CN103243163A

CN103243163A - miR-27a的新用途

Info

Publication number: CN103243163A
Application number: CN2013101685317A
Authority: CN
Inventors: 孙庆敏; 荆亚莉; 晏婷婷; 项静英; 邱召娟; 徐琳琳
Original assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明公开了miR-27a作为药物靶点在制备用于治疗卵巢癌药物中的应用以及miR-27a在制备卵巢癌诊断试剂盒中的应用。本发明根据miR-27a在卵巢癌癌组织中的表达高于卵巢良性组织这一特性，将miR-27a应用于制备卵巢癌诊断试剂盒；同时，通过反义核酸或者药物干扰miR-27a表达，可抑制卵巢癌细胞的生长和侵袭，可用miR-27a作为靶点设计或开发药物，在治疗卵巢癌治疗中，具有重要用途。

Description

miR-27a的新用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种miR-27a的新用途。

背景技术

MicroRNAs（miRNAs）是近年来发现的一类内源性非编码小分子RNAs，长度约为19-25nt，可通过直接降解靶基因mRNA 或抑制其蛋白翻译而负性调控转录后表达。研究发现miRNAs可调控约30%的人类基因，从而参与调控一系列的细胞生物学过程包括细胞分化、增殖及凋亡等。近年来，越来越多的研究表明一些miRNA可作为一些肿瘤的诊断标志物或治疗靶点包括结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等。因此，为我们针对miRNA为靶点开发诊断试剂或治疗药物提供了新的思路。

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。由于起病隐匿，许多病人就诊时已处于晚期。对于晚期病人，其5年生存率只有28%~45%。卵巢癌的标准治疗方法包括外科肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗。术后70%病人会对化疗药物起作用，但是大部分仍旧会复发，最终死于此疾病。因此，寻找与卵巢癌诊断、治疗有关的新靶点成为科研工作或临床实践中亟待解决的难题。目前，一系列研究发现异常的miRNAs表达在卵巢癌诊断和治疗方面发挥重要作用。MicroRNA-27a （miR-27a）位于19号染色体上，研究发现其广泛高表达于一系列肿瘤中。在乳腺癌细胞中，已经发现转染反义miR-27a后，通过对靶基因Myt-1的抑制，使细胞周期进展阻滞在G2-M，细胞有丝分裂受阻，增殖能力受到抑制。也有报道显示GT-094（NO类非甾体抗炎药）或CDODA-Me可通过下调miR-27a，进而上调ZBTB10表达，最终抑制转录因子Sp及其相关基因产物表达，引起细胞生长能力下降及凋亡增加。在胃腺癌细胞中，通过使用miR-27a ASO（反义寡核苷酸）下调miR-27a表达后，细胞的生长及克隆形成能力被显著下调。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种miR-27a的新用途，以期为制备用于治疗卵巢癌的药物提供有效途径。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

miR-27a作为药物靶点在制备用于治疗卵巢癌药物中的应用。

miR-27a在制备卵巢癌诊断试剂盒中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明根据miR-27a在卵巢癌癌组织中的表达高于卵巢良性组织这一特性，将miR-27a应用于制备卵巢癌诊断试剂盒；同时，通过反义核酸或者药物干扰miR-27a表达，可抑制卵巢癌细胞的生长和侵袭，可用miR-27a作为靶点设计或开发药物，在治疗卵巢癌治疗中，具有重要用途。

附图说明

图1是miR-27a在卵巢癌组织中的相对表达量结果图；

图2是SRB和Transwell实验结果图；A图为SRB细胞增殖实验，说明反义核酸干扰miR-27a表达后可抑制卵巢癌细胞的增殖；B图为Transwell迁徙实验，说明反义核酸干扰miR-27a表达后可抑制卵巢癌细胞的迁移；C图也为细胞增殖实验，说明当诱导miR-27a高表达则可促进卵巢癌细胞的增殖；D图为迁徙实验，说明当诱导miR-27a高表达后，在一定程度上可部分促进卵巢癌细胞的迁移；

图3是SRB结果图；显示药物Genistein可浓度、时间依赖性的抑制卵巢癌细胞的生长；

图4是Real time PCR结果图；显示药物Genistein可剂量依赖的抑制miR-27a的表达；

图5是Real time PCR结果图；显示药物Genistein可诱导miR-27a靶基因Sprouty2的mRNA表达增高；

图6是Western blot结果图；其中，A为Western blot结果图；显示药物Genistein可诱导miR-27a靶基因Sprouty2蛋白表达增高；B为Western blot结果灰度分析后量化的柱状图；

图7是miR-27a拮抗药物Genistein通过miR-27a途径对细胞的抑制作用结果图；

图8是miR-27a拮抗药物Genistein诱导靶基因Sprouty2表达的作用结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 miR-27a在卵巢癌组织标本中表达水平的检测

1、RNA的提取

（1）收集石蜡包埋的卵巢癌及良性卵巢组织，选取代表性蜡块，5μm厚切片5~10张，收于1.5mL Ep管。

（2）脱蜡：各Ep管加入二甲苯1.2mL，混匀，55℃下脱蜡5min；10000rpm离心5 min，去上清，视石蜡多少重复上述步骤3~5次；无水乙醇，1.2mL洗涤2次，10000 rpm离心5~8 min；室温干燥。

（3）消化：加入组织裂解液（20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/L EDTA，2% sodium dodecyl sulfate）200μL，蛋白酶K溶液5μL（20 mg/mL），置于55℃水浴锅内过夜；待组织完全溶解后，95℃加热10min，灭活蛋白酶K。

（4）加1mL Trizol，混匀，室温下放置10min；加入200μL氯仿，剧烈混匀15s；4℃，13000r/min，离心15 min；吸取水相，加入等体积异丙醇，-20℃放置1~2h；4℃，13000r/min，离心15min；弃上清，加75%乙醇1.5mL洗涤沉淀，4℃，13000r/min，离心10min；弃上清，室温干燥后，加DEPC水溶解RNA，测浓度后-80℃保存，得RNA样本。

2、利用“Stem Loop”方法检测miR-27a的表达

总体积7.5μL的反应体系为：1.5μL 5×M-MLV Buffer，2.45μL DEPC处理过的灭菌水，0.75μL 10mmol/L dNTP，0.1μL 40 U/μL Rnasin，0.2μL 200Uμ/l MMLV，1.5μL Stem Loop特异引物（购于Applied Biosystems公司），1μL RNA样本。

将以上体系吹打混匀，置于PCR仪器中16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min反应结束后，所得cDNA产物-20℃保存。

总体积10μL的miR-27a反应体系为：5μL TaqMan 2×Universal PCR Master Mix（购于Applied Biosystems公司），2.5μL DEPC处理过的灭菌水，0.5μL 20×TaqMan microRNA assays，2μL Stem Loop逆转录产物（购于Applied Biosystems公司）。

反应条件：将以上体系吹打混匀，置于ABI7300 PCR仪器，反应条件是50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 1min，共40个循环。

通过2^-△Ct统计方法比较，计算miR-27a的相对表达量。结果如图1所示，miR-27a在卵巢癌组织中的表达高于良性组织（P = 0.039）。以上结果提示miR-27a高表达与卵巢癌的发生有关。

实施例2 转染Anti-miR-27a/miR-27a minic对卵巢癌细胞生长和迁移的影响

Anti-miR-27a及miR-27a mimic均为常规化学合成。

miR-27a mimic序列为：5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3'，5'-GGAACUUAGCCACUGUGAAUU-3'；

Anti-miR-27a序列为：5'-GCGGAACUUAGCCACUGUGAA-3'；

转染前一天，取生长状态良好的细胞，胰酶消化，将其接种到不含抗生素的DMEM培养基中，使次日转染时细胞融合度达70%。转染之前用PBS轻轻地冲洗细胞。

a.稀释miRNA mimics/inhibitor：5μL+100μL无血清DMEM，轻轻混匀，室温孵育5 min；

b.稀释Lipofectamine2000：lipo2000 5μL +100μL无血清DMEM，轻轻混匀，并室温孵育5 min。

c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min。

d.混合液加入板内，并补充无血清DMEM，使miRNA mimics/inhibitor终浓度为100nm/L。4~6h后吸去培养液，换成含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。到指定时间后，弃去96孔板中的培养基，加入10%的氯醋酸（TCA）100μL /孔，在4℃固定1h。用去离子水洗涤96孔板5次，晾干。再加入sulforhodamine B 50μL /孔，室温孵育10 min以使细胞着色。再用1%的冰醋酸洗涤5次以除去未结合的SRB，晾干。加入10mM Tris碱（pH10.5）100μL /孔，在平板振荡器上振荡5 min混匀，用酶标仪在500 nm波长处读取吸光度值。

细胞存活率用下式计算：

细胞存活率% =（用药组吸光度值-空白对照）/（对照组吸光度值-空白对照）×100%。

细胞迁移实验：卵巢癌SKOV3细胞用Anti-miR-27a/miR-27a minic处理48 h后，消化重悬于无血清DMEM培养基，接种于24孔板Transwell上室内（8 μm 孔径），每小室200μL（含3×10⁴个细胞），同时下室加入含10% FBS的培养基600μL。继续培养16h后，取出小室，PBS洗三次，用棉签轻轻擦掉膜上层未穿过的细胞，小室上的聚碳酸酯膜用甲醇固定20min，再用三蒸水冲洗，晾干后0.1%结晶紫染色20min，于200倍显微镜下计数穿膜细胞。每膜计数上下左右中5个不同视野透过细胞数，计算平均值，每组平行3个滤膜。计算细胞相对迁移能力。细胞相对迁移率=处理组迁移细胞数/对照组迁移细胞数×100%。

通过SRB实验，发现相对于转染了inhibitor negative control组，miR-27a inhibitor使细胞生长能力明显降低（图2A，P < 0.01）。同时，利用Transwell实验，观察miR-27a对细胞运动能力的影响。结果说明转染了miR-27a inhibitor后，与对照组相比，细胞迁移数目降低至73%（图2B，P < 0.01）。而miR-27a minic处理细胞则可促进细胞的增殖。上述结果表明miR-27a在卵巢癌细胞中是癌基因，且可调控细胞生长及迁移。

实施例3 药物（Gen）通过miR-27a为靶点的抗卵巢癌活性

Genistein处理细胞：SKOV3细胞给予Gen 0，10，25，50，100，200μmol/L分别处理24，48，72h。用SRB法（方法同实施例2）检测药物对细胞生长的作用。药物对细胞生长的抑制率%= [1－（用药组吸光度值-空白对照）/（对照组吸光度值－空白对照）]×100%。

实时定量PCR检测miR-27a（方法同实施例1）及靶基因Sprouty2的表达。

Sprouty2反应条件是：95℃，2min；95℃，15s，60℃，40s，共40个循环；95℃，15s，60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s。

Sprouty2引物：上游引物5'-ATCCAGAGACAAGACATGTAC -3'；下游引物5'-TTCAGATGTGTTCTAAGCC-3'。

内参GAPDH引物：上游引物5'-TGTTCGACAGTCAGCCGC-3'；下游引物5'-GGTGTCTGAGCGATGTGGC-3'。

Western blot检测Sprouty2蛋白的表达。细胞经不同浓度Genistein（0，25，50，100μM），处理48h，每瓶按细胞量加入裂解液200~300μL，抽提细胞总蛋白。考马斯亮蓝法测蛋白浓度后加入5×SDS上样缓冲液，于95℃煮沸5 min，使蛋白变性，储存于-20℃备用。SDS-PAGE电泳后转膜、封闭、抗体孵育并ECL发光及显影后观察并分析结果。

结果表明（图3-6），Gen可随时间、剂量抑制人卵巢癌细胞的生长。当用25，50，100μM Genistein处理细胞48h后，与对照组相比，miR-27a表达水平分别降至83.1±1.9，71.1±4.6，72±8.1%。靶基因Sprouty2 mRNA表达水平则被显著上调，分别升高至1.7，2.7，5.7倍。Western blot实验也发现用100μM Genistein处理细胞后，Sprouty2蛋白水平也被上调，与对照组相比，增至1.81倍。

实施例4 miR-27a拮抗药物Gen通过miR-27a途径对细胞的抑制作用

为进一步明确miR-27a可作为药物开发的靶点，给予药物Gen处理细胞后，再利用miR-27a minic来恢复由Gen诱导的miR-27a下调。具体方法为将人卵巢癌细胞SKOV3接种于无菌六孔板，24h后细胞贴壁生长，分别转染miR-27a mimics，mimics negative control 24h（转染方法同实施例2）。之后细胞制成悬液接种于96孔板中，贴壁后，转染了miR-27a mimics或mimics negative control组，再分别加入Genistein 100μmol/L处理48h。SRB结果（图7）说明，外源性诱导miR-27a表达上调后，可以部分拮抗Gen的抑制细胞生长的能力。此外，对Gen致miR-27a靶基因Sprouty2高表达的作用，miR-27a minic同样可以部分拮抗（方法同实施例2，图8），该结果结合实例，明确的说明了miR-27a是某些药物的作用靶点。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省中医院

<120> miR-27a的新用途

<130> 100

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial

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<400> 7

ggtgtctgag cgatgtggc 19

Claims

1.miR-27a作为药物靶点在制备用于治疗卵巢癌药物中的应用。

2.miR-27a在制备卵巢癌诊断试剂盒中的应用。