JP2015501843A - miR−21およびmiR−29a、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願への相互参照
[0001] この出願は2011年5月9日に出願された米国仮出願第61/644,980号の、および2011年12月13日に出願された米国仮出願第61/569,862号の利益を主張し、その開示を全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
[0002] この発明は、国立衛生研究所により与えられたR01 CA135030およびR01 CA124541の下での米国政府の経済的支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
[0003] この出願は、MPEP§1730 II.B.2(a)(A)において認可され、示されているように、USPTO EFS−WEBサーバーを介して電子出願されており、この電子出願には電子的に提出された配列(SEQ ID)リストが含まれる。この配列リストの全内容を、全ての目的に関して、参照により本明細書に援用する。その配列リストは、2012年12月11日に作成された以下:604_53483_SEQ_LIST_2012−066.txtのような電子出願された.txtファイル上で同定され、大きさは3,171バイトである。
[00120] どのmiRNAが、腫瘍が分泌したエキソソーム中に存在するのかを同定するため、エキソソームをA−549およびSK−MES肺がん細胞株の上清から単離した。第1に、その精製された上清のエキソソーム画分を2つの既知のエキソソームマーカーであるCD9およびCD63における濃縮に関して評価した(図11A)。NanoString分析を実施することにより、9種類のmiRNA(miR−16、−21、−27b、−29a、−133a、−193a−3p、−544、−563、および−1283)が両方の細胞株由来のエキソソーム中に50コードカウントより高い発現レベルで存在することが観察された(図1A)。
[00140] 細胞培養、形質移入、および処置
[00141] 全ての細胞株は別途示さない限りアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購入した。ヒトHEK−293細胞は標準的な条件を用いて維持し、10%(体積/体積)FBSを添加したDMEM(Gibco)中で増殖させた。ヒトHEKBlue−TLR7およびTLR8 293細胞(Invivogen)(それぞれTLR7−HEK−293またはTLR8−HEK−293として示す)は10%(体積/体積)FBS、Normocin(50μg/mL)、ブラストサイジン(10μg/mL)、およびZeocin(100μg/mL)(Invivogen)を添加したDMEM中で培養した。
[00148] HEK−293細胞を形質移入の24時間前に60mmプレート上に蒔き、50%コンフルエンスまで増殖させた。次いでそれらに1μgのGFP−TLR8をコードするプラスミド(Origene)を用いて形質移入した。48時間後、細胞を上記のようにCy−5蛍光体にコンジュゲートされた、図中の成熟miRNAオリゴで処理し、PBSで4回洗浄し、PBS中で1:25,000希釈したLysoTracker青色DND−22(Invitrogen)と共に15分間保温した。
[00152] 1.それぞれのレーンに関して、全ての陰性対照の計数の平均値を計算した。
[00180] NF−κB活性をQUANTI−Blueアッセイ(Invivogen)により評価した。HEK−Blue−TLR7およびTLR8 293細胞はそれぞれのTLRの刺激後のNF−κBの活性化の検証を可能にする。これらの細胞株は両方とも、TLR7および8遺伝子ならびに5個のNF−κBおよびAP−1結合部位に融合したIFN−α最小プロモーターの制御下の最適化された分泌型胚性アルカリホスファターゼレポーター遺伝子(SEAP)のHEK−293細胞中への同時形質移入により得られた。TLR7または8リガンドによる刺激はNF−κBおよびAP−1を活性化し、それはSEAPの産生を誘導する。SEAPのレベルは、アルカリホスファターゼの存在下で紫/青に変わる検出媒体であるQUANTI−Blueにより容易に決定することができる。処理されたTLR7−HEK−293およびTLR8−HEK−293細胞に由来する上清を14,000gにおいて15分間で回収して破壊片を排除し;次いで20μlを96ウェルプレート中に移し、180μlのQUANTI−Blue溶液(Invivogen)に添加した。次いでそのプレートを37℃で1〜3時間インキュベートし、SEAPのレベルをそのプレートを分光光度計(SpectraMax,Molecular Devices)で620〜655nmにおいて読み取ることにより決定した。
Claims (66)
- 少なくとも1個のがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることならびに転移を阻害することを含む、少なくとも1個のがん細胞の転移を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項1に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項1に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項1に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1個のTLRを発現しているがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることならびにTLRに媒介される転移促進反応を阻害することを含む、少なくとも1個のがん細胞のTLRに媒介される転移促進反応を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項6に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項6に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項6に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項6に記載の方法。
- 発現される前記TLRがTLR7またはTLR8である、請求項6に記載の方法。
- 少なくとも1個のがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることならびに腫瘍増殖を阻害することを含む、少なくとも1個のがん細胞の腫瘍増殖を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項12に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項12に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項12に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項12に記載の方法。
- miR−21およびmiR−29aを発現している少なくとも1個のがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させること、ならびにmiR−21およびmiR−29aのtoll様受容体の活性化作用を阻害することを含む、少なくとも1個のmiR−21およびmiR−29aを発現しているがん細胞においてmiR−21およびmiR−29aのtoll様受容体の活性化作用を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項17に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項17に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項17に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項17に記載の方法。
- 少なくとも1個のがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることを含む、少なくとも1個のがん細胞において転移を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項22に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項22に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項22に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項22に記載の方法。
- 少なくとも1種類の医薬的に許容できるキャリヤーまたは賦形剤中に少なくとも1種類のロックド核酸anti−21阻害剤および少なくとも1種類のロックド核酸anti−29a阻害剤を含む物質の組成物。
- さらに追加の化学療法化合物を含む、請求項27に記載の組成物。
- 組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象においてがん転移を改善するための方法。
- 請求項27に記載の組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において全生存時間を増大させるための方法。
- 請求項27に記載の組成物をがんを有する対象に投与することを含む、がんを有する対象において腫瘍の多数性を減少させるための方法。
- 少なくとも1個のがん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることを含む、少なくとも1個のがん細胞の炎症マーカーの発現を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項32に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項32に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項32に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項32に記載の方法。
- 少なくとも1個の肺がん細胞においてmiR−21および/またはmiR−29aのレベルを減少させることを含む、少なくとも1個のがん細胞の肺腫瘍の多数性を阻害するための方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを遺伝子療法、小分子療法、または生物学的療法からなる群から選択される手段により減少させる、請求項37に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aの投与により減少させる、請求項37に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aを少なくとも1種類のエキソソーム阻害剤の投与により減少させる、請求項37に記載の方法。
- miR−21および/またはmiR−29aをロックド核酸anti−miR−21阻害剤および/またはロックド核酸anti−miR−29a阻害剤の投与により減少させる、請求項37に記載の方法。
- 対象におけるがん転移の危険性を診断する方法であって、以下の工程:
a.対照と比較した相対的なmiR−21およびmiR−29aの発現を同定し、そして
b.前記対象が対照と比較して増大したmiR−21およびmiR−29aの発現を有する場合、前記対象において増大したがん転移の危険性があると診断し、または
c.前記対象が対照と比較して増大したmiR−21およびmiR−29aの発現を有しない場合、前記対象において増大したがん転移の危険性がないと診断する;
を含む、前記方法。 - さらに診断に基づいた処置計画を設計することを含む、請求項42に記載の方法。
- さらに診断に基づいた処置を施すことを含む、請求項42に記載の方法。
- さらに肺がん転移が診断された場合に少なくとも1種類のアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aを投与することを含む、請求項42に記載の方法。
- さらに診断に基づいて予後を決定することを含む、請求項42に記載の方法。
- さらに以下の工程:
a.対象から得られた試験試料からmiR−21 RNAおよびmiR−29a RNAを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し;
b.前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをmiR−21特異的およびmiR−29a特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;そして
c.工程(b)のプロファイルを対照と比較する;
を含む、請求項42に記載の方法。 - 工程c)が試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較することを含む、請求項47に記載の方法。
- 工程c)が試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを試料と関係するデータベース、統計、またはmiRレベルの表に対して比較することを含む、請求項47に記載の方法。
- 少なくとも1種類の追加のmiRがマイクロアレイ中に含まれる、請求項47に記載の方法。
- 対象における炎症反応の危険性を診断する方法であって、以下の工程:
a.対照と比較した相対的なmiR−21およびmiR−29aの発現を同定し、そして
b.前記対象が対照と比較して増大したmiR−21およびmiR−29aの発現を有する場合、前記対象において増大した炎症反応の危険性があると診断し、または
c.前記対象が対照と比較して増大したmiR−21およびmiR−29aの発現を有しない場合、前記対象において増大した炎症反応の危険性がないと診断する;
を含む、前記方法。 - 前記炎症反応が転移促進性炎症反応である、請求項51に記載の方法。
- さらに診断に基づいた処置計画を設計することを含む、請求項51に記載の方法。
- さらに診断に基づいた処置を施すことを含む、請求項51に記載の方法。
- さらにがん転移が診断された場合に少なくとも1種類のアンチセンスmiR−21および/またはアンチセンスmiR−29aを投与することを含む、請求項51に記載の方法。
- さらに診断に基づいて予後を決定することを含む、請求項51に記載の方法。
- 以下の工程:
前記対象から得られた試験試料からmiR−21 RNAおよびmiR−29a RNAを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し;
前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをmiR−21特異的およびmiR−29a特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し;そして
前記ハイブリダイズ工程のプロファイルを対照と比較する;
を含む、請求項51に記載の方法。 - 前記比較工程が以下の工程:前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルに対して比較する;を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記比較工程が以下の工程:前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを試料と関係するデータベース、統計、またはmiRレベルの表に対して比較する;を含む、請求項57に記載の方法。
- 少なくとも1種類の追加のmiRが前記マイクロアレイ中に含まれる、請求項57に記載の方法。
- 前記がんがルイス肺癌;扁平上皮癌;非小細胞肺癌;小細胞肺癌からなる群から選択される肺がんである、上記の請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんが肺胞性基底上皮腺癌;肺腺癌;結腸腺癌;子宮頸部腺癌、前立腺腺癌;乳腺癌;食道腺癌、膵臓腺癌;および胃腺癌からなる群から選択される腺癌である、上記の請求項のいずれか1項に記載の方法。
- anti−miR−29aをそれを必要とする対象に投与することを含む、化学療法抵抗性のがんを処置する方法。
- 対象においてがんを処置する方法であって、以下の工程:(a)対象からエキソソームを含有する体液試料を得て、(b)前記体液試料からエキソソームを分離し、(c)(b)の前記エキソソーム中の1種類又はそれより多くのバイオマーカーを検出し、ここで前記1種類又はそれより多くのバイオマーカーはmiR−29aおよびmiR−21を含み、そして(c)エキソソーム中で高レベルのmiR−29aおよびmiR−21が検出された場合、前記対象をアンチセンスmiR−29a/miR−21で処置する;を含む、前記方法。
- 対象におけるがんの診断またはがんの進行もしくは退縮の監視を補助するための方法であって、以下の工程:(a)それを必要とする対象からエキソソームを含有する体液試料を得て、(b)前記体液試料からエキソソームを分離し、(c)(b)の前記エキソソーム中の1種類又はそれより多くのバイオマーカーを検出し、ここで前記1種類又はそれより多くのバイオマーカーはmiR−29aおよびmiR−21を含み、かつここでエキソソーム中の前記バイオマーカーの検出は前記対象中のがんと関係しており、それにより前記がんの診断、または前記がんの進行もしくは退縮の監視を助ける;を含む、前記方法。
- バイオマーカーの1種類又はそれより多くを生物学的経路中で前記バイオマーカーの上流もしくは下流で見出される分子、または前記分子の測定可能な断片で置き換えることができる、請求項65に記載の方法。
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