CN103146703B - 抑制上皮性卵巢癌肿瘤生长的siRNA及其重组载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，上皮性卵巢癌（EOC）是最常见的卵巢癌，在妇科生殖器官恶性肿瘤中，虽然发病率位居第三，仅次于宫颈癌与子宫内膜癌，但死亡率高达70%，居首位。本发明筛选到一种抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQ ID NO:4或5所示。本发明还构建了含有该干扰序列的重组载体。本发明的重组载体通过体内、体外实验结果证明，可以抑制EOC细胞中特异性高表达的HOST2，从而抑制肿瘤生长。本发明提供的siRNA和重组载体为临床治疗EOC提供了新的基因治疗药物。

Description

抑制上皮性卵巢癌肿瘤生长的siRNA及其重组载体与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制上皮性卵巢癌特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。

背景技术

上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer，EOC）是最常见的卵巢癌，约占80-90%，在妇科生殖器官恶性肿瘤中，虽然发病率位居第三，仅次于宫颈癌与子宫内膜癌，但死亡率高达70%，居首位。据统计，女性一生中发生卵巢癌的危险率约1.45%，死于卵巢癌的危险性为1%。由于卵巢解剖位置复杂，位于盆底深部，这给卵巢癌的早期诊断造成诸多困难。目前EOC的治疗以手术为主，辅以放化疗等。但由于转移前常无症状，多数EOC在确诊时已属于晚期，致使手术难度高、范围广，病灶往往不能全部清除，再加上放化疗作用局限，导致术后复发率高，预后极差。据近20年的统计资料，EOC的发病率逐年递增，但治疗效果一直未能改善，5年生存率徘徊于30-40%。EOC已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤，如何改善EOC的治疗效果是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。大量文献报道，分子靶向药物和化疗联合应用是目前提高恶性肿瘤患者生存率最有前景的治疗方法。

2003年，Rangel等人利用SAGE数据库分析、基因克隆、Northern Blot、RACE技术等，在EOC组织中发现一个特异性转录本HOST2（Rangel L.B.,Sherman-Baust C.A.,Wernyj R.P.,Schwartz D.R.,Cho K.R.,Morin P.J..Characterization of novel human ovarian cancer-specific transcripts(HOSTs)identified by serial analysis of gene expression.Oncogene.2003,22(46):7225-7232.）。HOST2长度约3000个碱基，没有开放式可读框，不能编码蛋白质，属于长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）。

长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一类长度大于200个碱基的功能性RNA分子，占人类基因组4-9%，缺乏编码蛋白的能力，在多种层面上调控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。目前许多研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关（Lee,J.T..Epigenetic regulation by long noncodingRNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.）。目前有文献报道，LncRNA特异性表达可作为治疗肿瘤潜在靶点，如肝细胞性肝癌中的LncRNA——MVIH（Yuan,S.X.,Yang,F.,Yang,Y.,Tao,Q.F.,Zhang,J.,Huang,G.,Wang,R.Y.,Yang,S.,Huo,X.S.,Zhang,L.,Wang F.,Sun S.H.,Zhou W.P..Long noncodingRNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma promotesangiogenesis and serves as a predictor for hepatocellular carcinoma patients'poorrecurrence-free survival after hepatectomy.Hepatology.2012.56(6):2231-2241.）。但目前尚无HOST2的深入研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列，并构建含有抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列的重组载体，本发明的另一目的是提供该siRNA2和重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。

本发明的第一方面，是寻找能抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列。

本发明人通过大量前期工作发现：HOST2与上皮性卵巢癌的增殖和迁移这两个肿瘤生长相关的生物学功能密切相关。

首先，我们以卵巢良性肿瘤（Benign Ovarian Tumor，OBT）组织为对照组（43例，采集自2010~2012年上海市长海医院妇科收治的OBT患者手术标本），以同期采集的确诊为EOC患者的术中标本为实验组（39例），验证了HOST2在EOC组织中表达的特异性，符合上述2003年文献报道（图1）。

然后，设计、合成并筛选HOST2特异性的高效干扰序列siRNA1~3，分别转染进OVCAR-3上皮性卵巢癌细胞中，结果发现siRNA2抑制HOST2表达的干扰效果最明显（图2）；

本发明提供了一种抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列（siRNA2），其序列如下：

正义链5’-GACUAAACAAGGUCUUAAUUU-3’（SEQ ID NO:4）

反义链5’-AUUAAGACCUUGUUUAGUCUU-3’（SEQ ID NO:5）。

本发明的第二方面，是构建含有抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列的重组载体，该重组载体采用真核表达载体pLKO.1puro。

构建方法如下：

1、合成HOST2-sh2片段；

选择合适的酶切位点Age I和EcoR I，根据该siRNA2的序列，设计其shRNA2序列如下，构建到真核表达载体pLKO.1puro中。

正义链5'CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG—ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG3'（SEQ ID NO:8）

反义链5'AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG—ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A3'（SEQ ID NO:9）

2、退火得到HOST2-sh2cDNA基因片段；

3、用真核表达载体pLKO.1puro构建pLKO.1-HOST2-sh2重组表达载体（图3和4），经典分子生物学方法参见《分子克隆实验指南》，美国冷泉港出版社。

进一步地，本发明还将pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒转染入OVCAR-3细胞并且利用G418加压筛选，建立OVCAR-3/HOST2-sh2T真核表达细胞株。

具体方法为：将以上重组载体转染入美国培养物保存中心（ATCC）建系的OVCAR-3上皮性卵巢癌细胞中，然后加G418（氨基糖苷类抗生素）筛选两次，每次挑取单克隆大量扩增OVCAR-3细胞，最终得到较高纯度的OVCAR-3/HOST2-sh2T。

本发明的第三方面，提供了上述的siRNA2和重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。

本发明将构建的重组载体转染EOC细胞，抑制EOC细胞的生长，以达到治疗EOC的目的。

体外实验：通过脂质体转染的方式，将pLKO.1-sh2转入OVCAR-3细胞中，利用细胞划痕实验、Transwell实验和CCK-8检测，发现细胞的迁移和增殖能力均明显下降（图5-7）。

体内试验，建立EOC裸鼠模型后，待肿瘤生长至直径约5mm时，定期将上述质粒直接打入异种移植的瘤体内，最终发现肿瘤生长明显受限，甚至可以逆转缩小。裸鼠异种移植瘤模型的构建及相关实验技术和方法，申请人已发表相关文章（Hu T.,Liu S.,Breiter D.R.,Wang F.,Tang Y.,Sun S..Octamer4SmallInterfering RNA Results in Cancer Stem Cell-Like Cell Apoptosis.Cancer Res.2008.68(16):6533-6540.）。

通过体内、体外实验结果证明：本发明的重组载体可以抑制EOC细胞中特异性高表达的HOST2，从而抑制肿瘤生长。因此本发明提供的siRNA2和重组载体为临床治疗EOC提供了新的基因治疗药物。

附图说明

图1：EOC患者和OBT患者术中标本组织中HOST2的相对表达量。

图2：HOST2特异性干扰序列siRNA1-3最佳干扰效果筛选。

图3：pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒及插入酶切位点示意图。

图4：小发卡shRNA示意图。U6启动子知道下游小发卡shRNA的转录。序列包括21个siRNA2正义链碱基，“Loop”为酶切位点识别序列，21个siRNA反义链碱基。

图5：转染pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒前后细胞划痕愈合情况，

其中A为空白对照组；B为转染pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒的细胞。

图6：转染pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒前后细胞迁移过膜的细胞个数统计。其中A为100倍电镜或光镜图；B为迁移过膜的细胞个数统计图。

图7：转染pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒前后细胞增殖曲线。

图8：OVCAR-3细胞株和OVCAR-3/HOST2-sh2T细胞株中HOST2的相对表达量。

图9：pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒注射与未注射组裸鼠异种瘤体大小比较。

图10：pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒注射与未注射组裸鼠的生存期比较。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：构建pLKO.1-HOST2-sh2真核表达载体

1.1所需试剂

限制性内切酶Age I和EcoR I及相应Buffer、T4连接酶及其缓冲液、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购于TaKaRa公司（大连宝生物工程有限公司）。真核表达载体选择常规RNAi载体pLKO.1puro（Plasmid8453），源于全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene。

1.2设计、合成并筛选HOST2的特异性siRNA。

HOST2cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

根据上述序列设计并合成特异性siRNA1-3（均由上海Invitrogen公司完成）：

从图2中看出，siRNA2可以将HOST2的表达抑制掉70%以上；siRNA1仅将HOST2的表达抑制掉20%左右；siRNA3也只能将HOST2的表达抑制掉约50%。

因此本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制HOST2表达效果最显著的siRNA2。

1.3根据siRNA2序列和选择的酶切位点，设计并合成用于构建真核质粒的HOST2-sh2序列（Primer5.0软件）（图3和4）。

上述正反两条核苷酸链均由上海Invitrogen公司合成。

1.4真核载体pLKO.1-HOST2-sh2的构建

具体流程：将1.3中HOST2-sh2两条核苷酸链经常规退火程序（等体积混合两核苷酸链，95℃2min后在45min内冷却至25℃）后直接放入4℃保存。用Age I和EcoR I内切酶，分别酶切以上退火产物和载体pLKO.1puro（37℃过夜）。酶切产物经电泳区分条带，用胶回收试剂盒回收正确的DNA片段，然后以基因片段与载体片段摩尔比约3:1进行连接反应。反应体系（10μl）：T4连接酶缓冲液1μl，载体片段50ng，基因片段20ng，T4连接酶1μl，余用去离子水补足。16℃连接过夜后，取5μl连接产物置于80-100μl的Top10感受态细菌中，冰浴30min，42℃热休克90s，二次冰浴5min，加入LB培养基1000μl，37℃摇床上培养30min-1h（150rpm），5000rpm离心5min，弃掉1000μl上清，将菌体均匀涂布于50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养18h。从转化的平板中挑去若干独立菌落接种于3ml含相应抗性的LB培养基中，37℃震摇（150rpm）12-16h后送上海Invitrogen公司序。经测序鉴定，获得pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒。

实施例2：体外细胞试验

利用细胞划痕实验、Transwell实验和CCK-8检测法研究HOST2表达被抑制前后EOC细胞的生物学功能的变化。

具体方法如下：

1、细胞划痕实验

用划痕法检测细胞迁移能力，用Image J软件测定迁移的平均距离。实验用品：6孔板、直尺、无血清培养基、PBS/生理盐水、黄枪头、Mark笔等。

步骤：①用Mark笔在6孔板背后，均匀划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。②在孔中加入约2.5-5×10⁵个细胞，待生长至50%左右，留下三个空白孔以作对照，将pLKO.1-HOST2-sh2转染至剩余三个实验孔中。③待细胞生长至完全汇合（约需24h），用黄枪头沿直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。④用PBS/生理盐水洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。⑤放入37℃5%CO2培养箱培养。⑥分别在适宜时间点，在镜下按照Mark笔所作标记线观察并在固定倍数拍照。

结果如图5所示：48h后，pLKO.1-HOST2-sh2转染后，细胞的迁移能力明显减弱，表现在划痕未见融合，而空白对照，即未转染pLKO.1-HOST2-sh2的细胞，划痕基本融合。

2、Transwell实验

用Transwell细胞小室检测细胞迁移能力。

步骤：①制备细胞悬液：去培养基，PBS洗2遍，用200μl胰酶消化细胞，终止消化后离心弃培养基，用无血清培养基洗2遍，加适量无血清培养基制备吹打重悬均匀，形成单细胞悬液。估计细胞密度（细胞计数板/流式细胞仪计数），调整细胞密度至1-5×104cells/ml（以细胞贴满板底为宜）。②分别接种转染pLKO.1-HOST2-sh2和未转染的细胞：先加600-1000μl含5-10%FBS的培养液至24孔板的孔中。再将Transwell细胞小室放入，加入100-200μl细胞悬液（约含2.5-5×103个细胞）。37℃，16-24h培养（贴壁过夜）。③将细胞小室移至其他未使用的孔中，用室温37℃预热后的PBS淋洗2遍（上室、下室均轻轻清洗），风干。用干棉签将上室内液体吸去，再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去上室内未迁移的细胞（切勿用力过猛而损坏滤膜）。下室加入600μl-1ml4%多聚甲醛，使滤膜下表面浸在其中固定细胞，20-25min，避免下室有气泡存在。取出小室，再次用PBS淋洗，自然风干。染色：24孔板中加入500μl1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃20-30min后取出，PBS/清水清洗3-5遍（也可使用DPAI染色，注意避光）。染色后用刀片沿小室底部轻轻割下滤膜，将滤膜置于载玻片上，标记封片。④细胞计数：显微镜（如Leica DC300F型号）进行观察、比较和拍照，附着于聚碳酯滤膜下表面的细胞在高倍镜下(×400)计数。迁移率（%）=（下层细胞数/添加的细胞数）×100%。

结果如图6所示：48h后，pLKO.1-HOST2-sh2转染后，穿过基底膜的细胞个数明显少于空白对照组。

3、CCK-8检测法

利用CCk-8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖活性变化。

步骤：①接种细胞悬液于96孔板中（100μl/孔，每孔细胞数量>1000个）。常规培养转染pLKO.1-HOST2-sh2和未转染的细胞。②做细胞增殖实验前换液，再向每孔加入10μl CCK-8溶液（如96孔板：100μl/孔=90μl培养基+10μlCCK-8，若采用24孔板或者其他容量的孔板，加入CCK-8溶液的量按比例增加，细胞培养体系:CCK-8溶液=10:1），也可以先配好10:1比例的含CCK-8的培养基，逐个加入孔内。勿生成气泡，气泡会影响折光系数，从而影响OD值。③常规培养稀薄啊30min-4h。④用酶标仪测定在450nm处的吸光度（OD值）。在0.5、1、2和4小时等时间点分别用酶标仪检测细胞OD值。⑤根据各时间点的OD值绘制曲线图。

结果如图7所示：pLKO.1-HOST2-sh2转染后，细胞的增殖能力明显低于空白对照组。

实施例3：体内模拟治疗实验

50只BALB/C-nu雌性裸鼠，4-6周龄，体质量约20g±2g，随机分为两组（25只/组，实验组和空白对照组）。制备OVCAR-3单细胞悬液，调整细胞浓度为1-5×10⁷/mL，取裸鼠于其近后肢的背部皮下注射细胞100-200μl。

用大型大量质粒抽提试剂盒（上海天根生物有限公司）抽取pLKO.1-HOST2-sh2质粒，利用分光光度计测定质粒密度为1437ng/ml。待肿瘤长至平均直径5mm时，往实验组裸鼠异种移植瘤体内注入约100ngpLKO.1-HOST2-sh2重组质粒（根据密度计算注入体积约70μl），每隔2天打药一次，一共持续30天，共计15次。pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒注射结束后，每天观察两组肿瘤体积变化，并用游标卡尺测定肿瘤长短径，计算肿瘤体积（mm³）。另外，统计裸鼠的生存曲线。

如图9所示，pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒注射后的瘤体明显缩小。图10显示，pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒注射后裸鼠的生存期明显延长。

实施例4：建立稳定的pLKO.1-HOST2-sh2重组OVCAR-3细胞株

（OVCAR-3/HOST2-sh2T）

将pLKO.1-HOST2-sh2转染入对数生长期的OVCAR-3细胞。具体操作：待6孔板中OVCAR-3细胞长至60%左右，吸弃培养基，加入2ml无血清培养基，37℃5%CO2孵箱培养6h。参照转染试剂Lipofectamine2000（上海Invitrogen公司）操作说明书，配制转染液，并缓慢加入培养基中，摇匀。37℃5%CO2孵箱培养4-6h后吸弃含转染液的无血清培养基，加入2ml含10%胎牛血清的1640培养基继续培养。

确定G418（上海Invitrogen公司）浓度，方法如下：24孔细胞培养板接种每孔1000个OVCAR-3细胞，并加G418使其浓度分别为500、1000、2000、3000μg/ml，选择能在10-14天把细胞彻底杀死的孔作为G418的筛选浓度，最终确定G418合适浓度为1000μg/ml。

转染后24小时，按1:10比例进行细胞传代，用含有1000μg/ml G418的压力筛选培养液筛选培养细胞，10-14天后，用克隆环圈住具有新霉素抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养。用HOST2的特异性引物检测HOST2的含量（引物序列为：正义链5`-GGACAGGTCCCTTGTTTCAA-3`反义链5`-CTGGTCTTTCCTTGCCTCTG-3`），并与未处理的OVCAR-3细胞检测的结果进行比较（图8）。最终得到含重组质粒pLKO.1-HOST2-sh2的EOC细胞株，命名为OVCAR-3/HOST2-sh2T。

上述实验证实：本发明的重组载体pLKO.1-HOST2-sh2通过真核表达体系OVCAR-3细胞的高效表达，可在很大程度上抑制HOST2的表达，并最终导致EOC肿瘤生长受抑制。本发明重组质粒可用于制备抑制EOC肿瘤生长的靶向小分子药物。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (7)

1.一种抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQID NO:4或5所示。

2.一种含有如权利要求1所述的抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体采用真核表达载体pLKO.1puro构建。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，构建方法如下：

A、合成HOST2-sh2片段；

选择合适的酶切位点Age I和EcoR I，根据权利要求1所述的抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列，设计其shRNA2序列如下：

正义链5'CCGGTGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG—ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—TTTTTG 3'(SEQ ID NO:8)

反义链5'AATTCAAAAAGACTAAACAAGGTCTTAATTT—CTCGAG—ATTAAGACCTTGTTTAGTCTT—A 3'(SEQ ID NO:9)；

B、退火得到HOST2-sh2cDNA基因片段；

C、用真核表达载体pLKO.1puro构建pLKO.1-HOST2-sh2重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，构建pLKO.1-HOST2-sh2重组表达载体后，将pLKO.1-HOST2-sh2重组质粒转染入OVCAR-3细胞并且利用G418加压筛选，建立OVCAR-3/HOST2-sh2T真核表达细胞株。

6.一种如权利要求1所述的抑制上皮性卵巢癌HOST2基因表达的干扰序列在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。

7.一种如权利要求2至5任一所述的重组载体在制备治疗上皮性卵巢癌药物中的应用。