CN103421792B - 真核生物翻译起始因子4H(eIF4H)基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用 - Google Patents
真核生物翻译起始因子4H(eIF4H)基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及真核生物翻译起始因子4H(eIF4H)基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用。具体地,本发明以真核生物翻译起始因子4H(eIF4H)为靶基因,利用慢病毒介导的RNA干扰技术使该基因沉默,创建了一个能够在体外有效的抑制小鼠血癌细胞生长的方法。该方法为白血病的发生和细胞分化机理的研究提供了新的视角,为抗肿瘤药物的研究提供了潜在的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的抑制肿瘤细胞生长的方法,该方法能够在体外抑制小鼠血癌细胞的生长。该方法为白血病的发生和细胞分化机理的研究提供了新的视角,为抗肿瘤药物的研究提供了潜在的靶点。
背景技术
白血病是一类严重的血液恶性肿瘤,在各类癌症中发病率较高。研究表明白血病的发生是造血祖细胞分化和凋亡紊乱所致。正常造血祖细胞程序性分化过程是受到一系列因子的严格调控,如果造血祖细胞失去了对调控因子的正常应答,就可能会引起细胞去分化和增殖失控。
利用基因沉默的方法可在mRNA和蛋白质水平降低目的基因表达,从而下调肿瘤发生相关的一些基因的异常表达来达到治疗肿瘤的目的。真核生物翻译起始因子4H(eukaryotictranslation initiation factor4H,eIF4H)是一个核糖体的翻译起始蛋白,可促进的蛋白质的合成。而对蛋白质合成的调控往往与细胞增殖、分化乃至肿瘤的发生密切相关,因此eIF4H是一个潜在抗肿瘤的治疗靶点。
eIF4H在进化过程中具有高度的保守性,对基因和蛋白质同源性的研究发现人和鼠的亚型II的同源性分别为91.4%和99.1%。eIF4H通过选择性的剪接5位外显子产生两个蛋白亚型,亚型Ⅰ含248个氨基酸,约27kDa,亚型Ⅱ含228个氨基酸,约25kDa,在小鼠中两个亚型的表达量相近。eIF4H通过调控cyclin D1的表达来促进细胞增殖。在常见人肿瘤细胞中,eIF4H均有较高表达。
慢病毒介导的RNA干扰技术可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,高效持久的实现特定基因的下调表达。含有干扰序列的慢病毒质粒载体可在宿主细胞内稳定表达小发夹结构的shRNA,shRNA在细胞内进一步加工成siRNAs,从而干扰目的基因,造成RNA水平上的基因沉默。
本发明构建了针对eIF4H的RNA干扰质粒,通过与两个慢病毒包装质粒共转染人肾胚细胞293T细胞获得可使eIF4H低表达的慢病毒,慢病毒侵染鼠红白血病细胞MEL细胞系,有效抑制了血癌细胞的生长,并可促进红系分化进程。
发明内容
本发明以真核生物翻译起始因子4H(eIF4H)为靶基因,利用慢病毒介导的RNA干扰技术使该基因沉默,创建了一个有效的抑制体外肿瘤细胞生长的方法。
本发明发现eIF4H在丁酸钠或六甲基烯二乙酰胺(HMBA)诱导MEL细胞红系分化过程中表达下调。在eIF4H基因的编码区选取翻译起始位点后的第179~199bp作为干扰靶位点,合成了可形成小发夹shRNA的寡聚核苷酸序列,通过分子生物学方法获得了含有该shRNA的真核干扰质粒。将干扰质粒与两个病毒包装质粒共同转染入人肾胚细胞293T细胞系以获得可使eIF4H低表达的慢病毒。然后将慢病毒侵染鼠红白血病MEL细胞,经嘌呤霉素筛选得到稳定株。蛋白质印迹分析技术显示,干扰细胞株中eIF4H蛋白表达量明显下降,表明eIF4H基因被有效的沉默了。通过MTT分析,发现低表达eIF4H的MEL细胞的生长速度明显低于对照组;利用流式细胞术分析了细胞周期,结果显示MEL细胞在eIF4H基因沉默后S期细胞减少,G1期细胞增多;利用联苯胺染色对红系分化进行分析,eIF4H低表达促进MEL细胞红系分化进程。以上三个实验结果表明eIF4H基因沉默后,MEL细胞的增殖受到抑制。
本发明提出的技术路线可以进一步应用于不同组织来源的肿瘤细胞和不同的肿瘤相关基因,可以用来研究肿瘤的发生机制,寻找用于抗肿瘤的基因治疗的理想靶点。
附图说明:
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
图1:eIF4H在丁酸钠或HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中表达下调;
图2:本发明中选择的干扰靶位点;
图3:eIF4H基因沉默MEL细胞稳定株的建立;
图4:eIF4H基因沉默后MEL细胞的生长速度明显低于对照组;
图5:eIF4H基因沉默后MEL细胞中S期细胞减少,G1期细胞增多;
图6:eIF4H基因沉默后促进了MEL细胞的红系分化进程。
下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的,应该明白,本发明并不受下述实施例的限制。
具体实施方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明,但并不限制本发明的范围。
实施例1
免疫印迹法检测eIF4H在丁酸钠或HMBA处理的MEL细胞中的表达变化
收集HMBA或丁酸钠处理不同时间(0,6,12,24,36,48,72,96和120h)的MEL细胞,提取总蛋白,采用Brandford法进行蛋白浓度测定。取30μg总蛋白,用12%的分离胶进行蛋白分离。通过湿转的方式将分离的蛋白样品转移到PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉室温封闭2h。分别加入兔抗小鼠eIF4H单克隆抗体(1:2,000稀释)、小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1:20,000稀释)和兔抗小鼠GAPDH抗体(1:10,000稀释)4℃孵育过夜,经PBST洗涤后加入(带有辣根过氧化物酶标记的)山羊抗兔二抗(1:5000稀释)和羊抗小鼠二抗(1:5,000稀释)37℃孵育1h,洗涤后用化学发光法进行显色反应。
实施例2
本发明中使用的寡核苷酸序列及用途
实施例3
真核干扰质粒的构建
加去离子水溶解寡核苷酸至终浓度为20μM,取RNAi-F和RNAi-R各5μl与5μl10×NEB Buffer2混合后加35μl去离子水至反应体系50μl。沸水浴中缓慢冷却至室温使之形寡核苷酸双链。
将寡核苷酸双链与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的PLKO.1-TRC载体连接形成重组质粒PLKO.1-eIF4H,转化感受态DH5α细菌,然后涂布于含氨卞青霉素的LB固体培养基上,37度培养12小时。挑选单克隆进行酶切鉴定(由于寡核苷酸的插入后导致载体上的Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点遭到破坏,固选用EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ作双酶切鉴定)。获得阳性克隆后于LB液体培养基中进一步扩大培养,提取质粒,通过测序确定插入片段是否正确,测序引物为5’-CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3’。将测序正确的PLKO.1-eIF4H菌液冻存备用。实验以“PLKO.1-载体对照”作为载体对照,“载体对照”为一段打乱寡核苷酸,在细胞内没有靶向基因。
实施例4
质粒DNA的大量制备(碱裂解法大量制备质粒)
1)分别收集过夜培养的含PLKO.1-eIF4H、PLKO.1-载体对照、pCMV-VSVG和pCMV-dR8.2(为两个慢病毒包装质粒)的菌液100ml,4℃7500rpm离心15min,弃去上清。
2)加6ml预冷的碱裂解溶液Ⅰ充分重悬菌体,使其完全分散后移入50ml离心管中。
3)加12ml碱裂解溶液Ⅱ室温轻轻颠倒数次混匀,室温放置5min,使菌体完全裂解,溶液变透明。
4)加9mL预冷碱裂解溶液Ⅲ,立即轻轻颠倒混匀,至白色絮状物产生,冰上放置10~15min。
5)12000rpm,4℃离心10min,小心吸取上清,加0.6倍体积异丙醇,轻轻颠倒混匀,室温放置10min。
6)12000rpm,4℃离心10min,弃去上清,加70%乙醇洗涤沉淀和管壁一次,室温干燥使乙醇挥发干净。
7)沉淀加400μl TE(PH8.0)充分溶解,转移至1.5ml离心管中,加400μl5M LiCl轻轻颠倒混匀。
8)12000rpm,4℃离心10min,上清转移至另一离心管中,加等量异丙醇充分混匀,-20℃沉淀15min。
9)12000rpm,4℃离心10min,弃上清,加70%乙醇洗涤沉淀,干燥使乙醇挥发干净。
10)依次加入500μl TE和250μl RNAse(1mg/ml)37℃孵育30min除去RNA。
11)加等体积含13%(m/v)PEG8000的1.6M NaCl充分混匀,冰上沉淀1h。
12)12000rpm,4℃离心10min,弃上清,加400μl TE,37℃水浴1h溶解质粒。
13)加等量苯酚(24):氯仿(25):异戊醇(1)12000rpm,4℃离心10min抽提;再用氯仿抽提一次。
14)上清水相转移至另一离心管中,加1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)充分混匀,再加入2倍体积无水乙醇。
15)12000rpm,4℃离心5min,弃上清,加200μl70%乙醇洗涤一次。
16)加100~200μl TE溶解沉淀,获得PLKO.1-eIF4H、PLKO.1-载体对照、以及另外两个慢病毒包装质粒pCMV-VSVG和pCMV-dR8.2。
实施例5
脂质体介导的慢病毒包装
1)细胞转染前将293T细胞以1.5×106的密度培养于10cm细胞培养皿中培养24h,转染时细胞汇合度达到50%~60%。
2)转染前3h将待转染细胞培养基换为无血清MEM培养基。
3)取16μg质粒(7.5μg pLKO.1-eIF4H或PLOK.1-载体对照、2.9μg pCMV-VSVG、5.6μgpCMV-dR8.2)至0.5ml无血清MEM培养基中混合均匀。再取15μl LipofectamineTM2000至0.5ml无血清MEM培养基中混合均匀,室温孵育5min。混合两份培养基,室温孵育25min。
4)在待转染细胞中加入4ml无血清MEM培养基,逐滴加入步骤3的混合液。混匀后放至37℃,CO2培养箱中培养6h后换成10%血清的DMEM培养基培养。
5)培养48h后取上清培养基至15ml离心管中,2000rpm,4℃离心7min收集上清病毒液,获得PLOK.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两种慢病毒。
实施例6
eIF4H低表达的MEL细胞稳定株的建立
复苏MEL细胞并传代2~3次后,按每孔4500个细胞接种于24孔板内,每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培养基,将pLKO.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两种病毒分别加到细胞悬液中。侵染96h后,弃去上清培养基,用0.5μg/ml的嘌呤霉素筛选含抗性基因的细胞,直到没有大量的细胞死亡为止,此过程大约需一个月。获得PLKO.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两个MEL细胞株,通过免疫印迹法验证干扰效果。
实施例7
MTT法检测eIF4H低表达对MEL增殖的影响
取对数生长期的PLKO.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两个MEL细胞株接种于96孔板,每孔3000个细胞,每组设3个复孔,置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养,分别于接种的1~5d加入10μl5mg/ml的MTT溶液,继续培养4h,3000rpm离心15min,弃去上清培养液,加入150μl DMSO,振荡10min,使紫色结晶充分溶解,OD595nm处测定吸光度值。以OD595nm为纵坐标,时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
实施例8
流式细胞术分析eIF4H低表达对MEL细胞周期的影响(南京凯基PI凋亡染色试剂盒)
收取对数生长期的PLKO.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两个MEL细胞株,PBS洗2次,1000rpm离心10min,弃上清,加入1ml预冷的70%乙醇于-20℃固定24h以上。1500rpm离心10min,弃上清,细胞沉淀用PBS洗两次,留0.2ml PBS,加入终浓度为50μg/ml RnaseA,37℃保温30~45min,冰浴1min。加入为5μl碘化丙锭,4℃避光染色30min,流式细胞仪分析细胞周期。
实施例9
eIF4H低表达对丁酸钠诱导MEL细胞红系分化的影响
收取对数生长期的PLKO.1-eIF4H和PLKO.1-载体对照两个MEL细胞株,按1.5×104/ml接种于24孔板中,加入1.25mM丁酸钠诱导红系分化,对照组不加丁酸钠。分别于加药后3~5d取各组细胞进行联苯胺染色。收集细胞,1000rpm,3min;弃上清,加入1ml生理盐水(0.85%)洗1次,去除残留培养基;加入预混的联苯胺染液:30%H2O2(50:1,v:v)100μl;滴片后镜检,统计联苯胺阳性细胞所占比例。
结果
1eIF4H在丁酸钠和HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中表达均下调
免疫印迹分析发现在丁酸钠或HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中,eIF4H蛋白的两个亚型表达均下调(图2)。
2eIF4H低表达稳定株的建立
免疫印迹显示,pLKO.1-eIF4H组细胞中eIF4H两个亚型表达均下调。结果表明成功构建了eIF4H基因沉默的MEL细胞稳定株(图3)。
3eIF4H低表达抑制了MEL细胞的增殖
与对照组细胞相比,pLKO.1-eIF4H组细胞增殖明显受到抑制。对照组细胞在3d时细胞生长达到平台期,而pLKO.1-eIF4H到4d时才达到平台期。结果表明eIF4H低表达显著抑制了MEL细胞的增殖(图4)。
4eIF4H低表达阻碍了MEL细胞的周期进程
pLKO.1-eIF4H组细胞周期各时期的分布:G1期为37.82%,G2期为5.36%,S期为56.82%;而PLKO.1-载体对照组细胞周期各时期的分布:G1期为32.30%,G2期为5.87%,S期为61.83%。结果表明eIF4H低表达阻碍MEL细胞周期在G1期(图5)。
5eIF4H低表达促进了MEL细胞红系分化进程
丁酸钠处理后,pLKO.1-eIF4H组联苯胺阳性细胞明显高于PLKO.1-载体对照(图6),结果表明eIF4H低表达促进了MEL细胞的红系分化进程。
综上所述,可见eIF4H在丁酸钠和HMBA诱导MEL细胞红系分化过程中表达下调。在eIF4H基因编码区选取翻译起始位点后的第179~199bp作为干扰靶位点,合成了可形成小发夹shRNA的寡聚核苷酸序列,通过慢病毒介导的RNA干扰技术成功构建了eIF4H低表达MEL细胞稳定株。进一步研究发现eIF4H低表达抑制了MEL细胞的增殖;并且发现eIF4H低表达促进了MEL细胞的红系分化进程。本发明提示选取eIF4H基因编码区翻译起始位点后的第179~199bp作为干扰靶位点可有效的沉默该基因的表达,并且eIF4H的下调表达可促使癌细胞恶性逆转。
虽然用上述实施方式描述了本发明,应当理解的是,在不背离本发明的精神的前提下,本发明可进行进一步的修饰和变动,且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.含有eIF4H干扰靶位点CTATCTTTAAGGATCTCAGCA的寡核苷酸,其是5’-CCGGCTATCTTTAAGGATCTCAGCACTCGAGTGCTGAGATCCTTAAAGATAGTTTTTG-3’,
或是
5’-AATTCAAAAACTATCTTTAAGGATCTCAGCACTCGAGTGCTGAGATCCTTAAAGATAG-3’。
2.质粒,其含有权利要求1中所述的寡核苷酸。
3.微生物,其含有权利要求1中所述的寡核苷酸。
4.权利要求3的微生物,其为慢病毒。
5.含有权利要求2的质粒的重组大肠杆菌。
6.含有权利要求2所述质粒的重组MEL细胞株。
7.权利要求1的寡核苷酸在制备用于通过基因沉默抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途,其中所述的肿瘤细胞是白血病细胞。
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