CN112368399A - miRNA用于高级别浆液性卵巢癌治疗护理的预测和预后用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及识别存在于循环miRNA中的生物标志物，该生物标志物适用于高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的诊断和预后判断，以及涉及用于这种诊断的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及存在于循环miRNA中的生物标志物的识别，该生物标志物适用于高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的诊断和预后判断(prognosis)，并涉及用于这种诊断的诊断试剂盒。
背景技术
诊断和预后判断分析是医疗专业人员和非专业人士使用的用于确定身体细胞或组织中指示健康状态变化的生理变化的标准工具。
超过75％的HGSOC患者出现了不可预测的复发，这与复发疾病通常变得对常规基于铂的化疗治疗无响应的事实有关，其是5年生存率低的原因(对于III-IV期<30％)。然而，随着靶向治疗的逐步出现，这种情况预计会随着时间的推移而改善。在特定的分子环境[同源修复缺陷(HRD)表型]中使用PARP抑制剂(PARPi)作为特别有效的药物是朝着这个方向迈出的一步。然而，HGSOC治疗管理的改善需要识别和验证更可靠的预测和随访生物标志物，这在目前仍是一个主要问题。
目前，为了对卵巢癌做出明确的诊断，妇科肿瘤学家必须进行手术以收集样本供病理学家分析。在手术过程中，外科医生将评估疾病扩散的程度。这种评估被称为“分期”。会同于分级，这些评估有助于肿瘤学家推荐治疗计划。
卵巢癌的分期已经由国际妇产科联合会(FIGO)标准化。虽然其他因素影响预后判断，但FIGO分期(分为四个主要阶段，I至IV期，参见上文)是迄今为止最重要的长期生存预测因素。
在I期卵巢癌中，在一侧或两侧卵巢中发现癌细胞。癌细胞可以在卵巢表面或从腹部收集的液体(腹水)中发现。在这个阶段，癌细胞还没有扩散到腹部或骨盆的其他器官和组织、淋巴结，或远处的部位：
·IA-在一侧卵巢或输卵管中的有限发展，卵巢外膜未破裂。卵巢外表面无肿瘤，且无腹水和/或冲洗液阴性。
·IB-癌症存在于两侧卵巢或输卵管中，但外包膜完整，并且外表面没有肿瘤。无腹水且冲洗液阴性。
·IC-癌症为IA期或IB期，但包膜破裂或卵巢表面有肿瘤，或腹水或冲洗液中有恶性细胞。
在II期卵巢癌中，癌细胞已经从一侧或两侧卵巢扩散到骨盆的其他组织。癌细胞在骨盆中的输卵管、子宫、膀胱、乙状结肠，或直肠被发现。癌细胞可能从腹部收集的液体中被发现：
·IIA-延伸或移植在子宫和/或输卵管上。冲洗液是阴性冲洗液并且无腹水。
·IIB-延伸或移植在其它骨盆组织上。冲洗液是阴性并且无腹水。
·IIC-如同IIA或IIB期的骨盆延伸或移植，但是具有阳性的骨盆冲洗液。
在III期卵巢癌中，癌细胞已经扩散到骨盆外的组织或腹部后部的区域淋巴结(腹膜后淋巴结)。癌细胞可能在肝脏外被发现：
·IIIA-肿瘤很大程度上局限于骨盆，但在显微镜下腹膜转移到骨盆以外的腹部腹膜表面或网膜。
·IIIB-如同IIIA期，但是具有小于2cm的骨盆外的宏观腹膜或网膜转移瘤。
·IIIC-如同IIIA期，但是具有大于2cm的骨盆外的腹膜或网膜转移，或淋巴结转移至腹股沟、骨盆或主动脉旁区域。癌症也可能扩散到淋巴结，但它没有扩散到肝脏或脾脏内部或远处。
在IV期卵巢癌中，癌细胞已经扩散到腹部和骨盆以外的组织。癌细胞可以在脾脏、肝脏、肺和位于腹膜腔外的其他器官中发现：
·IVA期：癌细胞在肺部周围的液体中(这被称为恶性胸腔积液)被发现，癌症没有扩散到骨盆或腹膜腔之外的其他区域。
·IVB期：癌症已经扩散到脾脏或肝脏内部、腹膜后淋巴结以外的淋巴结，和
/或腹膜腔外的其他器官或组织。这包括肺、大脑和皮肤。
通过在显微镜下观察组织和液体中的细胞，病理学家将癌症描述为1级、2级，或3级(根据若干种细胞和组织学特征)。1级最像卵巢组织并且不易扩散；2级，特别是3级的细胞更不规则，并且更容易转移。然而，卵巢癌通常被分为“低级”(1级)或“高级”(2级或3级)。因此，高等级浆液性卵巢癌(HGSOC)涉及2级或3级且I至IV期的卵巢癌患者(KurmanRJ.Origin and molecular pathogenesis of ovarian high-grade serouscarcinoma.Ann Oncol.2013Dec；24Suppl 10:x16-21)。
已经发表了几项关于卵巢癌中循环miRNA的研究；然而，迄今为止还没有在临床上引入miRNA作为这种癌症的生物标志物，即使目前用于诊断的其他已知生物标志物(诸如CA-125和蛋白质生物标志物(HE4))具有有限的预后判断价值。
因此，发明人进行的研究的目标是确定来自HGSOC患者的循环miRNA的存在是否可以作为疾病和治疗监测的非侵入性诊断和预后判断生物标志物。
MicroRNA(miRNA)是小的(19-25个核苷酸)非编码调节性RNA，其通过各种机制在转录后水平控制蛋白质表达。在人类基因组中已鉴定出约2654个成熟的microRNA(miRNA)(miRBase Release 22，2018年3月，www.mirbase.org)，并且所有人类基因的一半以上被认为受miRNA调控。由于单个miRNA可以调节整个基因网络，这些分子被认为是基因组的主要调节者。miRNA的失调可以改变或更改肿瘤抑制蛋白或激活癌基因。以前的研究表明，循环miRNA可以作为一种工具来更好地了解良性和恶性肿瘤的情况，并用于诊断目的(Sourvinou et al.,Quantification of circulating miRNAs in plasma:effect ofpreanalytical and analytical parameters on their isolation and stability,JMol Diagn.2013,15(6):827-34)。
发明内容
令人惊讶地，发明人已经观察到一种循环miRNA(根据miRBase的命名法称为hsa-miR-622)构成了一种综合信号(signature)，并使得能够有效预测对标准的基于铂的化疗治疗和创新的治疗(诸如PARPi)的响应。
此外，在治疗后以响应相关的方式发生的所述循环miRNA谱的特异性修饰，构成了对复发的早期检测有用的随访工具。
对于临床医生来说，这种分子工具的识别使得能够识别可能针对基于铂的常规化疗或特定策略(诸如最近在治疗铂敏感患者的临床试验中引入的PARPi)的患者，以避免不必要的暴露于具有毒副作用的无效治疗，并正确评估治疗的早期响应以及病理的随访。
本发明是在两个独立的同源分组(cohorts)中，即一个名为“CRB”的回顾性分组和一个名为“miRSA”的多中心前瞻性分组，通过单个RT-qPCR分析对miR表达进行研究的结果。
总之，对晚期HGSOC患者的这些研究结果已经证明了hsa-miR-622循环miRNA对预测患者对治疗的响应的意义(interest)：
-疾病复发(PFS，无进展生存期)，和
-总生存期。
这种有意义的miRNA可用于临床常规，其使用通过使用外源性标准化物(normalizers)的RT-qPCR的绝对剂量，并且这种方法可用于血液以外的其他生物液体(诸如尿液、腹水...)。
这种循环miRNA信号的定义使得能够指导治疗决策，该决策能够指导预测为铂或PARPi耐药的患者倾向于替代策略和/或至少使得能够对复发风险较高的患者进行更好的监测。由于伴随试验(简单、廉价、快速且易于在常规临床应用中转用)可以在与治疗决策一致的时间范围内识别铂或PARPi耐药患者，因此这种预后判断变得容易。
hsa-miR-622在肿瘤中的表达先前与接受铂治疗的HGSOC患者的耐药性相关(Choiet al.,Platinum and PARP Inhibitor Resistance Due to Overexpression ofMicroRNA-622in BRCAl-Mutant Ovarian Cancer,Cell Reports.2016,14(3):429-439)，然而从未被在生物流体(诸如血液)中调查该miR的存在和预测关联度。
因此，本发明涉及与高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)预后判断相关的miRNA的定义。更具体地，本发明涉及使用基于RT-qPCR的简单、快速、经济和可靠的测试来确定来自患者的生物样本(生物流体，诸如尿液、腹水、血液、血浆、血清...)中hsa-miR-622的表达水平。
根据第一方面，本发明涉及一种对晚期(III-IV)HGSOC患者对常规基于铂的化疗治疗的响应进行预后判断的方法，包括以下步骤：
-确定所述HGSOC患者的液体生物样本(优选血液、血清或血浆)中至少hsa-miR-622的浓度；
-将获得的值与至少一个参考值进行比较；
-并因此确定所述患者是否被预测为铂敏感患者或者铂耐药患者。
在本发明中，上述方法优选在对HGSOC患者施用常规化疗治疗之前进行。
“microRNA”、“miRNA”，或“miR”是指一种小的(19-24nt)非蛋白质编码的内源性RNA分子。据估计，miRNA基因占人类基因的2-5％，并调节50％的编码基因。负责miRNA表达的基因座位于蛋白质编码或非编码基因的内含子内、非编码基因的外显子内，或3’UTR内。miRNA已被证明通过RNA干扰(RNAi)途径调节mRNA表达和防止蛋白质产生。互联网上还提供了一个已发表miRNA序列和注释的可搜索数据库。miRBase序列数据库中的每个条目代表一个miRNA转录物的预测发夹部分(在数据库中称为miR)，带有成熟miRNA序列(称为miR)的位置和序列信息。发夹序列和成熟序列都可以搜索和浏览，并且条目也可以通过名称、关键字、引用和注释来检索。所有序列和注释数据也可下载。目前，miRBase由曼彻斯特大学生命科学系主办和维护，此前由威康信托桑格研究所主办和支持。
在本发明中考虑的靶标成熟miRNA hsa-miR-622(也称为miR-622)的序列是：
ACAGUCUGCUGAGGUUGGAGC(SEQ.ID.NO:1)。
在一个实施方案中，本发明的方法可以通过确定hsa-mir-622的“iso-miR”的浓度来实施。这种iso-miR与miR有几个核苷酸的不同(Bartel D.P.,Metazoan MicroRNAs,Cell.2018,173(1):20-51)。例如，“hsa-miR-622的iso-miR”的序列与序列SEQ.ID.NO:1相比，可以有1到5个核苷酸的差异。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以通过确定“hsa-pre-miR-622”的浓度来实施，hsa-pre-miR-622对应于hsa-mir-622的前体RNA。hsa-pre-miR-622的序列为：
AGAGAAGCUGGACAAGUACUGGUCUCAGCAGAUUGAGGAGAGCACCACAGUGG UCAUCACACAGUCUGCUGAGGUUGGAGCUGCUGAGAUGACACU(SEQ ID NO:2)。
在本发明中，“常规基于铂的化疗治疗”或“常规化疗”是指一线基于铂的疗法，优选与紫杉醇联合使用或不与紫杉醇联合使用的卡铂，更优选卡铂和紫杉醇联合使用。
对于诊断测试的评估，预测值有助于解释临床环境中的测试结果。过程的诊断价值由其敏感性、特异性、预测值和效率来定义。任何测试方法都会产生真阳性(TP)、假阴性(FN)、假阳性(FP)，和真阴性(TN)。
测试的“敏感性”是测试阳性的患者中所有存在疾病或确实有响应的患者的百分比或TP/(TP+FN)×100％。
测试的“特异性”是测试阴性的患者中所有无疾病或确实无响应的患者的百分比或TN/(FP+TN)×100％。
测试的“预测值”或“PV”是值(阳性或阴性)为真值的次数的测量(％)，即所有阳性测试中为真阳性的百分比为阳性预测值(PV+)或TP/(TP+FP)×100％。“阴性预测值”(PV)是指阴性试验的患者中无响应的百分比或TN/(FN+TN)×100％。
测试的“准确性”或“效率”是测试给出正确答案的次数相对于测试总数的百分比或(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN)×100％。“错误率”是根据那些预测有响应但没有响应的患者和那些预测没有响应但有响应的患者计算出来的或(FP+FN)/(TP+TN+FP+FN)×100％。总测试“特异性”是测试的敏感性和特异性的一种准确性的度量，且特异性不随人群中疾病的总体可能性改变而改变，预测值会改变。PV随着医生对给定患者是否存在疾病或是否存在临床响应的临床评估而变化。
Hsa-miR-622是一种在卵巢癌细胞和卵巢癌患者血清中表达的miRNA。
正如发明人首次表明的，循环hsa-miR-622表达使得能够将HGSOC患者分为高或低复发风险，并且也是总生存期的强预测因子。
此外，使用多因素分析，发明人已经表明，循环hsa-miR-622表达在调整相关临床协变量(诸如肿瘤分期和初次手术后的残留疾病)时保持其预后判断效果。
因此，将生物流体中hsa-miR-622的浓度的值与参考值进行比较，使得能够根据癌症复发(PFS)和总生存期(OS)将HGSOC患者分为低风险或高风险组。
实际上，从他们的循环hsa-miR-622谱，HGSOC患者可以被预测为铂耐药患者或铂敏感患者。
根据本发明，“铂耐药患者”(或“早期复发者”)是指在基于铂的一线化疗结束后不到6个月复发的HGSOC患者。在大多数情况下，铂耐药患者是短期存活者，总生存期不到24个月。
相反，“铂敏感患者”(或“晚期复发者”)是指在以铂为基础的一线化疗结束后未复发或6个月以上复发的HGSOC患者(即铂敏感复发患者)。在大多数情况下，铂敏感患者是长期存活者，总生存期至少24个月。
在一个实施方案中，在作出决定之前，可以使用基线处的hsa-miR-622浓度来预测治疗响应，而不管治疗顺序(PDS或NACT)如何，
具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂敏感患者，
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂耐药患者。
在另一个实施方案中，在作出决定之后，可以使用基线处的hsa-miR-622浓度来预测与治疗顺序(PDS或NACT)结合的治疗响应：
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.124zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂敏感患者，
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂耐药患者。
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.124zmo1/μl，并严格地低于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为：
-如果她接受新辅助化疗，则为铂耐药患者，或
-如果她接受初次减瘤手术而非新辅助化疗，则为铂敏感患者。
在本发明中，术语“新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy)”(或NACT)是指在肿瘤手术切除之前和/或在癌症主要治疗施用之前进行的药物治疗。
在另一个实施方案中，hsa-miR-622浓度可用于在复发时预测治疗响应：
-具体地，如果患者复发并且如果循环hsa-miR622浓度的值低于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂敏感患者，
-具体地，如果患者复发并且如果循环hsa-miR622浓度的值等于或高于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为铂耐药患者。
具体地，循环hsa-miR-622浓度可以通过RT-qPCR、微阵列或下一代测序(NGS)来确定。
更具体地，循环hsa-miR-622浓度可以通过TaqManTM RT-qPCR确定。
例如，从一线化疗前采集的生物流体(优选血清或血浆)样本中，使用
miRNA血浆试剂盒(Macherey-Nagel)乃至可以使用其他试剂盒，分离总RNA。然后，将总RNA溶液的等分试样进行反转录，例如使用TaqManTM的反转录试剂盒，然后进行扩增，例如使用TaqManTM的化学试剂。
具体地，循环hsa-miR-622浓度的绝对剂量可以首先通过与miRNA标准曲线进行比较来测量样本中的hsa-miR-622的量获得，miRNA标准曲线通过已知量的合成hsa-miR-622寡核苷酸来获得，且其次通过使用基于在RNA提取步骤之前在生物流体中添加已知量的ce1-miR39-3p、ce1-miR54-3p和ce1-miR238-3p的外源标准化来实现，使得能够如前所述计算生物流体中的绝对量[Vigneron et al.,Towards a new standardized method forcirculating miRNAs profiling in clinical studies:Interest of the exogenousnormalization to improve miRNA signature accuracy,Mol Oncol.2016,10(7):981-92]。根据用于提取RNA的方法，循环hsa-miR-622浓度的值可以变化，例如从5％到10％。
在一个实施方案中，液体生物样本选自尿液、血液、血清、血浆、腹水，优选为血清。
本发明的方法可以在离体(ex vivo)或体外(in vitro)进行。
这里公开的上述方法的所有特征和实施方案可以被加上必要细节(mutatismutandis)转用于根据本发明的以下方法。
另一方面，一种本发明涉及一种监测HGSOC患者对常规基于铂的化疗治疗敏感性的方法，包括以下步骤：
-确定所述HGSOC患者的液体生物样本中至少hsa-miR-622的浓度，其中，所述液体生物样本是在常规的基于铂的化疗治疗期间获得的；
-将获得的值与至少一个参考值进行比较；
-确定所述患者对所述常规的基于铂的化学疗法是否敏感。本发明的方法还可用于确定患者的治疗失败是否与肿瘤的铂耐药的改变相关。
本发明的方法也可用于检测肿瘤逃逸。
另一方面，本发明还涉及一种诊断和治疗患者HGSOC的方法，所述方法包括：
-从患有HGSOC的人类患者获得液体生物样本；
-确定所述患者的液体生物样本中hsa-miR-622的浓度；
-通过将所述hsa-miR-622的浓度与至少一个参考值进行比较，将所述患者诊断为铂敏感患者或铂耐药患者；
-对所诊断的铂敏感患者进行常规的基于铂的化疗治疗和/或PARPi的治疗。
本发明进一步涉及用于本发明方法的测试试剂盒，包括至少：一种能够结合循环hsa-miR-622的至少一部分的寡核苷酸探针。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒是PCR试剂盒。
在一个实施方案中，本发明的测试试剂盒进一步包含至少一种参考RNA和/或至少一种能够结合所述参考RNA的至少一部分的特异性寡核苷酸探针。
所述参考RNA可用于产生绝对标准曲线，以确定生物样本中hsa-miR-622的绝对浓度。
所述参考RNA优选在生物样本中不存在。例如，所述参考RNA可以是ce1-miR-54-3p(UACCCGUAAUCUUCAUAAUCCGAG,SEQ ID NO:3)或者ce1-miR-238-3p(UUUGUACUCCGAUGCCAUUCAGA,SEQ ID NO:4，其对应于在生物模型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中表达的两个miR。
优选地，所述RNA参考是合成RNA。
该试剂盒可适于从实时PCR检测中选择的检测的性能。其他技术(诸如miRNA微阵列以及NGS(下一代测序))也可用于量化miRNA的表达。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含使得能够测试RNA分离产量对照的引物。
另一方面，本发明提供了在液体生物样本(优选血液、血清或血浆)中测量的hsa-miR-622浓度作为生物标记物在根据所预期的预后判断和/或根据对基于常规基于铂的化疗治疗的所预期的响应对HGSOC患者进行分类的用途。
另一方面，本发明提供了在液体生物样本(优选血液、血清或血浆)中测量的hsa-miR-622浓度作为生物标记物在根据所预期的预后判断和/或根据对PARPi的治疗的所预期的响应对HGSOC患者进行分类的用途。
在本发明中，表述“PARPi的治疗”是指对患者施用至少一种化合物，该化合物作为PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)家族的酶(特别是PARP-1)的药理学抑制剂。PARP抑制剂可选自但不限于包括奥拉帕尼、尼拉帕尼、Talazoparib、维利帕尼、Painiparib、卢卡帕尼、CEP9722、E7016、Iniparib和3-氨基苯甲酰胺的组。
事实上，已经表明对PARP抑制剂治疗的响应与铂敏感性有关。特别地，承认铂敏感性可以被认为是临床生物标志物，以确定患者更可能对PARPi敏感(de Picciotto et at.,Ovarian cancer:Status of homologous recombination pathway as a predictor ofdrug response,Crit Rev Oncol Hematol.2016,101:50-59；Choi et at.,Platinum andPARP Inhibitor Resistance Due to Overexpression of MicroRNA-622in BRCAl-Mutant Ovarian Cancer,Cell Reports.2016,14(3):429-439)。如实施例中所示(参见实施例VIII)，在本发明中证实了对基于铂治疗和对基于PARPi的治疗的响应之间的相似性。
为此，使用在液体生物样本中测量的hsa-miR-622的浓度作为铂敏感性/耐药性的生物标志物的本发明的特征和实施方案将加上必要修改应用于使用在液体生物样本中测量的hsa-miR-622的浓度作为PARPi敏感性/耐药性的生物标志物的本发明。
因此，本发明还提供了对晚期HGSOC患者对基于PARPi的治疗的响应的预后判断方法，包括以下步骤：
-确定所述HGSOC患者的液体生物样本中至少hsa-miR-622的浓度；
-将获得的值与至少一个参考值进行比较；
-并因此确定所述患者是否被预测为PARPi敏感患者或者PARPi耐药患者。
在一个实施方案中，在作出决定之前，可以使用基线处的hsa-miR-622浓度来预测治疗响应，而不管治疗顺序(PDS或NACT)如何：
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感患者，
-特别地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药患者。
在另一个实施方案中，在作出决定之后，可以使用基线处的hsa-miR-622浓度来预测与治疗顺序(PDS或NACT)结合的治疗响应：
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.124zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感患者，
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药患者。
-具体地，如果循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.124zmo1/μl，并严格地低于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为：
-如果她接受新辅助化疗，则为PARPi耐药患者，或
-如果她接受初次减瘤手术而非新辅助化疗，则为PARPi敏感患者。
在另一个实施方案中，hsa-miR-622浓度可用于在复发时预测治疗响应：
-具体地，如果患者复发并且如果循环hsa-miR622浓度的值低于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感患者，
-具体地，如果患者复发并且如果循环hsa-miR622浓度的值等于或高于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药患者。
另一方面，本发明还提供了在液体生物样本(优选血液、血清或血浆)中测量的hsa-miR-622浓度作为早期检测HGSOC患者复发的生物标志物的用途。
在一个实施方案中，复发可以通过监测多次分析在液体生物样本中测量的hsa-miR-622浓度的演变来检测，多次分析以规则的间隔进行，例如一年一次、每六个月一次或每三个月一次。
在一个实施方案中，对基于铂的化疗治疗或基于PARPi的治疗出现耐药性可以通过监测多次分析在液体生物样本中测量的hsa-miR-622浓度的演变来检测，多次分析以规则的间隔进行，例如一年一次、每六个月一次或每三个月一次。
附图说明
图1、根据CRB分组中血清hsa-miR-622表达，按风险分类的无进展生存期和总生存期。用对数秩检验比较了Hsa-miR-622高风险和低风险曲线。Ss:敏感性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值；AUC：曲线下面积，P：p值。
图2、根据miRSA分组中血清hsa-miR-622表达，按风险分类的无进展生存期和总生存期。用对数秩检验比较了Hsa-miR-622高风险和低风险曲线。Ss：敏感性；Sp：特异性；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值；AUC：曲线下面积，P：p值。
图3、根据CRB分组的NACT患者中血清hsa-miR-622表达，按风险分类的无进展生存期和总生存期。用对数秩检验比较了Hsa-miR-622高风险(粗)和低风险(细)曲线，P：p值。
图4、按基线浆液性miR-622表达分类的MiRSA和CRB分组生存者。
将miRSA患者分为铂耐药(PFI＜6个月)和铂敏感(PFI≥6个月)复发，ROC曲线根据最佳Youden指数提供0.128zmo1/μl的界限值(A)。使用hsa-miR-622基线浆液表达的0.128zmo1/μl的界限值，Kaplan-Meier曲线显示了miRSA分组中无进展生存期和总生存期的分类(B&C)和CRB分组中无进展生存期的分类(D)。使用对数秩检验比较曲线。ROC＝接收(receiveir)操作特性，TPV＝真阳性值，FPV＝假阳性值，AUC＝曲线下面积。
图5、按复发浆液性miR-622表达分类的CRB分组总生存期。
根据复发将CRB患者分为短期(12个月)和长期(12个月)存活者，基于最佳Youden指数，ROC曲线提供0.34zmo1/μl的界限值(A)。使用hsa-miR-622浆液表达的0.34zmo1/μl的界限值，Kaplan-Meier曲线显示了CRB分组(B)和对二线基于铂的化疗治疗有响应的CRB铂敏感复发者(C)的复发总生存期分类。使用对数秩检验比较曲线。ROC＝接收操作特性，TPV＝真阳性值，FPV＝假阳性值，AUC＝曲线下面积。
图6、根据进展期通过PARPi维持治疗的患者(CRB分组)血清hsa-miR-622表达，按风险分类的总生存期。使用对数秩检验比较Hsa-miR-622高风险(粗)和低风险(细)曲线。
具体实施方式
实施例
材料与方法
患者血液样本
总的来说，本研究使用了两个来自患有HGSOC(III期和IV期)的未经治疗的样本分组：CRB(回顾性分组)和miRSA(多中心前瞻性分组，NCT01391351)。这些分组仅限于符合疾病和治疗同质标准的患者，其临床特征总结在表1中。
表1、患者的临床特征。数据为年龄、PFS和OS或其他参数的n(％)的中位值±四分位数。PDS＝初次减瘤手术，NACT＝新辅助化疗。
生物资源中心(CRB)卵巢资源(回顾性分组)
本项目中回顾性使用的所有血清样本均由法国卡昂省F.Baclesse综合癌症中心(CCC)妇科肿瘤科收集(自2000年起)，并来自CRB生物资源中心的生物库(ISO 9001质量管理)。血清样本以质量和安全的合适条件储存于-20℃。所有患者都书面同意CCCF.Baclesse的生物收集物的保存并将其用于生物研究。这些血清样本是根据法国现行法规，特别是公共卫生法典中与生物医学研究有关的规定，并遵循生物伦理法、计算机法和自由、赫尔辛基宣言和良好临床实践(GCP)获得的。此外，它们已根据各自的条例提交给主管当局，即ANSM(国家药品安全署)、CPP(个人保护委员会)、ARH(区域住院机构)、MESR(教育、卫生和研究部)和CNIL(国家计算和自由委员会)。
实施例I和实施例III中显示的分析限于来自39例组织学证实的临床高度浆液性卵巢癌(III-IV期)的血清样本。这些血清样本是在接受初次减瘤手术(32例)或新辅助化疗(7例NACT)的患者手术前和基于铂的化疗治疗前收集的。
实施例V中所示的扩展分析是对65个经组织学证实的临床HGSOC基线样本进行的。
实施例VI中所示的分析是对35个经组织学证实的临床HGSOC复发样本进行的。
实施例VII中显示的分析是对13个经组织学证实的符合PARPi(6个月以上复发和对基于铂的二线化疗的响应)临床HGSOC复发样本进行的。
实施例VIII中所示的分析是对8个经组织学证实的临床HGSOC(CRB分组)的血清样本进行的。这些血清样本是在对进展期接受PARPi维持治疗的患者进行一线化疗前收集的。
miRSA(miRNA血清分析)分组
血清样本取自2011年至2013年间纳入miRSA临床研究(NCT01391351)的患者。根据标准操作过程，由专门的临床团队和肿瘤实验室进行MiRSA研究。本研究获得了伦理委员会“Nord-Ouest III”[CPP N°2011 02]和国家当局(AFSSAPS N°B110260-20)的批准。在科学使用样本和数据之前，根据法国和欧洲的规定，患者被适当告知并被要求书面同意。患者的血清收集在SST II管上(BD
Becton Dickinson,Le Pont de Claix,France)，并根据常规的分析前方案进行处理。简而言之，生物流体被离心两次以去除所有残留的细胞，然后立即在-80℃冷冻。实验用只解冻一次的RNA进行。在整个过程中遵循无RNAse方案。
实施例II中显示的分析限于来自35个经组织学证实的临床高级别浆液性卵巢癌(III-IV期)的血清样本，并具有足够的血清进行辅助研究。这些血清样本是在对接受新辅助化疗(NACT)的患者进行基于铂的化疗治疗前收集的。
实施例IV中所示的扩展分析是对65个经组织学正式的临床HGSOC基线样本进行的。
结果
主要终点是无进展生存期(PFS)，因为预测因子的主要目标是能够识别有早期复发风险的患者。无进展生存期定义为诊断日期和进展或死亡日期之间的时间(以月为单位)，以先发生者为准，或无进展存活患者的最后随访日期。
次要终点是总生存期(OS)，其定义为诊断日期和死亡日期或存活患者最后一次接触日期之间的时间(以月为单位)。
合成miRNA
针对hsa-miR-622(SEQ ID NO:1)、cel-miR-54-3p(UACCCGUAAUCUUCAUAAUCCGAG(SEQ ID NO:3)和cel-miR-238-3p(UUUGUACUCCGAUGCCAUUCAGA，SEQ ID NO:4)，从Eurogentec(Liège,Belgium)购买了SDS-PAGE纯化的合成microRNA。寡核苷酸以20μM的浓度储存在-80℃。
从血清样本中分离RNA
根据制造商的推荐和之前公布的方法(Vigneron et al.,2016)，使用市售
miRNA血浆试剂盒(Macherey-Nagel，Hoerdt，France)从血清样本中分离出miRNA。变性步骤结束后，向每个样本中加入1500阿莫尔(attomoles)Eurogentec合成的cel-miR-54-3p和cel-miR-238-3p。用30μL无核酸酶水洗脱总RNA，并然后在-80℃下冷冻。
使用RT-qPCR对miRNA进行绝对定量
MiRNA首先使用特异性茎环引物(Thermo Fisher Scientific，LifeTechnologies)和MicroRNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific，LifeTechnologies)进行逆转录，然后使用水解探针(Thermo Fisher Scientific，LifeTechnologies)进行扩增。简言之，将5μL经分离的RNA与10μL RT主混合液混合。然后，将含1.33μL cDNA的三等分式样与18.7μL qPCR原始混合物(不含UNG的Universal Master MixII)在96孔光学板中混合。茎环引物和水解探针的Thermo Fisher ID参考如下:cel-miR-54-3p(001361)、cel-miR-238-3p(000248)和hsa-miR-622(001553)。使用带有7500软件v2.0.6(Thermo Fisher Scientific，Life Technologies，Applied Biosystems)的Applied ABI Prism 7500快速PCR系统测量荧光和阈值基线。在RT-qPCR步骤之前，通过在2×105、2×104、2×103、2×102、2×101和2zmol/μL稀释合成的cel-miR-54-3p、cel-miR-238-3p和hsa-miR-622制备绝对标准曲线。它们用于将定量循环(Cq)转换为每微升RNA提取物中miRNA的阿摩尔浓度。通过将回收量除以添加量计算出每份样本的cel-miR-54-3p和cel-miR-238-3p的血清分离产率，并使用它们的几何平均值估计每微升血清中hsa-miR-622的泽托摩尔(zeptomole)浓度。
统计分析
无铂治疗间隔期(PFI)是指从接受基于铂的一线化疗的最后一天起直到记录到疾病进展(复发、死亡或失访)的间隔期。卵巢癌患者通常分为铂耐药复发或铂敏感复发(PFI分别为<6个月和≥6个月)。
患者还分为短期和长期存活者(OS分别为<24和≥24个月)。
使用ROC曲线，针对每个分组，根据最佳Youden指数选择hsa-miR-622阈值。
然后根据患者的hsa-miR-622表达情况将其分为低表达组和高表达组。PFS和OS的hsa-miR-622阈值预后判断意义采用按顺序使用对数秩检验以及Cox单因素和多因素分析的Kaplan-Meier曲线进行评估。手术结果(无肉眼可见残留或存在肉眼可见残留)和分期(III期或IV期)作为已知的化疗前预后判断因素纳入多因素分析。
实施例I：CRB分组的PDS患者中血清hsa-miR-622表达水平与总生存期的关系
基于hsa-miR-622在卵巢癌肿瘤中具有预后判断意义的前期观察，在来自CRB分组的血清患者中对其表达进行了分析。如前所述，患者分为短期和长期存活者(分别为<24个月和≥24个月)，且根据最佳Youden指数，使用ROC曲线确定最佳判别hsa-miR-622值。将患者分为hsa-miR-622表达高和低两组(界限值＝0.28zmol/μL或169拷贝/μL)。观察到高血清hsa-miR-622表达组比低血清hsa-miR-622表达组表现出明显更差的OS(中位值OS 22.8比48.9个月，对数秩p＝0.0062)(参见图1)。未观察到低和高hsa-miR-622组之间的PFS存在显著差异(p＝0.81)。接下来，采用Cox单因素模型估计各相关预后判断变量的风险比(HR)。在单因素分析中，高hsa-miR-622表达组(HR＝3.43，CI95％1.3–8.7，p＝0.0098)和初次手术后次优减瘤(HR＝3.41，CI95％1.1–10.2，p＝0.028)与OS显著相关(参见表2)。然后使用Cox回归模型进行多因素分析，在其他已知预后判断因素(即分期和残留疾病)同时影响的情况下评估hsa-miR-622的预后判断效果。出乎意料地，在对这些临床协变量进行调整的多因素分析中，hsa-miR-622保持了其独立的预后判断效果(对于OS，p＝0.044)。
表2、对在CRB分组中血清hsa-miR-622预后判断意义的单因素和多因素分析。hsa-miR-622的预后判断意义和其他已知因素(如手术结果和分期)采用顺序法的Cox单因素和多因素分析进行评估。HR：风险比；CI95％：置信区间95％；NS：不显著。
在CRB分组中，使用0.280zmol/μL的界限值，高miR-622表达组包括7名铂耐药患者中的4名(早期复发)，敏感性为57.1％，特异性为71.4％，真实预测值为40.0％，且假预测值为83.3％。
在CRB分组中，使用0.280zmol/μL的界限值，高miR-622表达组包括10名短期存活者中的6名，敏感性为60.0％，特异性为80.0％，真实预测值为60.0％，且假预测值为80.0％。
实施例II：miRSA分组中的NACT患者中血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义
在来自miRSA分组的患者样本中分析了血清hsa-miR-622的表达水平。组成高和低hsa-miR-622表达组(界限值＝0.124zmol/μL或75拷贝/μL)。与之前在CRB分组中的观察结果一致，血清hsa-miR-622的高表达预示着更差的总生存期[24.4个月比≥32.2个月(终末生存期概率>0.5)；对数秩p＝0.025](参见图2)。有趣地，还发现与低hsa-miR-622表达组相比，高血清hsa-miR-622表达组的PFS显著降低(中位值PFS 12.7比22个月，对数秩p＝0.0077)。该miRNA信号可将接受HGSOC治疗的女性在癌症复发方面分为低风险组或高风险组，高风险组和低风险组的无进展生存期中位值差为9.4个月。接下来，对miRSA分组进行了单因素和多因素分析(NACT未接受初次手术)。在单因素分析中，高hsa-miR-622表达组与PFS(HR＝2.82，CI95％1.3–6.2，p＝0.010)和OS(HR＝4.00，CI95％1.1–14.7，p＝0.037)显著相关(参见表3)。此外，在调整临床协变量的多因素分析中，hsa-miR-622表达是PFS(p＝0.0057)和OS(p＝0.036)的独立预后判断因素。
表3、对在miRSA分组中血清hsa-miR-622预后判断意义的单因素和多因素分析。hsa-miR-622的预后判断意义和其他已知因素(如分期)采用顺序法Cox的单因素和多因素分析进行评估。HR：风险比；CI95％：置信区间95％；NS：不显著。
在miRSA分组中，使用0.124zmol/μL的界限值，高miR-622表达组包括10名铂耐药患者中的9名(早期复发)，敏感性为90.0％，特异性为56.0％，真实预测值为45.0％，假预测值为93.3％。
在miRSA分组中，使用0.124zmol/μL的界限值，高miR-622表达组包括10名短期存活者中的8名，敏感性为80.0％，特异性为60.0％，真实预测值为66.7％，且假预测值为75.0％。
实施例III：CRB分组的NACT患者中血清hsa-miR-622表达水平与总生存期的关系
基于先前观察到的hsa-miR-622对miRSA分组中的NACT患者具有预后判断意义的结果，初步将0.124zmol/μL这一相同的阈值用于对CRB分组的NACT患者的研究。将患者分为高和低hsa-miR-622表达两组(界限值＝0.124zmol/μL)。有趣地，发现高血清hsa-miR-622表达组比低血清hsa-miR-622表达组表现出更差的PFS和OS(中位值PFS 20.3比16.8个月，对数秩p＝0.17，和中位值OS 35.9比15.1个月，对数秩p＝0.29)(参见图3)。
实施例IV：miRSA分组中基线处的血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义
进行补充分析以研究基线处的血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义。
首先，在基线处评估了miRSA分组(n＝65)中血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义。根据患者的PFI分为铂耐药复发(<6个月)和铂敏感(≥6个月)复发，并使用ROC曲线将最佳界限值表达固定为77拷贝/μL(0.128zmol/μL)(参见图4A)。高miR-622组(n＝31，24个事件)与比低组(n＝34，22个事件)显著更低的PFS相关(中位值15.4个月比24.4个月；对数秩p＝0.049；HR 1.78 95％CI 1.0-3.2，p＝0.052；参见图4B)。高组(12个事件)还与比低组(5个事件)显著更低的OS相关(中位值29.7个月比40.6个月；对数秩p＝0.0046；HR 4.4995％CI 1.4-14.0，p＝0.0095；参见图4C)。
接下来，对基线处的miRSA分组进行单因素和多因素分析。在单因素分析中，高hsa-miR-622表达组与更低的PFS(HR＝1.78，CI95％1.0-3.2，p＝0.052)和OS(HR＝4.49，CI95％1.4-14.0，p＝0.0095)显著相关(参见表4)。此外，在调整临床协变量的多因素分析中，hsa-miR-622表达是PFS(p＝0.015)和OS(p＝0.0011)的独立预后判断因素。
表4、在基线处的对miRSA分组中血清hsa-miR-622预后判断意义的单因素和多因素分析。hsa-miR-622的预后判断意义和其他已知因素(如分期)采用顺序法的Cox单因素和多因素分析进行评估。HR：风险比；CI95％：置信区间95％；NS：不显著。
实施例V：CRB分组中基线处的血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义
也评估了CRB分组(n＝65)中基线处的血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义。使用相同的界限值，高组(n＝52，42个事件)与比低组(n＝13，7个事件)更显著的死亡风险相关(中位值30.3个月比48.9个月；对数秩p＝0.040；HR 2.28 95％CI 1.0-5.1，p＝0.045；参见图4D)。
接下来，对基线处的CRB分组进行单因素和多因素分析。在单因素分析中，高hsa-miR-622表达组与更低的OS显著相关(HR＝2.28，CI95％1.0-5.1，p＝0.045)(参见表5)。
表5、在基线处对CRB分组中的血清hsa-miR-622预后判断意义的单因素和多因素分析。hsa-miR-622的预后判断意义和其他已知因素(如分期)采用顺序法的Cox单因素和多因素分析进行评估。HR：风险比；CI95％：置信区间95％；NS：不显著。
实施例VI：CRB分组中复发时血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义
然后，研究了CRB中复发时血清hsa-miR-622表达水平的动态预后判断意义(n＝35)。根据残余OS将患者分为短期(<12个月)和长期(≥12个月)存活者。使用ROC曲线将最佳界限值表达固定为205拷贝/μL(0.34zmol/μL)(参见图5A)。高miR622组(n＝11，11个事件)表现出比低组(n＝24，21个事件)显著更低的PFS(中位值7.9个月比20.6个月；对数秩p＝000077；HR 3.56 95％CI 1.6-7.8，p＝0.0015；参见图5B)。
接下来，对复发的CRB分组进行单因素和多因素分析。在单因素分析中，高hsa-miR-622表达组与更低的OS显著相关(HR＝3.56，CI95％1.6-7.8，p＝0.0015)(参见表6)。此外，在调整临床协变量的多因素分析中，hsa-miR-622表达是OS的独立预后判断因素(p＝0.0062)。
表6、对在CRB分组中复发时血清hsa-miR-622预后判断意义的单因素和多因素分析。hsa-miR-622的预后判断意义和其他已知因素(如分期)采用顺序法的Cox单因素和多因素分析进行评估。HR：风险比；CI95％：置信区间95％；NS：不显著。
实施例VII:CRB分组中符合PARPi的患者复发时血清hsa-miR-622表达水平的预后
判断意义
此外，根据二线PARPi维持适合标准，重点关注对二线基于铂的化疗治疗有响应的铂敏感患者(参见图5C)，高miR-622组(n＝2，2个事件)与比低组(n＝11，8个事件)更低的OS相关(中位值15.3个月比34.8个月；对数秩p＝0.0026)。在基线处持续使用相同界线值的CRB分组(n＝65)中，高miR-622组(n＝20，19个事件)表现出比低组(n＝45，30个事件)显著更低的OS(中位值22.8个月比35.9个月；对数秩p＝0.017；HR 2.01 95％CI 1.1-3.6，p＝0.019)。
实施例VIII:进展时接受PARPi维持治疗的患者在一线化疗前血清hsa-miR-622表达水平的预后判断意义
在一线化疗前，对8名接受进展期PARPi维持治疗的患者的血清样本评估了miR-622的预测意义(CRB分组)。使用与先前相同的界限值时，高miR-622组(n＝2，1个事件)与比低miR-622组(n＝6，3个事件)显著更低的总生存期(OS)相关(中位值34.7个月比94.9个月；对数秩p＝0.28；HR 4.24p＝0.31；参见图6)。
序列表
<110> 卡昂大学
国立健康与医学研究所
弗朗索瓦巴克莱斯中心地区
格勒诺布尔大学
<120> miRNA用于高级别浆液性卵巢癌治疗护理的预测和预后用途
<130> F148400007/WO/PCT
<150> EP 18305887
<151> 2018-07-05
<150> EP 18290130
<151> 2018-11-08
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
acagucugcu gagguuggag c 21
<210> 2
<211> 96
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
agagaagcug gacaaguacu ggucucagca gauugaggag agcaccacag uggucaucac 60
acagucugcu gagguuggag cugcugagau gacacu 96
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> 秀丽隐杆线虫
<400> 3
uacccguaau cuucauaauc cgag 24
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 秀丽隐杆线虫
<400> 4
uuuguacucc gaugccauuc aga 23
Claims (11)
1.用于对晚期HGSOC患者对基于PARPi的治疗和/或常规基于铂的化疗治疗的响应进行预后判断的方法，包括以下步骤：
-确定所述HGSOC患者的液体生物样本中至少hsa-miR-622的浓度；
-将所述获得的值与至少一个参考值进行比较；
-并因此确定是否所述患者被预测为：
PARPi和/或铂敏感患者，或者
PARPi和/或铂耐药患者。
2.用于监控HGSOC患者对基于PARPi的治疗和/或常规基于铂的化疗治疗的敏感性的方法，包括以下步骤：
-确定所述HGSOC患者的液体生物样本中至少一种hsa-miR-622的浓度，其中，所述液体生物样本是在所述基于PARPi的治疗和/或常规基于铂的化疗治疗期间获得的；
-将所述获得的值与至少一个参考值进行比较；
-确定所述患者对基于PARPi的治疗和/或常规基于铂的化疗治疗是否敏感。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述液体生物样本选自由尿液、血液、血清、血浆、腹水组成的组，优选血清。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在作出决定之前，使用基线处的所述hsa-miR-622浓度来预测所述治疗响应，而不管治疗顺序(PDS或NACT)如何，
-具体地，如果所述循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感和/或铂敏感患者，而不管治疗顺序如何，
-具体地，如果所述循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.128zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药和/或铂耐药患者，而不管治疗顺序如何。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在作出决定之后，使用基线处的所述hsa-miR-622浓度来预测与治疗顺序(PDS或NACT)结合的所述治疗响应，
-具体地，如果所述循环hsa-miR-622浓度的值严格地低于0.124zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感和/或铂敏感患者，
-具体地，如果所述循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药和/或铂耐药患者，
-具体地，如果所述循环hsa-miR-622浓度的值等于或高于0.124zmo1/μl，并严格地低于0.28zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为：
-如果她接受新辅助化疗，则为PARPi耐药/或铂耐药患者，或
-如果她接受初次减瘤手术而非新辅助化疗，则为PARPi敏感和/或铂敏感患者。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述hsa-miR-622浓度用于在复发时预测治疗响应，
-具体地，如果所述患者复发并且如果所述循环hsa-miR622浓度的值低于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi敏感和/或铂敏感患者，
-具体地，如果所述患者复发并且如果所述循环hsa-miR622浓度的值等于或高于0.34zmo1/μl，则经测试的患者可以被预测为PARPi耐药和/或铂耐药患者。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，使用RT-qPCR、微阵列或下一代测序来确定所述循环hsa-miR-622浓度的值。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述循环hsa-miR-622浓度的值是使用通过TaqManTM RT-qPCR使用外源性标准化物的绝对剂量确定的。
9.用于根据权利要求1至8中任一项所述的方法的试剂盒，包括至少一种能够结合循环hsa-miR-622的至少一部分的寡核苷酸探针。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述试剂盒是PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包含至少一种参考RNA和/或至少一种能够结合所述参考RNA的至少一部分的特异性寡核苷酸探针。
11.液体生物样本中测量的hsa-miR-622浓度作为生物标志物在根据所预期的预后判断和/或根据对基于PARPi的治疗和/或常规基于铂的化疗治疗的所预期的响应对HGSOC患者进行分类的用途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18305887.4 | 2018-07-05 | ||
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