算模型中的应用。

7.一种胃癌的检测系统，其特征在于，包含：

1)用于测定样本中分子标志物特征值的工具；

2)比较样本中分子标志物特征值的工具；

3)数据存储介质。

8.分子标志物在制备治疗胃癌的药物中的应用，其特征在于，所述分子标志物选自AC074117.10、AC073283.7。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括AC074117.10、AC073283.7的抑制剂，优选的，所述抑制剂为siRNA；优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。

10.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括AC074117.10或AC073283.7的抑制剂；优选的，所述抑制剂为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～10所示。