JP2021528963A - 高悪性度漿液性卵巣癌の治療的治癒についてのｍｉＲＮＡの予測的及び予後的使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）の診断及び予後診断への使用に適した、循環ｍｉＲＮＡにあるバイオマーカーの特定、並びにかかる診断に使用される診断キットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）の診断及び予後診断への使用に適した、循環ｍｉＲＮＡにあるバイオマーカーの特定、並びにかかる診断に使用される診断キットに関する。

診断アッセイ及び予後診断アッセイは、健康状態の変化の指標となる身体の細胞又は組織の生理学的変化を判断するのに医療専門家及び一般人が使用する標準的なツールである。

ＨＧＳＯＣ患者の７５％超で起こる未だ予測不能な再発は、再発疾患が通常、従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に応答しなくなるという事実に関連して、低い５年生存率の原因となる（病期ＩＩＩ〜ＩＶで３０％未満）。しかしながら、標的療法が登場してきていることから、時間とともにこの状況が改善されることが期待される。特定の分子環境（相同組換え修復異常（Homologous Repair Deficiency）（ＨＲＤ）表現型）において特に効果的な作用物質であるＰＡＲＰ阻害剤（ＰＡＲＰｉ）の使用は、この方向性の一段階である。しかしながら、ＨＧＳＯＣ治療管理の改善には、より信頼性の高い予測バイオマーカー及び追跡バイオマーカーの特定及び検証が必要とされ、これは現在でも大きな課題となっている。

今のところ、卵巣癌の確定診断には、婦人科腫瘍医が手術を行い、病理医が分析するための試料を採取しなければならない。術中、外科医は疾患がどのくらい広がっているかを評価する。この評価は、「病期分類」と呼ばれる。グレード分類とともに、これらの評価は、腫瘍医が治療計画を勧める上で助けとなる。

卵巣癌の病期分類は、国際産婦人科連合（ＦＩＧＯ）によって標準化されている。他の因子も予後診断に影響を与えるが、ＦＩＧＯ病期（４つの主な病期Ｉ〜ＩＶがある、上記を参照されたい）は、長期生存のはるかに重要な予測因子である。

病期Ｉの卵巣癌では、癌細胞は一方又は両方の卵巣に見られる。癌細胞は、卵巣の表面上又は腹部から採取した体液（腹水）中に見られることもある。この病期では、癌細胞は、腹部若しくは骨盤における他の器官及び組織、リンパ節、又は遠隔部位には広がっていない：
ＩＡ−いずれか一方の卵巣又は卵管における限局的発生、ここでは外側の卵巣被膜は破綻していない。卵巣の外面には腫瘍はなく、腹水貯留がなく、及び／又は洗浄液は陰性である。
ＩＢ−癌が両方の卵巣又は卵管に存在するが、外側の被膜は無傷であり、外面上に腫瘍はない。腹水貯留がなく、洗浄液は陰性である。
ＩＣ−癌は病期ＩＡ又はＩＢのレベルのいずれかであるが、被膜が破綻しているか、又は卵巣表面上に腫瘍があるか、又は腹水若しくは洗浄液中に悪性細胞が存在する。

病期ＩＩの卵巣癌では、癌細胞は、一方又は両方の卵巣から骨盤内の他の組織へと広がっている。癌細胞は、骨盤内の卵管、子宮、膀胱、Ｓ字結腸、又は直腸に見られる。癌細胞は、腹部から採取した体液中に見られる場合もある：
ＩＩＡ−子宮及び／又は卵管への進展又は転移。洗浄液は陰性洗浄液であり、腹水貯留はない。
ＩＩＢ−他の骨盤組織への進展又は転移。洗浄液は陰性であり、腹水貯留はない。
ＩＩＣ−病期ＩＩＡ又はＩＩＢのような骨盤での進展又は転移であるが、骨盤洗浄液は陽性である。

病期ＩＩＩの卵巣癌では、癌細胞は、骨盤の外側の組織に、又は腹部の後ろにある所属リンパ節（後腹膜リンパ節）に広がっている。癌細胞は、肝臓の外側に見られる場合もある：
ＩＩＩＡ−腫瘍は主に、骨盤に限定されているが、微視的腹膜転移が骨盤を越えて腹部の腹膜表面又は大網に広がっている。
ＩＩＩＢ−ＩＩＩＡと同じであるが、骨盤を越えた巨視的腹膜転移又は大網転移のサイズが２ｃｍ未満である。
ＩＩＩＣ−ＩＩＩＡと同じであるが、骨盤を越えた腹膜転移若しくは大網転移が２ｃｍより大きいか、又はリンパ節転移が鼠径部、骨盤部、若しくは傍大動脈部に広がっている。癌は、リンパ節まで広がっている場合もあるが、肝臓若しくは脾臓の内部、又は遠隔部位には広がっていない。

病期ＩＶの卵巣癌では、癌細胞は、腹部及び骨盤の外側の組織に広がっている。癌細胞は、脾臓、肝臓の内部、肺、及び腹腔の外側に位置する他の器官に見られる場合がある：
病期ＩＶＡ：癌細胞は、肺の周りの体液に見られ（これは、悪性胸水と呼ばれる）、癌の他の領域は骨盤又は腹腔の外側には広がっていない。
病期ＩＶＢ：癌は、脾臓若しくは肝臓の内部に、後腹膜リンパ節以外のリンパ節に、及び／又は腹腔の外側の他の器官若しくは組織に広がっている。これには、肺、脳、及び皮膚が含まれる。

顕微鏡下で組織及び体液中の細胞を見ることで、病理医は、癌を（幾つかの細胞特徴及び組織学的特徴に従って）グレード１、２、又は３と評する。グレード１は、癌が恐らくは卵巣組織にあり、広がっている可能性は低い。グレード２、特にグレード３の細胞は、より不規則であり、転移している可能性がより高い。しかしながら、卵巣癌は通常、「低悪性度」（グレード１）又は「高悪性度」（グレード２又は３）に分類される。そのため、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）は、グレード２又は３、かつ病期Ｉ〜ＩＶの卵巣癌を有する患者に関するものである（非特許文献１）。

卵巣癌に関する循環ｍｉＲＮＡについての研究が幾つか公開されているが、かかる癌のバイオマーカーとして臨床に導入されているｍｉＲＮＡはこれまでに存在しておらず、ＣＡ−１２５及びタンパク質バイオマーカー（ＨＥ４）等の診断に現在使用されている他の既知のバイオマーカーは限られた予後的価値しか有していない。

そのため、本発明者らが行った研究の目的は、ＨＧＳＯＣ患者由来の循環ｍｉＲＮＡの存在が疾患の非侵襲的な診断バイオマーカー及び予後診断バイオマーカー並びに治療モニタリングとして作用することができるかを判断することであった。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、様々な機構を介して転写後レベルでタンパク質発現を制御する小さい（１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの）非コーディング調節ＲＮＡである。約２６５４個の成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がヒトゲノムにおいて同定されており（非特許文献２）、全ヒト遺伝子の半分以上がｍｉＲＮＡによって調節されていると考えられる。単一のｍｉＲＮＡが遺伝子のネットワーク全体を調節することができることから、これらの分子は、ゲノムのマスター調節因子とみなされる。ｍｉＲＮＡの調節不全は、腫瘍抑制タンパク質を変化若しくは改変させるか、又は癌遺伝子を活性化させる可能性がある。これまでの研究により、循環ｍｉＲＮＡを、良性腫瘍状態及び悪性腫瘍状態の両方のより良い理解を与えるツールとして、並びに診断目的に利用することができることが分かっている（非特許文献３）。

驚くべきことに、本発明者らによって、或る循環ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＢａｓｅによる命名法に従うとｈｓａ−ｍｉＲ−６２２と呼ばれる）は、統合シグネチャーを構成し、標準的なプラチナ製剤ベースの化学療法及びＰＡＲＰｉ等の革新的な治療に対する応答の効果的な予測を可能にすることが観察されている。

さらに、応答に関連して治療後に起こる、上記循環ｍｉＲＮＡプロファイルの特定の変化が、再発の早期検出に有用な追跡ツールを構成する。

臨床医にとって、かかる分子ツールの特定により、従来のプラチナ製剤ベースの化学療法又は特定の戦略（例えば、プラチナ製剤感受性患者の治療のために最近臨床試験に導入されたＰＡＲＰｉ）に向いている患者を特定することで、毒性又は副作用を伴う非効果的な治療への不必要な曝露を避けることが可能になるとともに、治療への初期応答の正しい評価及び病理の追跡が可能になる。

本発明は、「ＣＲＢ」と呼ばれる後向きコホート及び「ｍｉＲＳＡ」と呼ばれる多施設前向きコホートの２つの独立した均一コホートにおける個々のＲＴ−ｑＰＣＲアッセイによるｍｉＲの発現の研究に起因している。

要するに、進行期のＨＧＳＯＣ患者におけるこれらの研究の結果により、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の循環ｍｉＲＮＡが治療に対する患者の下記の両方の応答を予測するという興味深い事実が判明した：
疾患再発（無増悪生存期間（ＰＦＳ））、及び、
全生存期間（ＯＳ）。

この対象のｍｉＲＮＡを、外因性ノーマライザーを用いたＲＴ−ｑＰＣＲによる絶対量（dosages）を用いて臨床ルーチンにおいて使用することができ、この方法論を血液以外の体液（例えば、尿、腹水等）に用いることができる。

かかる循環ｍｉＲＮＡシグネチャーの規定により、プラチナ製剤抵抗性又はＰＡＲＰｉ抵抗性であると予測される患者を代替戦略に向けることを可能にする治療決定を導くことが可能になり、及び／又は少なくとも再発のリスクがより高い患者のより良好な監視が可能になる。この予後診断は、コンパニオン試験（単純、安価、高速、かつ日常的な臨床使用に容易に移行可能）のために、治療決定に適合した時間枠にてプラチナ製剤抵抗性又はＰＡＲＰｉ抵抗性の患者を特定することを容易にする。

腫瘍におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の発現は、これまでプラチナ製剤により治療されるＨＧＳＯＣ患者の抵抗性と関連付けられてきたが（非特許文献４）、このｍｉＲの存在及び予測妥当性は、血液等の体液では全く研究されてこなかった。

Kurman RJ. Origin and molecular pathogenesis of ovarian high-grade serous carcinoma. Ann Oncol. 2013 Dec;24 Suppl 10:x16-21 miRBase Release 22, March 2018, www.mirbase.org Sourvinou et al., Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability, J Mol Diagn. 2013, 15(6):827-34 Choi et al., Platinum and PARP Inhibitor Resistance Due to Overexpression of MicroRNA-622 in BRCA1-Mutant Ovarian Cancer, Cell Reports. 2016, 14(3):429-439

そのため、本発明は、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）における予後に関連する循環ｍｉＲＮＡの規定に関する。より具体的には、本発明は、ＲＴ−ｑＰＣＲをベースとする、単純、高速、経済的でかつ信頼性の高い試験を用いた、患者由来の生体試料（尿、腹水、血液、血漿、血清等の体液）中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の発現レベルの測定に関する。

第１の態様によれば、本発明は、従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対する進行期（ＩＩＩ〜ＩＶ）のＨＧＳＯＣ患者の応答を予後診断する方法であって、
上記ＨＧＳＯＣ患者の液体生体試料、好ましくは血液、血清又は血漿中の少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定する工程と、
得られた値と少なくとも１つの参照値とを比較する工程と、
その結果として、上記患者が、プラチナ製剤感受性患者又はプラチナ製剤抵抗性患者と予測されるか判断する工程と、
を含む、方法に関する。

本発明では、ＨＧＳＯＣ患者への従来の化学療法の実施前に、上記方法を行うことが好ましい。

「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、又は「ｍｉＲ」は、小さい（１９ｎｔ〜２４ｎｔの）非タンパク質コーディング内因性ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉＲＮＡ遺伝子は、ヒト遺伝子の２％〜５％までを占め、コーディング遺伝子の５０％を調節すると推定される。ｍｉＲＮＡ発現に関わる遺伝子座は、タンパク質コーディング若しくは非コーディング遺伝子のイントロン内に、非コーディング遺伝子のエキソンに、又は３’ＵＴＲに位置している。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）経路を介して、ｍＲＮＡ発現を調節し、タンパク質産生を妨げることが分かっている。公開済みのｍｉＲＮＡ配列及びアノテーションの検索データベースもインターネット上で利用可能である。ｍｉＲＢａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースにおける各エントリーは、成熟ｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲと称される）の位置及び配列についての情報とともに、ｍｉＲＮＡ転写産物（データベースにおいてｍｉｒと称される）の予測されるヘアピン部分を表す。ヘアピン及び成熟配列はどちらも検索及び閲覧が可能であり、エントリーは、名称、キーワード、参照及びアノテーションによっても検索することができる。全ての配列及びアノテーションデータはダウンロードも可能である。現在、ｍｉＲＢａｓｅは、マンチェスター大学の生活科学部がホストとして管理しているが、以前はＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅがホストとしてサポートしていた。

本発明にて検討されている標的となる成熟ｍｉＲＮＡ ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２（ｍｉＲ−６２２とも指定される）の配列は、
ＡＣＡＧＵＣＵＧＣＵＧＡＧＧＵＵＧＧＡＧＣ（配列番号１）
である。

一実施の形態では、本発明の方法は、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２２の「ｉｓｏ−ｍｉＲ」の濃度を測定することにより行うことができる。かかるｉｓｏ−ｍｉＲは、ｍｉＲとは数ヌクレオチド異なる（Bartel D.P., Metazoan MicroRNAs, Cell. 2018, 173(1):20-51）。例えば、「ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２のｉｓｏ−ｍｉＲ」の配列は、配列番号１の配列と比較して１ヌクレオチド〜５ヌクレオチド異なり得る。

別の実施の形態では、本発明の方法は、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２２のＲＮＡ前駆体に相当する「ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−６２２」の濃度を測定することにより行うことができる。ｈｓａ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−６２２の配列は、
ＡＧＡＧＡＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＧＵＡＣＵＧＧＵＣＵＣＡＧＣＡＧＡＵＵＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＵＧＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＡＧＵＣＵＧＣＵＧＡＧＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＣＵＧＡＧＡＵＧＡＣＡＣＵ（配列番号２）
である。

本発明では、「従来のプラチナ製剤ベースの化学療法」又は「従来の化学療法」という表現は、好ましくはカルボプラチンをパクリタキセルと組み合わせて、又は組み合わせずに用いた、より好ましくはカルボプラチン及びパクリタキセルを併用した、第一選択のプラチナ製剤ベースの治療法を指す。

診断検査の評価について、適中率（predictive values）は、臨床状況における検査の結果の解釈の助けとなる。手法の診断的価値は、その感度、特異度、適中率及び有効度によって定められる。いずれの検査法でも真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、偽陽性（ＦＰ）、及び真陰性（ＴＮ）が生じる。

検査の「感度」は、疾患が存在する又は応答性がある全ての患者の中で陽性の検査結果を有する患者の割合、すなわちＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）×１００％である。

検査の「特異度」は、疾患がない又は応答性がない全ての患者の中で陰性の検査結果を有する患者の割合、すなわちＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）×１００％である。

検査の「適中率」すなわち「ＰＶ」は、結果（value）（陽性又は陰性）が真である回数の評価基準（％）であり、すなわち全ての陽性の検査結果に対する真陽性のパーセントは、陽性適中率（ＰＶ＋）すなわちＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）×１００％である。「陰性適中率」（ＰＶ）は、陰性の検査結果を有する患者に対する応答性のない患者の割合すなわちＴＮ／（ＦＮ＋ＴＮ）×１００％である。

検査の「正確度」又は「有効度」は、その検査が総検査回数に対して正しい回答を与える回数の割合、すなわち（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。「誤り率（error rate）」は、応答性があると予測されたが、応答性がなかった患者、及び応答性がないと予測されたが、応答性があった患者から算出されるもの、すなわち（ＦＰ＋ＦＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）×１００％である。検査全体の「特異度」は、検査の感度及び特異度の正確度の評価基準であり、これは集団における疾患変化の全体尤度としては変わらず、適中率が変化する。ＰＶは、所与の患者における疾患の有無又は臨床応答の有無の医師による臨床的評価によって変わる。

ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２は、卵巣癌細胞及び卵巣癌患者の血清中で発現される内因性ｍｉＲＮＡである。

本発明者らによって初めて示されたように、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現は、ＨＧＳＯＣ患者を高い再発リスク又は低い再発リスクに分類することを可能にするものであり、また全生存期間の強力な予測因子でもある。

さらに、多変量分析を用いて、本発明者らは、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現が、腫瘍病期及び一次手術後に残存する疾患等の関連する臨床共変量に合わせて調整することで、その予後効果を維持することを示した。

このため、体液中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の値と参照値とを比較することで、ＨＧＳＯＣ患者を、癌再発（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）について低リスク群又は高リスク群に分けることが可能になる。

実際に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２プロファイルから、ＨＧＳＯＣ患者をプラチナ製剤抵抗性患者又はプラチナ製剤感受性患者のいずれかと予測することができる。

本発明によれば、「プラチナ製剤抵抗性患者」（又は「早発再発者（early relapser）」）は、プラチナ製剤ベースの第一選択化学療法の終了後、６ヶ月未満で再発するＨＧＳＯＣ患者を指す。殆どの場合、プラチナ製剤抵抗性患者は、全生存期間が２４ヶ月に満たない短期生存者である。

これに対して、「プラチナ製剤感受性患者」（又は「遅発性再発者（late relapser）」）は、プラチナ製剤ベースの第一選択化学療法の終了後、再発しない、又は６ヶ月以降に再発するＨＧＳＯＣ患者（すなわち、プラチナ製剤感受性の再発患者）を指す。殆どの場合、プラチナ製剤感受性患者は、全生存期間が少なくとも２４ヶ月である長期生存者である。

一実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の前に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）に関わらず治療応答を予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者はプラチナ製剤感受性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者はプラチナ製剤抵抗性患者と予測することができる。

別の実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の後に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）と組み合わせた治療応答を予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者はプラチナ製剤感受性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者はプラチナ製剤抵抗性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ以上であり、かつ厳密に０．２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者は、
患者がネオアジュバント化学療法で治療されている場合には、プラチナ製剤抵抗性患者、又は、
患者がネオアジュバント化学療法の代わりに一次腫瘍減量手術で治療されている場合、プラチナ製剤感受性患者、
と予測することができる。

本発明では、「ネオアジュバント化学療法」（すなわちＮＡＣＴ）という用語は、腫瘍の外科的摘出の前に及び／又は癌の主要な治療の実施の前に行われる薬物治療を指す。

別の実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度を使用して、再発時の治療応答を予測することができ、
特に、患者が再発中であり、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者をプラチナ製剤感受性患者と予測することができ、
特に、患者が再発中であり、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者をプラチナ製剤抵抗性患者と予測することができる。

特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ又は次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により測定することができる。

より詳しくは、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をＴａｑＭａｎ（商標） ＲＴ−ｑＰＣＲにより測定することができる。

例えば、第一選択化学療法前にサンプリングした体液の試料（好ましくは、血清又は血漿）から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標） ｍｉＲＮＡプラズマキット（Macherey-Nagel）を使用して全ＲＮＡを単離するが、他のキットも使用することができる。次いで、全ＲＮＡ溶液のアリコートを、例えばＴａｑＭａｎ（商標）逆転写キットを使用して逆転写した後、例えばＴａｑＭａｎ（商標）ケミストリーを用いて増幅する。

特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の絶対量は、初めに既知量の合成ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２オリゴヌクレオチドの測定により得られるｍｉＲＮＡの検量線との比較により試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２量をアッセイして、次にＲＮＡ抽出工程の直前に体液中の既知量のｃｅｌ−ｍｉＲ−３９−３ｐ、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ及びｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐを加えることに基づく外因性の正規化を用いることにより得ることができ、そのようにして体液中の絶対量（quantitation）を先に記載されているように算出することができる（Vigneron et al., Towards a new standardized method for circulating miRNAs profiling in clinical studies: Interest of the exogenous normalization to improve miRNA signature accuracy, Mol Oncol. 2016, 10(7):981-92）。ＲＮＡ抽出に用いられる方法に応じて、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値は、例えば５％〜１０％変動し得る。

一実施の形態では、液体生体試料は、尿、血液、血清、血漿、腹水の中から選択され、好ましくは血清である。

本発明の方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。

上記方法について本明細書で開示された特徴及び実施の形態は全て、必要な変更を加えて本発明による下記方法に置き換えることができる。

別の態様では、本発明は、従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対するＨＧＳＯＣ患者の感受性をモニタリングする方法であって、
上記ＨＧＳＯＣ患者の、ＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来の化学療法中に得られる液体生体試料中の少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定する工程と、
得られた値と少なくとも１つの参照値とを比較する工程と、
上記患者が上記従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対して感受性であるか否かを判断する工程と、
を含む、方法に関する。本発明の方法を用いて、患者における治療の失敗が腫瘍のプラチナ製剤抵抗性の変化に関連するものであるかを判断することもできる。

本発明の方法を用いて、腫瘍エスケープ（tumor escapement）を検出することもできる。

別の態様では、本発明は、患者においてＨＧＳＯＣを診断及び治療する方法であって、該方法は、
ＨＧＳＯＣを患うヒト患者から液体生体試料を得ることと、
上記患者の液体生体試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定することと、
ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度と少なくとも１つの参照値とを比較することにより、患者をプラチナ製剤感受性患者又はプラチナ製剤抵抗性患者と診断することと、
プラチナ製剤感受性と診断された患者に従来のプラチナ製剤ベースの化学療法及び／又はＰＡＲＰｉ治療を実施することと、
を含む、方法にも関する。

さらに、本発明は、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の少なくとも一部に結合することが可能な１つのオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも含む、本発明の方法に使用される検査キットに関する。

一実施の形態では、本発明のキットは、ＰＣＲキットである。

一実施の形態では、本発明の検査キットは、少なくとも１つの参照ＲＮＡ及び／又は該参照ＲＮＡの少なくとも一部に結合することが可能な少なくとも１つの特異的オリゴヌクレオチドプローブを更に備える。

上記参照ＲＮＡを用いて、生体試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の絶対濃度を測定する絶対検量線を作成することができる。

上記参照ＲＮＡは、生体試料には存在しないことが好ましい。例えば、上記参照ＲＮＡは、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ（ＵＡＣＣＣＧＵＡＡＵＣＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＧＡＧ、配列番号３）又はｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐ（ＵＵＵＧＵＡＣＵＣＣＧＡＵＧＣＣＡＵＵＣＡＧＡ、配列番号４）とすることができ、これらは生物学的モデルであるカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）において発現される２つのｍｉＲに相当する。

上記ＲＮＡ参照は、合成ＲＮＡであることが好ましい。

キットは、リアルタイムＰＣＲアッセイから選択されるアッセイの実施に適合させることができる。ｍｉＲＮＡマイクロアレイ及びＮＧＳ（次世代シークエンシング）等の他の技術を用いて、ｍｉＲＮＡ発現を定量することもできる。

一実施の形態では、本発明のキットは、ＲＮＡ単離収率制御（isolation yield controls）の試験を可能にするプライマーを更に備える。

別の態様では、本発明は、従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対して予測された予後及び／又は予測された応答に従ってＨＧＳＯＣ患者を層別化するためのバイオマーカーとしての液体生体試料、好ましくは血液、血清又は血漿中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、ＰＡＲＰｉ治療に対して予測された予後及び／又は予測された応答に従ってＨＧＳＯＣ患者を層別化するためのバイオマーカーとしての液体生体試料、好ましくは血液、血清又は血漿中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の使用を提供する。

本発明では、「ＰＡＲＰｉ治療」という表現は、ＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）ファミリーの酵素、特にＰＡＲＰ−１の薬理学的阻害剤として作用する少なくとも１つの化合物の患者への投与を指す。ＰＡＲＰ阻害剤は、これらに限定されるものではないが、オラパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、ベリパリブ、パミパリブ、ルカパリブ、ＣＥＰ ９７２２、Ｅ７０１６、イニパリブ及び３−アミノベンズアミドを含む群から選択することができる。

実際、ＰＡＲＰ阻害剤による治療に対する応答がプラチナ製剤感受性に関連していることが分かっている。特に、プラチナ製剤感受性は、ＰＡＲＰｉに感受性である可能性がより高い患者を特定するための臨床バイオマーカーであると考えることができることが認められる（de Picciotto et al., Ovarian cancer: Status of homologous recombination pathway as a predictor of drug response, Crit Rev Oncol Hematol. 2016, 101:50-59、非特許文献４）。プラチナ製剤ベースの治療に対する応答とＰＡＲＰｉベースの治療に対する応答との間のこの類似性は、実施例で示されるように本発明において検証された（実施例ＶＩＩＩを参照されたい）。

この理由から、液体生体試料中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度をプラチナ製剤感受性／抵抗性のバイオマーカーとして用いる本発明の特徴及び実施の形態を、必要な変更を加えて、液体生体試料中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度をＰＡＲＰｉ感受性／抵抗性のバイオマーカーとして用いる本発明に適用する。

そのため、本発明は、ＰＡＲＰｉベースの治療に対する進行期のＨＧＳＯＣ患者の応答を予後診断する方法であって、
少なくとも上記ＨＧＳＯＣ患者の液体生体試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定する工程と、
得られた値と少なくとも１つの参照値とを比較する工程と、
その結果として上記患者がＰＡＲＰｉ感受性患者又はＰＡＲＰｉ抵抗性患者と予測されるか判断する工程と、
を含む、方法も提供する。

一実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の前に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）に関わらず治療応答を予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ感受性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ抵抗性患者と予測することができる。

別の実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の後に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）と組み合わせた治療応答を予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ感受性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ抵抗性患者と予測することができ、
特に、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ以上であり、かつ厳密に０．２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者は、
患者がネオアジュバント化学療法で治療されている場合には、ＰＡＲＰｉ抵抗性患者、又は、
患者がネオアジュバント化学療法の代わりに一次腫瘍減量手術で治療されている場合、ＰＡＲＰｉ感受性患者、
と予測することができる。

別の実施の形態では、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度を使用して、再発時の治療応答を予測することができ、
特に、患者が再発中であり、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者をＰＡＲＰｉ感受性患者と予測することができ、
特に、患者が再発中であり、循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者をＰＡＲＰｉ抵抗性患者と予測することができる。

別の態様では、本発明は、ＨＧＳＯＣ患者の再発の早期検出のためのバイオマーカーとしての、液体生体試料、好ましくは血液、血清又は血漿中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の使用も提供する。

一実施の形態では、定期的に、例えば１年に１回、６ヶ月毎、又は３ヶ月毎に行われる複数回の分析により、液体生体試料中で測定されるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の展開をモニタリングすることにより、再発を検出することができる。

一実施の形態では、定期的に、例えば１年に１回、６ヶ月毎、又は３ヶ月毎に行われる複数回の分析により、液体生体試料中で測定されるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の展開をモニタリングすることにより、プラチナ製剤ベースの化学療法又はＰＡＲＰｉベースの治療に対する抵抗性の出現を検出することができる。

ＣＲＢコホートにおける血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現に応じたリスクにより層別化された無増悪生存及び全生存を示す図である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の高リスク曲線と低リスク曲線とを、ログランク検定を用いて比較した。Ｓｓ：感度、Ｓｐ：特異度、ＰＰＶ：陽性適中率、ＮＰＶ：陰性適中率、ＡＵＣ：曲線下面積、Ｐ：ｐ値。 ｍｉＲＳＡコホートにおける血清ｈａｓ−ｍｉＲ−６２２発現に応じたリスクにより層別化された無増悪生存及び全生存を示す図である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の高リスク曲線と低リスク曲線とを、ログランク検定を用いて比較した。Ｓｓ：感度、Ｓｐ：特異度、ＰＰＶ：陽性適中率、ＮＰＶ：陰性適中率、ＡＵＣ：曲線下面積、Ｐ：ｐ値。 ＣＲＢコホートのＮＡＣＴ患者における血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現に応じたリスクにより層別化された無増悪生存及び全生存を示す図である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の高リスク曲線（太字）と低リスク曲線（細字）とを、ログランク検定を用いて比較した。Ｐ：ｐ値。 ベースライン時の漿液性（serous）ｍｉＲ−６２２発現により層別化されたｍｉＲＳＡコホート及びＣＲＢコホートの生存を示す図である。ｍｉＲＳＡ患者をプラチナ製剤抵抗性の再発（ＰＦＩ ６ヶ月未満）及びプラチナ製剤感受性の再発（ＰＦＩ ６ヶ月以上）に分類するために、ＲＯＣ曲線から、最良のヨーデン指標（Youden indices）に基づいて０．１２８ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を得る（Ａ）。漿液性ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２のベースライン時の発現に対して０．１２８ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いて、カプラン−マイヤー曲線は、ｍｉＲＳＡコホートにおける無増悪生存及び全生存の層別化（Ｂ及びＣ）、並びにＣＲＢコホートにおける無増悪生存の層別化（Ｄ）を示す。曲線は、ログランク検定を用いて比較した。ＲＯＣ＝受信者動作特性、ＴＰＶ＝真陽性値、ＦＰＶ＝偽陽性値、ＡＵＣ＝曲線下面積。 再発時の漿液性ｍｉＲ−６２２発現により層別化されたＣＲＢコホートの全生存を示す図である。ＣＲＢ患者を再発からの短期生存者（ＯＳ １２ヶ月未満）及び長期生存者（ＯＳ １２ヶ月以上）に分類するために、ＲＯＣ曲線から、最良のヨーデン指標に基づいて０．３４ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を得る（Ａ）。漿液性ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の発現に対して０．３４ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いて、カプラン−マイヤー曲線は、ＣＲＢコホート（Ｂ）、及び第二選択のプラチナ製剤ベースの化学療法に対して応答性のあるＣＲＢプラチナ製剤感受性再発者（Ｃ）における再発時の全生存の層別化を示す。曲線は、ログランク検定を用いて比較した。ＲＯＣ＝受信者動作特性、ＴＰＶ＝真陽性値、ＦＰＶ＝偽陽性値、ＡＵＣ＝曲線下面積。 進行時にＰＡＲＰｉ維持により治療された患者（ＣＲＢコホート）における血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現に応じたリスクにより層別化された全生存を示す図である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の高リスク曲線（太字）と低リスク曲線（細字）とを、ログランク検定を用いて比較した。

材料及び方法
患者の血液試料
全体で、ＨＧＳＯＣ（病期ＩＩＩ及びＩＶ）の女性由来の試料の２つの治療未経験コホート：ＣＲＢ（後向きコホート）及びｍｉＲＳＡ（多施設前向きコホート、ＮＣＴ０１３９１３５１）をこの研究に使用した。コホートは、疾患及び治療の同種基準を満たす患者に限定し、患者の臨床的特徴を表１に概説する。

生物資源センター（ＣＲＢ）のＯｖａＲｅｓｓｏｕｒｃｅｓ（後向きコホート）
本プロジェクトにて後向きコホート研究に（retrospectively）使用される血清試料は全て、フランス、カーンのＦ．Ｂａｃｌｅｓｓｅ総合癌センター（ＣＣＣ）（２０００年設立）の婦人科腫瘍部門により回収され、生物資源センター（ＣＲＢ）のＯｖａＲｅｓｓｏｕｒｃｅｓ（ＩＳＯ ９００１品質マネジメント）のバイオバンクに由来するものであった。血清試料を品質及び安全性の最適条件にて−２０℃で保存した。全ての患者から、Ｆ．Ｂａｃｌｅｓｓｅ ＣＣＣの生物コレクションでの保存及び生物学的調査に関する使用について書面による同意を得た。これらの血清試料は、フランスの現行規程、特に公衆衛生規約の生物医学研究に関する規定に準拠して、また生命倫理法、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｌａｗ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｏｍｓ、ヘルシンキ宣言、及び良き臨床上の基準（ＧＣＰ）に従って得た。加えて、血清試料は、所轄官庁、すなわちＡＮＳＭ（National Agency for the Safety of Medicines）、ＣＰＰ（Committee for the Protection of Individuals）、ＡＲＨ（Regional Agency for Hospitalization）、ＭＥＳＲ（Ministry of Education, Health and Research）及びＣＮＩＬ（National Commission for Computing and Freedoms）に対するそれぞれの規程に従って提出された。

実施例Ｉ及び実施例ＩＩＩに示される分析は、３９個の組織学的に検証された臨床高悪性度漿液性卵巣癌（病期ＩＩＩ〜ＩＶ）由来の血清試料に限定した。これらの血清試料は、一次腫瘍減量手術（ＰＤＳ、Ｎ＝３２）又はネオアジュバント化学療法（ＮＡＣＴ、Ｎ＝７）で治療する患者に対して、手術前及びプラチナ製剤ベースの化学療法前に採取した。

実施例Ｖに示される拡張分析は、ベースライン試料で６５個の組織学的に検証された臨床ＨＧＳＯＣに対して行った。

実施例ＶＩに示される分析は、再発試料で３５個の組織学的に検証された臨床ＨＧＳＯＣに対して行った。

実施例ＶＩＩに示される分析は、再発試料で、ＰＡＲＰｉに適格な１３個の組織学的に検証された臨床ＨＧＳＯＣ（６ヶ月以降の再発及びプラチナ製剤ベースの第二選択化学療法に対する応答）に対して行った。

実施例ＶＩＩＩに示される分析は、８個の組織学的に検証された臨床ＨＧＳＯＣ（ＣＲＢコホート）由来の血清試料に対して行った。これらの血清試料は、進行時にＰＡＲＰｉ維持により治療した患者に対する第一選択化学療法の前に採取した。

ｍｉＲＳＡ（ｍｉＲＮＡ血清分析）コホート
２０１１年〜２０１３年に行われたｍｉＲＳＡ臨床研究（ＮＣＴ０１３９１３５１）に含まれていた患者から血清試料を得た。ｍｉＲＳＡ研究は、標準操作手順にて専門臨床チーム及び腫瘍学研究所により行われた。この研究は、倫理委員会「Ｎｏｒｄ−Ｏｕｅｓｔ ＩＩＩ」（ＣＰＰ番号２０１１ ０２）及び国内当局（ＡＦＳＳＡＰＳ番号Ｂ１１０２６０−２０）による承認を受けた。試料及びデータの科学的使用の前に、フランス及び欧州の規則に遵守して、患者に適切な情報を与え、書面による同意を求めた。患者の血清は、ＳＳＴ ＩＩチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）、Becton Dickinson（フランス、ル・ポン＝ド＝クレ））に回収し、通常の分析前プロトコルに従って処理した。要するに、体液を２回遠心分離して、残存細胞を全て除去した後、−８０℃で速やかに凍結した。実験は、１度だけ融解したＲＮＡを用いて行った。全ての手順を通してＲＮａｓｅフリーのプロトコルに従った。

実施例ＩＩに示される分析は、補助的研究に十分な血清を有する、３５個の組織学的に検証された臨床高悪性度漿液性卵巣癌（病期ＩＩＩ〜ＩＶ）由来の血清試料に限定した。これらの血清試料は、ネオアジュバント化学療法（ＮＡＣＴ）で治療した患者に対してプラチナ製剤ベースの化学療法前に採取した。

実施例ＩＶに示される拡張分析は、ベースライン試料で６５個の組織学的に検証された臨床ＨＧＳＯＣに対して行った。

結果
主要評価項目は、予測因子の主な目的が早期再発のリスクがある患者を特定することができることであったことから、無増悪生存期間（ＰＦＳ）とした。無増悪生存期間は、診断日と、進行日若しくは死亡日（どちらか初めに起こった方）又は進行なく生存している患者への最終追跡日との間の時間（月数）として定義した。

副次的評価項目は、全生存期間（ＯＳ）とした。全生存期間は、診断日と、死亡日又は生存患者への最後の接触日との間の時間（月数）として定義した。

合成ｍｉＲＮＡ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製された合成マイクロＲＮＡを、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２（配列番号１）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ（ＵＡＣＣＣＧＵＡＡＵＣＵＵＣＡＵＡＡＵＣＣＧＡＧ、配列番号３）及びｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐ（ＵＵＵＧＵＡＣＵＣＣＧＡＵＧＣＣＡＵＵＣＡＧＡ、配列番号４）についてEurogentec（ベルギー、リエージュ）から購入した。オリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度にて−８０℃で保存した。

血清試料からのＲＮＡ単離
ｍｉＲＮＡは、製造業者の推奨及び先に公開済みの方法論（Vigneron et al., 2016）に従って、市販のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標） ｍｉＲＮＡプラズマキット（Macherey-Nagel（フランス、ウルト）を使用して血清試料から単離した。変性工程後、Eurogentecにより合成された１５００アトモルのｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ及びｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐを各試料に加えた。全ＲＮＡを３０μＬにてヌクレアーゼフリー水に溶出させた後、−８０℃で凍結した。

ＲＴ−ｑＰＣＲを用いたｍｉＲＮＡの絶対定量
初めに、ｍｉＲＮＡを、特異的なステム−ループプライマー（Thermo Fisher Scientific, Life Technologies）及びマイクロＲＮＡ逆転写キット（Thermo Fisher Scientific, Life Technologies）を用いて逆転写してから、加水分解プローブ（Thermo Fisher Scientific, Life Technologies）を用いて増幅した。要するに、５μＬの単離ＲＮＡを１０μＬのＲＴマスターミックスと混合した。次いで、１．３３μＬのｃＤＮＡを有する三連試料（triplicates）を９６ウェル光学プレートにおいて１８．７μＬのｑＰＣＲマスターミックス（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ、ＵＮＧなし）と混合した。ステム−ループプライマー及び加水分解プローブについてのThermo Fisherの参照ＩＤは、下記の通りであった：ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ（００１３６１）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐ（０００２４８）及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２２（００１５５３）。蛍光及び閾値のベースラインは、７５００ソフトウェアｖ２．０．６を備えるＡｐｐｌｉｅｄ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ ＰＣＲシステム（Thermo Fisher Scientific, Life Technologies, Applied Biosystems）を使用して測定した。絶対検量線は、ＲＴ−ｑＰＣＲ工程の前に、合成ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ、ｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−６２２を、２×１０^５ｚｍｏｌ／μＬ、２×１０^４ｚｍｏｌ／μＬ、２×１０^３ｚｍｏｌ／μＬ、２×１０^２ｚｍｏｌ／μＬ、２×１０^１ｚｍｏｌ／μＬ及び２ｚｍｏｌ／μＬで希釈することにより作成した。この検量線を用いて、定量的サイクル数（Ｃｑ）をＲＮＡ抽出物１マイクロリットル当たりのアトモル数でのｍｉＲＮＡ濃度に換算した。ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４−３ｐ及びｃｅｌ−ｍｉＲ−２３８−３ｐの血清単離収率を、各試料について、回収量を添加量で割ることにより算出し、その幾何平均を用いて、血清１マイクロリットル当たりのゼプトモル数でのｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度を推定した。

統計分析
ＰＦＩ（Platinum-free interval）は、プラチナ製剤ベースの第一選択化学療法の最終日から、進行性疾患（再発、死亡又は追跡の喪失）が記録されるまでの期間として定義される。卵巣癌患者は通例、プラチナ製剤抵抗性再発又はプラチナ製剤感受性再発（それぞれ６ヶ月未満及び６ヶ月以上のＰＦＩ）のいずれかに分類された。

患者は、短期生存者及び長期生存者（それぞれ、２４ヶ月未満及び２４ヶ月以上のＯＳ）にも分類された。

各コホートについてＲＯＣ曲線を用いて、最良のヨーデン指標に従ってｈｓａ−ｍｉＲ−６２２値の閾値を選択した。

次いで、患者を、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現に従って、低発現群及び高発現群に分類した。ＰＦＳ及びＯＳに対するｈｓａ−ｍｉＲ−６２２値の閾値の予後的利得（prognosis interest）を、カプラン−マイヤー曲線にて、ログランク検定、並びに逐次方法によるＣｏｘ単変量分析及び多変量分析を用いて評価した。手術結果（巨視的残存物の有無）及び病期（ＩＩＩ又はＩＶ）を既知の化学療法前予後因子として多変量分析に含めた。

実施例Ｉ：ＣＲＢコホートのＰＤＳ患者における血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルと全生存期間との関連性
卵巣癌腫瘍におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の予後的利得を示す先の観察結果に基づき、ＣＲＢコホート由来の患者の血清におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の発現を分析した。上記のように、患者を短期生存者及び長期生存者（それぞれ、２４ヶ月未満及び２４ヶ月以上）に分類し、最良の判別子であるｈｓａ−ｍｉＲ−６２２値を、ＲＯＣ曲線を用いて、最良のヨーデン指標に従って特定した。患者を高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現及び低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現の２つの群に分けた（カットオフ＝０．２８ｚｍｏｌ／μＬ又は１６９コピー／μＬ）。高血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群に比べて有意に悪いＯＳを示すことが観察された（中央値ＯＳ ２２．８ヶ月対４８．９ヶ月、ログランクｐ＝０．００６２）（図１を参照されたい）。ＰＦＳについては、低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２群と高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２群との間で有意差は観察されなかった（ｐ＝０．８１）。次に、Ｃｏｘ単変量モデルを用いて、それぞれの関連の予後変数についてのハザード比（ＨＲ）を推定した。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群（ＨＲ＝３．４３、ＣＩ９５％ １．３〜８．７、ｐ＝０．００９８）及び一次手術後の準最適な腫瘍減量（ＨＲ＝３．４１、ＣＩ９５％ １．１〜１０．２、ｐ＝０．０２８）は、単変量分析においてＯＳと大きく関連していた（表２を参照されたい）。次いで、Ｃｏｘ回帰モデルによる多変量分析を用いて、他の既知の予後因子（すなわち、病期及び残存疾患）の随伴効果に関してｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の予後効果を評価した。予想外のことに、これらの臨床共変量に合わせて調整を行う多変量分析にて分析したところ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２は、独立した予後効果（ＯＳについて、ｐ＝０．０４４）を維持した。

０．２８０ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いたＣＲＢコホートでは、高ｍｉＲ−６２２発現群には、感度５７．１％、特異度７１．４％、真適中率（true predictive value）４０．０％及び偽適中率（false predictive value）８３．３％にて、７人のうち４人のプラチナ製剤抵抗性患者（早期再発者）が含まれている。

０．２８０ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いたＣＲＢコホートでは、高ｍｉＲ−６２２発現群には、感度６０．０％、特異度８０．０％、真適中率６０．０％及び偽適中率８０．０％にて、１０人のうち６人の短期生存者が含まれている。

実施例ＩＩ：ｍｉＲＳＡコホートのＮＡＣＴ患者における血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルをｍｉＲＳＡコホート由来の患者試料において分析した。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現及び低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現の２つの群が構成された（カットオフ＝０．１２４ｚｍｏｌ／μＬ又は７５コピー／μＬ）。ＣＲＢコホートにて導かれた先の観察結果と十分一致して、血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の高発現がより悪い全生存期間を予測するものであった（２４．４ヶ月対３２．２ヶ月以上（最終生存確率０．５超）、ログランクｐ＝０．０２５）（図２を参照されたい）。興味深いことに、高血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群と比べて有意に低いＰＦＳを示すことも見いだされた（中央値ＰＦＳ １２．７ヶ月対２２ヶ月、ログランクｐ＝０．００７７）。このｍｉＲＮＡシグネチャーは、ＨＧＳＯＣに対する治療を受けた女性を癌再発に関して低リスク群又は高リスク群に分けることができた。高リスク群と低リスク群との無増悪生存期間の中央値の差は９．４ヶ月であった。次に、ｍｉＲＳＡコホートの単変量分析及び多変量分析を行った（ＮＡＣＴは、一次手術を受けなかった）。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、単変量分析においてＰＦＳ（ＨＲ＝２．８２、ＣＩ９５％ １．３〜６．２、ｐ＝０．０１０）及びＯＳ（ＨＲ＝４．００、ＣＩ９５％ １．１〜１４．７、ｐ＝０．０３７）と大きく関連していた（表３を参照されたい）。さらに、臨床共変量に合わせて調整を行う多変量分析にて分析したところ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現は、ＰＦＳ（ｐ＝０．００５７）及びＯＳ（ｐ＝０．０３６）について独立した予後因子であった。

０．１２４ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いたｍｉＲＳＡコホートでは、高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群には、感度９０．０％、特異度５６．０％、真適中率４５．０％及び偽適中率９３．３％にて、１０人のうち９人のプラチナ製剤抵抗性患者（早期再発者）が含まれている。

０．１２４ｚｍｏｌ／μＬのカットオフ値を用いたｍｉＲＳＡコホートでは、高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群には、感度８０．０％、特異度６０．０％、真適中率６６．７％及び偽適中率７５．０％にて、１０人のうち８人の短期生存者が含まれている。

実施例ＩＩＩ：ＣＲＢコホートのＮＡＣＴ患者における血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルと全生存期間との関連性
ｍｉＲＳＡコホートのＮＡＣＴ患者に対するｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の予後的利得を示す先の観察結果に基づき、予備的に、０．１２４ｚｍｏｌ／μＬという同じ閾値をＣＲＢコホート由来のＮＡＣＴ患者に用いた。患者を高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現及び低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現の２つの群に分けた（カットオフ＝０．１２４ｚｍｏｌ／μＬ）。興味深いことに、高血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群と比べて悪いＰＦＳ及びＯＳを示すことが見いだされた（中央値ＰＦＳ ２０．３ヶ月対１６．８ヶ月、ログランクｐ＝０．１７及び中央値ＯＳ ３５．９ヶ月対１５．１ヶ月、ログランクｐ＝０．２９）（図３を参照されたい）。

実施例ＩＶ：ｍｉＲＳＡコホートにおけるベースライン時の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
補足的分析を行い、ベースライン時の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得を調べた。

初めに、血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得をｍｉＲＳＡコホート（ｎ＝６５）においてベースライン時に評価した。患者をＰＦＩに従ってプラチナ製剤抵抗性再発（６ヶ月未満）及びプラチナ製剤感受性再発（６ヶ月以上）に分類し、ＲＯＣ曲線を用いて、最適カットオフ発現を７７コピー／μＬ（０．１２８ｚｍｏｌ／μＬ）に固定した（図４Ａを参照されたい）。高ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝３１、２４事象）は、低ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝３４、２２事象）より有意に低いＰＦＳと関連していた（中央値 １５．４ヶ月対２４．４ヶ月、ログランクｐ＝０．０４９、ＨＲ １．７８、９５％ＣＩ １．０〜３．２、ｐ＝０．０５２、図４Ｂを参照されたい）。また、高ｍｉＲ−６２２群（１２事象）は、低ｍｉＲ−６２２群（５事象）よりも有意に低いＯＳと関連していた（中央値 ２９．７ヶ月対４０．６ヶ月、ログランクｐ＝０．００４６、ＨＲ ４．４９、９５％ＣＩ １．４〜１４．０、ｐ＝０．００９５、図４Ｃを参照されたい）。

次に、ベースライン時のｍｉＲＳＡコホートの単変量分析及び多変量分析を行った。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、単変量分析においてより低いＰＦＳ（ＨＲ＝１．７８、ＣＩ９５％ １．０〜３．２、ｐ＝０．０５２）及びより低いＯＳ（ＨＲ＝４．４９、ＣＩ９５％ １．４〜１４．０、ｐ＝０．００９５）と有意に関連していた（表４を参照されたい）。さらに、臨床共変量に合わせて調整を行う多変量分析にて分析したところ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現は、ＰＦＳ（ｐ＝０．０１５）及びＯＳ（ｐ＝０．００１１）について独立した予後因子であった。

実施例Ｖ：ＣＲＢコホートにおけるベースライン時の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得をＣＲＢコホート（ｎ＝６５）においてもベースライン時に評価した。同じカットオフ値を用いて、高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝５２、４２事象）は、低ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝１３、７事象）より有意に大きい死亡リスクと関連していた（中央値 ３０．３ヶ月対４８．９ヶ月、ログランクｐ＝０．０４０、ＨＲ ２．２８、９５％ＣＩ １．０〜５．１、ｐ＝０．０４５、図４Ｄを参照されたい）。

次に、ベースライン時のＣＲＢコホートの単変量分析及び多変量分析を行った。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、単変量分析においてより低いＯＳと有意に関連していた（ＨＲ＝２．２８、ＣＩ９５％ １．０〜５．１、ｐ＝０．０４５）（表５を参照されたい）。

実施例ＶＩ：ＣＲＢコホートにおける再発時の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
次いで、血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの動的な予後的利得をＣＲＢ（ｎ＝３５）において再発時に調べた。患者を残存ＯＳに従って短期生存者（１２ヶ月未満）及び長期生存者（１２ヶ月以上）に分類した。ＲＯＣ曲線を用いて、最適カットオフ発現を２０５コピー／μＬ（０．３４ｚｍｏｌ／μＬ）に固定した（図５Ａを参照されたい）。高ｍｉＲ ６２２群（ｎ＝１１、１１事象）は、低ｍｉＲ ６２２群（ｎ＝２４、２１事象）より有意に低いＯＳを示す（中央値 ７．９ヶ月対２０．６ヶ月、ログランクｐ＝０．０００７７、ＨＲ ３．５６、９５％ＣＩ １．６〜７．８、ｐ＝０．００１５、図５Ｂを参照されたい）。

次に、再発時のＣＲＢコホートの単変量分析及び多変量分析を行った。高ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現群は、単変量分析においてより低いＯＳと有意に関連していた（ＨＲ＝３．５６、ＣＩ９５％ １．６〜７．８、ｐ＝０．００１５）（表６を参照されたい）。さらに、臨床共変量に合わせて調整を行う多変量分析にて分析したところ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現は、ＯＳ（ｐ＝０．００６２）について独立した予後因子であった。

実施例ＶＩＩ：ＣＲＢコホート由来のＰＡＲＰｉに適格な患者における再発時の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
さらに、第二選択ＰＡＲＰｉ維持適格基準に従って、第二選択のプラチナ製剤ベースの化学療法に応答性のあるプラチナ製剤感受性患者に注目したところ（図５Ｃを参照されたい）、高ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝２、２事象）は、低ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝１１、８事象）より低いＯＳに関連していた（中央値 １５．３ヶ月対３４．８ヶ月、ログランクｐ＝０．００２６）。ＣＲＢコホート（ｎ＝６５）に対してベースライン時に同じカットオフ値を用いた場合と一致して、高ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝２０、１９事象）は、低ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝４５、３０事象）より有意に低いＯＳを示す（中央値 ２２．８ヶ月対３５．９ヶ月、ログランクｐ＝０．０１７、ＨＲ ２．０１、９５％ＣＩ １．１〜３．６、ｐ＝０．０１９）。

実施例ＶＩＩＩ：進行時にＰＡＲＰｉ維持により治療された患者における第一選択化学療法前の血清ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２発現レベルの予後的利得
進行時にＰＡＲＰｉ維持により治療された８人の患者（ＣＲＢコホート）由来の血清に対する第一選択化学療法前のｍｉＲ−６２２の予後的利得を評価した。上記と同じカットオフ値を用いて、高ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝２、１事象）は、低ｍｉＲ−６２２群（ｎ＝６、３事象）よりも有意に低い全生存期間（ＯＳ）に関連していた（中央値 ３４．７ヶ月対９４．９ヶ月、ログランクｐ＝０．２８、ＨＲ ４．２４、ｐ＝０．３１、図６を参照されたい）。

Claims (11)

1. ＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対する進行期のＨＧＳＯＣ患者の応答を予後診断する方法であって、
   前記ＨＧＳＯＣ患者の液体生体試料中の、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定する工程と、
   得られた値と少なくとも１つの参照値とを比較する工程と、
   その結果として、前記患者が、
   ＰＡＲＰｉ感受性及び／又はプラチナ製剤感受性の患者、又は、
   ＰＡＲＰｉ抵抗性及び／又はプラチナ製剤抵抗性の患者、
   と予測されるか判断する工程と、
   を含む、方法。
2. ＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対するＨＧＳＯＣ患者の感受性をモニタリングする方法であって、
   前記ＨＧＳＯＣ患者の、ＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来の化学療法中に得られる液体生体試料中の少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度を測定する工程と、
   得られた値と少なくとも１つの参照値とを比較する工程と、
   前記患者がＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対して感受性であるか否かを判断する工程と、
   を含む、方法。
3. 前記液体生体試料が、尿、血液、血清、血漿、腹水からなる群において選択され、好ましくは血清である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の前に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）に関わらず治療応答を予測し、
   特に、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者は治療シーケンスに関わらずＰＡＲＰｉ感受性及び／又はプラチナ製剤感受性の患者と予測することができ、
   特に、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者は治療シーケンスに関わらずＰＡＲＰｉ抵抗性及び／又はプラチナ製剤抵抗性の患者と予測することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度をベースライン時に使用して、治療方針の決定の後に治療シーケンス（ＰＤＳ又はＮＡＣＴ）と組み合わせた治療応答を予測し、
   特に、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が厳密に０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ感受性及び／又はプラチナ製剤感受性の患者と予測することができ、
   特に、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．２８ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者はＰＡＲＰｉ抵抗性及び／又はプラチナ製剤抵抗性の患者と予測することができ、
   特に、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．１２４ｚｍｏｌ／μｌ以上であり、かつ厳密に０．２８ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者は、
   患者がネオアジュバント化学療法で治療されている場合には、ＰＡＲＰｉ抵抗性及び／又はプラチナ製剤抵抗性の患者、又は、
   患者がネオアジュバント化学療法の代わりに一次腫瘍減量手術で治療されている場合、ＰＡＲＰｉ感受性及び／又はプラチナ製剤感受性の患者、
   と予測することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度を使用して、再発時の治療応答を予測し、
   特に、前記患者が再発中であり、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ未満である場合、被検患者をＰＡＲＰｉ感受性及び／又はプラチナ製剤感受性の患者と予測することができ、
   特に、前記患者が再発中であり、前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値が０．３４ｚｍｏｌ／μｌ以上である場合、被検患者をＰＡＲＰｉ抵抗性及び／又はプラチナ製剤抵抗性の患者と予測することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値を、ＲＴ−ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、又は次世代シークエンシングを用いて測定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２濃度の値を、外因性ノーマライザーを用いたＴａｑＭａｎ（商標） ＲＴ−ｑＰＣＲによる絶対量を用いて測定する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 循環ｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の少なくとも一部に結合することが可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に使用されるキット。
10. 少なくとも１つの参照ＲＮＡ及び／又は該参照ＲＮＡの少なくとも一部に結合することが可能な少なくとも１つの特異的オリゴヌクレオチドプローブを備えるＰＣＲキットである、請求項９に記載のキット。
11. ＰＡＲＰｉベースの治療及び／又は従来のプラチナ製剤ベースの化学療法に対して予測された予後及び／又は予測された応答に従ってＨＧＳＯＣ患者を層別化するためのバイオマーカーとしての液体生体試料中で測定されたｈｓａ−ｍｉＲ−６２２の濃度の使用。

Images