CN102007408A - 与急性髓性白血病(aml)中的细胞遗传学和预后相关的微rna特征及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了用于白血病相关疾病,特别地急性髓性白血病的诊断、预后和/或治疗的利用miRNA特征的方法和组合物。
Description
发明者:Carlo M.Croce,Ramiro Garzon
交叉参考相关申请
本申请要求2008年2月28日提交的美国临时申请案61/067,419的权益,其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。
关于联邦政府支助的研究的声明
本发明是在NCI基金CA76259和CA8134下由政府支助进行的。政府在本发明中具有某些权利。
本发明的技术领域和工业适用性
本发明总地说来涉及分子生物学领域。本发明的某些方面包括在白血病相关病症的诊断、治疗和预后中的应用。
发明背景
不承认本部分中公开的背景技术在法律上构成了现有技术。
急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是特征在于克隆性髓系前体细胞(clonal myeloid precursor)的分化停滞和恶性增殖的在细胞遗传学上和分子上异质的病症(1)。具有中等风险和高风险的细胞遗传学的患者代表大多数AML;基于化学疗法的方案不能治愈大部分此类患者,并且干细胞移植是通常选择的治疗(2,3)。由于众多原因异基因干细胞移植不适合于许多高危白血病患者,因此存在对提高我们对此类白血病的生物学的理解以开发新型疗法的急切需要。
微RNA(miRNA)是长度为19至25个核苷酸的非编码RNA,其通过诱导翻译抑制和切割它们的靶mRNA(经由与部分或完全互补位点碱基配对)来调控基因表达(4)。miRNA参与至关重要的生物学过程,包括发育、细胞分化、压力应答、细胞凋亡和增殖(4)。最近,已将miRNA的表达与造血作用和癌症相关联(5-11)。在小鼠中,miR-181在造血祖细胞中的异位表达导致B细胞区室中的增殖(5)。同样,已在人粒细胞、红细胞和巨核细胞的分化过程中发现miRNA的重要作用(6-8)。将miRNA与癌症相关联的第一个报导涉及慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(9)。已发现2个miRNA(miR-15a和miR-16-1)的簇位于13q14上的最小缺失区域(约30kb)中,并且在大约60%的CLL样品中缺失或下调(9)。其他研究确认,miRNA广泛参与癌症(10,11)。然而,关于AML中的miRNA表达,知之甚少。
尽管对治疗此类疾病的疗法进行了相当多的研究,但仍然难以有效地诊断和治疗它们,并且在患者中观察到的死亡率表明,需要改进所述疾病的诊断、治疗和预防。
发明概述
在第一广泛的方面,本文中描述了……………。
在确定权利要求后,我们将在此处插入权利要求的概述………………………。
当根据附图进行阅读时,根据下列优选实施方案的详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
附图概述
本专利或申请文件可包括一个或多个以彩色制成的图和/或一个或多个照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局(Patent Office)提供。
图1:相对于CD34+细胞和成熟的造血前体细胞(hematopoietic precursor),在AML样品中下调的miRNA。
图1A,图1B:我们根据SAM评分和倍数变化选择差异最大的miRNA并且通过定量RT-PCR在6个AML患者和获自健康供体的4个CD34样品的随机组中测量它们。在用let-7i进行标准化和2ΔCt转换(18)后,结果表示为相对于一个健康供体的CD34+表达,AML样品中miRNA表达的倍数变化(细棒代表标准差)。根据t检验,除了miR-135外(P=.38),4个CD34与所有6个AML患者之间miRNA表达的差异在统计学上是显著的:miR-106a(P=.001)、miR125a(P=.001)、miR-126(P=.001)、miR-93(P=.001)、miR-130a(P=.006)、miR-146(P=.001)。
图1C:在标准化和2ΔCt转换后,与CD34+细胞的平均miRNA表达相比较的外周血成熟粒细胞和单核细胞以及骨髓定向(红细胞和巨核细胞)前体细胞的平均miRNA表达(来自4个不同的健康供体)和6个AML患者的平均miRNA表达。结果表示为相对于CD34+细胞,平均miRNA表达的倍数变化。根据t检验(P<.05),相对于CD34细胞,成熟外周血细胞和定向前体细胞中mi RNA表达的下调在统计学上是显著的。
图2:具有FLT3-ITD突变的AML中MiR-155的表达。通过定量RT-PCR测量的具有FLT3-WT(n=12)和FLT3-ITD阳性突变(n=4)的AML患者中的平均miR-155表达。使用t检验(SPSS)比较不同组之间的miRNA表达。
图3A-3B:与新近诊断的AML患者中的总体存活相关的miRNA。60个具有高或低的miR-191(图3A)和miR-199a(图3B)的表达(通过定量RT-PCR进行检测)的AML患者的总体存活的Kaplan-Meier评估。将时序检验用于比较存活曲线之间的差异。
图4:表1-新近诊断的AML患者的临床和细胞遗传学特征。除了无成熟作用的AML(χ2,P=.03)的类别外,通过t检验和χ2未在两组患者(微阵列对定量RT-PCR)之间观察到统计学上显著的差异。所有值代表频率(%)。*这些AML病例不满足将其包括在之前描述的亚组之一中的标准。WHO分类中未另外分类的其他细胞遗传学组。来自微阵列群组(cohort)的122个患者中总共116个以及来自定量RT-PCR群组的60个患者中总共59个已通过常规核型分析对至少20个或更多个中期进行了分析。复杂核型定义为3个及3个以上的染色体异常。并非所有患者都进行了FLT3的分析。显示的百分比与经历了FLT3突变研究的患者的总数相关。§122个AML患者中活着的患者的中值随访期是100周(范围,1至586周),在60个AML的群组中该中值随访期是124周(范围,7-278周)。
图5:表2-相对于获自10个健康供体的CD34+细胞,在122个新近诊断的AML患者中下调的MiRNA。
图6:表3-miRNA对用于结果预测的临床多变量模型的影响。
图7:表S1。用于标准化微阵列数据的持家基因探针(PDF,15.2KB)。
图8:表S2。与WBC计数以及外周和骨髓母细胞(blast)百分比相关的微RNA(PDF,27.5KB)。所有miRNA都上调并且与WBC计数以及PB和BM母细胞百分比具有正相关。通过使用定量SAM分析获得这些结果。以黄色突出显示的MiRNA由至少两个特征(signature)共有。
图9:表S3。与具有其他细胞遗传学异常(包括正常核型)的其他AML患者相比,在具有t(11q23)的患者中差异表达的微RNA(PDF,19.3KB)。以红色标示的MiRNA上调,以绿色标示的MiRNA下调。除了miR-196a、miR-372和miR-193外,在具有t(11q23)的经治疗的患者(4)的独立组中与具有其他细胞遗传学异常的经治疗的患者(44)的独立组中观察到相同的特征。
图10:表S4-在具有t(6;11)的患者n=4与具有t(9;11)的患者n=5之间差异表达的微RNA(PDF,17.3KB)。
图11:表S5-与其他AML细胞遗传学亚组相比较,在具有分离的8号染色体三体(trisomy 8)的患者中差异表达的微RNA(PDF,28.4KB)。为了进行该分析,我们只包括具有分离的8号染色体三体的样品。将这些样品与具有已知的细胞遗传学的其他AML样品(不包括具有8号染色体三体作为第二细胞遗传学异常的样品)相比较。所有miRNA都上调。
图12:表S6-与异常核型的AML相比较,在正常核型的AML患者中差异表达的微RNA(PDF,19.6KB)。与具有异常核型的经治疗的AML患者(38)相比较,除了miR-368、miR-191和miR-192以外,发现所有miRNA也在具有正常核型的经治疗的AML患者(10)中差异表达。以红色标示的MiRNA上调,以绿色标示的MiRNA下调。
图13:表S7-54个经治疗的AML患者样品(复发的n=34或原发性难治的n=20)的临床特征(PDF,68.9KB)。□-这些AML病例不满足将其包括在之前描述的亚组之一中的标准。-在WHO分类中未另外分类的其他细胞遗传学组。来自微阵列群组的122个患者中的116个和来自qRT-PCR群组的60个患者中的59个已通过常规核型分析对至少20个或更多个中期进行了分析。复杂核型定义为:●3个染色体异常。*-并非所有患者都进行了FLT3分析。显示的百分比与进行了FLT3突变研究的患者的总数(n=30)相关。
图14:表S8-与具有其他细胞遗传学异常(包括正常核型)的其他经治疗的AML患者相比较,在具有t(11q23)的经治疗的患者中差异表达的微RNA(PDF,28.2KB)。上调的以红色(粗体)标示,下调的以绿色(正常字体)标示。
图15-表S9-与具有异常核型的经治疗的AML患者相比,在正常核型的经治疗的AML患者中差异表达的微RNA(PDF,29.3KB)。*这些miRNA具有FDR>5。然而,为了与在未经治疗的患者中观察到的特征进行比较的目的,在此处显示它们。
图16:表S 10-与具有FLT3-wt的经治疗的AML患者相比较,在具有FLT3-ITD突变的经治疗的AML患者中上调的微RNA(PDF,13.7KB)。
图17:通过qRT-PCR对微阵列数据的验证(JPG,33.8KB)。散点图显示各样品的miRNA微阵列表达值与标准化的qRT-PCR(在2ΔCt转换后)呈正相关。粉红色实线代表预测的Y,而蓝点是患者样品。qRT-PCR(ΔCt值)越低,miRNA的表达水平越低。
图18A-18B:具有t(9;11)的患者中选择的miRNA的微阵列结果的验证(JPG,28.3KB)。通过qRT-PCR测量的新近诊断的具有t(9;11)的AML患者(n=3)和非11q23AML患者(n=10)中miR-326(图18A)以及miR-29a、miR-29b和miR-29c(图18B)的平均表达。使用t检验(SPSS)比较不同组之间的miRNA表达。
图19A-19B:具有正常核型的患者中选择的miRNA的微阵列结果的验证(JPG,31.1KB)。通过qRT-PCR测量的新近诊断的具有正常核型(n=12)和异常核型(n=22)的AML患者中的miR-10a(图19A)、miR-126(图19B)和miR-30c(图19C)的平均表达。使用t检验(SPSS)比较不同组之间的miRNA表达。
优选实施方案的详细描述
在整个本公开内容中,通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本公开内容以更全面地描述本发明涉及的现有技术。
使用miRNA微阵列分析一大组主要具有中等(intermediate)和不良预后的AML患者以研究miRNA表达是否与临床特征、细胞遗传学异常和结果相关。
在下列实施例中进一步解释本发明,其中,除非另有说明,所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解,表示本发明的优选实施方案的这些实施例仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例,本领域技术人员可以确定本发明的本质特征,并且无需背离其精神和范围,可以对本发明进行多种变化和改进以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物,包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。
实施例I
患者和细胞样品
从M.D.Anderson Cancer Center(MDACC;(n=172)和Thomas Jefferson University(n=10)的Cell and Tissue Bank获得来自182个新近诊断的AML患者的治疗前骨髓和血液样品。使用微阵列平台,将总共122个AML样品用于分析miRNA的表达,同时使用定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR;图4-表1),将60个未经治疗的AML样品用于验证结果特征(outcome signature)。
将获自MDACC的具有复发性(n=34)或难治性(n=20)疾病的54个AML患者的第二群组用于测定新近诊断的AML患者与复发性/原发性难治的AML患者之间miRNA表达的差异(图13-表S7)。根据Declaration of Helsinki,从患者获得知情同意书以获得和贮存细胞,以便将来根据制度指导方针进行研究。通过Ficoll-Hypaque(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)梯度离心制备患者的样品,通过CD3/CD19耗尽(MACS;Miltenyi Biotec,Auburn,CA)富集白血病细胞并且冷藏保存(12)。在使用或不使用直接方法和G分带(G-banding)的情况下,使用未受刺激的短期(24-、48-和72-小时)培养物在诊断时或复发时进行样品的细胞遗传学分析。用于描述细胞遗传学克隆的标准和核型的描述遵从国际人类细胞遗传学术语命名法系统的推荐(13)。在确定为具有正常核型的患者中分析了至少20个骨髓中期细胞。如之前所述(14),对大多数样品进行FLT3内部串联重复(in tandem duplication,ITD)和激活环D835突变的分析。在收集期间,在MDACC的众多的制度审查委员会批准的方案中治疗122个AML的第一群组,所述方案包括伊达比星与2种不同阿糖胞苷的组合(n=53;方案91004和10193)、含有高剂量ARA-C(n=20)的方案(方案330139和202074)、DCTER(n=5;方案202089),和临床试用药物例如PKC 412和白细胞介素-11(n=24;方案201591和20202)。所有4个具有急性早幼粒细胞白血病的患者接受包含全反式视黄酸的方案。使用相同的伊达比星和阿糖胞苷方案(n=47;方案91003)、含有高剂量ARA-C的方案(n=5;方案330139和202074)和其他临床试用试剂例如PKC 412和白细胞介素-11(n=6;方案201591和20202)治疗验证群组中60个患者的大多数(78%)。来自4个健康供体的血液成熟粒细胞和单核细胞以及骨髓CD71+选择性红细胞前体细胞购自Allcells(Emeryville,CA)。来自10个健康供体的骨髓CD34+祖细胞购自Allcells。如之前所述(8),获得体外分化的巨核细胞。
RNA提取和miRNA微阵列实验
如之前所述(15),进行RNA提取和miRNA微芯片实验。miRNA微阵列基于单通道系统(15)。芯片包含通过接触技术点印并且共价连接至聚合物基质的基因特异性寡核苷酸探针(本文中的实施例II,关于miRNA寡核苷酸探针序列,参见EBI的ArrayExpress数据库)。
miRNA的实时定量
如之前所描述的(16),使用PCR 9700 Thermocycler ABI Prism7900HT和序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,CA),将单管TaqMan miRNA测定用于检测和定量成熟miRNA。使用let-7-i进行标准化。选择let-7-i是因为其在微阵列患者数据集中具有最低的表达变异性。以一式三份进行比较实时PCR(包括无模板对照)。使用比较Ct法(17)计算相对表达。
数据分析
使用GENEPIX PRO分析微阵列图像。将各miRNA的重复点的平均值减去背景;使用一组持家基因(表S1)和BRB Array工具(linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)进行log2转换和标准化。在统计分析之前将不存在(absent call)的阈值设定为22(在log2标度中为4.5)。该水平是在miRNA芯片实验中高于背景检测到的平均最小强度水平。在比较2个类别(例如,CD34对AML)时,在微阵列显著性分析(SAM)中使用调整的t检验法鉴定差异表达的miRNA(18)。此处使用的SAM Excel plug-in基于表达变化(相对于所有测量的标准差)计算各基因的评分。因为这是多重检验,因此进行排列(permutation)以计算假发现率(FDR)或q值。FDR低于5%且倍数变化大于2的miRNA被考虑用于进一步分析。为了研究与数量变量(例如白细胞计数)相关的miRNA,我们使用SAM中的定量回归分析。将微阵列数据集储存在Array-Express(ebi.ac.uk/arrayexpress),阵列登录号E-TABM-405。
存活分析和定义
从诊断时间直至死亡日期(在最后一次随访时检查活着的患者)计算总体存活(Overall survival,OS),从诊断时间直至复发或死亡(在最后一次随访时检查活着的患者)计算无事件存活(event-free survival,EFS)。在122个AML患者的第一群组中,我们使用SAM法(其包括改进的Cox比例-危险最大-似然评分)来鉴定其表达与存活的持续时间显著相关的一组miRNA。然后我们使用定量RT-PCR在60个新近诊断的AML患者的独立群组(图4-表1)中验证这些miRNA。
将单变量Cox比例危险法(Cox proportional hazard method)用于该60个患者的验证组中以鉴定与OS和EFS相关的miRNA。然后利用R 2.4.0软件,使用多变量比例危险分析来评估miRNA是否可不依赖于其他因素(例如细胞遗传学和FLT-ITD+)而预测结果。为了在所有多变量模型中选择最佳模型,我们使用Akaike Information Criteria。将Kaplan-Meier曲线用于展示miRNA与结果的关联。为了产生Kaplan-Meier曲线,通过将样品分成2类(高和低表达,根据整个样品组的中值表达),将通过定量RT-PCR测量的miRNA水平转换成离散变量。获得各组的存活曲线,然后使用时序检验进行比较。
统计分析
将Fisher精确检验、t检验和x2用于比较患者组之间的基线特征和平均miRNA表达。十一(11)个报导的P值是双侧的并且使用SPSS软件包(对于Windows,SPSS 15.0)获得。
结果
AML患者显示与正常CD34+祖细胞相比不同的miRNA表达谱。
我们使用之前描述的和经验证的miRNA微阵列平台(15)就差异miRNA表达将122个新近诊断的AML样品(图4-表1)与来自10个正常供体的CD34+细胞相比较。我们鉴定了26个与CD34+正常细胞相比较在AML样品中下调的miRNA并且未鉴定到上调的miRNA(图5-表2)。
为了验证这些结果,我们使用随机选择的AML样品的亚组和4个获自不同供体的CD34+样品进行7个下调的miRNA(miR-126、miR-130a、miR-135、miR-93、miR-146、miR-106b和miR-125a)的定量RT-PCR。如图1A、图1B中所示,我们确认除了miR-135外,上述miRNA在AML样品中(相对于骨髓CD34+祖细胞)下调。
此外,为了验证微阵列平台的结果,我们在12个随机选择的AML样品中进行其表达在芯片上是高、中和低的42个miRNA的定量RT-PCR。如图17中所示,通过微阵列测量的miRNA水平与通过定量RT-PCR测量的水平高度相关(r=0.92,P<.001),从而确认微阵列平台是测量miRNA表达的分析工具。
miRNA的亚组与特定的造血谱系相关
已显示miRNA表达提供了造血发育谱系和肿瘤分化期的信息(11)。为了测定AML样品和CD34+细胞之间最差异表达的miRNA与不同造血谱系相关的水平,我们通过定量RT-PCR在一组人造血细胞中评估了26个miRNA中的5个(根据SAM评分进行选择)的表达水平,所述造血细胞包括成熟粒细胞、单核细胞和红细胞以及巨核细胞前体细胞。
与正常CD34+细胞相比,在AML中下调的miRNA当中,miR-126、miR-130a、miR-93、miR-125a和miR-146在成熟和前体造血细胞中也显著下调(图1C)。
miRNA-181a在具有多系发育不良的AML中下调
具有多系发育不良(MLD)的AML在老年患者中最频繁地发生并且通常与不利的细胞遗传学特征谱和对治疗的应答相关(19)。为了研究该组是否具有特征性miRNA特征谱,我们将未经治疗的患有“初发(de novo)”或原发性AML的AML患者(n=79)与按照AML的WHO分类(19)定义的具有MLD的AML患者(n=29)相比较。通过使用SAM,我们只鉴定到miR-181a在具有MLD的AML中下调(FDR 0%,FC>2,1.68的SAM评分)。然后,我们将未经治疗的初发样品(n=79)与具有治疗相关AML的未经治疗的患者(n=12)相比较,并且在治疗相关AML患者中鉴定到3个上调的miRNA(miR-190、miR-9和miR-188,全部具有0%的FDR,FC>1.8,SAM评分>1.8)。我们在具有MLD的AML与治疗相关AML之间未检测到miRNA表达的任何显著差异。
miRNA与白细胞和母细胞计数正相关
我们使用本文中描述的SAM定量分析来研究miRNA是否与治疗前患者特征例如年龄、性别、白细胞(WBC)计数、骨髓或外周血母细胞百分比相关。我们检测到几种miRNA的正相关(全部具有0%的FDR,高SAM定量评分大于2),包括miR-155和miR-181b(对于WBC、外周和骨髓母细胞百分比)、miR-30b和miR-30c(对于WBC和骨髓母细胞百分比)和miR-25(对于循环母细胞百分比)(图8-表S2)。
与确定的细胞遗传学亚组相关的miRNA特征
为了鉴定AML中与已知的细胞遗传学异常相关的miRNA,我们研究了116个具有已知核型的治疗前AML样品。使用SAM来检测在确定的细胞遗传学组与其他核型(包括正常核型)组之间差异表达的miRNA。因为一些细胞遗传学亚组在一个批次中主要是混杂的(例如,t(11q23)和正常核型),因此我们使用定量RT-PCR来验证特征。
11q23平衡易位
相对于所有其他AML患者,我们在具有t(11q23)的患者(n=9)中鉴定了8个上调的miRNA(miR-326、miR-219、miR-194、miR-301、miR-324、miR-339、miR-99b、miR-328)和14个下调的miRNA(miR-34b、miR-15a、miR-29a、miR-29c、miR-372、miR-30a、miR-29b、miR-30e、miR-196a、let-7f、miR-102、miR-331、miR-299、miR-193)(图9-表S3)。
我们使用来自结果验证特征群组的患者样品(非t(11q23),n=10;和t(9;11),n=3)通过定量RT-PCR验证选择的miRNA(根据更高的SAM评分进行选择)的微阵列结果(图18A-18B)。
在平衡11q23易位患者中下调的miRNA当中,许多是靶向至关重要的癌基因的肿瘤抑制miRNA,即,miR-34b(CDK4和CCNE2)(20)、miR-15a(BCL-2)(21)、let-7家族(RAS)(22)、miR-29家族(MCL-1和TCL-1)(23,24)miR-372(LATS2)(25)和miR-196(HOX-A7、HOX-A8、HOX-D8、HOX-B8)(26)。然后我们探询miRNA的表达在具有t(6;11)(n=4)和t(9;11)(n=5)的患者之间是否不同。16个miRNA在具有t(6;11)的患者中上调(图10-表S4),包括抗细胞凋亡miR-21(其靶向肿瘤抑制基因PTEN(27))以及miR-26a和b(其靶向TGFb1调节剂SMAD1(28))。已提出,SMAD1的下调参与与癌症发生相关的TGFb1的失调(29)。
8号染色体三体
使用SAM获得的特征包括,与具有其他核型的所有其他AML患者(除去具有次要8号染色体三体的患者)(n=5;图11-表S5)相比,在具有分离的8号染色体三体的患者样品(n=5)中上调的42个miRNA和无下调的miRNA。
在上调的miRNA当中,miR-124a和miR-30d分别位于8p21和8q23上,从而显示基因剂量效应可以在它们的上调中起作用。有趣地,miR-124a靶向骨髓转录因子CEBPA。
具有正常核型的AML
我们首先将正常核型AML(NK-AML)患者与具有异常核型的AML患者相比较。我们发现NK-AML中的特征包括10个上调的miRNA(miR-10a、miR-10b、miR-26a、miR-30c、let-7a-2、miR-16-2、miR-21、miR-181b、miR-368和miR-192)与13个下调的miRNA(miR-126、miR-203、miR-200c、miR-182、miR-204、miR-196b、miR-193、miR-191、miR-199a、miR-194、miR-183、miR-299和miR-145)(图12-表S6)。可能由于该亚组的分子异质性(数据未显示),该特征不预测NK-AML。我们使用来自结果验证特征群组的患者样品验证选择的miRNA的微阵列结果(NK-AML,n=12;和异常核型AML,n=22,通过定量RT-PCR;图19A-19C)。
MiR-155在AML患者中在FLT3-ITD突变中过表达
为了鉴定AML中与FLT3-ITD突变(FLT3-ITD+)的存在相关的miRNA,我们首先使用SAM比较具有FLT3-ITD+的未经治疗的AML患者(n=17)与具有FLT3-wt的未经治疗的AML患者(n=73)(不包括FLT3-D835突变(n=2))。我们发现3个miRNA在FLT3-ITD+中上调,miR-155(3.1-倍)、miR-10a(2.5-倍)和miR-10b(2.27-倍),全都具有0的FDR和大于2的SAM评分。
没有足够的具有FLT3-D 835突变的患者(n=2)来进行统计评估。我们使用定量RT-PCR在AML患者的独立组(来自结果特征验证组的16个患者)中验证这些结果。具有FLT3-ITD+的AML患者(n=4)再次具有比FLT3-wt患者(n=12,P=.007,t检验;图2)更高的miR-155表达。
复发性和原发性难治的AML患者中的miRNA表达
通过使用我们的miRNA平台,我们进一步研究了具有复发性(n=34)或原发性难治的AML(n=20;图13-表S7)的54个患者的miRNA特征谱。
从与最初的122个患者的群组不同的患者获得该经治疗的患者样品的独立群组。在未经治疗的(n=122)与经治疗的患者(n=54)之间未检测到显著差异(数据未显示)。通过使用该54个经治疗的患者的组,我们使用SAM分析不同细胞遗传学和分子亚组(例如,具有t(11q23)的AML对其他核型的AML,FLT3-ITD+对FLT3-wt等)间的miRNA表达。获得与未经治疗的患者的miRNA特征相似的miRNA特征(图14-表S8,图15-表9,图16-表S10),从而显示miRNA的表达主要由细胞遗传学驱动。
与结果相关的miRNA
我们研究了122个新近诊断的AML患者的存活和miRNA表达。此处,我们鉴定了少数miRNA(其FDR低于1%,SAM存活评分(Cox回归)大于2)。所有鉴定的基因,miR-199a、miR-199b、miR-191、miR-25和miR-20a,当过表达时,负面影响OS。
为了验证该预后性miRNA特征,我们用不同技术(定量RT-PCR)在60个新近诊断的AML患者的独立组中测量miR-199a、miR-191、miR-25和miR-20a。(图4-表1)。
进行单变量Cox比例危险分析以确定各miRNA与OS和EFS的关联。我们确认,miR-199a和miR-191与OS(miR-199a,P=.001;miR-191,P=.03)和EFS(miR-199a,P=.002;miR-191,P=.02)显著关联。我们未能验证miR-20和miR-25与OS(miR-20P=.92;miR-25,P=.07)和EFS(miR-20,P=.8;miR-25,P=.07)的关联。为了进一步确认和图解展示这些miRNA与结果的关联,通过将样品分成2类(高表达和低表达,根据整个60个样品的组的中值表达),将通过定量RT-PCR测量的miRNA表达水平转换成离散变量,并产生Kaplan-Meier存活曲线。发现具有miR-199a和miR-191的高表达的患者具有显著更短的OS(图3)和EFS(miR-199a,P=.002;和miR-191,P=.02,时序检验)。
诊断时按照Cancer and Leukemia Group B标准(31)确定的不利细胞遗传学与OS和EFS相关(通过单变量Cox分析,两者P<.001)。其他特征例如年龄(P=.48)、白细胞(P=.92)和FLT3-ITD+(P=.2)在该60个AML患者的独立组中都不与OS和EFS显著关联(数据未显示)。FLT3-ITD突变与我们的新近诊断的患者群组之间缺乏存活关联的背后原因可能是漏失数据的患者的数目(即,无FLT3检验,n=8)和研究的群体的相当大的年龄(中值年龄=59岁)。与年轻AML患者相反,未发现FLT3-ITD突变与AML老年患者的不良结果相关(32)。
为了评估miRNA是否可不依赖于其他因素(例如,细胞遗传学)而预测结果,首先我们使用Cox比例危险模型(允许任何可能的临床协变量(WBC、FLT3-状态、细胞遗传学和年龄))来建立纯粹的临床模型以预测OS和EFS。在应用Akaike Information Criteria从模型中消除冗余项后,细胞遗传学提供了OS(危害比=3.87;95%的置信区间,1.83-8.18,P<.001)和EFS(危害比=3;95%的置信区间,1.47-6.10,P=.002)的最佳预测器。然后,我们将4个miRNA(miR-20a、miR-25、miR-191和miR-199)作为二分miRNA变量(高或低miRNA表达,根据整个样品组的中值表达)加入至最佳临床模型。最佳模型保留miR-191、miR-199和细胞遗传学(用于OS和EFS)(图6-表3)。
讨论
我们使用微阵列平台来进行AML样品和正常祖先CD34+细胞的基因组范围的miRNome分析。大多数miRNA相对于CD34+细胞在AML患者中下调。两个最近的研究已显示,在CD34+细胞体外分化成几个谱系期间存在广泛的miRNA下调(8,33)。我们的数据确认,相对于CD34+细胞在AML中下调的大多数miRNA也在健康的前体细胞和成熟外周血髓系细胞中下调,这显示白血病中miRNA的亚组密切遵从正常造血中miRNA表达的分化模式。
此处,我们鉴定了与几个细胞遗传学组关联的分子特征。2个最强的特征是与平衡11q23易位和分离的8号染色体三体相关的特征。
已知在具有11q23易位的患者中调控HOX基因(26)的miR-196的下调显示解释几个HOX基因在这些患者中上调的新机制。
通过使用微阵列平台,我们还能够区分t(6;11)与t(9;11)。在t(6;11)中上调的miRNA当中,已发现miR-21在许多实体瘤中过表达(10)。另一个研究显示,miR-21靶向PTEN(27)(重要的肿瘤抑制剂),并且miR-21的反义抑制体外诱导肿瘤细胞的细胞凋亡并且在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长(34)。现认为oncomiR例如miR-21和miR-26在t(6;11)中的异常表达解释了该患者亚组的更差的预后(31)。
相反地,在平衡11q23易位中下调的miR-29家族成员靶向癌基因TCL1(24)和MCL1(24)(已发现在抗多种化学治疗剂的细胞中上调的至关重要的细胞凋亡调节剂(35))。此外,其他miR-29家族成员在高危CLL(25)和肺癌(37)中下调。
有趣地,已发现miR-155在具有高白细胞计数和FLT3-ITD突变的AML患者中上调。最近已描述,该miRNA体外阻断人髓细胞集落形成(38)、停止巨核细胞生成(megakaryopoiesis)(38)以及在小鼠中诱导B细胞淋巴瘤和白血病(39)。
存在少数具有有利的细胞遗传学例如inv(16)[4]和t(15;17)[4]的患者。我们未能在这2个AML患者组中鉴定任何特征性miRNA特征。关联的不存在可能是由于组内异质性和/或小样品量。
我们描述了与OS和EFS显著关联的miRNA特征。几个观察巩固了我们的结果。miRNA的这些亚组在AML中明显失调并且与细胞遗传学组和结果相关联。
第一,我们鉴定了与存活相关的miRNA(虽然本文研究的患者具有总体较差的预后和较短的存活),其中结果差异可能难以证实。第二,也在具有分离的8号染色体三体的患者(AML的亚组)中鉴定了miR-199a和miR-191的高表达,这与不良结果相关联(31)。第三,结果特征由上调的miRNA组成,所述miRNA与6个实体瘤的共有特征相同(例如,miR-20、miR-25、miR-199a和miR-191)(1)。
实施例II
微RNA(miRNA)微阵列
以一式四份将5微克的总RNA用于在miRNA微阵列芯片上与相应于250个人成熟和前体miRNA的探针(如2005年11月的miRBase(microrna.sanger.ac.uk)中所述)杂交。分开地向12μl终体积的反应混合物(含有1μg 3′-(N)8-(A)12-生物素-(A)12-生物素-5′随机寡核苷酸引物)中加入总RNA。将混合物在70℃下温育10分钟,然后在冰上冷却。将混合物保持在冰上,加入4μl 5×第一链缓冲液、2μl 0.1M DTT、1μl 10mM dNTP混合物和1μl SuperScript II RNaseH-逆转录酶(200个单位/μl)至20μl的终体积,将混合物在37℃水浴中温育90分钟。在温育以进行第一链cDNA合成后,将3.5μl 0.5M NaOH/50mM EDTA加入至20μl的第一链反应混合物中,并在65℃下温育15分钟以使RNA/DNA杂交体变性和降解RNA模板。然后,加入5μl 1MTris·HCI(pH 7.6,Sigma)以中和反应混合物,在杂交之前将标记的靶贮存于-80℃下。将微阵列在25℃下于6×SSPE(0.9M氯化钠/60mM磷酸钠/8mM EDTA,pH 7.4)/30%甲酰胺中杂交18小时,在37℃下于0.75×TNT(Tris·HCl/氯化钠/Tween 20)中清洗40分钟,然后通过用链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测含有生物素的转录物来对其进行处理。使用GenePix Axon 4000B微阵列扫描仪(将激光设置至635nm,使用固定的800的PMT设置和10mm的扫描分辨率)扫描经处理的载玻片。除了miRNA探针外,还包括使用相似的设计标准产生的针对8个人TRNA和3个snRNA的寡核苷酸。(图7-表S1)。
数据分析
在使用GenePix Pro获得载玻片图像后,将各miRNA的重复点的平均值减去背景,然后进行标准化并经历进一步的分析。根据GenePix Pro质量控制标记为不存在或异常值(outlier)的点不包括在分析中。将BRB Array Tools用于标准化。作为单通道实验,将阵列针对参照阵列进行标准化,以使阵列与参照阵列之间的对数强度的差异具有为0的中值(对于持家基因组)。参照阵列被自动地选择为中值阵列(其中值对数-强度值是整个阵列组的所有中值对数-强度值的中值的阵列)。通过计算各阵列与参照阵列之间的各个基因的差异,然后将该阵列上的对数-强度减去持家基因的中值差异来进行持家基因标准化。选择“持家”非编码基因,因为它们与miRNA基因一样是非编码性的(图7-表S1)。
我们将第1版本的tRNA基因扩展至包括U2、U4、U6小非编码RNA基因和GAPDH mRNA。U6在来自不同实验室的miRNA论文中广泛地用于Northern印迹的标准化。由于AML的异质性,当miRNA存在于至少20%的样品中时,保留该miRNA。在进行统计分析之前,将不存在的阈值设置为22(log2对数标度中为4.5)。该水平是miRNA芯片实验中高于背景检测到的平均最小强度水平。MiRNA命名根据Sanger Center1的miRNA数据库。通过使用微阵列显著性分析(SAM)中的调整的t检验法来鉴定差异表达的miRNA2。SAM 2.0应用程序的表达的阈值差异设置为2、s0百分位数设置为0.05(缺省值)和排列的数目设置为100(缺省值)。此处使用的SAM Excel plug-in基于表达变化(相对于所有测量的标准差)计算各基因的评分。因为这是多重检验,因此进行排列以计算假发现率(FDR)或q-值。FDR小于5%和倍数变化大于2的MiRNA被考虑用于进一步的分析。将微阵列数据集储存在Array-Express(ebi.ac.uk/arrayexpress)中。
MiRNA qRT-PCR验证
按照制造商的说明书(Applied Biosystems,Foster City,CA),在Applied Biosystem Real-Time PCR仪上使用单管TaqMan miRNA测定来检测和定量成熟miRNA。用不变的let-7i(Applied Biosystems)进行标准化。在GeneAmp PCR 9700Thermocycler(Applied Biosystems)上进行所有RT反应,包括无模板对照和RT负对照。使用ABI Prism7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)定量基因表达水平。以一式三份进行比较实时PCR(包括无模板对照)。使用比较Ct法3计算相对表达。为了验证微阵列数据,我们使用Pearson相关和线性回归分析(SPSS软件包),使用12个患者中的42个miRNA测量值。这些函数检查每一对测量值(一个来自芯片,另一个来自qRT-PCR)以确定两个变量是否趋向于一致地变化,即来自芯片的较大的值(高表达)是否与来自qRT-PCR的较高的值(2ΔCt)相关。
其用途和定义的实例
除非另外指出,否则本发明的实施将使用在本领域技术人员的能力之内的药物学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见,例如,Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell eds.,Blackwell Scientific Publications);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)。
因此,本文中提供了用于进一步解释的定义,所述定义不应解释为限定性的。
冠词“a”和“an”在本文中是指一个或多于一个(即,至少一个)冠词的语法对象。例如,“an element”是指一个元素或多于一个的元素。
“标志物”和“生物标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比,其在组织或细胞中改变的表达水平与病症和/或疾病状态相关的基因和/或蛋白质和/或其功能性变体。
标志物的“正常”的表达水平是标志物在未患病症和/或疾病状态的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平,所述表达水平高于用于估量表达的测定的标准误,在某些实施方案中,至少2倍,在其他实施方案中,3、4、5或10倍于对照样品(例如,来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。
标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平,所述表达水平比对照样品(例如,来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍,在某些实施方案中低3、4、5或10倍。
试剂盒是包含至少一种试剂,例如用于特异性检测标志物的表达的探针的任何产品(例如,包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。
“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段;变异标志物蛋白和它们的片段;包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽;以及包含标志物或变异标志物蛋白,或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。
本文中所述的组合物、试剂盒和方法特别地具有下列非限定性用途:
评估受试者是否患有病症和/或疾病状态;
评估受试者的病症和/或疾病状态的分期;
评估受试者的病症和/或疾病状态的分级;
评估受试者的病症和/或疾病状态的性质;
评估受试者发生病症和/或疾病状态的可能性;
评估与受试者的病症和/或疾病状态相关的细胞的组织学类型;
制备可用于治疗受试者的病症和/或疾病状态的抗体、抗体片段或抗体衍生物;
评估病症和/或疾病状态在受试者的细胞中的存在;
评估一种或多种测试化合物抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效;
评估疗法抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效;
监控受试者的病症和/或疾病状态的进展;
选择抑制受试者的病症和/或疾病状态的组合物或疗法;
治疗患有病症和/或疾病状态的受试者;
抑制受试者的病症和/或疾病状态;
评估测试化合物的有害潜能;和
预防处于发生病症和/或疾病状态的风险中的受试者的病症和/或疾病状态的发作。
筛选方法
可产生动物模型以使能够筛选可用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。因此,该方法可用于鉴定用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。该方法包括对由本文所述的方法产生的动物模型施用候选试剂,和评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中的至少一种应答。如果至少一种应答在症状上减轻或在发作上延迟,则候选试剂是用于治疗或预防疾病的试剂。
候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologic agent)或可以是之前未知具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离,或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中,候选试剂是具有大于50且小于大约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂,包括但不限于:肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法,包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地,以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外,天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰,并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中,候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得,所述方法包括非限定性实例:生物文库法;空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries);需要解卷积(deconvolution)的合成文库法;“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法;和使用亲和层析选择的合成文库法。
在某些其他实施方案中,可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰,例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。
用于鉴定治疗受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound)/试剂。
候选试剂可以是上调或下调受试者中一个或多个病症和/或疾病状态应答途径的试剂。在某些实施方案中,候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。
用于治疗病症和/或疾病状态的方法
本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转病症和/或疾病状态应答的方法。在本文所述的方法中,对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂,所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的受试者和已具有至少一种这样的应答的受试者。
在前一种情况下,这样的治疗用于预防此类应答的发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下,这样的治疗用于减轻此类应答发生的程度,阻止它们进一步发展或逆转所述应答。
在某些实施方案中,干扰应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。
生物标志物的表达
可以以许多方式抑制标志物的表达,所述方式包括非限定性实例:可对疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地,可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸,以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理疾病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法,可筛选多种分子,特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子,以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对受试者提供如此鉴定的化合物以抑制受试者的疾病细胞。
任何标志物或标志物的组合,以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地,期望使用这样的标志物,对于所述标志物,疾病细胞中该标志物的表达水平与正常结肠系统细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于评估标志物的表达的方法的检测极限,但期望差异至少大于评估方法的标准误,在一些实施方案中,与正常组织中相同标志物的表达水平相比,至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍或更大的差异。
已公认,某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在体液样品中检测,因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案,所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人受试者收集。此外,用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如,抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。
为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白,在例如哺乳动物细胞例如人细胞系中表达标志物蛋白,收集细胞外液体,评估蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如,使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。
应理解,含有此类细胞的受试者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中,标志物的表达水平可通过评估样品中标志物的量(例如,绝对量或浓度)来评估。当然,可在评估样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如,核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
还应理解,可使标志物流出细胞进入例如呼吸系统、消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查痰、BAL、血清、血浆、尿、粪便等来检测流出的标志物。
组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达,所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如,可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白,或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即,包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如,使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体),所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。
标志物的表达可通过多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来评估。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。
在特定的实施方案中,标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如,放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如,缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如,单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来评估。
在另一个特定的实施方案中,标志物的表达通过下述来评估:从受试者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即,转录的多核苷酸),然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参照多核苷酸或其片段杂交。任选地,可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA;优选,其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以评估标志物的表达水平。备选地,可使用检测标志物的突变或变体(例如,单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测受试者中标志物的存在。
在相关实施方案中,将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如,至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如,可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置),那么可使用单个基质(例如,固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时,期望在严格杂交条件下进行杂交。
在某些实施方案中,可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(biomarker assay)。在不同的实施方案中,鉴定活性抗受试者的病症和/或疾病状态的试剂的方法可包括一个或多个下列步骤:a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品;b)从此类细胞制备提取物;c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合;和,d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shift assay)。
在某些实施方案中,测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定,例如,表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中,SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察,因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的105至10-6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此,SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。
因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测,因此期望标志物的表达水平显著大于用于评估至少一种正常细胞和受结肠癌影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。
应理解,通过使用一种或多种标志物对另外的受试者样品进行常规筛选,将了解某些标志物在不同类型的细胞,包括受试者的特定病症和/或疾病状态细胞中过表达。
此外,通过就标志物的表达评估更大数量的受试者样品,并且使从其获得样品的个体受试者的结果相互关联,还将确认某些标志物的改变的表达与受试者的病症和/或疾病状态强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。
当组合物、试剂盒和方法用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时,期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20%,在某些实施方案中,至少大约40%、60%或80%和基本上所有受试者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的病症和/或疾病状态)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10%的阳性预测值(在非限定性的实例中,外加大于80%的测定特异性)。
当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时,可在单个反应混合物(即,使用针对各个标志物的试剂,例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中,将受试者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非病症和/或非疾病样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中,相对于相应的正常水平,样品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示受试者患有病症和/或疾病状态。当使用多个标志物时,可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物;在某些实施方案中,可能期望使用更少的标志物。
为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于受试者样品中系统来源的细胞的情况下),期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非系统组织中表达)的标志物。
应认识到,组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生受试者的病症和/或疾病状态的风险的受试者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生病症和/或疾病的风险的受试者包括例如具有此类病症或疾病的家族史的受试者。
可以以多种方法评估正常人系统组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中,该正常表达水平通过下述来评估:评估一部分表现正常的系统细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的系统细胞中的表达水平相比较。备选地,特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时,可使用标志物的正常表达的群体平均值。在其他实施方案中,标志物的″正常″表达水平可通过评估标志物在从未受影响的受试者获得的受试者样品、在怀疑病症和/或疾病状态在受试者中发作之前从受试者获得的受试者样品、编档保存的受试者样品等中的表达来进行测定。
本文中还提供了用于评估病症和/或疾病状态细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从受试者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同,除了必要时,使组合物、试剂盒和方法适用于除了受试者样品外的样品。例如,当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时,可能必需在用于评估样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。
试剂盒和试剂
试剂盒可用于评估疾病细胞的存在(例如在样品例如受试者样品中)。试剂盒包括多种试剂,其各自能够特异性结合标志物核酸或蛋白质。用于与标志物蛋白结合的合适的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于与标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如,核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记的或未标记的)、不与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如,试剂盒可包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常结肠系统细胞样品、结肠癌相关疾病细胞样品等。
产生抗体的方法
本文中还提供了制备产生用于评估受试者是否患有病症和/或疾病状态的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中,合成或分离(例如通过从表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次,从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞,使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤,从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。
评估功效的方法
本文还提供了评估测试化合物抑制疾病细胞的功效的方法。如上所述,标志物的表达水平的差异与受试者的细胞的异常状态相关。虽然公认,某些标志物的表达水平的变化可能由此类细胞的异常状态引起,但同样公认,其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此,抑制受试者的病症和/或疾病状态的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即,所述标志物在正常细胞中的表达水平)的水平。
因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二结肠细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下,标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制相关疾病。细胞样品可以例如是获自受试者的正常细胞的单个样品的等分、获自受试者的正常细胞的混合样品、正常细胞系的细胞、获自受试者的相关疾病细胞的单个样品的等分、获自受试者的相关疾病细胞的混合样品、相关疾病细胞系的细胞等。
在一个实施方案中,样品是获自受试者的癌症相关疾病细胞,并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物,以鉴定可能最佳地抑制受试者的癌症相关疾病的化合物。
同样可将该方法用于评估疗法抑制受试者的相关疾病的有效性。在该方法中,评估一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法,另一个不经历疗法)中的表达水平。与评估测试化合物的有效性的方法一样,如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平,则疗法对于抑制癌症相关疾病是有效的。如上,如果来自选择的受试者的样品用于本方法,那么可在体外评估备选疗法以选择对于抑制受试者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。
如本文中所描述的,人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度,通过比较其表达水平被增强或抑制的标志物的数目,或通过比较两者来评估。在下列部分更详细地描述了各个方面。
分离的蛋白质和抗体
一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分,以及适合用作免疫原以产生抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中,天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中,含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外,可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白,或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此,基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30%、20%、10%或5%(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。
当重组产生蛋白质或其生物活性部分时,其也优选基本上不含培养基,即,培养基占据低于大约20%、10%或5%的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时,其优选基本上不含化学前体或其他化学药品,即,其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此,此类蛋白质制剂具有低于大约30%、20%、10%、5%(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。
标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽,其包含比全长蛋白质更少的氨基酸,并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常,生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外,其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备,并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中,有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如,至少大约40%,在某些实施方案中,50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
此外,标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。
预测医学
本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途,其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的,从而预防性治疗个体。因此,本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生特定病症和/或疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的,从而在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。
在另一个方面,方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。
另一方面涉及监控被施用以抑制病症和/或疾病或治疗或预防任何其他病症的试剂(例如,药物或其他化合物)在临床试验中对标志物的表达或活性的影响(例如,以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用)。
药物组合物
化合物可进行配制以用于在合适的药物载体中局部(topically)、局域(locally)或全身性施用。Remington′s PharmaceuticalSciences,第15版,E.W.Martin(Mark Publishing Company,1975),公开了常用载体和制备方法。化合物还可以封装在用于靶向细胞的合适的生物相容性微胶囊、微粒或微球体(由生物可降解或非生物可降解聚合物或蛋白质或脂质体形成)。此类系统对于本领域技术人员来说是熟知的并且可进行最优化以与合适的核酸一起使用。
在例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York;和Ausubel等人,1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York中描述了用于核酸递送的各种方法。此类核酸递送系统包括期望的核酸,例如但不限于,其以“裸露的”形式作为“裸露的”核酸,或配制于适合于递送的媒介物中例如与阳离子分子或形成脂质体的脂质的复合物中,或作为载体的成分或药物组合物的成分。可将核酸递送系统直接(例如通过将其与细胞接触)或间接(例如通过任何生物过程的作用)提供给细胞。
用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。需要时可使用常规药物载体(水性的、粉状的或基于油的)或增稠剂。
适合用于胃肠外施用例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液,其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质,以及水性和非水性无菌悬浮液、溶液或乳剂,其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的制剂可以以单位剂型、与加入的防腐剂一起存在,例如存在于安瓿中或存在于多剂量容器中。本领域技术人员可容易地确定制备和配制组合物的各种参数而无需过度的实验。可单独地或与其他合适的成分组合来使用化合物。
一般地,施用化合物(包括核酸)的方法在本领域内是熟知的。特别地,已用于核酸治疗剂的施用途径,和目前使用的制剂一起,为选择的核酸提供了优选的施用和配制途径,当然这将取决于因素例如特定的制剂、待治疗的受试者的状态的严重度和治疗功效所需的剂量。如本文中通常使用的,“有效量”是指在对其施用了制剂的受试者(与未接受所述化合物的匹配的受试者相比较)中能够治疗病症的一个或多个症状,逆转病症的一个或多个症状的进展,终止病症的一个或多个症状的进展或预防病症的一个或多个症状的发生的量。化合物的实际有效量可根据待使用的特定化合物或其组合、配制的特定组合物、施用模式,和个体的年龄、体重、状况,和待治疗的症状或病况的严重度而变化。
本领域技术人员已知的任何可接受的方法可用于给受试者施用制剂。取决于待治疗的病况,施用可以是局部的(即,至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。
药物基因组学
标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的,“药物基因组学标志物”是其表达水平与受试者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的受试者应答和更特别地受试者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过评估受试者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量,可选择最适合于受试者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。
监控临床试验
监控试剂(例如,药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选,而且还可用于临床试验。例如,可在接受结肠癌相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的有效性。
在一个非限定性实施方案中,本发明提供了用于监控利用试剂(例如,激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法,该方法包括步骤:
在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品;
检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平;
从受试者获得一个或多个施用后的样品;
检测标志物在施用后的样品中的表达水平;
将施用前的样品中标志物的表达水平与施用后的样品中标志物的表达水平相比较;和
相应地改变试剂至受试者的施用。
例如,在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量,从而需要增加剂量。相反地,减少的标志基因的表达可表明有效治疗,从而不需要改变剂量。
电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
如本文中所使用的,“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于:磁性存储介质,例如软盘、硬盘存储介质以及磁带;光学存储介质例如光盘;电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等;以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
如本文中所用的,术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备;网络,包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网;电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等;以及局域和分布式处理系统。
如本文中所使用的,“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。
许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质,可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如,文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物,可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如,本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。
因此,本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质,其中所述方法包括步骤:确定标志物的存在或不存在,并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性,和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况(pre-cancer-related disease condition)的特定治疗。
本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法,其中所述方法包括步骤:确定标志物的存在或不存在,并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有特定病症和/或疾病或具有对此类病症和/或疾病的易感性,和/或推荐用于此类疾病或疾病和/或这样的癌症相关疾病前状况的特定治疗。该方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。
本文中还提供了网络,用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对与标志物相关的病症和/或疾病的易感性的方法,所述方法包括步骤:接收与标志物相关的信息,接收与受试者相关的表型信息,从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息,并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个,确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还包括推荐用于病症和/或疾病或对其的易感性的特定治疗的步骤。
本文中还提供了用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性的商业方法,所述方法包括步骤:接收与标志物相关的信息,接收与受试者相关的表型信息,从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息,并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个,确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还可包括推荐用于其的特定治疗的步骤。
本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中,阵列可用于测定组织中基因的表达,从而确定阵列中基因的组织特异性。这样,可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。
除了此类定性测定外,本文中还提供了基因表达的定量。因此,不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此,可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此,可干扰一个组织,然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中,可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用,则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定,从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地,即使在单个细胞类型中,可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此,可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。
在另一个实施方案中,阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的,这可发生在各种生物学背景(例如病症和/或疾病的发生,其进展)和过程(例如与其相关的细胞转化)中。
阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶,那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。
阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。
替代标志物(Surrogate Marker)
标志物可用作一种或多种病症或疾病状态或导致其的状况的替代标志物。如本文中所使用的,“替代标志物”是与疾病或病症的不存在或存在,或与疾病或病症的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此,此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或病症中是否有效。当疾病状态或病症的存在或程度难以通过标准方法来评估,或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病进展时,替代标志物是特别有用的。
标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的,“药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或病症无关;因此,标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如,药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度,因为标志物在该组织中表达或转录,或者不表达或转录与药物的水平相关。这样,药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地,药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关,这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。
药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用,特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达,因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样,标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测;例如,通过使用本文中描述的方法,可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统,或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外,药效标志物的使用可提供由于药物治疗超出可直接观察的范围而产生的风险的基于机制的预测。
用于检测的方案
检测病症和/或疾病的方法可包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试者的生物学样品中的表达水平和将该水平与对照生物学样品中标志物基因的水平相比较。
当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如,比对照中的表达水平更高或更低)时,受试者被判断为患有病症和/或疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时,受试者不可能患有所述病症和/或疾病。
可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值,以比较表达水平。例如,可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如,在某些实施方案中,容许的范围基于标准值采用±2S.D.。在测定标准值后,可通过只测量来自受试者的生物学样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。
标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此,基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较,进行检测病症和/或疾病的一个方法。
可根据各种基因分析方法在病症和/或疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地,可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术,或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。
可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。
此外,应理解,高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与结肠癌相关疾病相关的、具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中,即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
也应理解,标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此,除非明确指出,否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。
同样,应理解,“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因,其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。
含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此,“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
此外,“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列,而且还指具有在某些情况下至少40%,在某些情况下50%,在某些情况下60%,在某些情况下70%,在某些情况下80%,在某些情况下90%和在某些情况下95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针,或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时,多核苷酸通常包含15bp至100bp,在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时,DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链),或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时,3′区域必须与标志物基因互补,而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。
“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样,通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中,术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外,可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法,可更加定量地分析标志物基因的表达。
在PCR基因扩增监控法中,将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时,荧光染料与猝灭剂彼此分离,从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品,可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样,本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测结肠癌相关疾病的方法。在下文中,标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法,可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如,Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。
用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样,为了检测标志物蛋白,可适当地标记这样的抗体。备选地,可不标记抗体,而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地,此类检测方法可包括ELISA法。
可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体,将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株,培养所述转化株以表达重组蛋白,然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地,可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽,以用作免疫原。
此外,可通过将不仅生物学样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性用作指标来进行结肠癌相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物学活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。
即使在常规检测中受试者未被诊断为患有病症和/或疾病(尽管症状暗示此类疾病),这样的受试者是否患有病症和/或疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。
更特别地,在某些实施方案中,当标志物基因是本文描述的基因之一时,其症状至少暗示对病症和/或疾病的易感性的受试者中,标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由所述病症和/或疾病引起。
此外,检测可用于确定病症和/或疾病是否在受试者中得到改善。换句话说,本文中描述的方法可用于判断用于所述病症和/或疾病的治疗的治疗效果。此外,当标志物基因是本文描述的基因之一时,已被诊断为患有所述病症和/或疾病的受试者中,标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。
还可基于表达水平的差异测定病症和/或疾病的严重度和/或对其的易感性。例如,当标志物基因是本文描述的基因之一时,标志物基因的表达水平的增加程度与病症和/或疾病的存在和/或严重度相关。
动物模型
还可产生病症和/或疾病的动物模型,其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的,“功能上等同的基因”通常是编码具有与标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物,其是动物本身固有的。
动物模型可用于检测由于病症和/或疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中,动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。
动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生动物模型。在另一个实施方案中,方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生动物模型。还应理解,在某些其他实施方案中,可过表达标志物,以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中,动物模型可通过导入选自此类基因的基因,或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。在另一个实施方案中,病症和/或疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。蛋白质的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。
动物模型可用于阐明病症和/或疾病背后的机制,还可用于检测通过筛选获得的化合物的安全性。例如,当动物模型产生特定病症和/或疾病的症状时,或当牵涉某种病症和/或疾病的测量值在动物中改变时,可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。
如本文中所使用的,表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种:人工表达作为外源基因导入的标志物基因;受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强;或作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制。
如本文中所用的,表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的情况,或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的情况。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外,翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常情况中的活性相比较来测定。
也在预期的范围内的是:动物模型可包括转基因动物,包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物;标志物基因敲除动物;和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物,在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而得到增强或抑制,或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。
表达的实例
此外,标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样,被突变的氨基酸的数目不受特别限制,只要活性得到保持即可。通常,其在50个氨基酸以内,在某些非限定性实施方案中,在30个氨基酸以内,在10个氨基酸以内,或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点,只要活性得到保持即可。
在另一个方面,本文中提供了治疗特定病症和/或疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得结肠癌相关疾病的治疗剂。
应理解,表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面,表述“减少基因的表达水平的化合物”,如本文中所用的,是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。
在特定的方面,可在体内或体外进行筛选用于病症和/或疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行:
对动物受试者施用候选化合物;
测量动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平;或
选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。
在另一个方面,本文中提供了这样的方法,其通过将动物受试者与候选化合物接触,然后监控化合物对来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外,基于评估,可通过筛选来选择药剂的候选化合物。
本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明,但各种改变、修饰和改进是显然的,且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解,本发明可进行适当地改变以适合于实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。
某些核碱基(Nucleobase)序列
本文中描述的成熟miRNA和它们的相应的茎-环序列的核碱基序列是见于miRBase(见于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中的序列。miRBase序列数据库中的条目(entry)代表预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)和关于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。数据库中miRNA的茎-环序列严格说来不是前体miRNA(pre-miRNA),并且在一些情况下可包括pre-miRNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。本文中描述的miRNA核碱基序列包括miRNA的任何形式,包括miRBase序列数据库的Release 10.0中描述的序列和miRBase序列数据库的任何更早的Release中描述的序列。序列数据库释放可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库释放可导致成熟miRNA序列的变化。可包括此类修饰的寡核苷酸的化合物可与本文中描述的miRNA的任何核碱基序列形式互补。
应理解,本文中所示的任何核碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。还应理解,包含U的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘U’的位点上‘U’被‘T’置换的相同核碱基序列。反过来,应理解,包含T的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘T’的位点上‘T’被‘U’置换的相同核碱基序列。
在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱基序列,这意味着修饰的寡核苷酸的核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域中与miRNA或其前体的互补序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一,或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此,在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸的核碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可具有一个或多个错配的碱基对,并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体100%互补的核碱基序列。在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸的核碱基序列具有对miRNA的全长互补性。
miRNA(miR)疗法
在一些实施方案中,本发明提供了抑制受试者的一个或多个基因的表达的微RNA。微RNA表达特征谱可用作新型癌症生物标志物。
本文中包括使用一个或多个MiR抑制基因表达和/或活性的方法。在一些实施方案中,miR抑制蛋白质的表达。在其他实施方案中,miRNA抑制基因活性(例如,细胞侵袭活性)。
可通过本领域技术人员熟知的许多种技术从细胞或组织分离,重组产生或体外合成miRNA。在一个实施方案中,从细胞或组织分离miRNA。用于从细胞或组织分离miRNA的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如,可使用来自Ambion,Inc.的mirVana miRNA分离试剂盒从总RNA分离miRNA。另一种技术利用flashIPAGETM FractionatorSystem(Ambion,Inc.)来进行小核酸的PAGE纯化。
关于miRNA治疗剂的使用,本领域技术人员理解,体内施用的核酸被吸收和分配至细胞和组织。
可以以合适的方式递送核酸,所述方式使得能够组织特异性地吸收试剂和/或核酸递送系统。本文中描述的试剂可通过任何已知的常规疗法来补充治疗状况,所述疗法包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂的施用。可一起或相继使用两个或多个组合的化合物。
本发明的某些实施方案提供了包含(a)一种或多种核酸或小分子化合物以及(b)一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。
另外的有用的定义
“受试者”是指经选择接受治疗或疗法的人或非人动物。“怀疑患有……的受试者”是指展示病症、疾病或病况的一个或多个临床指标的受试者。
“预防”或“防止”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展,持续一段时间,包括数周、数月或数年。“治疗”或“医治”是指一种或多种用于治愈或改善病症和/或疾病的特定方法的应用。在某些实施方案中,特定方法是一种或多种药剂的施用。
“改善”是指减轻病况或疾病的至少一个指标的严重度。在某些实施方案中,改善包括病况或疾病的一个或多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重度可通过对于本领域技术人员来说是已知的主观或客观量度来测定。
“有此需要的受试者”是指确定为需要治疗或疗法的受试者。
“施用”是指给受试者提供药剂或组合物,包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
“胃肠外施用”是指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用和颅内施用。“皮下施用”是指紧在皮肤下方施用。
“改善功能”是指使功能向正常参数改变。在某些实施方案中,通过测量在受试者的体液中发现的分子评估功能。“药物组合物”是指适合于给个体施用的物质的混合物,其包括药剂。例如,药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水性溶液。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。“靶向”是指与靶核酸杂交并且诱导期望的作用的核碱基序列的设计和选择的过程。“被靶向”是指具有核碱基序列,所述序列允许与靶核酸杂交以诱导期望的作用。在某些实施方案中,期望的作用是靶核酸的减少。
“调控”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中,调控是指基因表达的增加。在某些实施方案中,调控是指基因表达的减少。
“表达”是指藉以将基因的编码信息转变成存在于细胞中和在细胞中运转的结构的任何功能和步骤。
“区域”是指核酸内一部分连接的核苷。在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的区域互补的核碱基序列。例如,在某些此类实施方案中,修饰的寡核苷酸与miRNA茎-环序列的区域互补。在某些此类实施方案中,修饰的寡核苷酸与miRNA序列的区域100%同一。
“区段”是指更小的区域或区域的亚部分。
“核碱基序列”是指以5′至3′方向,不依赖于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”是指核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键非共价配对的能力。“互补”是指第一核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域内与第二核碱基序列的互补序列至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一,或100%同一,或两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中,具有与miRNA或其前体100%互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸可以在修饰的寡核苷酸的整个长度上不与miRNA或其前体100%互补。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸之间的核碱基配对能力。“全长互补性”是指第一核酸的各核碱基能够与第二核酸中相应的位点上的各核碱基配对。例如,在某些实施方案中,其中各核碱基与miRNA中的核碱基具有互补性的修饰的寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
“百分比互补性”是指核酸中互补核碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基数目。在某些实施方案中,修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基的数目。
“百分比结合的区域”是指与寡核苷酸区域互补的区域的百分比。通过将与寡核苷酸互补的靶区域的核碱基的数目除以靶区域的长度来计算百分比结合的区域。在某些实施方案中,百分比结合的区域是至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%。
“百分比同一性”是指第一核酸中与第二核酸相应的位点上的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。
本文中使用的“大体上同一的”可以指第一与第二核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一,或100%同一。
“杂交”是指通过核碱基的互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”是指不能够与第二核酸的相应的位点上的核碱基配对的第一核酸的核碱基。
“非互补核碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核碱基。
“同一的”是指具有相同核碱基序列。
“miRNA”或“miR”是指长度在18至25个核碱基之间的非编码RNA,其与编码RNA杂交并且调控编码RNA的表达。在某些实施方案中,miRNA是Dicer切割pre-miRNA的产物。miRNA的实例见于称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“Pre-miRNA”或“pre-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA,其包含miRNA。在某些实施方案中,pre-miRNA是称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri-miR的产物。
“茎-环序列”是指具有发夹结构并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎-环序列可重叠。茎-环序列的实例可见于称为miRBase的miRNA数据库(microrna.sanger.ac.uk)。
“miRNA前体”是指源自基因组DNA并且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码性结构化RNA的转录物。例如,在某些实施方案中,miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中,miRNA前体是pri-miRNA。
“反义化合物”是指具有允许与靶核酸杂交的核碱基序列的化合物。在某些实施方案中,反义化合物是具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物,各核苷可以彼此独立地被修饰或不被修饰。“天然发生的核苷间连接”是指核苷之间的3′至5′磷酸二酯连接。“天然核碱基”是指相对于其天然发生的形式未被修饰的核碱基。“miR拮抗剂”是指经设计用于干扰或抑制miRNA的活性的试剂。在某些实施方案中,miR拮抗剂包括靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中,miR拮抗剂包括具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中,miR拮抗剂包括干扰或抑制miRNA的活性的小分子等。
本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案,是示例性的,并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说,同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
应理解,虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开,但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化,并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。
虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明,但本领域技术人员应当理解,可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外,可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开案和其他材料通过引用合并入本文,并且为方便起见提供于下列参考书目中。
本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。关于日期的所有声明和关于这些文献的内容的所有陈述基于申请人可获得的信息,并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
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Claims (70)
1.用于不依赖于其他因素而预测患有急性髓性白血病(AML)的患者的结果的miRNA特征,其包括:与正常CD34+祖细胞相比较不同的miRNA表达特征,其中所述特征包括与CD34+正常细胞相比较,AML样品中一个或多个下调的miRNA并且无上调的miRNA,所述miRNA选自图5-表2中所列的miR:hsa-miR-126、hsa-miR-130a、hsa-miR-135、hsa-miR-93、hsa-miR-146、hsa-miR-106b、hsa-miR-224、hsa-miR-125a、hsa-miR-92、hsa-miR-106a、hsa-miR-95、hsa-miR-155、hsa-miR-25、hsa-miR-96、hsa-miR-124a、hsa-miR-18、hsa-miR-20、hsa-let-7d、hsa-miR-26a、hsa-miR-222、hsa-miR-101、hsa-miR-338、hs a-miR-371、hsa-miR-199b、hsa-miR-29b和hsa-miR-301。
2.权利要求1的mi RNA特征,其中所述miR包括下列中的一个或多个:miR-126、miR-130a、miR-93、miR-146、miR-106b和miR-125a。
3.miRNA特征,其用于鉴定患有多系发育不良的患者,包括筛选在患有多系发育不良的AML中下调的miR-181a。
4.miRNA特征,其用于确定诊断受试者是否患有或将发生AML,所述诊断包括检查来自受试者的样品和确定miR的表达与高白细胞计数是否存在正相关:如图8-表S2中所示,包括下列中的一个或多个:hsa-miR-155、hsa-miR-30e、hsa-miR-23b、hsa-miR-181b、hsa-miR-221、hsa-miR-29b、hsa-miR-95、hsa-miR-128b、hsa-miR-27a、hsa-miR-181c、hsa-miR-921、hsa-miR-181a、hsa-miR-23a、hsa-miR-214、hsa-miR-30b、hsa-miR-30c、hsa-miR-26b、hsa-miR-21和hsa-miR-222。
5.miRNA特征,其用于确定诊断受试者是否患有或将发生AML,所述诊断包括检查来自受试者的样品和确定miR的表达与高骨髓(BM)母细胞是否存在正相关:如图8-表S2中所示,包括下列中的一个或多个:hsa-miR-30b、hsa-miR-30c、hsa-miR-192、hsa-miR-181a、hsa-miR-155、hsa-let-7a-2、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c、hsa-miR-219、hsa-miR-214和hsa-miR-26a。
6.miRNA特征,其用于确定诊断受试者是否患有或将发生AML,所述诊断包括检查来自受试者的样品和确定miR的表达与高骨髓(BM)母细胞是否存在正相关:如图8,表S2中所示,包括下列中的一个或多个:hsa-miR-133b、hsa-miR-214、hsa-miR-25、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-220、hsa-miR-92、hsa-miR-184、hsa-miR-92、hsa-miR-124a、hsa-miR-100、hsa-miR-181b、hsa-miR-135、hsa-miR-155、hsa-miR-222和hsa-miR-181c。
7.用于确定诊断受试者是否患有或将发生AML的方法,其包括检查来自受试者的样品和确定是否存在图8-表S2中所列的一个或多个miR的正相关,所述正相关包括下列中的一个或多个:
miR-155和miR-181b与受试者的白细胞计数(对于WBC)、外周和骨髓母细胞百分比;
miR-30b和miR-30c与受试者的白细胞计数(对于WBC)和骨髓母细胞百分比,和
miR-25与受试者的白细胞计数循环母细胞百分比。
8.与确定的11q23平衡易位的细胞遗传学亚组相关的miRNA特征;包括选自图9-表S3中所列的miR:miR-326、miR-219、miR-194、miR-301、miR-324、miR-339、miR-99b和miR-328的一个或多个miR;以及选自下列的一个或多个下调的miR:miR-34b、miR-15a、miR-29a、miR-29c、miR-372、miR-30a、miR-29b、miR-30e、miR-196a、let-7f、miR-102、miR-331、miR-299和miR-193。
9.与确定的t(6;11)11q23平衡易位的细胞遗传学亚组相关的miRNA特征;包括选自图10-表S4中所列的miR:hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-128b、hsa-miR-130b、hsa-miR-27a、hsa-miR-99、hsa-miR-26b、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-130a、hsa-miR-24、hsa-miR-30c、hsa-miR-103、hsa-miR-192、hsa-miR-1和hsa-miR-221的一个或多个miR。
10.与确定的8号染色体三体的细胞遗传学亚组相关的miRNA特征;包括选自图11-表S 5所列的miR:hsa-miR-337、hsa-miR-184、hsa-miR-302b、hsa-miR-105、hsa-let-7d、hsa-miR-153、hsa-miR-124a*、hsa-miR-215、hsa-miR-1、hsa-miR-194、hsa-miR-29c、hsa-miR-208、hsa-miR-199a、hsa-miR-24-1、hsa-miR-302c、hsa-miR-367、hsa-miR-200a、hsa-miR-183、hsa-miR-199b、hsa-miR-143、hsa-miR-96、hsa-miR-29b、hsa-miR-202、hsa-miR-340、hsa-miR-102、hsa-miR-191、hsa-let-7i、hsa-miR-30d*、hsa-miR-9-3、hsa-miR-203、hsa-miR-302a、hsa-miR-199a、hsa-miR-206、hsa-miR-197、hsa-miR-198、hsa-miR-372、hsa-miR-182、hsa-miR-193、hsa-miR-325、hsa-miR-192、hsa-miR-204和hsa-miR-299的一个或多个miR。
11.包含图12-表S6中所列的miR的NK-AML的特征,其包括上调的miRNA(miR-10a、miR-10b、miR-26a、miR-30c、let-7a-2、miR-16-2、miR-21、miR-181b、miR-368和miR-192),和下调的miRNA(miR-126、miR-203、miR-200c、miR-182、miR-204、miR-196b、miR-193、miR-191、miR-199a、miR-194、miR-183、miR-299和miR-145)。
12.与AML患者中确定的FLT3-ITD突变的细胞遗传学亚组相关的miRNA特征,其包括选自下列的一个或多个miR:在AML患者中在FLT3-ITD突变中过表达的miR-155:miR-155、miR-10a和miR-10b。
13.与新近诊断的AML患者中的结果,总体存活(OS)和/或无事件存活(EFS)相关的miRNA特征,包括选自下列的一个或多个miR:miR-199a、miR-199b、miR-191、miR-25和miR-20a,其中此类过表达表示不利的OS。
14.权利要求13的特征,其中miR-199a和miR-191与OS和/或EFS相关。
15.与具有其他细胞遗传学异常包括正常核型的其他经治疗的AML患者相比较在具有t(11q23)的经治疗的患者中差异表达的miR的miRNA特征,包括一个或多个图14-表S8中所示的miR。
16.权利要求15的特征,其中包括一个或多个图14-表S8中所示的上调的miR:hsa-miR-326、hsa-miR-330、hsa-miR-99b、hsa-miR-194、hsa-miR-133b、hsa-miR-339、hsa-miR-138、hsa-miR-128a、hsa-miR-219、hsa-miR-129-2、hsa-miR-138、hsa-miR-210、hsa-miR-301、hsa-miR-200b、hsa-miR-328和hsa-miR-324。
17.权利要求15的特征,其包括一个或多个图14-表S8中所示的下调的miR:hsa-miR-29c、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-15a、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-let-7d、hsa-miR-21、hsa-miR-29b、hsa-miR-370、hsa-miR-34b、hsa-miR-102、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-195、hsa-let-7f、hsa-miR-203-prec、hsa-miR-181c、hsa-miR-19b、hsa-miR-194-1、hsa-miR-331-prec、hsa-miR-182*、hsa-miR-183-prec、hsa-miR-16、hsa-miR-302c*、hsa-miR-299-3p和hsa-miR-30e。
18.与具有异常核型的经治疗的AML患者相比较在具有正常核型的经治疗的AML患者中差异表达的miR的miRNA特征,其包括一个或多个图15-表S9中显示的miR。
19.权利要求18的特征,其包括一个或多个图15-表S9中显示的上调的miR:hsa-miR-21、hsa-let-7d、hsa-miR-30c、hsa-miR-15b、hsa-miR-219、hsa-miR-302b*、hsa-miR-15a、hsa-miR-34b、hsa-miR-16-1、hsa-miR-16-2、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-140、hsa-miR-15a、hsa-let-7a-2、hsa-miR-30b、hsa-miR-222、hsa-miR-10b、hsa-miR-26a、hsa-miR-10a、hsa-miR-195、hsa-let-7a和hsa-miR-181b。
20.权利要求18的特征,其包括一个或多个图15-表S9中显示的下调的miR:hsa-miR-193a、hsa-miR-204、hsa-miR-196a、hsa-miR-205、hsa-miR-200b、hsa-miR-198、hsa-miR-212、hsa-miR-188、hsa-miR-200c、hsa-miR-194、hsa-miR-206、hsa-miR-203、hsa-miR-204-prec、hsa-miR-126、hsa-miR-182*、hsa-miR-199a、hsa-miR-183、hsa-miR-30b、hsa-miR-145、hsa-miR-187、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-128a和hsa-miR-143。
21.相对于具有FLT3-wt的经治疗的AML患者在具有FLT3-ITD突变的经治疗的AML患者中差异表达的miR的miRNA特征,其包括一个或多个图16-表S10中所示的miR:has-miR-19a、has-miR-155、has-miR-10a、has-miR-99b和has-miR-192b。
22.将前述权利要求的任一项的特征用于患有或可能发生AML的受试者的诊断、治疗或预后的确定中的一个或多个的方法。
23.用于不依赖于其他因素而预测患有急性髓性白血病(AML)的患者的结果的方法,其包括:确定与正常细胞相比较,miRNA表达的独特特征,其中所述特征包括一个或多个前述权利要求的任一项的miRNA特征。
24.一种方法,其用于:i)诊断受试者是否患有急性髓性白血病(AML)或处于发生急性髓性白血病(AML)的风险中,ii)确定这样的受试者的预后,和/或iii)治疗这样的受试者,包括
测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平,其中所述生物标志物选自一个或多个前述权利要求的AML特征,和
其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平,测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症或处于发生所述病症的风险中。
25.权利要求24的方法,其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
26.权利要求24的方法,其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
27.影响白血病中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法,其包括使有此需要的受试者中一个或多个微RNA失调。
28.权利要求27的方法,其包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
29.微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析的用途,其用于鉴定人白血病中发生的微RNA功能的改变。
30.确定患有急性髓性白血病(AML)的受试者的预后的方法,其包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平,其中:
所述生物标志物与此类癌症中不利的预后相关;和
相对于对照样品中相应的生物标志物的水平,测试样品中所述至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
31.一种方法,其确定患有急性髓性白血病(AML)的受试者的预后,包括诊断受试者是否患有AML或处于发生AML的风险中,所述方法包括:
从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸;
将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱;和
将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较,其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有所述AML或处于发生所述AML的风险中。
32.权利要求31的方法,其中相对于从对照样品产生的信号,至少一个miRNA的信号下调,和/或其中相对于从对照样品产生的信号,至少一个miRNA的信号上调。
33.权利要求32的方法,其中选自下列中所列的miR的至少一个生物标志物的信号的改变表示受试者患有具有不良预后的AML癌症或处于发生所述癌症的风险中:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10。
34.用于调控白血病细胞中的蛋白质表达的方法,其包括调节白血病细胞中图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的miR的一个或多个的表达。
35.用于调控白血病细胞中一个或多个蛋白质的表达水平的组合物,所述组合物包含下列中的一个或多个:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的miR或其功能性变体。
36.一种组合物,其包含图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的miR的一个或多个反义miR,用于在有此需要的受试者中增加白血病细胞中的蛋白质水平。
37.治疗患有白血病的受试者的白血病的方法,在所述白血病中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调,所述方法包括:
当所述至少一个生物标志物在癌细胞中下调时,给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物,或其分离的变体或生物学活性片段,以便受试者中癌细胞的增殖被抑制;或
当所述至少一个生物标志物在癌细胞中上调时,给受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一个生物标志物表达的化合物,以便受试者中癌细胞的增殖被抑制。
38.治疗受试者的白血病的方法,其包括:
测定相对于对照细胞,白血病细胞中至少一个生物标志物的量;其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体,和
通过下列来改变白血病细胞中表达的生物标志物的量:
如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量,给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物;或
如果癌细胞中表达的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量,给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一个生物标志物表达的化合物。
39.用于治疗白血病的药物组合物,其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体,其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
40.前述权利要求的药物组合物;其包含至少一种miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
41.鉴定抗白血病试剂的方法,其包括给细胞提供测试试剂和测量至少一个与白血病细胞中减少的表达水平相关的生物标志物的水平,其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体,
其中相对于对照细胞,细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗白血病试剂。
42.鉴定抗白血病试剂的方法,其包括给细胞提供测试试剂和测量与白血病细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平,其中相对于对照细胞,细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗癌症试剂,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
43.评估疗法预防、诊断和/或治疗白血病相关疾病的有效性的方法,其包括:
使动物经历其有效性待评估的疗法,和
通过评估至少一个生物标志物来测定被测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性的水平,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
44.前述权利要求的方法,其中候选治疗剂包括下列中的一种或多种:药物组合物、营养组合物和顺势疗法组合物。
45.前述权利要求的方法,其中被评估的疗法用于人受试者。
46.一种制品,其包含至少一种捕获试剂,所述捕获试剂结合包含至少一个生物标志物的白血病相关疾病的标志物,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
47.用于筛选治疗白血病相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒,其中所述试剂盒包括:至少一个生物标志物的一个或多个试剂和表达至少一个生物标志物的细胞,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
48.前述权利要求的试剂盒,其中使用包含特异性结合至少一个生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
49.干扰白血病相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途,所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重度,其中所述试剂包含至少一个生物标志物,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
50.用于治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的白血病相关疾病并发症的严重度的方法,其包括:给个体施用干扰至少白血病相关疾病应答级联的试剂,其中所述试剂包含至少一个生物标志物,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
51.干扰至少白血病相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途,所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的白血病相关疾病并发症的严重度,其中所述试剂包含至少一个生物标志物,
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体。
52.一种组合物,其包含:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂。
53.治疗有此需要的受试者的急性髓性白血病(AML)的方法,其包括给受试者施用治疗有效量的前述权利要求的组合物。
54.前述权利要求的方法,其中预防性施用所述组合物。
55.前述权利要求的方法,其中所述组合物的施用延迟了AML的一个或多个症状的发作。
56.前述权利要求的方法,其中所述组合物的施用抑制了AML的发展。
57.前述权利要求的方法,其中所述组合物的施用抑制了AML。
58.用于检测生物学样品中白血病的存在的方法,该方法包括:
将怀疑包含白血病的生物学样品暴露于用于其的标志物;
其中所述生物标志物选自:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体,和
如果有的话,检测样品中所述标志物的存在或不存在。
59.前述权利要求的方法,其中所述生物标志物包括可检测的标记。
60.前述权利要求的方法,其还包括将来自受试者的生物学样品中生物标志物的量与来自正常受试者的相应的生物学样品中生物标志物的量相比较。
61.前述权利要求的方法,其还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在受试者中是随时间增加还是减少。
62.治疗受试者的急性髓性白血病(AML)的方法,该方法包括:白血病受体激动剂。
63.前述权利要求的方法,其中所述受体激动剂是:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂。
64.制造用于治疗急性髓性白血病的药物的用途,所述药物包含选自下列的核酸分子:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的miR或其功能性变体、来源于其的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
65.前述权利要求的用途,其中所述药物包含核酸分子,所述核酸分子提供选自下列的序列:图5-表2、图8-表S2、图9-表S3、图10-表S4、图11-表S5、图12-表S6、图14-表S8、图15-表S9和图16-表S10中所列的一个或多个miR或其功能性变体、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
66.鉴定诱导急性髓性白血病(AML)细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法,该方法包括步骤:
培养来源于AML细胞的细胞,
向细胞系的培养基中加入至少一种化合物,
分析步骤(i)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化,和
鉴定诱导步骤(i)与(ii)之间miR的表达水平的变化的化合物或化合物的组合。
67.前述权利要求的方法,其中步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
68.前述权利要求的方法,其中步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
69.前述权利要求的方法,其中步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
70.前述权利要求的方法,其中所述化合物是治疗癌症的治疗剂。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110406 |