CN102292456A - 用于诊断和治疗卵巢癌的基于microRNA 的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于诊断、预后和/或治疗卵巢癌的方法和组合物。

Description

用于诊断和治疗卵巢癌的基于microRNA 的方法和组合物
发明人：David E.Cohn，Kimberly E.Resnick，Hansjuerg Alder，Carlo M.Croce
交叉引用相关申请
本申请要求2008年12月28日提交的美国临时申请案61/120,123的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。
关于联邦政府支助的研究的声明
本发明是在无政府支助的情况下进行的，因此政府在本发明中不具有权利。
本发明的技术领域和工业适用性
本发明总地说来涉及分子生物学领域。本发明的某些方面包括在卵巢癌相关病症的诊断、治疗和预后中的应用。
背景
不承认本部分中公开的背景技术在法律上构成现有技术。
在2008年，预期20，180个妇女被诊断为患有卵巢癌并且15,310个将死于该疾病[1]。卵巢癌是其中只有20％的患者被诊断为患有I期疾病的毁灭性疾病[2]。与卵巢相关的不良预后是多因素导致的：缺乏最低限度地侵袭性早期检测测试，微妙的症状发展和肿瘤的化学抗性。即使出现了化学抗性测定，仍然难以预测药物抗性并且只有10-15％的患者将在初步细胞毒性疗法后保持缓解期延长。
虽然已广泛实行每年一次的骨盆检查，但其缺乏用作卵巢癌的筛查策略所需的灵敏度[3]。处于患卵巢癌的高风险中的妇女通常可利用经阴道超声和血清CA-125进行筛查。然而，CA-125仍然是用于早期疾病的较差标志物，具有40％的记录的灵敏度[4，5]。此外，已显示即使在高风险的经筛查的群体中，新发病例(incident case)仍然更可能是晚期[6]。可帮助确定治疗计划和预测化疗结果的生物标志物(biomarker)的鉴定在该患者群体中是高度期望的。
存在关于microRNA在各种病理状况中的作用的新出现的研究，所述病理状况包括实体恶性肿瘤和恶性血液病。MicroRNA(miRNA)是小的22-25个核苷酸的非编码RNA序列。此类序列通过在靶向3′UTR后对信使RNA转录物的翻译抑制或降解来控制基因表达。利用漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的早期研究显示，大量的此类序列在所有物种中是高度保守的，这证明miRNA在细胞分化、增殖和细胞周期控制中起重要作用[7]。现已公认，miRNA在恶性肿瘤中频繁地失调。表达不足的miRNA例如肺癌中的let-7和白血病中的mir-15/16是分别抑制Ras和BCL2的肿瘤抑制基因[8，9]。过表达的miRNA例如mir-21和簇mir-17-92是分别靶向实体恶性肿瘤和恶性血液病中的肿瘤抑制基因PTEN和E2F1的癌基因(oncomirs)[10，11]。虽然妇科恶性肿瘤的miRNA研究处于初级阶段，但最近已公布了卵巢癌的miRNA特征谱[12-14]。
最近已揭示循环RNA在良性和恶性状况中的诊断和预后效用。胎盘相关循环miRNA与妊娠进展(pregnancy progression)相关[15]。在恶性状态中，已显示肾细胞癌患者的循环mRNA[16]以及来自患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者的血清的miRNA[17]稳定并且高效地预测恶性肿瘤以及存活。最近已显示，卵巢癌患者的循环肿瘤外来体(exosome)的miRNA特征显示与原发性肿瘤的miRNA表达的高度关联性[18]。卵巢癌仍然是高度期望具有针对其的改进的非侵袭性血清筛查测试的疾病。
尽管对治疗此类疾病的疗法进行了相当多的研究，但它们仍然难以有效地诊断和治疗，并且在患者中观察到的死亡率表明，卵巢癌的诊断、治疗和预防需要改进。
概述
在第一广泛的方面，本文中提供了方法，其诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生卵巢相关病症的风险中，确定患卵巢相关病症的受试者的预后和/或治疗患有卵巢相关病症的受试者的卵巢相关病症，其包括：测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中的生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症，或处于发生所述病症的风险中。
在某些实施方案中，所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方案中，测试样品中生物标志物的水平高于对照样品中相应生物标志物的水平。
在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方案中，测试样品中所述至少一种生物标志物的水平低于对照样品中相应生物标志物的水平。在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了筛选受试者的卵巢癌的一种或多种生物标志物的方法，其包括：获得受试者的血清样品，进行定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及定量在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的一种或多种生物标志物，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，样品包括血液样品。
在某些实施方案中，样品包括血清或血浆血液样品中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢癌的方法生物标志物，其包括在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的至少一种生物标志物，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢肿瘤的独特的microRNA表达特征，其包括调节肿瘤microRNA加工的一种或多种生物标志物的表达的改变，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于影响有些需要的受试者的卵巢中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体的一种或多种microRNA失调。
在某些实施方案中，所述方法还包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
在某些实施方案中，所述方法包括改变miR-21、miR-92、mir-93、miR-126和miR-129a中的一种或多种的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
在另一个广泛的方面，本文中提供了microRNA和/或编码蛋白质的RNA的大规模基因表达表征用于鉴定人卵巢肿瘤中发生的microRNA功能的改变的用途。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于筛查有此需要的受试者的卵巢的方法，其包括对受试者的血清样品进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR)的步骤。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括：miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括如下的一种或多种：被上调的miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体；和被下调的miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括：miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述生物标志物包括卵巢肿瘤中的在卵巢肿瘤中增加的宿主基因表达。在某些实施方案中，所述生物标志物包括miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了miR-21、miR92和/或miR-93，或其功能变体的用途，其用作卵巢癌细胞中的至少一个基因的靶和/或用于抑制此类基因的蛋白质表达。
在另一个广泛的方面，本文中提供了调节卵巢癌细胞表达的一种或多种基因的方法，其包括改变miR-21、miR92和/或miR-93在卵巢癌细胞中的表达的步骤。
在另一个广泛的方面，本文中提供了将microRNA与3′UTR序列结合以导致哺乳动物卵巢癌细胞中被靶向的mRNA的降解和/或积累的用途。
在另一个广泛的方面，本文中提供了人组织中microRNA与mRNA之间的负相关和/或正相关用于预测卵巢癌的microRNA靶基因的用途。
在另一个广泛的方面，本文中提供了miR-表达抑制剂，其包含miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了包含miR-21、miR92和/或miR-93或其功能变体中的一种或多种的miR-表达抑制剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了包含miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的miR-表达反义抑制剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节卵巢癌细胞中蛋白质表达的方法，其包括调节miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节卵巢癌细胞中蛋白质表达的方法，其包括调节miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于确定患有卵巢癌的受试者的预后的方法，其包括测量受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种，并且其中：i)所述生物标志物与卵巢癌的不利预后相关；以及ii)相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中至少一种生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断受试者是否患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中的方法，其包括：从获自受试者的血清测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；以及将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中。
在某些实施方案中，至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号被下调，和/或其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号被上调。
在某些实施方案中，至少一种生物标志物miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的卵巢癌或处于发生该疾病的风险中。
在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗患有卵巢癌的受试者的卵巢癌的方法，其中相对于对照细胞，至少一种生物标志物在受试者的癌细胞中被下调或上调，其包括：当至少一种生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；或当至少一种生物标志物在癌细胞中被上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗受试者的卵巢癌的方法，其包括：测定相对于对照细胞，卵巢癌细胞中至少一种生物标志物的量；和通过如下步骤改变卵巢癌细胞中表达的生物标志物的量：如果癌细胞中表达的生物标志物的量少于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物；或者如果癌细胞中表达的生物标志物的量多于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物；其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含至少一种分离的生物标志物和药学上可接受的载体，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，所述生物标志物相应于相对于对照细胞在卵巢癌细胞中被上调的生物标志物。在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。
在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与卵巢癌细胞中增加的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的降低表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量与卵巢癌细胞中下降的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且其中所述生物标志物选自miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了评估疗法预防、诊断和/或治疗卵巢癌相关疾病的功效的方法，其包括：使动物经历其功效有待评估的疗法，然后通过评估至少一种生物标志物来测定待测试的疗法在治疗或预防疾病中的功效的水平，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方案中，候选治疗剂包括如下的一种或多种：药物组合物、营养食品组合物和顺势疗法组合物。
在某些实施方案中，待评估的疗法是用于人受试者的。
在另一个广泛的方面，本文中提供了制品，其包含：至少一种结合卵巢癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于筛选治疗卵巢癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：至少一种生物标志物的一种或多种试剂，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种，和表达至少一种生物标志物的细胞。在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一种生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述生物标志物的存在。
在另一个广泛的方面，本文中提供了干扰卵巢癌相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性的方法，其包括：给个体施用干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
在另一个广泛的方面，本文中提供了包含miR-21、miR-92和miR-93中的一种或多种的抑制剂的组合物。
在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗有此需要的受试者的卵巢病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的所述组合物。在某些实施方案中，预防性施用所述组合物。在某些实施方案中，所述组合物的施用延迟病症的一种或多种症状的发作。
在某些实施方案中，肽的施用抑制卵巢癌的发展。
在某些实施方案中，肽的施用抑制肿瘤生长。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于检测卵巢癌在生物学样品中的存在的方法，所述方法包括：将怀疑包含卵巢癌的生物学样品暴露于用于此的标志物；然后检测所述标志物(如果有的话)在样品中的存在或不存在；其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，所述标志物包括可检测的标记。
在某些实施方案中，所述方法还包括将受试者的生物学样品中标志物的量与正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比较。在某些实施方案中，所述方法还包括在不同的时间点从受试者收集多个生物学样品并且比较每一个生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括：miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种的抑制剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括：miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的反义抑制剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了制造用于治疗卵巢癌的药物的用途，包含选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的核酸分子。在某些实施方案中，药物包含显示选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的序列的核酸分子。
在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定诱导卵巢癌细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，所述方法包括如下阶段：i)培养来源于卵巢肿瘤的细胞，ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析阶段(i)与(ii)之间至少一种miR的表达水平的变化，和iv)鉴定诱导阶段(i)与(ii)之间的miR表达水平的变化的化合物或化合物的组合。在某些实施方案中，阶段(iii)包括分析至少一种miR的表达水平。在某些实施方案中，阶段(iv)包括鉴定调节至少一种miR的表达水平的化合物或化合物的组合。在某些实施方案中，阶段(iv)包括鉴定降低至少一种miR的表达水平的化合物或化合物的组合。在某些实施方案中，所述化合物是用于治疗癌症的治疗剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了用于分类受试者的卵巢组织的方法，其包括：测量测试细胞群体中miR之中miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的表达，其中测试细胞群体中至少一种细胞能够表达miR之中miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种；将miR的表达与参照细胞群体中miR的表达相比较，所述参照细胞群体包含至少一种对于其的卵巢癌分类是已知的细胞；以及鉴定测试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种miR的表达水平的差异(如果存在的话)，从而分类受试者的卵巢癌。
在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中表达的差异表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。
在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中相似的表达模式表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。
在某些实施方案中，参照细胞群体是多个细胞或数据库。在某些实施方案中，参照细胞群体选自：分类为来自正常卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体。
当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
附图概述
本专利或申请文件包含至少一个以彩色制成的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局提供。
图1：公布的miRNA特征谱与来自卵巢癌患者血清的差异表达的miRNA的比较。
图2：患者与对照血清之间差异表达的miRNA的中位倍数变化差异。
发明详述
在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本文以更全面地描述本发明涉及的现有技术。
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定制剂或过程参数，因为这些当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述本发明的特定实施方案，而不意欲是限定性的。
虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的许多方法和材料可用于实践本发明，但优选的材料和方法描述于下文中。
MicroRNA是调节编码蛋白质的基因的表达的小的非编码RNA。MicroRNA表达随卵巢癌的发展和进展而开始改变。此类microRNA中的一些调节卵巢癌细胞中癌症相关基因的表达。如在本文中可互换使用的，“miR基因产物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”是指来自miR基因的未加工的或经加工的RNA转录物。
如本文中所使用的，“生物标志物”可包括“miR基因产物”、″microRNA″、″miR″或“miRNA”或编码蛋白质的RNA中的一种或多种。
有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活性的19-25个核苷酸的RNA分子，而不必从miR前体加工获得。当在本文中通过名称提及microRNA时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。
本发明包括诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生该病症的风险中的方法。如本文中所使用的，“受试者”可以是患有或怀疑患有卵巢癌的任意哺乳动物。
我们提供了关于下列的描述：从卵巢癌患者的血清提取miRNA，患者与健康对照之间许多此类miRNA的差异表达，以及新型实时PCR微阵列检测方法。
在下列实施例中进一步阐释本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，虽然这些实施例表示本发明的优选实施方案，但它们仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离本发明的精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进，以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。
实施例I
方法
在获得The Ohio State University College of Medicine的伦理审查委员会(Institutional Review Boards)的批准后，我们分析来自28个具有新近确诊的卵巢癌的患者和15个正常对照的血清样品。在确定的手术治疗和/或辅助疗法之前，在最初会诊时收集这些血清样品。获得血清作为前瞻性组织和血清获得研究(procurement study)的一部分，并且将其贮存于-80℃下。从志愿充当对照的15个健康妇女获得新鲜血清。解冻冷冻的血清，同时从患者和对照群体提取RNA。没有一个健康对照之前被诊断为患有恶性肿瘤。
如制造商所说明的，使用Tri-Reagent BD(Molecular ResearchCenter，Inc.，Cincinnati，OH)从250μl血清提取RNA。利用ThermoScientific NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA)评估RNA质量。利用TaqMan Array Human MicroRNA Panel(v.1，Applied Biosystems，Foster City，CA)，使用50ng RNA/端口(总共400ng)，用来自4个对照和9个癌症患者的RNA进行MicroRNA表达表征。该阵列包含365个miRNA靶以及内源对照。利用小核RNA(snRNA)U44和U48进行标准化。此类snRNA是适合在TaqMan测定中用作标准化物的稳定表达的参照基因。
除了在微阵列板(microarray panel)上鉴定差异表达的miRNA外，第二目的是鉴定在缺乏关于受试者的公开数据的情况下可用作标准化物的miRNA。凭经验从表达特征谱选择21个miRNA，用于对照和患者血清(11个对照和19个患者)的进一步检查。基于对照与患者之间4个循环或更多循环的表观Ct差异选择此类miRNA。鉴于在全部患者和对照样品之间的一致表达，两种miRNA(142-3p和16)被鉴定为潜在的标准化物。对于目的miRNA，使用单管TaqMan MicroRNA测定。全部试剂、引物和探针获自Applied Biosystems(Applied Biosystems，Foster City，CA)。将1ng RNA/样品用于测定。MiRNA-142-3p用作标准化物。在GeneAmp PCR 9700热循环仪(Applied Biosystems)中进行全部RT反应，包括无模板(无cDNA)对照和负对照(无逆转录酶)。使用ABI Prism7900HT Sequence检测系统(Applied Biosystems)定量基因表达水平。以一式三份进行比较实时PCR，包括无模板对照。
利用比较Ct.法计算microRNA的表达。利用STATA v.10(CollegeStation，TX)进行统计分析。使用曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)比较表达。P值大于0.05被认为是统计学上显著的。
结果
本研究包括28个患上皮卵巢癌的患者。分期细目(Stage breakdown)如下：I期-8(28.5％)、II期-2(7.1％)、III期-8(28.5％)、IV期-10(35.7％)。组织学细目如下：血清(60％)、透明细胞(21.2％)、子宫内膜样(12％)、粘蛋白(6％)。年龄中位数为57岁(年龄范围34-79)。与大多数患有卵巢癌的组相似，大部分(66％)具有III期或IV期疾病，并且主要(60％)是血清组织学。
使用微阵列的初步miRNA表达表征鉴定了23种目的miRNA(包括2种标准化物)。我们产生了维恩图以将来自我们的初始测试组的23种目的miRNA与已知的miRNA特征谱相比较。在所述组中存在10种目的miRNA，其与已在文献公开的、作为卵巢癌miRNA特征的一部分的miRNA相同(图1)。
在继续进行21种miRNA的定量RT-PCR后，与对照相比较，卵巢癌患者的血清中5种miRNA过表达(miRNA-21、29a、92、93和126，p＝.0002、p＝.003、p＝.0001、p＝.0003、p＝.007)以及3种miRNA表达不足(mir-127、155和99b，p＝.0001、p＝.0003、p＝.0001)。患者相对于对照的miRNA中位表达的倍数差异示于图2中。
3个患者被鉴定为手术前CA-125＜35U/ml。然后我们检查具有最高血清表达的三种miRNA，miR-21、92和93在具有正常CA-125的患者中的表达模式，以确定miRNA模式是否模拟CA-125模式。当将患者群体中的中位表达与对照相比较时，发现这三种miRNA在这些患者中显著过表达(表1)。
Figure BDA0000078450990000161
miRNA状态与分级、分期或组织学亚类之间不存在相关性。由于小的样品大小和疾病的新近诊断，我们未尝试将miRNA状态与无瘤间期或存活相关联。
讨论
我们证明，从经诊断患有卵巢癌的个体的血清提取RNA和鉴定miRNA是可实施的。
发明人在本文中首次描述，使用实时PCR、微阵列平台筛选大量miRNA，同时使需要的RNA的量最小化。
此外，发明人在本文中显示，miRNA可作为具有正常CA-125的患者的早期检测生物标志物。
产生特征谱，随后在19个患者和11个健康对照的组中进行检验。在我们选择的21种目的miRNA中，有10种miRNA与已公开的卵巢癌特征谱是相同的。在我们发现的5种过表达的miRNA中，有3个是潜在的oncomir：miR-21、92和93。已显示miR-21在胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和胃癌中过表达[19，20]。已显示其调节肝细胞癌中的PTEN的表达[10]，并且调节PDCD4和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(maspin)(参与调节侵袭和转移的两个基因)[21，22]。
患者的血清中最始终如一地过表达的miRNA是miR-92。Mir-92a-1是位于染色体13q13上的mir-17-92多顺反子的一部分。在淋巴瘤的转基因小鼠模型中，已知的oncomir，mir-17-92增强的表达明确地显示加速淋巴瘤进展[23]。miR-93的过表达与卵巢癌患者中减少的无瘤生存期和总体生存期相关[13]。在胃肿瘤中，该簇负调节TGFβ肿瘤抑制活性[24]。已提及的miR-92和miR-93的致癌活性与我们的血清发现一致。
与已公开的卵巢癌特征谱相反，发明人在本文中现已显示miR-29a和miR-126在卵巢癌患者的血清中显著过表达。已提及miR-126和29a的许多肿瘤抑制活性。Mir-126在具有与不良结果相关的丢失的乳腺癌中表现为“转移抑制剂”[25]。已发现Mir-29a在肺癌中表达不足；其牵涉在肺癌中观察到的甲基化模式的调节[26]。虽然此类miRNA的过表达倾向于暗示，它们是oncomir，但TargetScan(4.2)确实预测，PTEN是miR-29a的潜在的靶。
Mir-127已被鉴定为卵巢癌细胞系中31个下调的miRNA之一[14]。最近已显示，其包埋在CpG岛中并且在大多数癌细胞系中完全沉默。在该相同的研究中，已显示利用5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理细胞系不仅恢复miR-127表达，而且还减少原癌基因BCL6的表达[27]。总之，这些结果将miR-127鉴定为肿瘤抑制基因，这支持了我们的发现，在患者血清中表达降低。
应注意，关于从血清提取质量miRNA，存在有限量的已公开的数据。尽管经历RNA降解以及基因组DNA污染(结果未显示)，发明人发现，进行TaqMan Array Human MicroRNA只需要400ng总RNA。此外，鉴于目的扩增子为约25至30个核苷酸，因此，发明人确定RNA的一些降解是可耐受的。
同样地，发明人还在本文中确定，用于实时PCR的对照说明了由试剂产生的交叉污染(无模板对照)以及基因组DNA污染(RT负对照)。
由于微阵列芯片通常只使用多至约5μg的样品，因此本文中描述的基于实时的方法不需要从血清提取大量的纯RNA。发明人在本文中第一次显示，实时PCT方法可用于获得血清RNA的miRNA特征谱。
用途实例和其定义
除非另有指出，否则本发明的实践将利用在本领域技术人员的能力范围内的药理学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中得到详尽解释。参见，例如，Handbook ofExperimental Immunology，第I至IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook，等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)。
因此，在本文中提供了用于进一步解释的定义并且所述定义不被解释为限制性的。
冠词″a″和″an″在本文中用于指1个或多于1个(即，至少1个)该冠词的语法宾语。举例而言，″an element″意指1个元件或多于一个元件。
“标志物”和“生物标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比，其在组织或细胞中的改变的表达水平与病症和/或疾病状态相关的基因或蛋白质和/或其功能变体。
标志物的“正常”表达水平是标志物在未患病症和/或疾病状态的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于评估表达的测定的标准误，在某些实施方案中，至少2倍，在其他实施方案中，3、4、5或10倍于对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。
标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平比对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍，在某些实施方案中低3、4、5或10倍。
试剂盒是包含至少一种试剂，例如用于特异性检测标志物的表达的探针的任何产品(例如，包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。
“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段；变异标志物蛋白和它们的片段；包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽；以及包含标志物或变异标志物蛋白，或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。
本文中所述的组合物、试剂盒和方法尤其可具有下列非限制性用途：
1)评估受试者是否患有病症和/或疾病状态；
2)评估受试者中病症和/或疾病状态的分期；
3)评估受试者中病症和/或疾病状态的分级；
4)评估受试者中病症和/或疾病状态的性质；
5)评估受试者中发生病症和/或疾病状态的可能性；
6)评估受试者中与病症和/或疾病状态相关的细胞的组织学类型；
7)制备用于治疗受试者的病症和/或疾病状态的抗体、抗体片段或抗体衍生物；
8)评估受试者的细胞中病症和/或疾病状态的存在；
9)评估一种或多种测试化合物抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
10)评估疗法抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
11)监控受试者的病症和/或疾病状态的进展；
12)选择抑制受试者的病症和/或疾病状态的组合物或疗法；
13)治疗患有病症和/或疾病状态的受试者；
14)抑制受试者的病症和/或疾病状态；
15)评估测试化合物的有害潜能；和
16)在处于发生病症和/或疾病状态的风险中的受试者中预防病症和/或疾病状态的发生。
筛选方法
可产生使得能够筛选可用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的动物模型。因此，该方法可用于鉴定用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病的治疗剂。该方法包括，对由本文中所述方法产生的动物模型施用候选试剂，和评估动物模型中的至少一种应答，与未施用候选试剂的对照动物模型相比较。如果至少一种应答在症状上减轻或在发作上延迟，则候选试剂是用于治疗或预防疾病的试剂。
候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologic agent)或可以是之前未知的具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中，候选试剂是具有大于50且小于大约2，500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例：生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries)；需要解卷积(deconvolution)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。
在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。
用于鉴定治疗受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound)/试剂。
候选试剂可以是上调或下调一个或多个受试者的病症和/或疾病状态应答途径的试剂。在某些实施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。
用于治疗病症和/或疾病状态的方法
本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转病症和/或疾病状态应答的方法。在本文所述的方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的受试者和已具有至少一种此类应答的受试者。
在前一种情况下，此类治疗用于预防此类应答的发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下，此类治疗用于减轻此类应答发生的程度，阻止它们进一步发展或逆转所述应答。
在某些实施方案中，干扰应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。
标志物的表达
可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例：可对患病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理患病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对受试者提供如此鉴定的化合物以抑制受试者的患病细胞。
任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，患病细胞中该标志物的表达水平与正常系统细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于评估标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至少大于评估方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍或更大的差异。
已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人受试者收集。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。
为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，评估蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。
应理解，含有此类细胞的受试者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中，标志物的表达水平可通过评估样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来评估。当然，可在评估样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
还应理解，可使标志物流出细胞进入例如呼吸系统、消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查痰、BAL、血清、血浆、尿、粪便等来检测流出的标志物。
组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体)，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。
标志物的表达可通过用多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来评估。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。
在特定的实施方案中，标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来评估。
在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来评估：从受试者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸或其片段的互补序列的参照多核苷酸杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA；优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以评估标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测受试者中标志物的存在。
在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时，期望在严格杂交条件下进行杂交。
在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(biomarker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗受试者的病症和/或疾病状态的试剂的方法可包括如下步骤中的一个或多个步骤：a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品；b)从此类细胞制备提取物；c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobilityshift assay)。
在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中，SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的105至10-6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。
因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测，因此期望标志物的表达水平显著大于用于评估至少一种正常细胞和受癌症影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。
应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的受试者样品进行常规筛选，将了解某些标志物在不同类型的细胞，包括受试者的特定病症和/或疾病状态中过表达。
此外，通过就标志物的表达评估更大数量的受试者样品，并且使从其获得样品的个体受试者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与受试者的病症和/或疾病状态强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。
当组合物、试剂盒和方法用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20％，在某些实施方案中，至少大约40％、60％或80％和基本上所有受试者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的病症和/或疾病状态)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10％的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80％的测定特异性)。
当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对各个标志物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中，将受试者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非病症和/或非疾病样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，样品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示受试者患有病症和/或疾病状态。当使用多个标志物时，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望使用更少的标志物。
为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏度最大化(即在干扰可归因于受试者样品中系统来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非系统组织中表达)的标志物。
应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生受试者的病症和/或疾病状态的风险的受试者和他们的医学顾问是特别有用的。被认为具有增加的发生病症和/或疾病的风险的受试者包括例如具有此类病症和/或疾病的家族史的受试者。
可以以多种方法评估正常人系统组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正常表达水平通过下述来评估：评估一部分表现正常的系统细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的系统细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正常表达的群体平均值。在其他实施方案中，标志物的“正常”表达水平可通过评估标志物在从未患病的受试者获得的受试者样品、在怀疑受试者的病症和/或疾病状态发作之前从受试者获得的受试者样品、编档保存的受试者样品等中的表达来进行测定。
本文中还提供了用于评估病症和/或疾病状态细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从受试者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了受试者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在用于评估样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。
试剂盒和试剂
试剂盒可用于评估患病细胞(例如在样品例如受试者样品中)的存在。试剂盒包含多种试剂，每一种试剂能够特异性结合标志物核酸或蛋白。适合于结合标志物蛋白的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。适合于结合标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记或未标记的)、未与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常系统细胞样品、癌症相关疾病细胞样品等。
产生抗体的方法
本文中还提供了制备产生用于评估受试者是否患有病症和/或疾病状态的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从其中表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。
评估功效的方法
本文还提供了评估测试化合物抑制患病细胞的功效的方法。如上所述，标志物的表达水平的差异与受试者的细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的变化可能由此类细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此，抑制受试者的病症和/或疾病状态的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常细胞中的表达水平)的水平。
因此，本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制相关疾病。细胞样品可以例如是获自受试者的正常细胞的单个样品的等分、获自受试者的正常细胞的混合样品、正常细胞系的细胞、获自受试者的相关疾病细胞的单个样品的等分、获自受试者的相关疾病细胞的混合样品、相关疾病细胞系的细胞等。
在一个实施方案中，样品是获自受试者的癌症相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物，以鉴定可能最佳地抑制受试者的癌症相关疾病的化合物。
同样可将该方法用于评估疗法抑制受试者的相关疾病的功效。在该方法中，评估一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法，另一个不经历疗法)中的表达水平。与评估测试化合物的功效的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对于抑制癌症相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的受试者的样品用于本方法，那么可在体外评估备选疗法以选择对于抑制受试者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。
如本文中所描述的，人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的标志物的数目，或通过比较两者来评估。各个方面在下列部分中进一步详细描述。
分离的蛋白质和抗体
一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物学活性部分，以及适合用作免疫原以引发抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物学活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。
当重组产生蛋白质或其生物学活性部分时，其也优选基本上不含培养基，即，培养基占据低于大约20％、10％或5％的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30％、20％、10％、5％(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。
标志物蛋白的生物学活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物学活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物学活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物学活性部分可通过重组技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40％，在某些实施方案中，50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。
预测医学
本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生特定病症和/或疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。
在另一个方面，该方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。
另一方面涉及监控被施用以抑制病症和/或疾病或治疗或预防任何其他病症(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用)的试剂(例如，药物或其他化合物)在临床试验中对标志物的表达或活性的影响。
药物组合物
化合物可存在于用于局部、局域或全身性施用的在适当的药物载体中的制剂中。由E.W.Martin编著的Remington′s PharmaceuticalSciences，第15版(Mark Publishing Company，1975)，公开了常用载体和制备方法。化合物还可被封装在由生物可降解的或非生物可降解的聚合物或蛋白质或脂质体形成的适当的生物相容性微胶囊、微粒或微球体中以用于靶向细胞。此类系统对于本领域技术人员来说是公知的并且可被优化以用于适当的核酸。
在例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；和Ausubel等人，1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York中描述了用于核酸递送的各种方法。此类核酸递送系统包括期望的核酸，其例如但不限于以“裸露”形式存在，例如“裸露的”核酸，或配制于适合于递送的媒介物中，例如与阳离子分子或形成脂质体的脂质复合，或作为载体的成分或药物组合物的成分。可以例如通过将核酸递送系统与细胞接触来给细胞直接提供核酸递送系统，或例如通过任何生物过程的作用来给细胞间接提供核酸递送系统。
用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。需要时，可使用常规药物载体、水性、粉末状或油性基质或增稠剂。
适合用于胃肠外施用例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液、溶液或乳剂，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的制剂可以以单位剂量形式(加入了防腐剂)例如在安瓿中或在多剂量容器中提供。本领域技术人员可容易地确定用于制备和配制组合物的各种参数，而无需花费过度的实验。可单独地或与其他适当的成分组合使用化合物。
一般地，施用化合物包括核酸的方法在本领域内是公知的。具体地，已用于核酸疗法以及当前使用的制剂的施用途径提供了优选的施用途径，并且选择的核酸的制剂将当然取决于因素例如具体的制剂、待治疗的受试者的状态的严重性和治疗功效所需的剂量。如本文中通常使用的，“有效量”是与未接受化合物的匹配的受试者相比较，能够在施用了制剂的受试者中治疗病症的一个或多个症状、逆转病症的一个或多个症状的进展、停止病症的一个或多个症状的进展或防止病症的一个或多个症状的发生的量。化合物的实际有效量可根据待使用的具体化合物或其组合、配制的具体组合物、施用模式和个体的年龄、体重、状况以及待治疗的症状或状况的严重性而变化。
本领域技术人员已知的任何可接受的方法可用于给受试者施用制剂。取决于待治疗的状况，施用可以是局部性的(即，至特定区域、生理学系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。
药物基因组学
标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物”是其表达水平与受试者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的受试者应答和更特别地受试者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过评估受试者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可选择最适合于受试者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。
监控临床试验
监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受癌症相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的功效。
在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，该方法包括步骤：
i)在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；
ii)检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平；
iii)从受试者获得一个或多个施用后样品；
iv)检测标志物在施用后样品中的表达水平；
v)将施用前样品中标志物的表达水平与施用后样品中标志物的表达水平相比较；以及
vi)相应地改变试剂至受试者的施用。
例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗，从而不需要改变剂量。
电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。
如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。
许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。
因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况(pre-cancer-related disease condition)的特定治疗。
本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有特定病症和/或疾病或具有对此类病症和/或疾病的易感性，和/或推荐用于此类疾病和/或此类癌症相关疾病前状况的特定治疗。该方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。
本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对与标志物相关的病症和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。该方法还包括推荐用于病症和/或疾病或对其的易感性的特定治疗的步骤。
本文中还提供了用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性的商业方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。该方法还可包括推荐用于此的特定治疗的步骤。
本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。
除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此，可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。
在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如病症和/或疾病的发生，其进展)和过程(例如与所述病症和/或疾病相关的细胞转化)中。
阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。
阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。
替代标志物(Surrogate Marker)
标志物可用作一种或多种病症或疾病状态或导致所述病症或疾病状态的状况的替代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或病症的不存在或存在，或与疾病或病症的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或病症中是否有效。当疾病状态或病症的存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病进展时，替代标志物是特别有用的。
标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或病症无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。
药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外，药效标志物的使用可提供由于药物治疗而产生的超出可直接观察的范围的风险的基于机制的预测。
用于检测的方案
检测病症和/或疾病的方法可包括例如在一段时间内测量各标志物基因在受试者的生物学样品中的表达水平和将该水平与对照生物学样品中标志物基因的表达水平相比较。
当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有病症和/或疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时，受试者不可能患有所述病症和/或疾病。
可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施方案中，容许的范围基于标准值采用±2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者的生物学样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行测试方法。
标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此，基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较，进行检测病症和/或疾病的一个方法。
可根据各种基因分析方法在病症和/或疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。
可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于测试的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。
此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。
同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。
含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40％，在某些情况下50％，在某些情况下60％，在某些情况下70％，在某些情况下80％，在某些情况下90％和在某些情况下95％或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至100bp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3′区域必须与标志物基因互补，而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。
“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。
在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测癌症相关疾病的方法。在下文中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如，Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。
用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检测标志物蛋白，可适当地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更具体地，此类检测方法可包括ELI SA法。
可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
此外，可通过使用指数(不仅生物学样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性)来进行癌症相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物学活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。
即使在常规检测中受试者未被诊断为患有病症和/或疾病(尽管症状暗示此类疾病)，这样的受试者是否患有病症和/或疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。
更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至少暗示对病症和/或疾病的易感性的受试者中标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由所述病症和/或疾病引起。
此外，检测可用于确定病症和/或疾病是否在受试者中得到改善。换句话说，本文中描述的方法可用于判断用于所述病症和/或疾病的治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基因之一时，已被诊断为患有所述病症和/或疾病的受试者中标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。
还可基于表达水平的差异测定病症和/或疾病的严重性和/或易感性。例如，当标志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与病症和/或疾病的存在和/或严重性相关。
动物模型
还可产生病症和/或疾病的动物模型，其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是编码具有与由标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本身固有的。
动物模型可用于检测由于病症和/或疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。
动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。该方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生动物模型。在另一个实施方案中，该方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生动物模型。还应理解，在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中，可通过引入选自此类基因的基因，或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生动物模型。在另一个实施方案中，可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导病症和/或疾病。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。可通过施用抑制活性的物质例如抗体来有效地控制蛋白质的活性。
动物模型可用于阐明病症和/或疾病背后的机制，还可用于测试通过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型产生特定病症和/或疾病的症状时，或当牵涉某种病症和/或疾病的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。
如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种：在人工表达作为外源基因导入的标志物基因的情况下；在受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强的情况下；或在作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制的情况下。
如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的状态，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的状态。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常状态中的活性相比较来测定。
也在预期的范围内的是：动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而被增强或被抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。
表达的实例
此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到保持即可。
在另一个方面，本文中提供了治疗特定病症和/或疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得癌症相关疾病的治疗剂。
应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。
在特定的方面，可在体内或体外进行筛选病症和/或疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行：
1)对动物受试者施用候选化合物；
2)测量动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平；或
3)选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。
在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。
本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本发明可进行适当地改变以适合实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。
某些核碱基(Nucleobase)序列
本文中描述的成熟miRNA和它们的相应的茎-环序列的核碱基序列是见于miRBase(见于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中的序列。miRBase序列数据库中的条目(entry)代表预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)和关于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。数据库中miRNA的茎-环序列严格说来不是前体miRNA(pre-miRNA)，并且在一些情况下可包括pre-miRNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。本文中描述的miRNA核碱基序列包括miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库的Release 10.0中描述的序列和miRBase序列数据库的任何更早的Release中描述的序列。序列数据库释放可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库释放可导致成熟miRNA序列的变化。可包括此类修饰的寡核苷酸的化合物可与本文中描述的miRNA的任何核碱基序列形式互补。
应理解，本文中所示的任何核碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。还应理解，包含U的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘U’的位点上‘U’被‘T’置换的相同核碱基序列。反过来，应理解，包含T的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘T’的位点上‘T’被‘U’置换的相同核碱基序列。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱基序列，这意味着修饰的寡核苷酸的核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域中与mi RNA或其前体的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可具有一个或多个错配的碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列具有对miRNA的全长互补性。
miRNA(miR)疗法
在一些实施方案中，本发明提供了抑制受试者的一个或多个基因的表达的microRNA。microRNA表达特征谱可用作新型癌症生物标志物。
本文中包括使用一个或多个MiR来抑制基因表达和/或活性的方法。在一些实施方案中，miR抑制蛋白质的表达。在其他实施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，细胞侵袭活性)。
可通过本领域技术人员熟知的许多种技术从细胞或组织分离，重组产生或体外合成miRNA。在一个实施方案中，从细胞或组织分离miRNA。用于从细胞或组织分离miRNA的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可使用来自Ambion，Inc.的mirVana miRNA分离试剂盒从总RNA分离miRNA。另一种技术利用flashIPAGETMFractionatorSystem(Ambion，Inc.)来进行小核酸的PAGE纯化。
关于miRNA治疗剂的使用，本领域技术人员理解，体内施用的核酸被吸收和分配至细胞和组织。
可以以合适的方式递送核酸，所述方式使得能够组织特异性地吸收试剂和/或核酸递送系统。本文中描述的试剂可补充治疗通过任何已知的常规疗法治疗的状况，所述疗法包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂的施用。可一起或相继使用两个或多个组合的化合物。
本发明的某些实施方案提供了包含(a)一种或多种核酸或小分子化合物以及(b)一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。
另外的有用的定义
“受试者”是指经选择接受治疗或疗法的人或非人动物。“怀疑患有......的受试者”是指展示病症、疾病或病况的一个或多个临床指标的受试者。
“预防”或“防止”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展，持续一段时间，包括数周、数月或数年。“治疗”或“医治”是指一种或多种用于治愈或改善病症和/或疾病的特定方法的应用。在某些实施方案中，特定方法是一种或多种药剂的施用。
“改善”是指减轻病况或疾病的至少一个指标的严重度。在某些实施方案中，改善包括病况或疾病的一个或多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重度可通过对于本领域技术人员来说是已知的主观或客观量度来测定。
“有此需要的受试者”是指确定为需要治疗或疗法的受试者。
“施用”是指给受试者提供药剂或组合物，包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
“胃肠外施用”是指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用和颅内施用。“皮下施用”是指紧在皮肤下方施用。
“改善功能”是指使功能向正常参数改变。在某些实施方案中，通过测量在受试者的体液中发现的分子评估功能。“药物组合物”是指适合于给个体施用的物质的混合物，其包括药剂。例如，药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水性溶液。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。“靶向”是指与靶核酸杂交并且诱导期望的作用的核碱基序列的设计和选择的过程。“被靶向”是指具有核碱基序列，所述序列允许与靶核酸杂交以诱导期望的作用。在某些实施方案中，期望的作用是靶核酸的减少。
“调控”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中，调控是指基因表达的增加。在某些实施方案中，调控是指基因表达的减少。
“表达”是指藉以将基因的编码信息转变成存在于细胞中和在细胞中运转的结构的任何功能和步骤。
“区域”是指核酸内一部分连接的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的区域互补的核碱基序列。例如，在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA茎-环序列的区域互补。在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA序列的区域100％同一。
“区段”是指更小的区域或区域的亚部分。
“核碱基序列”是指以5′至3′方向，不依赖于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”是指核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键非共价配对的能力。“互补”是指第一核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域内与第二核碱基序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中，具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸可以不在修饰的寡核苷酸的整个长度上与miRNA或其前体100％互补。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸之间的核碱基配对能力。“全长互补性”是指第一核酸的各核碱基能够与第二核酸中相应的位点上的各核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中各核碱基与miRNA中的核碱基具有互补性的修饰的寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
“百分比互补性”是指核酸中互补核碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基数目。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基的数目。
“百分比结合的区域”是指与寡核苷酸区域互补的区域的百分比。通过将与寡核苷酸互补的靶区域的核碱基的数目除以靶区域的长度来计算百分比结合的区域。在某些实施方案中，百分比结合的区域是至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％。
“百分比同一性”是指第一核酸中与第二核酸相应的位点上的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。
本文中使用的“大体上同一的”可以指第一与第二核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一。
“杂交”是指通过核碱基的互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”是指不能够与第二核酸的相应的位点上的核碱基配对的第一核酸的核碱基。
“非互补核碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核碱基。
“同一的”是指具有相同核碱基序列。
“miRNA”或“miR”是指长度在18至25个核碱基之间的非编码RNA，其与编码RNA杂交并且调控编码RNA的表达。在某些实施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的产物。miRNA的实例见于称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“Pre-miRNA”或“pre-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，其包含miRNA。在某些实施方案中，pre-miRNA是称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri-miR的产物。
“茎-环序列”是指具有发夹结构并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎-环序列可重叠。茎-环序列的实例可见于称为miRBase的miRNA数据库(microrna.sanger.ac.uk/)。
“miRNA前体”是指源自基因组DNA并且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码性结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体是pri-miRNA。
“反义化合物”是指具有允许与靶核酸杂交的核碱基序列的化合物。在某些实施方案中，反义化合物是具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此独立地被修饰或不被修饰。“天然发生的核苷间连接”是指核苷之间的3′至5′磷酸二酯连接。“天然核碱基”是指相对于其天然发生的形式未被修饰的核碱基。“miR拮抗剂”是指经设计用于干扰或抑制miRNA的活性的试剂。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括干扰或抑制miRNA的活性的小分子等。
本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。
虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开案和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见提供于下列参考书目中。
本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。关于日期的所有声明和关于这些文献的内容的所有陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
1.Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics.CA Cancer J Clin2008；58(2)：71-96.
2.Cannistra SA.Cancer of the ovary.N Engl J Med 2004；351(24)：2519-29.
3.Myers ER，Bastian LA，Havrilesky LJ，et al.Management of adnexal masses.EvidRep/Technol Assess 2006(130)：1-145.
4.Jacobs IJ，Menon U.Progress and challenges in screening for earlydetection of ovarian cancer.Mol Cell Proteomics 2004；3(4)：355-66.
5.Jacobs I，Davies AP，Bridge J，et al.Prevalence screening for ovarian cancer in post-menopausal women by CA-125 measurement and ultrasonography.BMJ 1993；306：1030-4.
6.Olivier RI，Lubsen-Brandsma MA，Verhoef S，van Beurden M.CA 125 andtransvaginal ultrasound monitoring in high-risk women cannot prevent the diagnosis ofadvanced ovarian cancer.Gynecol Oncol 2006；100(1)：20-6.
7.Jannot G，Simard MJ.Tumor-related microRNAs functionsin Caenorhabditiselegans.Oncogene 2006；25(46)：6197-201.
8.Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let-7microRNA family.Cell 2005；120(5)：635-47.
9.Cimmino A，Calin GA，Fabbri M，et al.miR-15 and miR-16 induce apoptosis bytargeting BCL2.Proc Natl Acad Sci U S A 2005；102(39)：13944-9.
10.Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.MicroRNA-21 regulates expression ofthe PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer.Gastroenterology2007；133(2)：647-58.
11.Mendell JT.miRiad roles for the miR-17-92 cluster in development and disease.Cell 2008；133(2)：217-22.
12.Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovariancancer.Cancer Res 2007；67(18)：8699-707.
13.Nam EJ，Yoon H，Kim SW，et al.MicroRNA expression profiles in serous ovariancarcinoma.Clin Cancer Res 2008；14(9)：2690-5.
14.Zhang L，Volinia S，Bonome T，et al.Genomic and epigenetic alterations deregulatemicroRNA expression in human epithelial ovarian cancer.Proc Natl Acad Sci U S A2008；105(19)：7004-9.
15.Chim SS，Shing TK，Hung EC，et al.Detection and characterization of placentalmicroRNAs in maternal plasma.Clin Chem 2008；54(3)：482-90.
16.Feng G，Li G，Gentil-Perret A，Tostain J，Genin C.Elevated serum-circulating RNAin patients with conventional renal cell cancer.Anticancer Res 2008；28(1A)：321-6.
17.Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br JHaematol 2008；141(5)：672-5.
18.Taylor DD，Gercel-Taylor C.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes asdiagnostic biomarkers of ovarian cancer.Gynecol Oncol 2008；110(1)：13-21.
19.Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al.A microRNA expression signature of humansolid tumors defines cancer gene targets.Proc Natl Acad Sci U S A 2006；103(7)：2257-61.
20.Chan JA，Krichevsky AM，Kosik KS.MicroRNA-21 is an anti apoptotic factor inhuman glioblastoma cells.Cancer Res 2005；65：6029-33.
21.Zhu S，Wu H，Wu F，et al.MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasionand metastasis.Cell Res 2008；18(3)：350-9.
22.Secord AA，Lee PS，Darcy KM，et al，Gynecologic Oncology Group.Maspinexpression in epithelial ovarian cancer and associations with poor prognosis：agynecologic oncology group study.Gynecol Oncol 2006；101(3)：390-7.
23.He L，Thomson JM，Hemann MT，et al.A microRNA polycistron as a potentialhuman oncogene.Nature 2005；435(7043)：828-33.
24.Petrocca F，Visone R，Onelli MR，et al.E2F1-regulated microRNAs impairTGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer.Cancer Cell2008；13(3)：272-86.
25.Tavazoie SF，
Figure BDA0000078450990000491
C，Oskarsson T，et al.Endogenous human microRNAs thatsuppress breast cancer metastasis.Nature 2008；451(7175)：147-52.
26.Fabbri M，Garzon R，Cimmino A，et al.MicroRNA-29 family reverts aberrantmethylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B.Proc NatlAcad Sci U S A 2007；104(40)：15805-10.
27.Saito Y，Liang G，Egger G，et al.Specific activation of microRNA-127 withdownregulation of the proto-oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs in humancancer cells.Cancer Cell 2006；9(6)：435-43.
28.Tili E，Michaille JJ，Calin GA.Expression and function of micro-RNAs in immunecells during normal or disease state.Int J Med Sci 2008；5(2)：73-9.

Claims (81)

1.诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生所述病症的风险中，确定患卵巢相关病症的受试者的预后和/或治疗患卵巢相关病症的受试者的卵巢相关病症的方法，其包括，
测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，
其中相对于对照样品中相应生物标志物的水平，所述测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有卵巢相关病症，或处于发生所述病症的风险中。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
3.权利要求1的方法，其中测试样品中至少一种生物标志物的水平高于对照样品中相应生物标志物的水平。
4.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
5.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
6.权利要求1的方法，其中测试样品中至少一种生物标志物的水平低于对照样品中相应生物标志物的水平。
7.权利要求5的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
8.筛选受试者的卵巢癌的一种或多种生物标志物的方法，其包括：
获得受试者的血清样品，
进行定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)，以及
定量在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的一种或更多种的生物标志物，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
9.权利要求1的方法，其中所述样品包括血液样品。
10.权利要求10的方法，其中所述样品包括血清或血浆血液样品中的一种或多种。
11.卵巢癌的生物标志物，其包括在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的至少一种生物标志物，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
12.卵巢肿瘤的独特的microRNA表达特征，其包括调节肿瘤microRNA加工的一种或多种生物标志物的表达的改变，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
13.用于影响有此需要的受试者的卵巢中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使选自下列的一种或多种microRNA失调：miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
14.前述权利要求的方法，其包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
15.前述权利要求的方法，其包括改变miR-21、miR-92、miR-93、miR-126和miR-129a中的一种或多种的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
16.microRNA和/或编码蛋白质的RNA的大规模基因表达表征用以鉴定人卵巢肿瘤中发生的microRNA功能的改变的用途。
17.用于筛查有此需要的受试者的卵巢的方法，其包括对受试者的血清样品进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR)的步骤。
18.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括：miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
19.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括如下的一种或多种：被上调的miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体；和被下调的miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体。
20.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括：miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
21.权利要求1的方法，其中所述生物标志物包括卵巢肿瘤中的宿主基因表达，所述宿主基因表达在卵巢肿瘤中增加。
22.前述权利要求的方法，其中所述生物标志物包括miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
23.miR-21、miR92和/或miR-93或其功能变体的用途，其用作卵巢癌细胞中的至少一个基因的靶和/或用于抑制所述基因的蛋白质表达。
24.调节由卵巢癌细胞表达的一种或多种基因的方法，其包括改变miR-21、miR92和/或miR-93在卵巢癌细胞中的表达的步骤。
25.将microRNA与3′UTR序列结合以导致哺乳动物卵巢癌细胞中被靶向的mRNA的降解和/或积累的用途。
26.人组织中microRNA与mRNA之间的负相关和/或正相关用于预测卵巢癌的microRNA靶基因的用途。
27.包含miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种的miR-表达抑制剂。
28.包含miR-21、miR92和/或miR-93或其功能变体中的一种或多种的miR-表达抑制剂。
29.包含miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的miR-表达反义抑制剂。
30.卵巢病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
31.卵巢病症或疾病的oncomiR生物标志物，其包括miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
32.用于调节卵巢癌细胞中的蛋白质表达的方法，其包括调节miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
33.用于调节卵巢癌细胞中的蛋白质表达的方法，其包括调节miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
34.用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
35.用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
36.用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
37.用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用miR-21、miR92和miR-93或其功能变体中的一种或多种。
38.用于确定患有卵巢癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，
其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种，并且
其中：i)所述生物标志物与卵巢癌的不利预后相关；以及ii)相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中至少一种生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
39.诊断受试者是否患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中的方法，其包括：
a)从获自受试者的血清测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
b)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；以及
c)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中。
40.前述权利要求的方法，其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号被下调，和/或其中至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号被上调。
41.前述权利要求的方法，其中至少一种生物标志物miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的卵巢癌或处于发生该疾病的风险中。
42.治疗患有卵巢癌的受试者的卵巢癌的方法，其中至少一种生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞被下调或上调，所述方法包括：
a)当所述至少一种生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；或
b)当所述至少一种生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；
其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
43.治疗受试者的卵巢癌的方法，其包括：
a)测定相对于对照细胞，卵巢癌细胞中至少一种生物标志物的量；和
b)通过如下步骤改变卵巢癌细胞中表达的生物标志物的量：
(i)如果癌细胞中表达的生物标志物的量少于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物；或者
(ii)如果癌细胞中表达的生物标志物的量多于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物；
其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
44.用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含至少一种分离的生物标志物和药学上可接受的载体，其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
45.前述权利要求的药物组合物，其中所述至少一种分离的生物标志物相应于与对照细胞相比在卵巢癌细胞中被上调的生物标志物。
46.前述权利要求的药物组合物，其包含至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。
47.鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量卵巢癌细胞中与增加的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，
其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的降低表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且
其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种。
48.鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量卵巢癌细胞中与下降的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，
其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且
其中所述生物标志物选自miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
49.评估疗法预防、诊断和/或治疗卵巢癌相关疾病的功效的方法，其包括：
a)使动物经历其功效有待评估的疗法，然后
b)通过评估至少一种生物标志物来测定被测试的疗法在治疗或预防疾病中的功效的水平，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
50.前述权利要求的方法，其中候选治疗剂包括如下的一种或多种：药物组合物、营养食品组合物和顺势疗法组合物。
51.前述权利要求的方法，其中所述被评估的疗法是用于人受试者的。
52.一种制品，其包含：至少一种结合卵巢癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
53.用于筛选治疗卵巢癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：至少一种生物标志物的一种或多种试剂和表达至少一种生物标志物的细胞，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
54.前述权利要求的试剂盒，其中使用包含特异性结合至少一种生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述生物标志物的存在。
55.干扰卵巢癌相关疾病的应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
56.治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性的方法，其包括：给个体施用干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂，
其中所述试剂包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
57.干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
58.包含miR-21、miR-92和miR-93中的一种或多种的抑制剂的组合物。
59.治疗有此需要的受试者的卵巢病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的前述权利要求的组合物。
60.前述权利要求的方法，其中预防性施用所述组合物。
61.前述权利要求的方法，其中所述组合物的施用延迟病症的一种或多种症状的发作。
62.前述权利要求的方法，其中肽的施用抑制卵巢癌的发展。
63.前述权利要求的方法，其中肽的施用抑制肿瘤生长。
64.用于检测卵巢癌在生物学样品中的存在的方法，所述方法包括：
a)将怀疑包含卵巢癌的生物学样品暴露于用于此的标志物；以及
b)如果有的话，检测所述标志物在样品中的存在或不存在；
其中所述生物标志物选自miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种。
65.前述权利要求的方法，其中所述标志物包括可检测的标记。
66.前述权利要求的方法，其还包括将受试者的生物学样品中标志物的量与正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比较。
67.前述权利要求的方法，其还包括在不同的时间点从受试者收集多个生物学样品并且比较每一个生物学样品中标志物的量，以测定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。
68.用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括：
miR-21、miR92、miR-93、miR-126和miR-29a或其功能变体中的一种或多种的抑制剂。
69.用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括：
miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的反义抑制剂。
70.制造用于治疗卵巢癌的药物的用途，包含选自miR中的miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的核酸分子。
71.前述权利要求的用途，其中所述药物包含显示选自miR中的miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种的序列的核酸分子。
72.鉴定诱导卵巢癌细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，所述方法包括如下阶段：
i)培养来源于卵巢肿瘤的细胞，
ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，
iii)分析阶段(i)与(ii)之间至少一种miR的表达水平的变化，和
iv)鉴定诱导阶段(i)与(ii)之间所述miR的表达水平的变化的化合物或化合物的组合。
73.前述权利要求的方法，其中阶段(iii)包括分析至少一种miR的表达水平。
74.前述权利要求的方法，其中阶段(iv)包括鉴定调节至少一种miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
75.前述权利要求的方法，其中阶段(iv)包括鉴定降低至少一种miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
76.前述权利要求的方法，其中所述化合物是用于治疗癌症的治疗剂。
77.用于分类受试者的卵巢组织的方法，其包括：
a)测量miR中的miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种在测试细胞群体中的表达，
其中测试细胞群体中至少一种细胞能够表达miR中的miR-21、miR92、miR-93、miR-126、miR-29a、miR-155、miR-127和miR-99b或其功能变体中的一种或多种；
b)将miR的表达与参照细胞群体中miR的表达相比较，所述参照细胞群体包含至少一种其卵巢癌分类是已知的细胞；以及
c)如果存在的话，鉴定测试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种miR的表达水平的差异，从而分类受试者的卵巢癌。
78.权利要求77的方法，其中与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中表达的差异表示，测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。
79.权利要求77的方法，其中与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中相似的表达模式表示，测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。
80.权利要求77的方法，其中所述参照细胞群体是多个细胞或数据库。
81.权利要求80的方法，其中所述参照细胞群体选自：分类为来自正常卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体。
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CA (1) CA2745746A1 (zh)
WO (1) WO2010065156A1 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952465A (zh) * 2013-12-10 2014-07-30 长沙赢润生物技术有限公司 一种基于血浆microRNA分析的卵巢癌肿瘤诊断方法
CN104619353A (zh) * 2011-12-13 2015-05-13 俄亥俄州国家创新基金会 与miR-21和miR-29a相关的方法和组合物、外切体抑制和癌症转移
CN105177173A (zh) * 2015-11-02 2015-12-23 崔长友 用于卵巢癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒
CN105695612A (zh) * 2016-04-19 2016-06-22 中南大学 microRNA-126-5p在心肌损伤中的表达检测方法
CN104123480B (zh) * 2013-04-27 2017-03-08 中国科学院上海生命科学研究院 新型微rna筛选方法、验证系统及其应用
CN106520924A (zh) * 2016-10-14 2017-03-22 浙江大学 一种用于检测卵巢癌的引物组及检测方法
CN108348547A (zh) * 2015-08-28 2018-07-31 纽约市哥伦比亚大学信托人 用于匹配肿瘤学特征的系统和方法
CN112626209A (zh) * 2020-12-22 2021-04-09 绵竹市人民医院 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016548A2 (en) 2005-08-01 2007-02-08 The Ohio State University Research Foundation Micro-rna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer
EP2484782B1 (en) 2006-01-05 2015-11-18 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
EP2502630B1 (en) 2006-01-05 2015-03-11 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer
EP2591794A1 (en) 2006-01-05 2013-05-15 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA expressions abnormalities in pancreatic endocrine and acinar tumors
ES2446362T3 (es) 2006-03-20 2014-03-07 The Ohio State University Research Foundation Huellas de microARN durante megacariocipoyesis humana
ES2434070T3 (es) 2006-07-13 2013-12-13 The Ohio State University Research Foundation MIR-103-2 para el diagnóstico de adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia
JP5426383B2 (ja) 2006-09-19 2014-02-26 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイション 慢性リンパ球性白血病におけるｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−１８１によって制御されるＴＣＬ１発現
US8252538B2 (en) 2006-11-01 2012-08-28 The Ohio State University MicroRNA expression signature for predicting survival and metastases in hepatocellular carcinoma
EP2109687B1 (en) 2007-01-31 2014-06-04 The Ohio State University Research Foundation Micro-rna-based methods for the treatment of acute myeloid leukemia
CN101711287B (zh) 2007-06-08 2016-04-27 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府 确定肝细胞癌亚型和检测肝癌干细胞的方法
CA2690749A1 (en) 2007-06-15 2008-12-24 The Ohio State University Research Foundation Oncogenic all-1 fusion proteins for targeting drosha-mediated microrna processing
AU2008282318B2 (en) 2007-07-31 2014-02-27 The Ohio State University Research Foundation Methods for reverting methylation by targeting methyltransferases
JP2010535473A (ja) 2007-08-03 2010-11-25 ズィ、オハイオウ、ステイト、ユーニヴァーサティ、リサーチ、ファウンデイシャン ｎｃＲＮＡをコードする超保存領域
AU2008288806B2 (en) 2007-08-22 2014-11-27 The Ohio State University Research Foundation Methods and compositions for inducing deregulation of EphA7 and Erk phosphorylation in human acute leukemias
WO2009055773A2 (en) 2007-10-26 2009-04-30 The Ohio State University Research Foundation Methods for identifying fragile histidine triad (fhit) interaction and uses thereof
JP5662166B2 (ja) * 2008-02-28 2015-01-28 ジ・オハイオ・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデイションＴｈｅ Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 胃癌の診断、予後診断及び治療のためのマイクロｒｎａに基づいた方法及び組成物
AU2009257410B2 (en) 2008-06-11 2014-03-06 Fudan University Use of miR-26 family as a predictive marker of hepatocellular carcinoma and responsiveness to therapy
AU2010321555B2 (en) 2009-11-23 2015-10-15 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
WO2011106104A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for the detection and treatment of cancer involving mirnas and mirna inhibitors and targets
US8946187B2 (en) 2010-11-12 2015-02-03 The Ohio State University Materials and methods related to microRNA-21, mismatch repair, and colorectal cancer
CN103313706A (zh) 2010-11-15 2013-09-18 俄亥俄州立大学研究基金会 控制释放粘膜粘合系统
WO2012122239A1 (en) 2011-03-07 2012-09-13 The Ohio State University MUTATOR ACTIVITY INDUCED BY MICRORNA-155 (miR-155) LINKS INFLAMMATION AND CANCER
WO2012135814A2 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 University Of Houston Microrna29a,b,c as a tumor suppressor and sensitizing agent for chemotherapy
CN104364390B (zh) 2011-10-14 2016-08-24 俄亥俄州立大学 与卵巢癌相关的方法和材料
CN104685065B (zh) 2012-01-20 2017-02-22 俄亥俄州立大学 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签
WO2014071226A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 The Regents Of The University Of California Methods and systems for determining a likelihood of adverse prostate cancer pathology
KR101508580B1 (ko) 2013-05-14 2015-04-07 연세대학교 산학협력단 재발성 난소암의 예측 또는 진단 방법
KR101784714B1 (ko) 2014-08-19 2017-10-12 주식회사 엠모니터 재발 난소암 진단 또는 난소암 재발 예측용 mirna 마커 및 그 용도
EP3147370A1 (en) * 2015-09-28 2017-03-29 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Exosomal microrna in serum as an indicator for the activation of brown and beige fat tissue (bat)
KR102641469B1 (ko) 2016-03-17 2024-02-28 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 고효율 형광 유세포 분석기를 사용하는 세포 선별
US11236337B2 (en) 2016-11-01 2022-02-01 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer
CA3042401A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified micrornas and their use in the treatment of cancer
WO2018129535A1 (en) * 2017-01-09 2018-07-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Circulating microrna signatures for ovarian cancer
EP3681895A4 (en) 2017-09-13 2021-05-26 Becton, Dickinson and Company METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS USING FERROUS PARTICLES
CN112368399A (zh) * 2018-07-05 2021-02-12 卡昂大学 miRNA用于高级别浆液性卵巢癌治疗护理的预测和预后用途
KR20210137828A (ko) * 2020-05-11 2021-11-18 의료법인 성광의료재단 기계학습 예측모델을 이용한 난소암 진단 방법 및 이를 적용하는 시스템

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016548A2 (en) * 2005-08-01 2007-02-08 The Ohio State University Research Foundation Micro-rna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer
WO2007081740A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 The Ohio State University Research Foundation Micrornarna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
WO2008029295A2 (en) * 2006-06-30 2008-03-13 Rosetta Genomics Ltd A method for detecting nucleic acids

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050182005A1 (en) * 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007016548A2 (en) * 2005-08-01 2007-02-08 The Ohio State University Research Foundation Micro-rna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer
WO2007081740A2 (en) * 2006-01-05 2007-07-19 The Ohio State University Research Foundation Micrornarna-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
WO2008029295A2 (en) * 2006-06-30 2008-03-13 Rosetta Genomics Ltd A method for detecting nucleic acids

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAS PARTHA M ET AL.: "Early detection of ovarian cancer", 《NIH PUBLIC ACCES AUTHOR MANUSCRIPT》 *
EUN JI NAM ET AL: "MicroRNA Expression Profiles in Serous Ovarian Carcinoma", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》 *
IORIO MARILENA V ET AL: "MicroRNA signatures in human ovarian cancer", 《CANCER RESEARCH》 *
KIMBERLY E. RESNICK ET AL.: "The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform", 《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》 *
NEETU DAHIYA ET AL: "MicroRNA Expression and Identification of Putative miRNA Targets in Ovarian Cancer", 《PLOS ONE》 *
SHIH K K ET AL.: "Exosomal microRNAs step into the biomarker arena", 《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》 *
TAYLOR D D ET AL.: "MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer", 《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》 *
ZHANG ET AL.: "Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer", 《CANCER RES》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104619353A (zh) * 2011-12-13 2015-05-13 俄亥俄州国家创新基金会 与miR-21和miR-29a相关的方法和组合物、外切体抑制和癌症转移
CN104123480B (zh) * 2013-04-27 2017-03-08 中国科学院上海生命科学研究院 新型微rna筛选方法、验证系统及其应用
CN103952465A (zh) * 2013-12-10 2014-07-30 长沙赢润生物技术有限公司 一种基于血浆microRNA分析的卵巢癌肿瘤诊断方法
CN108348547A (zh) * 2015-08-28 2018-07-31 纽约市哥伦比亚大学信托人 用于匹配肿瘤学特征的系统和方法
CN108348547B (zh) * 2015-08-28 2023-09-22 纽约市哥伦比亚大学信托人 用于匹配肿瘤学特征的系统和方法
CN105177173A (zh) * 2015-11-02 2015-12-23 崔长友 用于卵巢癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒
CN105695612A (zh) * 2016-04-19 2016-06-22 中南大学 microRNA-126-5p在心肌损伤中的表达检测方法
CN106520924A (zh) * 2016-10-14 2017-03-22 浙江大学 一种用于检测卵巢癌的引物组及检测方法
CN112626209A (zh) * 2020-12-22 2021-04-09 绵竹市人民医院 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒

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