CN104491880A - MicroRNA-141作为抑制剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MicroRNA-141作为抑制剂的用途，具体公开了含有如SEQ ID No.1所示序列的TAZ表达抑制剂在制备治疗TAZ过度表达引起的癌症药物中的应用，以及在制备抑制肿瘤细胞增殖、侵袭或转移的试剂中的应用。通过本发明的研究表明，MicroRNA-141能够通过抑制其靶基因TAZ的表达，进一步抑制胃癌细胞的增殖、浸润和转移；体内动物实验研究表明MicroRNA-141尤其对胃癌的转移具有良好的抑制作用。由此，本发明为开发新型胃癌治疗药物和肿瘤细胞TAZ基因抑制试剂提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于医药生物工程技术领域，具体涉及MicroRNA-141作为抑制剂的用途。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率居各类肿瘤之首，每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，而且胃癌的预后较差，严重威胁人类的生命健康。
微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类长度约为20～25nt的内源性非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA(mRNAs)3’非翻译区互补结合，诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调控作用。研究表明，大约50％的miRNAs在基因组上定位于肿瘤相关基因区域或脆性位点(fragilesite)。miRNAs作为一类新的癌基因或抑癌基因，其表达失衡与多种肿瘤的发生密切相关。许多证据表明，miRNAs的表达谱在胃癌组织中常出现异常，miRNAs参与了胃癌的发生、发展和转移，提示它们在胃癌的诊断、预后和治疗中具有广阔的应用前景。
miR-141位于染色体12p13(6964097bp-6964191bp)，属于miR-200家族,被证实在诸如卵巢癌、肝癌、肾细胞癌、结直肠癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达下调，在肿瘤细胞的生长、分化和转移方面发挥重要的调控作用，是一类新的抑癌基因。基于此，本研究进一步探讨了miR-141在胃癌发生发展中的作用，旨在为寻找新型胃癌治疗药物提供新的思路和方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种MicroRNA-141作为抑制剂的用途，具体地，提供MicroRNA-141作为抑制剂通过抑制TAZ基因的表达，达到抑制胃癌转移的目的。
本发明采取的技术方案如下：
1、TAZ表达抑制剂在制备治疗TAZ过度表达引起的癌症药物中的应用，所述TAZ表达抑制剂含有如SEQ ID No.1所示序列。
优选的，所述TAZ表达抑制剂为含有如SEQ ID No.1所示序列的重组质粒、重组病毒或重组病毒载体中的一种。
优选的，所述TAZ表达抑制剂为MicroRNA-141、miRNA-141agomir或miRNA-141mimics。
优选的，所述癌症为胃癌。
2、TAZ表达抑制剂在制备抑制肿瘤细胞增殖、侵袭或转移的试剂中的应用，所述TAZ表达抑制剂含有如SEQ ID No.1所示序列。
优选的，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。
优选的，所述胃癌细胞为HGC-27细胞或SGC7901细胞。
本发明的有益效果在于：本发明对TAZ基因与miR-141之间的关系进行了深入研究。通过研究表明，MicroRNA-141能够通过抑制其靶基因TAZ的表达，进一步抑制胃癌细胞的增殖、浸润和转移；体内动物实验研究表明MicroRNA-141尤其对胃癌的转移具有良好的抑制作用。由此，本发明为开发新型胃癌治疗药物和肿瘤细胞TAZ基因抑制试剂提供了新思路。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1荧光素酶实验结果；由图可知，TAZ基因的3'UTR含有miR-141的结合位点，TAZ基因是miR-141的靶基因。
图2细胞转染后免疫印迹结果；1泳道为阴性对照组，2泳道为miR-141mimics组；由图可知，过表达miR-141能够抑制其靶基因TAZ的蛋白表达水平。
图3MiR-141和TAZ pcDNA共转染免疫印迹结果；所用细胞为HGC-27细胞；其中，1泳道为阴性对照组，2泳道为miR-141mimics组，3泳道为miR-141mimics+pcDNA3,1-TAZ组。
图4miR-141通过抑制TAZ的表达抑制肿瘤细胞增殖的CCK-8实验结果。
图5细胞的体外侵袭和转移实验结果；其中A为侵袭实验结果，B为转移实验结果。
图6裸鼠胃癌模型建立实验结果；所用细胞为HGC-27细胞。
图7体内肿瘤转移实验结果；其中A为肺组织HE染色结果；B为在Agomir-miR-141和阴性对照中发生和没有发生肿瘤肺部转移的裸鼠数量。
图8体内成瘤后免疫印迹实验结果；其中1泳道为阴性对照Agomir-NC组，2泳道为Agomir-miR-141组。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
肿瘤侵袭(ECM550)试剂盒和细胞迁移分析(ECM220)试剂盒购自Millipore公司；野生型TAZ-3’UTR和突变型TAZ-3’UTR寡核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成；TAZ一抗购自Cell signaling公司；GAPDH一抗购自Cell signaling公司；miR-141mimics及阴性对照miR-NC购自RIBOBIO公司；CCK8试剂盒购自Beyotime公司；内参质粒pRL-TK购自Promega公司；双荧光素酶报告基因检测系统购自Promega公司；质粒pcDNA3.1-TAZ购自百恩维生物科技公司；Agomir-141和Agomir阴性对照购自RIBOBIO公司。
HGC-27细胞和SGC-7901细胞购自ATCC细胞库。
实施例1证实TAZ基因为miR-141的靶基因
TAZ，也被称为WWTR1(WW-domain containing transcriptional regulator 1)，是一类重要的转录共激活因子，能与多种转录因子相互作用，其中包括Runx2，PPAR，TBX5，TEADs，TTF-1，PAX3等。研究证实，TAZ基因能够促进细胞增殖、细胞迁移和诱导上皮细胞向间充质细胞(EMT)转化，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。另有研究发现TAZ基因在胃癌组织中表达上调，基于此，本发明进一步研究TAZ与miR141之间的关联性。
荧光素酶实验：先合成野生型TAZ-3’UTR和突变型TAZ-3’UTR寡核苷酸序列，序列如下：
正义序列：5’-ctagtataaaaaattaaaaaaacaagggacctaacaaaactcagcagtgttactgtat-3’(SEQ ID NO.2)；反义序列：5’-agcttatacagtaacactgctgagttttgttaggtcccttgtttttttaattttttat-3’(SEQ ID NO.3)。
两条寡核苷酸在1×退火缓冲液中，90℃放置3min，30℃放置1h，进行退火；1×退火缓冲液为：10mM，pH 8.0的Tris，50mM NaCl，1mM EDTA。退火体系为：两条寡核苷酸片段按1μg/μL的浓度各取2μL，1×退火缓冲液46μL。荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT HindIII/Spe I双酶切后与退火片段进行连接，制备成重组质粒pMIR-TAZ-3’UTR。将HEK293细胞接种于96孔板，24h后细胞贴壁达50％时进行转染，具体为将miR-141mimics及阴性对照miR-NC与构建好的质粒pMIR-TAZ-3’UTR及内参质粒pRL-TK共转染HEK293细胞，具体操作按脂质体2000试剂盒说明书进行转染。转染24h以后，用双荧光素酶报告基因检测系统处理裂解细胞，并用GloMax20/20发光检测仪检测荧光强度。
结果：由图1可见，与阴性对照组相比，野生型TAZ-3’UTR在加入miR-141mimics后荧光强度变弱，而突变型TAZ-3’UTR在加入miR-141mimics后荧光强度几乎无变化，说明TAZ基因的3’UTR含有miR-141的结合位点，TAZ基因是miR-141的靶基因。
实施例2HGC-27细胞和SGC-7901细胞中miR-141抑制TAZ基因的表达
细胞转染实验：实验采用HGC-27细胞和SGC-7901细胞分别进行。首先采用6孔板分别培养HGC-27细胞和SGC-7901细胞，至细胞贴壁生长汇合率达到50％时开始用脂质体2000试剂盒转染。先用I Reduced Serum Medium培养基按25：1的体积比稀释LipofectamineTM2000，轻轻混合后室温放置5min再使用。另外将15μL，50nM miR-141mimics或阴性对照miR-NC加入750μLI Reduced Serum Medium培养基中，轻轻混合后室温静止5min使用。取750μL稀释后的miR-141mimics或阴性对照miR-NC和750μL转染试剂充分混匀，室温孵育20min后取250μL加至含细胞和培养基的培养孔中，轻摇混匀后37℃孵育细胞18～48h。
免疫印迹实验：将转染后的全细胞用细胞裂解缓冲液裂解，12000rpm离心15min后，收集上清，BCA法进行蛋白浓度测定。取20μg蛋白经10％SDS-PAGE凝胶电泳分离后，湿法转印至PVDF膜上，根据marker标示切下TAZ和GAPDH条带区域，5％脱脂奶粉封闭后，分别用TAZ一抗(1:500稀释)，GAPDH一抗(1:5000稀释)孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG孵育1h，用持久性化学发光底物试剂(Supersignal West DuraExtended Duration substrate)处理并曝光显色。
结果：由图2可知，两种细胞过表达miR-141后，TAZ蛋白表达水平与对照组相比均降低，表明细胞过表达miR-141能够抑制其靶基因TAZ的蛋白表达水平。
实施例3miR-141通过抑制TAZ的表达进而抑制肿瘤细胞增殖、浸润与转移
细胞增殖实验：用CCK-8试剂盒进行增殖实验，取胃癌细胞HGC-27和SGC-7901进行miR-141mimics转染，转染方法同实施例2。转染24h后制备单细胞悬液进行铺板，设置细胞浓度为104/孔，100uL/孔，分别在37℃培养箱中培养24h，36h，48h和72h，同一样本做8个重复。在培养24h，36h，48h和72h后向每孔中加入10uL CCK-8，然后继续在37℃细胞培养箱中培养2小时。最后测定570nm吸光度，得出对应的OD值。
细胞侵袭和转移试验：HGC-27和SGC-7901细胞分别转染miR-141mimics和阴性对照miR-NC，用肿瘤侵袭(ECM550)试剂盒和细胞迁移分析(ECM220)试剂盒测定转染后能够穿透膜的细胞数目。具体操作步骤如下：1)用无血清培养基轻洗transwell小室上室2小时，2)消化法从细胞培养瓶中获取细胞，用RPMI1640培养基洗3遍后1％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，细胞浓度为5×105个/mL；3)上室加入200μL细胞悬液，下室加入600μL含10％FBS的RPMI1640细胞培养基，含有5μg/mL纤维连接蛋白作为黏连亚族，37℃条件下培养20～24h；4)培养完毕后，用棉签擦去上室上面的非侵袭细胞，移去transwells，倒置，风干；5)将小室置于加有500μL含0.1％结晶紫染色液的24孔板中，37℃条件下使膜浸没在培养基染液中30min；6)取出小室，PBS清洗后，拍照并计数；7)然后将小室置于加有500μL 33％醋酸的24孔板中，振荡浸膜10min，待溶解后取出小室，酶标仪上560nm和570nm测OD值。
MiR-141和TAZ pcDNA共转染：把HGC-27细胞接种于6孔板，24h后细胞贴壁达50％时进行转染。将miR-141mimics及阴性对照miR-NC与构建好的质粒pcDNA3.1-TAZ共转染
HGC-27细胞，按脂质体2000试剂盒说明进行转染。转染完毕后进行免疫印迹实验，方法同实施例2。
结果：结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一种新发现可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积生长因子，在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病发生发展密切相关，并且研究表明CTGF为Hippo通路中TAZ下游转录产物。由图3可知，miR-141mimics组与阴性对照组相比，TAZ与CTGF的表达水平均降低，而转染含有miR-141+pcDNA TAZ的质粒后，TAZ和CTGF的表达水平则与对照组差别不大，表明miR-141通过抑制TAZ的表达，进而抑制促进细胞增殖的相关因子的表达水平，最终发挥其抑制肿瘤细胞增殖的功能。由图4可知，两种细胞经过24h，36h，48h和72h培养后，miR-141mimics组与阴性对照组相比，细胞的增殖均不同程度的受到抑制，当转染含有miR-141+pcDNA TAZ的质粒后，细胞的增殖水平基本恢复到对照组的水平，因此，图4同样表明miR-141通过抑制TAZ的表达进而抑制胃癌细胞的增殖。细胞的侵袭和转移实验结果分别见图5中A和B，由图5可知，miR-141mimics组与阴性对照组相比，细胞的侵袭和转移均不同程度的受到抑制，当转染含有miR-141+pcDNA TAZ的质粒后，细胞的侵袭和转移水平基本恢复到对照组的水平。
实施例4动物实验
裸鼠胃癌模型建立：利用5μM Agomir-141过表达HGC-27细胞中miR-141的表达，阴性对照为同样浓度的Agomir阴性对照；然后选取5-6周龄的雌性裸鼠，将已经稳定过表达成熟miR-141的HGC-27细胞以5×105个/mL重悬于100μL PBS，并皮下注射于裸鼠腋窝；连续5周观察记录肿瘤的大小，肿瘤的体积(V)＝长度(L)×宽度2(W2)×0.5。
体肿瘤转移分析实验：利用5μM Agomir-141过表达HGC-27细胞中miR-141的表达，阴性对照为同等浓度的Agomir阴性对照；选取5-6周龄的雌性裸鼠，将已经稳定过表达成熟miR-141的HGC-27细胞以5×105个/mL重悬于100μL PBS，然后通过尾静脉注射于裸鼠体内；5周后，解剖小鼠，取出肺组织，固定后做HE染色，显微镜下观察肿瘤结节。
取体内形成的肿瘤细胞进行免疫印迹实验，实验方法同实施例2。
结果：由图6可知，与Agomir阴性对照相比，过表达miR-141的HGC-27细胞注射裸鼠5周后，Agomir-141组肿瘤体积显著小于对照组，提示miR-141具有抑制胃癌细胞增殖的作用；而图7的结果则显示miR-141能够抑制胃癌细胞的肺转移。另外，由图8则可得出，miR-141正是通过下调TAZ基因的表达从而达到对体内胃癌细胞增殖和转移的抑制作用。
综合实施例1-3的实验结果，miR-141能够作为TAZ基因的抑制剂，从而应用于胃癌的治疗。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.TAZ表达抑制剂在制备治疗TAZ过度表达引起的癌症药物中的应用，其特征在于，所述TAZ表达抑制剂含有如SEQ ID No.1所示序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TAZ表达抑制剂为含有如SEQ ID No.1所示序列的重组质粒、重组病毒或重组病毒载体中的一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TAZ表达抑制剂为MicroRNA-141、miRNA-141agomir或miRNA-141mimics。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为胃癌。
5.TAZ表达抑制剂在制备抑制肿瘤细胞增殖、侵袭或转移的试剂中的应用，其特征在于，所述TAZ表达抑制剂含有如SEQ ID No.1所示序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胃癌细胞为HGC-27细胞或SGC7901细胞。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441449A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-03-30 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种与他莫昔芬耐药性相关的microRNA分子MiR-141及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182577A (zh) * | 2007-11-19 | 2008-05-21 | 宁波大学 | 一种用于胃癌组织的微小rna探针及其检测方法 |
| EP2505668A2 (en) * | 2006-01-05 | 2012-10-03 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA-based methods for the diagnosis of colon, lung, and pancreatic cancer |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2505668A2 (en) * | 2006-01-05 | 2012-10-03 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA-based methods for the diagnosis of colon, lung, and pancreatic cancer |
| CN101182577A (zh) * | 2007-11-19 | 2008-05-21 | 宁波大学 | 一种用于胃癌组织的微小rna探针及其检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 李远航: "TAZ蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义", 《世界华人消化杂志》 * |
| 杜颖: "微小RNA miR-141在胃癌发病中的作用", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 申发娟: "MiR-200a和miR-141对人胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响及机制的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441449A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-03-30 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种与他莫昔芬耐药性相关的microRNA分子MiR-141及其应用 |
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