CN102146412B

CN102146412B - 一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用

Info

Publication number: CN102146412B
Application number: CN201110004598A
Authority: CN
Inventors: 庄诗美; 方坚鸿; 周慧超
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2031-01-11
Also published as: CN102146412A

Abstract

本发明提供一种小分子非编码RNA(该小分子非编码RNA命名为hsa-miR-29b)及其应用。本发明进行了体外管形成实验和裸鼠成瘤及免疫组化实验，体外管形成实验的结果表明体外恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞诱导的血管生成；裸鼠成瘤及免疫组化实验的结果表明体内恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力和肿瘤血管生成能力，从而抑制肿瘤血行转移。因此，hsa-miR-29b可用于制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物和抗肿瘤血行转移药物。

Description

一种小分子非编码RNA 基因hsa-miR-29b 及其应用

技术领域

本发明涉及一种RNA及其应用，尤其涉及一种小分子非编码RNA及其应用。

背景技术

癌症(恶性肿瘤)已成为一个全球性公共健康问题，在我国尤为突出。卫生部报道，中国城乡居民的癌症死亡率在过去30年中增长了八成以上。目前，癌症已经成为中国城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因。其中，原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均高居各种恶性肿瘤前列。中国是肝癌的高发区，占全世界HCC患者总数的55％。现今恶性肿瘤主要的治疗方法以根治性切除为主，癌症难以根治的主要原因是局部复发和远处转移，转移癌是肿瘤复发的主要原因。众所周知，血行转移是肿瘤转移的主要途径，所以以血管生成为治疗靶标可以有效抑制肿瘤转移，这也是目前肿瘤学研究亟待解决的问题。恶性肿瘤都是高度血管化的，血管生成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。新生的血管不仅为肿瘤细胞提供营养，也为肿瘤细胞的扩散和转移提供了渠道，故抗血管生成是一种有效的抗肿瘤方法。一些抑制血管生成的药物，如多吉美，已经广泛应用于抗肝癌。

小分子非编码RNA，也称微小RNA(microRNA)，是广泛存在于各种生物体内的一类小分子非编码的核糖核酸，长度约为20-22个碱基。它通过碱基配对识别靶基因信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’UTR)，促进靶基因降解或抑制其翻译来实现对基因表达的负调控，从而参与了细胞的多种生物学过程。多个证据表明，microRNA的异常表达和功能失调直接影响着恶性肿瘤的发生发展。

现有研究发现，一种命名为hsa-miR-29b的小分子非编码RNA的表达在肝细胞肝癌组织标本中普遍下调，并且hsa-miR-29b表达低的患者无瘤生存时间显著较短，提示其与肝癌复发相关。而现有的国内外文献中至今未见有关hsa-miR-29b与肿瘤血管生成的研究报道。进一步研究hsa-miR-29b在肿瘤血管生成中的作用，对于制备新型抗血管生成、抗血行转移和抗肿瘤药物意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小分子非编码RNA基因，该基因命名为hsa-miR-29b，其序列如序列表<400>1序列所示。

本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤血行转移中的应用。

本发明通过体外管形成实验研究hsa-miR-29b在体外恢复表达对肿瘤细胞促血管生成功能的作用。体外管形成实验是在体外模拟血管内皮细胞在体内形成管腔结构的实验，通过管状结构的节点数来评估人脐静脉内皮细胞HUVEC出芽能力并表征人脐静脉内皮细胞HUVEC的血管生成能力。

上述体外管形成实验设A、B、C、D、E五个实验，上述五个实验内均设置空白对照组、阴性对照组和实验组。

步骤一：利用目的RNA转染肿瘤细胞株，使目的RNA在肿瘤细胞株内恢复表达，空白对照组的肿瘤细胞株不转染任何RNA；

上述目的RNA为hsa-miR-29b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(也称为anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA(也称为NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(也称为anti-NC)其中的一种。

上述肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6)、肝细胞肝癌细胞株H2M(简称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D(简称95D)或结肠腺癌细胞株HCT116(简称HCT116)其中的一种。

上述NC序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT。

步骤二：收集步骤一的肿瘤细胞培养上清孵育人脐静脉内皮细胞HUVEC，孵育后在显微镜下观察人脐静脉内皮细胞HUVEC网状结构的生成情况。

实验A：

空白对照组：加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验B：

空白对照组：加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的H2M肿瘤细胞培养上清；

实验C：

空白对照组：加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入转染了anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染了anti-hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验D：

空白对照组：加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的95D肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的95D肿瘤细胞培养上清；

实验E：

空白对照组：加入未经转染的HCT116肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的HCT116肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的HCT116肿瘤细胞培养上清；

对实验结果进行对比分析及相关性统计表明：实验A中，相对于阴性对照组和空白对照组，实验组的肿瘤细胞培养上清明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形成；实验B、实验D和实验E的结果与实验A相同。而在实验C中，相对于阴性对照组和空白对照组，实验组中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的anti-hsa-miR-29b拈抗后，收集的肿瘤细胞培养上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形成。管状结构的节点数与hsa-miR-29b表达水平呈负相关。

体外管形成实验结果表明，hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力，且该抑制肿瘤细胞的促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。

本发明通过裸鼠成瘤及免疫组化实验研究hsa-miR-29b在体内表达对肿瘤细胞生长和促血管生成的影响。

具体实验步骤为：

(1)细胞转染：将目的RNA(NC或hsa-miR-29b)转染肿瘤细胞株，使目的RNA在肿瘤细胞株内恢复表达；

(2)裸鼠成瘤：收集步骤(1)中恢复表达的肿瘤细胞对BALB/c裸鼠进行皮下注射，选取5只BALB/c裸鼠，在每只BALB/c裸鼠的两只后腿分别注射实验组和阴性对照组的肿瘤细胞，连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。观察完毕后完整剥离肿瘤组织，制成石蜡切片4℃保存。

(3)免疫组化：将步骤(2)得到的裸鼠肿瘤组织切片和人肝癌组织切片分别进行免疫组化染色后在显微镜下观察肿瘤组织中血管生成情况。

上述步骤(2)裸鼠成瘤设置阴性对照组和实验组。阴性对照组的肿瘤细胞株中转染NC，实验组的肿瘤细胞株中转染hsa-miR-29b。

上述步骤(2)裸鼠成瘤所采用的肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6。

上述步骤(3)人肝癌组织切片中hsa-miR-29b的表达水平通过实时定量PCR(也称为realtime PCR)测定。

裸鼠成瘤及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果：相对于阴性对照组，实验组肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低，体积较小；且实验组肿瘤组织中形成的微血管密度明显较高，肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度呈显著负相关。

对人肝癌组织切片的免疫组化结果：hsa-miR-29b表达水平高的人肝癌组织切片血管管径明显较小且血管密度明显较低。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示，两者呈显著负相关。

裸鼠成瘤及免疫组化实验结果表明，体内恢复小分子非编码RNA基因hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力，而且显著抑制了肿瘤血管生成能力，从而抑制肿瘤的血行转移。

综上所述，本发明提供的hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物以及抑制肿瘤血行转移药物方面都有广泛应用。

附图说明

图1为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图1A、图1B、图1C分别对应实施例1中的实验A、B、C的实验结果。图1A、图1B和图1C从左至右依次为空白对照组、阴性对照组和实验组的显微镜成像图，最右侧为相对节点数统计图。

图2为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图2A采用的肿瘤细胞为肺巨细胞癌细胞株95D，图2B采用的肿瘤细胞为结肠腺癌细胞株HCT116。图2A和图2B从左至右依次为空白对照组、阴性对照组和实验组的显微镜成像图；最右侧为相对节点数统计图。

图3为裸鼠成瘤及裸鼠肿瘤组织免疫组化结果图。图3A为从裸鼠皮下分离出来的肿瘤成像图；图3B为肿瘤生长曲线图；图3C为CD34标记的裸鼠肿瘤组织切片血管内皮细胞

在显微镜下成像图，图3D为裸鼠肿瘤组织切片hsa-mir-29b表达水平与微血管密度相关性分析图。

图4为人肝癌组织免疫组化示意图。图4A为CD34标记的人肝癌组织血管内皮细胞于100倍镜下成像图；图4B为人肝癌组织切片中has-mir-29b表达水平与微血管密度的相关性分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

本发明所采用的hsa-miR-29b序列从Sanger microRNA序列数据库miRBase V15.0获得，由上海吉玛公司合成。阴性对照组的阴性对照RNA序列(简称NC)为上海吉玛公司合成的用于microRNA实验的标准阴性对照序列，NC序列从5’端到3’端为：5’UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3’。

实施例1：体外管形成实验

体外管形成实验是在体外模拟血管内皮细胞在体内形成管腔结构的实验。血管生成涉及血管基底膜的降解，血管内皮细胞增殖和迁移到细胞外基质和重组血管内皮细胞后成三维管状结构，形成新的基底膜。在体外管形成实验中，通过铺基质胶为人脐静脉内皮细胞HUVEC提供细胞外基质，模拟体内环境，人脐静脉内皮细胞HUVEC通过增殖，迁移和粘附等过程，形成二维管状结构。出芽是血管生成的必须步骤，因此，体外可通过计算上述二维管状结构的节点数来评估人脐静脉内皮细胞HUVEC出芽能力并表征人脐静脉内皮细胞HUVEC的血管生成能力。

1.1细胞转染

此步骤的目的是在肿瘤细胞株中恢复目的RNA的表达，将目的RNA导入肿瘤细胞并恢复表达的步骤是利用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX进行反转实现。以24孔板为例，具体实验步骤为：

(1)取胰蛋白酶消化细胞重悬于含有10％FBS的无双抗DMEM培养基(购自Invitrogen公司)中，使得细胞密度为3×10⁴个细胞/ml；

(2)将30p mol目的RNA稀释于100μl opti-MEM(购自Invitrogen公司)中，轻敲管壁混匀；每管加入1ul Lipofectamine RNAi MAX，轻敲管壁混匀，室温放置15min；得到RNAi MAX/siRNA稀释液；

(3)每孔加入100μl RNAi MAX/siRNA稀释液，再加入500μl细胞稀释液，该细胞稀释液可使细胞密度在转染24h后大约为30-50％汇合，混匀后培养箱中培养一定时间混匀后培养箱中培养36-48小时后进行上清收集。获得hsa-miR-29b的肿瘤细胞培养上清。上述实施例为24孔板，其他孔板可根据孔的大小按比例放大或者缩小试剂用量。

1.2管形成检测

按照步骤1.1在肿瘤细胞株中恢复目的RNA的表达，收集转染后恢复表达的肿瘤细胞培养上清，与人脐静脉内皮细胞HUVEC共培养。

上述目的RNA可为hsa-miR-29b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(简称anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA(简称NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(简称anti-NC)其中的一种。

本实施例中采用的肿瘤细胞株选自：肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6)、肝细胞肝癌细胞株H2M(简称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D(简称95D)或结肠腺癌细胞株HCT116(简称HCT116)其中的一种。

本实施例中LM6出自上海细胞所；H2M出自香港大学；95D从中科院细胞中心购得；HCT116出自Bert Vogelstein&Kenneth W.Kinzler实验室。本实施例中未标明具体来源的试剂与材料均为市售标样。

人脐静脉内皮细胞HUVEC为本实验室按本领域常规方法制备：以人脐带(出自中山大学附属第二医院)为原材料，将内皮细胞从脐静脉中用胰酶(购于广州展晨公司)消化出来后，贴于培养瓶培养。

本实施例共设A、B、C、D、E五个实验，每个实验中均设置空白对照组、阴性对照组和实验组。

实验A：

空白对照组：加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验B：

空白对照组：加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的H2M肿瘤细胞培养上清；

实验C：

空白对照组：加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入转染了anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染了anti-hsa-miR-29b的LM6肿瘤细胞培养上清；

实验D：

空白对照组：加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的95D肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的95D肿瘤细胞培养上清；

实验E：

空白对照组：加入未经转染的HCT116肿瘤细胞培养上清；

阴性对照组：加入NC的HCT116肿瘤细胞培养上清；

实验组：加入转染hsa-miR-29b的HCT116肿瘤细胞培养上清；

具体实验步骤为：

(1)取96孔板，以每孔1.2×10⁴个人脐静脉内皮细胞HUVEC (细胞悬液∶肿瘤细胞培养上清＝25％∶75％)贴于预包被Matrigel(R&D，MN，USA)的孔中；于37℃孵育10小时；

(2)显微镜下观察加入不同肿瘤细胞培养上清的各实验组内皮细胞的管形成情况。通过对管状结构节点的计数表征肿瘤细胞促血管生成能力的强弱。所有实验组都是计数复孔，以三次重复实验取平均值。

1.3结果分析

实验A、实验B和实验C的实验结果如图1所示。图1A为实验A的结果示意图，图1B为实验B的结果示意图，图1C为实验C的结果示意图；实验D和实验E的实验结果如图2所示，图2A为实验D的结果示意图，图2B为实验E的结果示意图。

实验A、实验B、实验D、实验E结果分析：实验A结果如图1A所示，显微镜下空白对照组和阴性对照组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大，而实验组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较低；人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构的节点数与hsa-miR-29b的表达浓度的相对性统计结果表明，肿瘤细胞上清中hsa-miR-29b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著负相关。实验B、实验D、实验E的实验结果，分别如图1B、图2A、图2B所示，与实验A的实验结果相同。说明肿瘤细胞上清中hsa-miR-29b的表达明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC的管状结构形成。

实验C的结果分析：如图1C所示，显微镜下空白对照组和阴性对照组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大，而实验组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较高；人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构的节点数与anti-hsa-miR-29b表达浓度的相对性统计结果表明，anti-hsa-miR-29b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著正相关。说明肿瘤细胞上清中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的anti-hsa-miR-29b拈抗后，收集的肿瘤细胞上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构形成。

结果显示，hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力，且该抑制肿瘤细胞的促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。

实施例2裸鼠成瘤及免疫组化实验

2.1细胞转染

利用Invitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX转染目的RNA(hsa-miR-29b或NC)到肝细胞肝癌细胞株LM6(简称LM6，出自上海细胞所)，目的RNA终浓度为50nM，培养48h后用胰酶消化并计数后按1×10⁷个/ml的浓度用PBS重悬。本实施例中未标明具体来源的试剂与材料均为市售标样。

2.2裸鼠成瘤

选用5只5周龄的BALB/c裸鼠，在其两只后腿分别皮下注射1×10⁶恢复hsa-miR-29b或NC表达LM6肿瘤细胞。连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。完整剥离所有裸鼠的肿瘤组织，按本领域常规方法制成石蜡切片4℃保存。

2.3免疫组化

本实施例对步骤2.2中得到的裸鼠肿瘤组织切片进行免疫组化，利用特异性的CD34抗体标记血管内皮细胞，通过显色原理使被标记的血管内皮细胞显色并使用显微镜观察肿瘤组织切片中血管生成情况。同时按相同原理对人肝癌组织切片进行免疫组化，观察人肝癌组织切片中的血管生成情况。

上述人肝癌组织切片取自中山大学附属肿瘤医院标本库，人肝癌组织切片中hsa-miR-29b的表达水平事先通过实时定量PCR(也称为real time PCR)测定。

免疫组化步骤为：

(1)预处理：取出55℃烤片1h，放于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；依次用100％、95％、90％、80％、70％的乙醇洗一次，每步3min，后用双蒸水洗3min；0.3％的双氧水处理10min，双蒸水再洗3次，每次3min；浸泡于修复液中，用微波炉进行热修复，室温冷却半小时；用1×PBS洗三次，每次3min；

(2)杂交染色：用人或鼠特异性的-CD34抗体进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×PBS洗三次，每次5min；加入二抗，37℃半小时；用1×PBS洗三次，每次5min；加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染；

(3)计数：微血管密度(MVD)计数，先寻找血管最密集区，然后在100倍镜下观察染成棕色的单个细胞或连续细胞丛，并以此计为一个血管，以5个视野的均数表示该标本的微血管密度。

2.4结果分析

裸鼠成瘤以及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果如图3所示，恢复hsa-miR-29b表达的实验组肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低，体积较小(见图3A和图3B)；且实验组肿瘤组织中形成的微血管密度相对于阴性对照组明显较高，肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示，两者呈显著负相关(图3C和图3D)。

类似地，对人肝癌组织切片的免疫组化结果如图4所示，通过免疫组化标记血管内皮细胞，可以发现hsa-miR-29b高表达的人肝癌组织切片的血管管径明显较小且血管密度明显较低(见图4A)。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示，两者呈显著负相关(见图4B)。

综上所述，恢复hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力，而且显著抑制了肿瘤血管生成能力，从而可抑制肿瘤细胞通过血行途径形成转移瘤。

Claims

1.一种小分子非编码RNA在制备抑制实体肿瘤细胞促血管生成药物中的应用，其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。

3.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤血管生成药物中的应用，其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。

5.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤药物中的应用，其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌、肺巨细胞癌或结肠癌。

7.一种小分子非编码RNA在制备抗实体肿瘤血行转移药物中的应用，其中所述小分子非编码RNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的实体肿瘤选自原发性肝细胞肝癌。